JP2000270872A - Ｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高いＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を
育種し、より安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造
法を提供する 【解決手段】 Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又
は低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ
型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生
成蓄積させ、該培地からＬ−グルタミン酸を採取するこ
とによって、Ｌ−グルタミン酸を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−グルタミン酸
生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸
の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品
等として重要なアミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタ
ミン酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバ
クテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法によ
り工業生産されている（アミノ酸発酵、学会出版センタ
ー、１９５〜２１５頁、１９８６年）。これらのコリネ
型細菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離
した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。

【０００３】また、組換えＤＮＡ技術により、Ｌ−グル
タミン酸生合成系酵素の遺伝子を増強することによっ
て、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術
が開示されている。例えば、特開昭63-214189号公報に
は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ
遺伝子、及びクエン酸シンターゼ遺伝子を増強すること
によって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術
が開示されている。

【０００４】一方、アミノ酸の生産量を増加させるため
に、アミノ酸の取り込み系を破壊する技術がＬ−スレオ
ニンで知られている（Okamoto, K. et al., Biosci. Bi
otech. Biochem., 61(11), 1877-1882 (1997)）。

【０００５】Ｌ−グルタミン酸においては、コリネバク
テリウム・グルタミカムのＬ−グルタミン酸の取り込み
系の遺伝子クラスター（gluABCDオペロン）の構造が知
られている（Kronemeyer, W. et al., J. Bacteriol.,
177(5), 1152-1158 (1995)）。また、Kronemeyerらは、
gluABCDオペロンによるＬ−グルタミン酸取り込み系を
欠失した株を作製し、同株を用いてＬ−グルタミン酸の
排出について研究しているが、コリネバクテリウム・グ
ルタミカムのＬ−グルタミン酸の排出はgluABCDには依
存せず、他の取り込み・排出機構に依存していると結論
付けている。さらに、gluABCD以外のＬ−グルタミン酸
の取り込み系が報告されている（Burkovski, A. et a
l., FEMS Microbiology Letters, 136, 169-173 (199
6)）。これらの報告は少なくともgluABCDオペロンによ
るＬ−グルタミン酸取り込み系を欠失させても、Ｌ−グ
ルタミン酸の培地中の蓄積量には影響しないことを示唆
している。したがって、gluABCDによるＬ−グルタミン
酸の取り込み系の破壊によりＬ−グルタミン酸の生産能
を向上させようとする試みはなされていなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｌ−
グルタミン酸の需要の一層の増大に応えるために、高い
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する菌株を育種し、より安
価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法を提供するこ
とにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、gluABCDオペ
ロンを欠失させたコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産
菌は、上記先行技術による示唆に反し、高いＬ−グルタ
ミン酸生産能を有することを見出し、本発明を完成する
に至った。

【０００８】すなわち本発明は、以下のとおりである。 （１）Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下
し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌
を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積
させ、該培地からＬ−グルタミン酸を採取することを特
徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。 （２）前記Ｌ−グルタミン酸の取り込み系がgluABCDオ
ペロンによりコードされるものである（１）の方法。 （３）前記コリネ型細菌はgluABCDオペロンの少なくと
も一つの発現産物を欠失したことを特徴とする（２）の
方法。 （４）前記コリネ型細菌は少なくともgluAを欠失してい
ることを特徴とする（３）の方法 （５）前記コリネ型細菌はgluA、gluB、gluC及びgluDの
すべてを欠失していることを特徴とする（４）の方法。

【０００９】本発明においてＬ−グルタミン酸生産能と
は、本発明に用いるコリネ型細菌を培地に培養したとき
に、該培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力をい
う。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸の取
り込み系が欠失又は低下し、かつＬ−グルタミン酸生産
能を有するコリネ型細菌である。本発明でいうコリネ型
細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デター
ミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に
定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽
性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であり、従来
ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバ
クテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Int.
J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネ
バクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細
菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。Ｌ−グルタミン
酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株として
は、例えば以下に示すものが挙げられる。

【００１１】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム

【００１２】具体的には、下記のような菌株を例示する
ことができる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１
５８０６ コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２
１５１１ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２
０、１３０３２、１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６
５ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３
４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９） コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
８ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０
６７ ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１
４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、Ａ
ＴＣＣ１３８６９、 ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１
４０６６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１ ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１ ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１
５３５４

【００１３】上記のようなコリネ型細菌のＬ−グルタミ
ン酸の取り込み系を欠失又は低下させることは、突然変
異処理又は遺伝子組換え技術を利用して、同取り込み系
をコードする遺伝子を変異又は破壊することによって行
うことができる。Ｌ−グルタミン酸の取り込み系の欠失
又は低下とは、同取り込み系が正常に機能しないことを
いい、同取り込み系を構成するタンパク質の少なくとも
一つの欠失又は活性の低下であってもよく、二又はそれ
以上のタンパク質の欠失又は活性の低下であってもよ
い。また、ここでタンパク質の欠失とは、タンパク質が
全く発現しないこと、及び正常に機能しないタンパク質
を発現することの両方を含む。

【００１４】Ｌ−グルタミン酸の取り込み系をコードす
る遺伝子の破壊は、相同組換えを利用した遺伝子置換に
よって行うことができる。同遺伝子の内部を欠失し、取
り込み系が正常に機能しないように改変した遺伝子（欠
失型遺伝子）を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換
し、欠失型遺伝子と染色体上の正常遺伝子との間で組換
えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を破壊す
ることができる。このような相同組換えによる遺伝子破
壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度
感受性複製開始点を含むプラスミドを用いる方法などが
あるが、温度感受性複製開始点を含むプラスミドを用い
る方法が好ましい。

【００１５】Ｌ−グルタミン酸の取り込み系をコードす
る遺伝子としては、gluABCDオペロン（Kronemeyer, W.
et al., J. Bacteriol., 177(5), 1152-1158 (1995)）
が知られている。また、gluABCDオペロンよる取り込み
系以外のＬ−グルタミン酸の取り込み系も知られている
（Burkovski, A. et al., FEMS Microbiology Letters,
136, 169-173 (1996)）。破壊するのはいずれの遺伝子
であってもよいが、gluABCDオペロンによる取り込み系
が好ましい。

【００１６】gluABCDオペロン又は同オペロン中の各構
造遺伝子は、同オペロンの塩基配列が知られているので
（GenBank/EMBL/DDBJ Accession X81191）、該塩基配列
に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより、
コリネ型細菌の染色体ＤＮＡから単離することができ
る。こうして得られる遺伝子断片から一定の領域を制限
酵素により切り出し、コード領域又はプロモーター等の
発現調節配列の少なくとも一部を欠失させることによっ
て、欠失型遺伝子を作製することができる。

【００１７】また、遺伝子の一部を欠失するように設計
したプライマーを用いてＰＣＲを行うことによっても、
欠失型遺伝子を取得することができる。例えば、配列表
の配列番号１及び２に示す塩基配列を有するプライマー
を用いると、５’端側の一部を欠失したgluD遺伝子を得
ることができる。また、配列番号３及び４に示す塩基配
列を有するプライマーを用いると、３’端側の一部を欠
失したgluA遺伝子を得ることができる。これらのプライ
マーを用いて取得される欠失型のgluA遺伝子又はgluD遺
伝子を用いて遺伝子置換を行うと、gluA遺伝子又はgluD
遺伝子を破壊することができる。また、これらの欠失型
gluA遺伝子及び欠失型gluD遺伝子を連結し、得られる融
合遺伝子を用いて遺伝子置換を行うと、gluA、gluB、gl
uC及びgluDのすべてを破壊することができる。さらに、
配列番号３及び５に示す塩基配列を有するプライマーを
用いて取得されるgluA遺伝子を含むプラスミドを鋳型と
して、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するプライ
マーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を閉環化すると、
内部を欠失し、５’端側領域と３’端側領域がインフレ
ームで連結したgluA遺伝子を含むプラスミドが得られ
る。同プラスミドを用いて遺伝子置換を行うと、gluA遺
伝子のみを破壊することができる。

【００１８】また、当業者によく知られた方法によっ
て、例示したプライマー以外のプライマーを設計するこ
とができ、そのようなプライマーを用いることによって
gluABCDオペロン中の任意の構造遺伝子を欠失させるこ
とができる。あるいは、gluABCDオペロンのプロモータ
ー等の発現調節配列を欠失させ、同遺伝子が発現しない
ようにすることによっても、取り込み系を欠失させるこ
とができる。

【００１９】以下に、gluABCD遺伝子クラスター（以
下、単に「gluABCD遺伝子」という。）の遺伝子置換に
ついて説明するが、同様にしてその任意の構造遺伝子又
は発現制御配列を欠失させることができる。欠失型gluA
BCD遺伝子を、宿主染色体上のgluABCD遺伝子と置換する
には以下のようにすればよい。すなわち、温度感受性複
製開始点と欠失型gluABCD遺伝子とクロラムフェニコー
ル、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等の薬剤に
耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを
調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換
し、温度感受性複製開始点が機能しない温度で形質転換
株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養するこ
とにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた
形質転換株が得られる。

【００２０】こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込ま
れた株は、染色体上にもともと存在するgluABCD遺伝子
配列との組換えを起こし、染色体gluABCD遺伝子と欠失
型gluABCD遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの
他の部分（ベクター部分、温度感受性複製開始点及び薬
剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されてい
る。したがって、この状態では正常なgluABCD遺伝子が
優性であるので、形質転換株はＬ−グルタミン酸取り込
み系を発現する。

【００２１】次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型gluABCD遺
伝子のみを残すために、２個のgluABCD遺伝子の組換え
により１コピーのgluABCD遺伝子を、ベクター部分（温
度感受性複製開始点及び薬剤耐性マーカーを含む）とと
もに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なgluA
BCD遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型gluABCD遺
伝子が切り出される場合と、反対に欠失型gluABCD遺伝
子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なgluABCD遺伝子が
切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性
複製開始点が機能する温度で培養すれば、切り出された
ＤＮＡはプラスミド上で細胞内に保持される。このプラ
スミド上のＤＮＡは、温度感受性複製開始点が機能しな
い温度で培養すると、細胞から脱落する。いずれの遺伝
子が染色体ＤＮＡ上に残されたかは、染色体上のgluABC
D遺伝子の構造をPCR又はハイブリダイゼーション等で調
べることによって、確認することができる。

【００２２】上記のようにして得られるgluABCD遺伝子
破壊株は、温度感受性複製開始点が機能する温度（例え
ば低温）で培養すればgluABCD遺伝子を細胞内に保持
し、温度感受性複製開始点が機能しない温度（例えば高
温）で培養すればgluABCD遺伝子を欠損する。

【００２３】コリネ型細菌細胞内で機能する温度感受性
複製開始点を有するプラスミドとしては、pHS4、pHSC
4、pHS22、pHSC22、pHS23、pHSC23（以上、特公平7-108
228号公報参照）等が挙げられる。これらの温度感受性
プラスミドはコリネ型細菌細胞中において、約10〜32℃
では自律増殖できるが、約34℃以上では自律増殖できな
い。

【００２４】尚、上記のようにして染色体上のgluABCD
遺伝子を破壊した後は、遺伝子破壊株にｒｅｃＡ^-を導
入しておくと、低温で培養中にプラスミド上のgluABCD
遺伝子が再び染色体へ組み込まれるのを防ぐことができ
る点で好ましい。

【００２５】本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グル
タミン酸の取り込み系が欠失又は低下していることに加
えて、Ｌ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素の活性が
増強されていてもよい。このようなＬ−グルタミン酸生
合成を触媒する酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンタ
ーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒ
ドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ピルビン酸カルボキ
シラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラー
ゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリ
ン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコー
スリン酸イソメラーゼ等がある。

【００２６】また、本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ
−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミ
ン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性
が低下あるいは欠損されていてもよい。このような酵素
としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソ
クエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラー
ゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ア
セト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げら
れる。

【００２７】さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する
コリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができ
る（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌とし
ては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ130
29株は、1994年9月2日付けで工業技術院生命工学工業技
術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、19
95年8月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管さ
れ、受託番号FERM BP-5189が付与されている。

【００２８】Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は
低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型
細菌を好適な培地で培養すれば、Ｌ−グルタミン酸が培
地に蓄積する。本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グ
ルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下しているので、
細胞から培地中に排出されたＬ−グルタミン酸が再び細
胞中に取り込まれるのを抑制することができ、その結
果、培地中におけるＬ−グルタミン酸の蓄積量が増加す
る。本発明の方法によれば、培地中のＬ−グルタミン酸
濃度が高くなったときの区間収率（培養中の一定の期間
中における糖の消費量に対するＬ−グルタミン酸の蓄積
量の増加量の比）の向上が期待できる。特に、発酵中に
培地中のＬ−グルタミン酸の濃度が高くなる高生産株を
用いる場合には、高い効果が得られる。

【００２９】本発明の微生物を用いてＬ−グルタミン酸
を製造するのに用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イ
オン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する
通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラク
トース、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、
廃糖蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールや
イノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、
クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができ
る。

【００３０】窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモ
ニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、
コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有
機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いること
ができる。

【００３１】無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ₁など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。

【００３２】培養は、振とう培養、通気撹拌培養等によ
る好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培
養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御
する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用するこ
とができる。

【００３３】発酵液からのＬ−グルタミン酸の採取は、
例えばイオン交換樹脂法、晶析法等によることができ
る。具体的には、Ｌ−グルタミン酸を陰イオン交換樹脂
により吸着、分離させるか、または中和晶析させればよ
い。

【００３４】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００３５】＜１＞gluABCD遺伝子破壊用プラスミドの
作製 コリネ型細菌のgluABCD遺伝子破壊株を、温度感受性プ
ラスミドを用いた相同組換え法により作製するために、
gluABCD遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。

【００３６】まず、欠失型gluABCD遺伝子を、5'端側を
欠失したgluD遺伝子をクローニングし、それに3'端側を
欠失したgluA遺伝子を連結することにより作製した。具
体的には、コリネ型細菌野生株であるブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色体ＤＮＡか
ら、gluD内に存在するBamHI部位からgluDの約270bp下流
までの約300bpの断片を、配列番号１及び２に示す塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPC
Rで増幅し、この増幅断片をBamHI及びXbaIで消化して得
られる断片を、BamHI及びXbaIで消化したpHSG299（宝酒
造(株)製）とT4DNAリガーゼ(宝酒造(株)製)を用いて結
合させ、プラスミドpHSGΔgluDを取得した。

【００３７】次にブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムATCC13869の染色体から、gluAの約180bp上流から
gluA内に存在するBamHI部位までの約300bpの断片を、配
列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドをプライマーとするPCRで増幅し、この増幅断片をE
coRI及びBamHIで消化して得られる断片を、EcoRI及びBa
mHIで消化したpHSGΔgluDとT4 DNAリガーゼを用いて結
合させ、プラスミドpHSGΔgluADを取得した。このプラ
スミドはgluB、gluCを欠失し、gluAとgluDの一部を連結
させた構造になっている。

【００３８】次に、pHSGΔgluADをコリネ型細菌で自律
複製可能にするために、コリネ型細菌内で自律複製可能
なプラスミド由来の温度感受性複製開始点を、pHSGΔgl
uAD上にただ一つ存在するHincII切断部位に導入した。
具体的には、以下のようにして行った。

【００３９】温度感受性複製開始点を含むプラスミドpH
SC4（特開平5-7491号公報参照）をBamHI及びKpnIで切断
し、得られたDNA断片の両末端をBlunting kit（宝酒造
(株)製）を用い平滑化し、KpnIリンカー（宝酒造(株)
製）を結合させた後セルフライゲーション（自己結合）
させて、pKCT4を得た。尚、pHSC4は、次のようにして得
られたプラスミドである。pHM1519（K. Miwa et al., A
gric. Biol. Chem., 48,2901-2903(1984)、特開昭58-77
895号公報）由来の複製開始点を持つプラスミドpAJ1844
（特開昭58-216199号公報参照）から複製開始点を含むD
NA断片を切り出し、エシェリヒア・コリ用プラスミドpH
SG298と連結し、シャトルベクターpHK4を得た。このpHK
4をヒドロキシルアミン処理し、温度感受性となるよう
に改変されたプラスミドをpHS4を得た。pHS4から温度感
受性複製開始点を切り出し、pHSG398に接続してpHSC4を
得た。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、
1990年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991
年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管さ
れ、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。

【００４０】上記のようにして得られたpKCT4は、pHSG3
99のKpnI部位に温度感受性となるように改変されたpHM1
519由来の複製開始点が挿入された構造を有する。pKCT4
をKpnIで消化して得られる温度感受性複製開始点を含む
断片を取得し、この断片を宝酒造（株）製Blunting kit
を用い平滑末端化した後、HincIlで切断したpHSGΔgluA
Dに連結し、pTΔADを取得した（図１）。

【００４１】＜２＞gluA遺伝子破壊用プラスミドの作製 gluA遺伝子が単独で破壊されたコリネ型細菌を作製する
ために、gluA遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。

【００４２】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムATCC13869の染色体DNAから、gluA遺伝子を含む約15O0
bpのDNA断片を、配列番号３及び５に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRで増幅
し、この増幅断片をEcoRIで消化した後、この増幅断片
をEcoRIで消化したpHSG299（宝酒造(株)製）とT4 DNAリ
ガーゼ（宝酒造(株)製）を用いて結合させ、プラスミド
pHSGgluAを取得した。

【００４３】次に、配列番号６及び７に示す塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、pHSGgluA
を鋳型とするPCRにより、gluA遺伝子の内部領域を除い
てgluA遺伝子の5'端領域及び3'端領域及びベクター部分
を増幅した。前記プライマーは、BglII認識配列を含む
ように設計した。増幅断片をBglIIで処理後、T4 DNAリ
ガーゼを用いてセルフライゲーションさせ、プラスミド
pHSGΔgluAを取得した。このプラスミドは、gluAのオー
プン・リーディング・フレーム約730bpのうち、内部の
約250bpを欠失し、5'端領域及び3'端領域をインフレー
ムで連結させた構造になっている。

【００４４】次に、pHSGΔgluAをコリネ型細菌で自律複
製可能にするために、コリネ型細菌内で自律複製可能な
プラスミド由来の温度感受性複製開始点をpHSGΔgluAに
ただ一つ存在するKpnI切断部位に導入した。具体的に
は、pKCT4をKpnIで消化して複製開始点を含むDNA断片を
取得し、得られた断片をpHSGΔgluAのKpnI部位に挿入
し、pTΔAを取得した（図２）。

【００４５】＜３＞gluABCD遺伝子破壊株及びgluA遺伝
子破壊株の作製 前記のようにして得られた遺伝子破壊用プラスミドpTΔ
AD及びpTΔAを、野生株であるブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムATCC13869株に、電気パルス法を用
いて導入し、ATCC13869/pTΔAD及びATCC13869/pTΔAを
得た。これらの形質転換株を用いて遺伝子破壊を行っ
た。

【００４６】具体的には、ATCC13869/pTΔAD及びATCC13
869/pTΔAをCM2B液体培地で25℃にて24時間振とう培養
した後、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2B培地上に撒
き、温度感受性複製開始点が機能しない温度である34℃
でコロニーを形成した株を、プラスミド組み込み株とし
て取得した。次に、これらの株から、34℃でカナマイシ
ンに対して感受性になった株をレプリカ法により取得し
た。これらの感受性株の染色体DNAを常法により取得
し、PCR及びシークエンスにより染色体上のgluABCD遺伝
子及びgluA遺伝子の構造を調べ、これらの遺伝子が欠失
型に置換されていることを確認し、それぞれΔAD株及び
ΔA株と命名した。ΔAD株及びΔA株は、各々プライベー
トナンバーAJ13587及びAJ13588と命名され、１９９９年
３月２３日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東一丁
目１番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７
３２７及びＦＥＲＭ Ｐ−１７３２８が付与されてい
る。

【００４７】＜４＞ΔAD株及びΔA株のＬ−グルタミン
酸生産能の評価 ATCC13869株、ΔAD株及びΔA株のＬ−グルタミン酸の生
産培養を以下のようにして行った。CM2Bプレート培地に
て培養することによってリフレッシュを行ったこれらの
菌株を、グルコース80g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄・7H₂O 0.4
g、(NH₄)₂SO₄ 30g、FeSO₄・7H₂O 0.01g、MnSO₄・7H₂O 0.0
1g、大豆加水分解液15ml、サイアミン塩酸塩 200μg、
ビオチン 3μg、及びCaCO₃ 50g を純水1L中に含む培地
（KOHを用いてpH8.0に調製）と、この培地にＬ−グルタ
ミン酸を50g/L添加した培地の２種類の培地において31.
5℃にて培養した。培養後に培地中のＬ−グルタミン酸
の蓄積量及び51倍希釈した培養液の620nmにおける吸光
度を測定した。Ｌ−グルタミン酸無添加培地の結果を表
１に、Ｌ−グルタミン酸を添加した培地の結果を表２に
示す。

【００４８】

【表１】 表１ ──────────────────────────── 菌株 0D₆₂₀ L-グルタミン酸(g/L) 収率(%) ──────────────────────────── ATCC13869 0.937 40.8 50.4 ΔAD 1.127 36.3 44.9 ΔA 0.766 44.3 54.8 ────────────────────────────

【００４９】

【表２】 表２ ──────────────────────────── 菌株 0D₆₂₀ L-グルタミン酸(g/L)^* 収率(%) ──────────────────────────── ATCC13869 0.845 29.5 43.9 ΔAD 0.927 30.0 44.6 ΔA 0.749 32.0 47.6 ──────────────────────────── ＊：培地に加えたＬ−グルタミン酸は含まない

【００５０】これらの結果から、高濃度のＬ−グルタミ
ン酸を含む培地では、ΔA株及びΔAD株のいずれもＬ−
グルタミン酸の蓄積量及び収率が向上していることがわ
かる。また、ΔA株は、Ｌ−グルタミン酸を添加しない
培地でも、Ｌ−グルタミン酸の収率が向上している。

【００５１】

【発明の効果】本発明により、従来よりも高収率でＬ−
グルタミン酸を生産することができる。

【００５２】

【配列表】 Sequence Listing <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> Ｌ−グルタミン酸の製造法 <130> P-6262 <141> 1999-03-25 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００５３】 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR gactggcagg atcctgatta taagg 25

【００５４】 <400> 2 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 2 cgcgtctaga ggcgcttgag caaatcgacc 30

【００５５】 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 3 aggtgaattc cggacaggat cggagactac 30

【００５６】 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 4 ttgacttgcc ggatccggat ggtcc 25

【００５７】 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 5 tcatgaattc ctcaccgttt tgaatgaggg 30

【００５８】 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 6 gatgagatct cgttccaaca ggctcatcgc 30

【００５９】 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 7 aagcagatct tcgtgtgttg ttcatggcgg 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 gluABCD遺伝子破壊用プラスミドpTΔADの構
築過程を示す図。

【図２】 gluA遺伝子破壊用プラスミドpTΔAの構築過
程を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 大瀧 博美 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA74 CA03 DA10 EA04 GA14 GA19 GA25 GA27 4B064 CA02 CA19 CC01 CC24 DA01 DA10 4B065 AA22X AA22Y AA24X AB01 AC14 AC15 BA02 BA03 BA25 BA30 BB02 BB03 BB15 BB20 BB27 BC01 BC03 CA17 CA41 CA43 CA44

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又
   は低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ
   型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生
   成蓄積させ、該培地からＬ−グルタミン酸を採取するこ
   とを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
2. 【請求項２】 前記Ｌ−グルタミン酸の取り込み系がgl
   uABCDオペロンによりコードされるものである請求項１
   記載の方法。
3. 【請求項３】 前記コリネ型細菌はgluABCDオペロンの
   少なくとも一つの発現産物を欠失したことを特徴とする
   請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 前記コリネ型細菌は少なくともgluAを欠
   失していることを特徴とする請求項３記載の方法
5. 【請求項５】 前記コリネ型細菌はgluA、gluB、gluC及
   びgluDのすべてを欠失していることを特徴とする請求項
   ３記載の方法。