JP2000500571A - 電気化学的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 作用電極およびそれから離れた対電極を有する種類の電気化学的セルでレドックス化学種の還元または酸化形態の濃度を求める方法は、レドックス化学種の電解酸化が拡散律速となるように電極間に電位を加え(２１)、時間の関数として電流値を測定し、定常状態電流（２３）の大きさを見積もり、電位を逆転させ、再度、時間の関数として電流を測定し、逆転電位の定常状態を見積もることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 電気化学的方法 発明の分野 本発明は、キャリヤ中における分析対象物の濃度を測定する電気化学的方法お よびその方法を実施する場合に使用するのに適当な装置に関する。 背景技術 本明細書に開示する発明は、出願人による係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ ９６／００３６５号に記載された発明の改善または修正であり、この引用によっ て、この出願の内容は、本明細書の内容に組み込まれる。 血液中のグルコース濃度の測定に使用されるバイオセンサを特に参照して本発 明を説明するが、本発明は、そのような特定の用途に限定されるものではなく、 他の分析的測定にも適用することができるものと理解されよう。 電流的（またはアンペロメトリック）測定（amperometric measurement）に適 当であるインピーダンスを有する２つの電極を有して成る電気化学的セルにおい て反応領域に水性液体試料を配置することにより試料中に存在する分析すべき成 分の濃度を測定することは知られている。分析すべき成分は、電極と直接、ある いはレドックス試薬と直接的または間接的に反応でき、それによって、分析すべ き成分の濃度に対応する量で酸化可能（または還元可能な）基質が生成する。そ の時に、存在する酸化可能（または還元可能な）基質の量を電気化学的に見積も る。一般的に、この方法は、電極の十分な分離を必要とし、その結果、一方の電 極における電解生成物は、他方の電極に達することができず、測定の間、他の電 極におけるプロセス（過程）を阻害しないようになっている。 出願人による係属中の出願において、本願出願人は、作用電極および作用極か ら離れた対（または対／参照）電極を有して成る種類の電気化学的セルにおいて 、レドックス化学種の還元（または酸化）形態の濃度を測定する新規な方法を開 示 している。この方法は、電極間に電位差を加え、対電極から反応生成物が作用電 極に達するように作用電極を対電極から離し、化学種の還元形態を電気的に酸化 （もしくは電解酸化）（または酸化形態を電気的に還元(もしくは電解還元)）す る速度が拡散律速となるように作用電極の電位を選択することを含む。電位を加 えた後で定常状態電流に達する前に時間の関数として電流を測定し、次に、定常 状態電流の大きさを見積もることにより、先に説明した方法は、拡散係数および ／または化学種の還元（または酸化）形態の濃度を見積もることを可能にする。 本願出願人の係属中の出願は、この方法をＧＯＤ／フェロシアン化物系を使用 する「薄層」セルを使用する場合を参照して説明している。本明細書において使 用する場合、「薄層電気化学的セル」なる用語は、対電極から反応生成物が作用 電極に達するように近接して離された電極を有するセルを意味する。実際、血液 中のグルコースを測定するそのようなセルにおける電極の距離は、５００ミクロ ン以下、好ましくは２００ミクロン以下である。 例示されている電気化学的セルにおいて使用される化学反応は以下のようであ る： グルコース＋ＧＯＤ→グルコン酸＋ＧＯＤ＊ 反応１ ＧＯＤ＊＋２フェリシアン化物→ＧＯＤ＋２フェロシアン化物 反応２ 式中、ＧＯＤはグルコースオキシダーゼ酵素であり、ＧＯＤ＊は「活性化」酵素 である。フェリシアン化物（[Ｆｅ(ＣＮ)₆]^3-）は、ＧＯＤ＊をその触媒状態に 戻す「メディエータ(mediator、伝達物質)」である。酵素触媒であるＧＯＤは、 過剰のメディエータが存在する限り、反応の間、消費されない。フェロシアン化 物（[Ｆｅ(ＣＮ)₆]^4-）は、反応全体としての生成物である。理想的には、フェ ロシアン化物は最初存在しないが、実際には少量存在するのがしばしばである。 反応が完了した後、（電気化学的に測定される）フェロシアン化物の濃度は、初 期のグルコース濃度を示す。全体としての反応は、反応１および反応２の和であ る： 「グルコース」は、特にβ−Ｄ−グルコースである。 従来技術は、幾つかの問題点を有する。第１に、試料が望ましい量より多く必 要である。減少した体積について測定できることが一般的に望ましく、それによ り、試料を得るためにより侵略的でない方法を使用できる。 第２に、測定の精度を向上させ、また、例えばセルの非対称性またはマイクロ セルの大量生産の間にもたらされる他の要因による変動をなくすまたは減少させ ることが一般的に望ましい。 第３に、測定値を得るために必要である時間を減らすことが一般的に望ましい 。現在市販されている電気化学的グルコースセンサにおいて使用されている試験 手順は、酵素がグルコースと反応して電気化学的に検知される化学種が生成する 間、試験の開始時において、所定の待ち時間を含む。この初期の時間は、使用の 全条件の下、所望の反応を達成するために必要である最大時間に設定されている 。 第４に、酸素による変動をなくすことが望ましい。酸素は、血漿中に溶解して いるか、あるいはヘモグロビンに結合されて、血液中に多く存在し得る。また、 セルに供給される前に、小さい体積および大きい表面積の血液の滴が大気にさら される「フィンガー・スティッキング（指に刺す）」の間に、入ることも有り得 る。酸素は、ＧＯＤに対してメディエータであるので、酸素はじゃまをし得る。 この反応は次のようになる： グルコース＋ＧＯＤ→グルコン酸＋ＧＯＤ＊ 反応４ ＧＯＤ＊＋酸素＋水→ＧＯＤ＋過酸化水素 反応５ 全体としての反応は次のようになる： 大部分の状況において、メディエータとしても作用する酸素の共存は、最終の フェロシアン化物の濃度が初期のグルコース濃度に直接的に比例しないという理 由で、望ましくない。代わりに、初期グルコース濃度は、フェロシアン化物およ び過酸化水素の最終濃度の双方に相関される。 発明の目的 本発明の目的は、従来技術の問題点を回避するか、あるいは改善する、キャリ ヤ中における分析対象物の濃度を測定する、改善された方法を提供することであ る。向上した精度および／または信頼性および／またはスピードを有するバイオ センサを提供することが本発明の好ましい形態の目的である。 発明の開示 １つの要旨では、本発明は、作用電極およびそれから所定距離だけ離れた対電 極を有して成る種類の電気化学的セルにおいてレドックス化学種の還元（または 酸化）形態の濃度を測定する方法に存し、その方法は、次の工程を含んで成る： （ａ）反応生成物が対電極から作用電極に拡散により到達するように電極が離 れ、作用電極の電位は、レドックス化学種の還元形態（または酸化形態）の電気 的酸化（または電解酸化）の速度が拡散律速となるように、電極間に電位を加え る工程、 （ｂ）電位を加えた後で定常状態に到達する前に、時間の関数として電流を測 定する工程、 （ｃ）定常状態電流の大きさを推定する（または見積もる）工程、 （ｄ）電位を遮断または電位の極性を逆転させる工程、 （ｅ）工程（ｂ）および工程（ｃ）を繰り返す工程。 本発明は、初期定常状態電流に達した後に極性を逆転する（即ち、アノードが カソードになり、カソードがアノードになる）場合には、第２遷移電流が観測さ れ、ある時間経過後に第２定常状態に到達するとの知見に基づくものである。こ のことは、診断に、また、遷移電流に影響を与えるセルの非対称性および他の要 素の影響を減らすのに有用であることが判った。加えて、逆の極性を用いて測定 を繰り返すことにより、推定のより大きい信頼性および／または精度が達成され る。同様に、濃度プロフィールが緩和してランダム状態になるのに十分な時間電 位を遮断して、その後、再度加えると、工程（ｂ）および工程（ｃ）を繰り返す ことができる。 第２の要旨では、本発明は、本発明は、作用電極、対電極、酵素触媒およびレ ドックスメディエータを有するセルにより、試料中のグルコース濃度を測定する ための第１の要旨に基づく方法に存し、その方法は、レドックス反応より高い電 位にてセルを操作してアノードにおいて過酸過水素を酸化する工程および第１の 要旨に基づく方法を実施する工程を含んで成る。 これにより、後で詳細に説明するように、酸素による阻害を改善できる。 第３の要旨では、本発明は、試料を酵素触媒およびレドックスメディエータと 反応させる第１または第２の要旨に基づく方法に存し、その方法は、以下の工程 を含んで成る： （ａ）セルの充填の前またはその間に電極間に電位を加える工程； （ｂ）時間の関数として電流の増加を測定する工程； （ｃ）該触媒との反応が完了する時間を、工程（ｂ）の測定値から決定または 予想する工程； （ｄ）次に、電位を遮断または電位の極性を逆転させる工程。 図面の簡単な説明 添付図面を参照して例により本発明をより詳細に説明する。 図１は、本発明のセルにおいて生じる反応を例示する。 図２は、電位を加える前、電位を加えた後で定常状態に到達する前および定常 状態における、本発明の電気化学的セルにおける濃度プロフィールを例示する。 図３は、電位を加える前および電位を加えた後の電流の時間依存性を示す。 図４は、電位を逆転させる前、電位を逆転させた後で定常状態に到達する前お よび定常状態における、本発明の電気化学的セルにおけるフェロシアン化物の濃 度プロフィールを示す。 図５は、極性を逆転させる前および極性を逆転させた後の電流の時間依存性を 示す。 図６は、１５秒間の印加電位の遮断の前および後の電流の時間依存性を示す。 図７は、過酸過物の酸化を伴う、電気化学的セルにおける反応を示す。 図８は、過酸化水素を酸化するのに十分な初期電位が加えられた場合の電流の 時間依存性を示す。 図９は、図７のセルを平面図にて示す。 図１０は、図９の線１０−１０に沿った断面にて、本発明において使用するの に適当なセルの態様を示す。 図１１は、図７のセルを端部断面図にて示す。 図９、１０および１１を参照すると、本発明の方法において使用するのに適当 な電気化学的セルを例により示している(実寸ではない)。 セルは、約１８ｍｍ×５ｍｍで厚さが約１００ミクロンで、直径３．４ｍｍの 円形の開口部８を有するポリエステルコア４を有して成る。開口部８は円筒状の セル側壁１０を規定する。コア４の一方の側面にはパラジウムのスパッタリング 被覆２を有するポリエステルシート１が接着されている。スパッタリング被覆は 、４〜６ミリバールの圧力でアルゴンガス雰囲気にて実施して約１００〜１００ ０Åの厚さの均一な被覆を得たものである。このシートは接着剤３によりコア４ に接着され、パラジウム２がコア４に隣接して開口部８を覆っている。 パラジウムのスパッタリング被覆６を有する第２のポリエステルシート７がコ ア４の他方の側面に触圧接着剤５により接着されて開口部８を覆っている。それ によって、円筒状側壁１０を有し、パラジウム金属によってそれぞれの端部が閉 じられたセルが規定される。このアッセンブリは９の箇所にてノッチ（切り込み ）を有し、灯芯作用または毛管作用により溶液がセル内に入ることができ、また 、排出でき、更に、空気が流れ出ることができるようになっている。金属フィル ム２、６は適当な電気的接続部またはシステムと接続され、それにより、電位を 加えることができ、電流を測定できる。セルにはＧＯＤおよびフェロシアンン化 物が乾燥形態で配置される。このセルを図１に模式的に示している。 本発明の方法に基づいて使用する場合、血液の滴は毛管作用により９からセル 内に引き込まれ、また、反応できる。 発明の好ましい態様 反応が完了した後のフェロシアン化物の濃度を測定する電気化学的手段は、図 １を参照して考慮できる。 薄い層のセルにおいて、（「酵素」反応が完了した後）フェロシアン化物およ びフェリシアン化物の初期濃度は、セル全体で等しい(着目すべき軸は電極間の ものである)。フェロシアン化物の濃度プロフィールを図２に示す。 有る特定の電位をセルに加えた場合、カソードにおいてフェリシアン化物はフ ェロシアン化物に、また、アノードにおいてフェロシアン化物はフェリシアン化 物に転換される。この反応は、反応が完了した後で、フェロシアン化物に対して 過剰のフェリシアン化物が存在するように行う。この理由のため、完全な電気化 学的プロセスを制限する過程は、アノードにおけるフェロシアン化物のフェリシ アン化物への転換である。それは、フェロシアン化物が相当小さい濃度で存在す るからである。更に、フェロシアン化物の反応の速度を律する過程は、フェロシ アン化物のアノードへの拡散である。ある時間が経過した後、定常状態に到達し 、その場合、フェロシアン化物およびフェリシアン化物の濃度プロフィールは、 一定のままである（図２参照）。 従って、２つの制限的状態が存在する：最初、フェロシアン化物はセル全体に 等しく分布する(２０の状態)。セルに既知の電位を所定時間加えた後、フェロシ アン化物の定常状態プロフィールに達する(２３の状態)。初期の状態から最終の 定常状態２３に濃度が変化する場合、「遷移的」な状態は、セルを流れる電流を 反映する(２２の状態)。これは、図３に時間の関数として示している。この「遷 移的」な時間の間における時間による電流の変化は、フェロシアン化物の全濃度 およびフェロシアン化物の拡散係数に依存することが見出された。 この状態の拡散方程式を解くことにより、遷移的状態は、制限された計算可能 な時間範囲にわたって以下の式により適当に表現できることが判る： ｌｎ（ｉ／ｉ_ss−１）＝−４π²Ｄｔ／Ｌ²＋ｌｎ（２） 式１ 式中、ｉは測定される電流であり、ｉ_ssは定常状態における電流であり、Ｄはセ ルにおけるフェロシアン化物の拡散係数であり、Ｌはアノードとカソードとの間 の距離であり、ｔは時間である。 これは、一般的な拡散方程式の簡単な解である。しかしながら、他の解を使用 することも可能である。 定常状態における最終電流は、フェロシアン化物の全濃度およびフェロシアン 化物の拡散係数にも依存する。定常状態電流は、拡散理論によりモデル化するこ ともでき、次式により与えられる： ｉ_ss＝２ＤＦＣＡ／Ｌ 式２ 式中、Ｆはファラデー定数であり、Ｃはフェロシアン化物の初期濃度であり、Ａ は作用電極の面積である。初期濃度は、不安定でない濃度を意味する(図２の２ ０で示されるもの)。 遷移状態の間および定常状態において観察される電流の解析によりフェロシア ン化物の濃度および拡散係数の双方を算出でき、また、それにより初期グルコー ス濃度も算出できる。 この解析は、 ｌｎ（ｉ／ｉ_ss−１） 式３ を時間に対してプロットすることにより行うことができる。このプロットは、制 限された計算可能な時間範囲にわたり実質的に線形であり、従って、例えば線形 最小二乗法により解析できる。Ｌは所定のセルについて一定であるので、時間お よびｉ_ssの関数としてのｉの測定値によりレドックスメディエータの拡散係数の 値を計算することができ、従って、分析対象の濃度を決定できる。 データを解析するもう１つの可能な方法は、電位のステップを電極に加えたす ぐ後で、時間に対する電流の変動を使用する方法である。この時間範囲において 、電流はCottrellの式により適切に表される。即ち、 ｉ−ＦＡＤ^1/2Ｃ／（ｐｉ^1/2ｔ^1/2） 式４ ｉ対１／ｔ^1/2のプロットについての最小二乗法によって、ＦＡＤ^1/2Ｃ／ｐｉ^1/2 の値をこのプロットの勾配から算出できる。定常状態電流ｉ_ssは先のように 与えられ、従って、先に与えられたプロットの勾配を定常状態電流と組み合わせ ることにより、フェロシアン化物の濃度の値を、セルにおけるフェロシアン化物 の拡散係数に依存しないで、算出できる。これは、次式により与えられる： Ｃ＝２（勾配）²ｐｉ／（ＦＡＬｉ_ss） 式５ 本発明の実施例において、図７、８および９を参照して先に説明したような、 ＧＯＤ／フェロシアン化物系を含む薄層セルに血液の試料を入れる。反応のため の短い時間（２０）の経過後、図３に示すように、電極間に電位を加え、電位を 加えた時に電流の流れが生じ(２１)、その後、遷移状態となり(２２)、そして定 常状態となる(２３)。拡散係数および／またはグルコース濃度は、時間の関数と して電流を測定し、定常状態電流を見積もることにより得られる。 本発明では、電流を遮断するか、あるいは例えば適当なスイッチにより極性を 逆転させる。極性を逆転させる場合、第２遷移状態が観察され、追加の時間の経 過後に第２の定常状態に達するが、プロフィールは逆となる。セルにおけるフェ ロシアン化物濃度の基本的な変化を図４に模式的に示している。電流の逆転の前 の初期プロフィールは２３である。新たな定常状態の濃度プロフィールは２５に より示している。遷移的な濃度プロフィールは２４により示している。 この状態についての拡散方程式を解くことにより、遷移電流は次式により表さ れることが判る： ｌｎ（ｉ／ｉ_ss−１）＝−４π²Ｄｔ／Ｌ²＋ｌｎ（４） 式６ 従って、逆転極性条件下における拡散係数および濃度を再度見積もることは簡 単である。理論的には、結果は、遷移状態の種類または極性により影響されるも のではない。実際には、結果は、試料の不均一性、電極の状態、またはより重要 なことであるが、セル構造の非対称性のような遷移状態に影響を与える要因によ って変わる場合がある。従って、この方法は、セルの診断に有用であり、また、 測定を繰り返して、極性を逆転させた場合を用いて平均することによって精度を より良くすることができる。 同様に、定常状態に達した後に電位を遮断すると、初期濃度プロフィールが短 時間（例えば４秒）のうちに再形成される。 初期状態が一旦再形成される（ほぼ形成される）と、電位を再度印加してよく 、逆の電流を用いないで手順を繰り返す。図６は、時間に対する電流のプロット であり、これは、図３に類似するが、２６の位置において電位が遮断され、１５ 秒後、２７の位置において再度印加され、新たな遷移状態２８を示して、その後 、 定常状態２９となっている。 先に説明したように、血液中における酸素の存在は、最終のフェロシアン化物 の濃度が初期グルコース濃度に直接的に比例しないので、阻害要因となる。代わ りに、初期グルコース濃度がフェロシアン化物および過酸化水素の最終濃度に相 関する。しかしながら、本発明者らは、フェロシアン化物／フェリシアン化物レ ドックス反応の場合より大きい既知の電位で、過酸化水素をアノードにて酸化で きることを見出した。全体の電気化学的経路を図７に示している。過酸化水素の 反応は次のようになる： 過酸化水素→酸素＋２Ｈ⁺＋２ｅ” 式７ 酵素反応の間に、過酸化水素を酸化するのに十分な電位をセルに加えると、そ の間に以下のことが生じる： （ａ）グルコースが反応してグルコン酸になる。 （ｂ）フェロシアン化物および過酸化水素が生じる。 （ｃ）フェロシアン化物／フェリシアン化物レドックスが最終的に定常状態に なる。 （ｄ）アノードにて過酸化物が酸化されて電子がフェリシアン化物をフェロシ アン化物に転化するために使用される。 全体として、一定電位においてある時間（図８では約２．５秒）が経過した後 、全ての過酸化物は酸素に転化され(これが次に触媒となり、酵素反応を完了さ せてグルコースが消費される)、電子は、フェリシアン化物をフェロシアン化物 に転化するために使用される。 この段階（図８では６０秒の位置）にて、逆の遷移状態を適用する。即ち、セ ルの極性を切り替えるが、フェリシアン化物／フェロシアン化物レドックス反応 に適当であるより小さい電位とする。最終の定常状態のフェロシアン化物は、再 度初期グルコース濃度を反映する。これは、初期試料における全グルコース濃度 を決定する先に説明した方法で解析できる。 本発明の方法を用いて、測定フェーズを阻害することなく、試験の反応フェー ズをその場で電気化学的にモニタできる。反応が完了する時、遅れることなく、 測定に移ることができる。待ち時間は、試験によって変わり、セルによって変わ る酵素の活性の変化ならびに温度およびグルコース濃度の違いなどを考慮して、 いずれの試料およびセルに対しても必要である最小時間となる。これは、これら の要因を考慮して反応に必要な最長の時間まで測定を遅らせる従来技術とは全く 対照的である。 本発明の方法では、セルに試料を充填し始めるとすぐに、２つの電極の間で電 位（例えば−３００ｍＶ）を加えることにより、反応フェーズをモニタする。 還元メディエータの線形の濃度プロフィールがセルにわたってすぐに達成され る。グルコースとの酵素反応によってより多くのメディエータが生成すると、こ の線形の濃度プロフィールは、より急になり、電流が増加する。反応が完了する と、電流はもはや増加しない。この点を周知の電子的な方法により検知すること ができ、試験の測定フェーズを始めることができる。 また、反応の終点は、試験のこの部分の間において得られる電流対時間曲線に 理論的速度論式をフィッティングさせることにより見積もることができる。この 式は、いずれの時間にもおける反応の完了の程度を予測することができ、それに より、終点に達するまで待つことなく、いつ終点に達するのかを知ることができ る。これにより、試験時間が更に短縮される。例えば、測定した予めパルス状に した電流対時間曲線にある式をフィッテングさせることができる。この式は、時 間Ｘにおいて反応が例えば９０％完了するということを予想できる。時間Ｘにお いて濃度を測定する場合には、解を０．９０により割ることによって、真の濃度 を得ることができる。 この系における濃度の測定は、電位を逆転させることにより、即ち、電極間に ＋３００ｍＶの電位を加えることにより行う。電流対時間曲線が得られるが、こ れは、2回の遷移状態が存在する実験における第2の遷移状態のものと同じである 。即ち、測定フェーズの間に測定される電流ｉを変換することにより、ｌｎ（ｉ ／ｉ_ss−１）対時間のプロットを得ることができる。これは、−４ｐｉ²Ｄ／Ｌ² の勾配および切片ｌｎ（４）を有する。 ある状況において、電気化学的セルにおける電極間の距離を知ることが困難で あるか、不可能である場合がある。例えば、非常に小さな距離（約１０ミクロン ）は、再現性良く形成することおよび測定することは非常に困難である場合があ る。このような場合には、試料を加える前に、一方のセルが既知の濃度の分析対 象を含むまたは対応する還元されたメディエータを含む、２つの隣接するセルか らの情報を用いてセルの距離を知ることなく、試料における分析対象の濃度を算 出することができる。別法では、セルに試料を加える前に、既知の量の分析対象 または還元メディエータを２つのセルの一方に供給する試料に加えてよい。もう １つのバリエーションは、双方のセルが所定の分析対象または還元メディエータ 濃度を含むが、それぞれが異なる濃度を有する場合である。更にもう１つのバリ エーションは、２つの異なる所定量の分析対象または還元メディエータを試料の ２つのアリコートに加え、その後、これらを隣接するセルに加える場合である。 次に、２つの電気化学的セルを通常の方法で使用して、各セルから以下の量を 測定する：定常状態電流（ｉ_ss）およびｌｎ（ｉ／ｉ_ss−１）対時間により規定 される直線の勾配(ｉは測定電流である)。これらの値の知り、また、2つのセル 間の分析対象または還元メディエータの濃度差を知る（一方のセルに意図して加 えた値に等しい）ことにより、電極間の距離を知ることなく、試料中の分析対象 または還元メディエータの濃度を計算することができる。 上述のことは、化学物質の乾燥および適用により生成する還元メディエータ、 金属表面の触媒作用、金属表面の酸化、分析対象またはメディエータに影響を与 える試料成分、試料の電気化学的的に反応する成分等により生じる電流によるバ ックグラウンド電流または濃度を測定するために第3セルと組み合わせることが できる。このバックグラウンド電流または濃度を先に説明した２つのセルから測 定される値から差し引いて、試料中における分析対象から得られる各セルに対す る真の値を算出し、ある場合では、セルもしくは試料に意図して加えた分析対象 または還元メディエータおよび試料における分析対象から得られる各セルに対す る真の値を算出する。 本明細書の教示事項から当業者には明らかなように、この方法は自動測定装置 と共に使用するのが適当である。説明した種類のセルを、マイクロプロセッサー または他のプログラムされた電子制御および表示回路を有する装置に接続される 電気コネクターを設けてよい。そのような装置は、必要な測定を行い、必要な計 算を行い、また、結果を表示する。この方法は、血液以外の液体においてグルコ ース以外の分析対象の濃度を測定するために使用できる。 この方法は、他の設計および／または構造のセルを用いて、また、例示した以 外の既知の触媒およびレドックス系を用いて実施できる。

【手続補正書】 【提出日】１９９８年５月１９日（１９９８．５．１９） 【補正内容】 明細書中、次の箇所を補正します。 （１）第８頁下から第１１行、「決定できる」の後、改行して「これは、従来 技術において測定されるCottrell電流とは対照的である。センサの電極に電位を 加えた後に既知の時間にてCottrell電流を測定することによって、生成物濃度と 拡散係数の平方根との積を決定することが初めて可能になる。従って、Cottrell 電流だけからでは、拡散係数に依存せずにメディエータの濃度を求めることは不 可能である。」を挿入。 （２）第１１頁第７行、「モニタする。」の後に「好ましい様態では、セルの 充填を検知した時から電位を連続的に加えるが、それほど好ましくない態様では 、セルが充填され始めた後に短時間電位を遮断してもよい。」を挿入。 （３）第１１頁下から第２行、「を有する。」の後に「上述から当業者に明ら かなように、電流対時間曲線に理論的速度論式をフィッティングさせる代わりに 、電流対時間曲線の少なくとも一部分に実験的関係をフィッティングさせること により反応の終点を予想できる。この関係によって、反応が完了すると予想され る、より先の時間まで測定曲線を外挿することができる。そのようなアプローチ の例は、電流の逆数を時間の逆数に対してプロットした曲線を直線によりフィッ ティングする場合である。この直線は、反応が実質的に完了する時より長い時間 における電流を予想するために使用できる。試験の濃度測定フェーズに適当な予 想電流に対するより長い時間における予想電流の比を確認できる。この比は、測 定フェーズの間に得られる濃度の予想値を、反応が実質的に終点に達することに より生じる値に訂正するために使用できる。」と挿入。 （４）第１３頁第６行、「実施できる。」の後、改行して「例えば、表１に示 すような他の周知の従来技術の試薬システムを用いることができるが、それらに 限定されるものではない。」と挿入し、更にその後に別紙の表１を挿入。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ヨハンセン，オッドバール オーストラリア3170ビクトリア州マルグレ ーブ、ダーンリー・グローブ16番 (72)発明者 マックスウェル，イアン・アンドリュー オーストラリア2040ニュー・サウス・ウェ ールズ州ライチハルト、ホワイティング・ ストリート３番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．作用電極およびそれから所定距離離れた対電極を有して成る種類の電気化 学的セルにおいてレドックス化学種の還元（または酸化）形態の濃度を測定する 方法であって、次の工程： （ａ）反応生成物が対電極から作用電極に拡散により到達する程度に電極が離 れ、作用電極の電位は、レドックス化学種の還元形態（または酸化形態）の電気 的酸化の速度が拡散律速であるように、電極間に電位を加える工程、 （ｂ）電位を加えた後で定常状態に到達する前に、時間の関数として電流を測 定する工程、 （ｃ）定常状態電流の大きさを見積もる工程、 （ｄ）電位の遮断または電位の極性を逆転させる工程、 （ｅ）工程（ｂ）および工程（ｃ）を繰り返す工程 を含んで成る方法。 ２．工程（ｄ）において極性を逆転させる請求の範囲１記載の方法。 ３．電極は５００ミクロン以下の距離で離れている請求の範囲１または２記載 の方法。 ４．電極は２００ミクロン以下の距離で離れている請求の範囲１〜３のいずれ かに記載の方法。 ５．作用電極は、対電極が延在する面に対して平行であり、その面に面する面 において延在する請求の範囲１〜４のいずれかに記載の方法。 ６．電位を繰り返して逆転させ、各逆転の前に得られる結果からの平均として 化学種の濃度を見積もる請求の範囲１記載の方法。 ７．セルは、酵素およびレドックスメディエータを含む請求の範囲１〜６のい ずれかに記載の方法。 ８．セルは、ＧＯＤを含む請求の範囲１〜７のいずれかに記載の方法。 ９．セルは、フェリシアン化物を含む請求の範囲１〜８のいずれかに記載の方 法。 １０．試料を酵素触媒およびレドックスメディエータと反応させ、方法は、レ ドックス反応より大きい電位にてセルを操作してアノードにて過酸化水素を酸化 する前の工程を含んで成る請求の範囲１〜６のいずれかに記載の方法。 １１．試料を酵素触媒およびレドックスメディエータと反応させる以下の工程 ： （ａ）セルの充填の前またはその間に電極間に電位を加える工程； （ｂ）時間の関数として電流の増加を測定する工程； （ｃ）該触媒との反応が完了する時間を、工程（ｂ）の測定値から決定または 予想する工程； （ｄ）次に、電位を遮断または電位の極性を逆転させる工程 を更に含んで成る請求の範囲１〜１０のいずれかに記載の方法。 １２．既知の濃度の分析対象または還元メディエータを含む第２セルを更に有 して成り、第２セルを使用して第1セルのキャリブレーションをする請求の範囲 １〜１１のいずれかに記載の方法。 １３．既知の濃度の分析対象または還元メディエータを分析対象に加え、キャ リブレーションに使用する請求の範囲１〜１２のいずれかに記載の方法。