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JP2000201692A - 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法 - Google Patents

発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法

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Publication number
JP2000201692A
JP2000201692A JP11007058A JP705899A JP2000201692A JP 2000201692 A JP2000201692 A JP 2000201692A JP 11007058 A JP11007058 A JP 11007058A JP 705899 A JP705899 A JP 705899A JP 2000201692 A JP2000201692 A JP 2000201692A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
glutamic acid
gene
pyruvate carboxylase
brevibacterium
corynebacterium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP11007058A
Other languages
English (en)
Inventor
Wataru Hibino
渉 日比野
Yasuhiko Yoshihara
康彦 吉原
Masakazu Sugimoto
雅一 杉本
Harufumi Miwa
治文 三輪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Priority to JP11007058A priority Critical patent/JP2000201692A/ja
Priority to BR0000041-8A priority patent/BR0000041A/pt
Publication of JP2000201692A publication Critical patent/JP2000201692A/ja
Priority to US10/307,320 priority patent/US6852516B2/en
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

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  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 効率のよいＬ−グルタミン酸の製造法を提供
する。 【解決手段】 細胞内のピルビン酸カルボキシラーゼを
コードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝
子の発現調節配列の機能が強化されることにより、細胞
中のピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強され、かつ
Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を培地に
培養し、該培養物中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せし
め、該培養物からＬ−グルタミン酸を採取する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、
食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブ
レビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン
酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製
造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９
５〜２１５頁、１９８６年）。
【０００３】近年は、遺伝子組換え技術を利用して、コ
リネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌を育種する技術が開示さ
れている。例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子の破壊等により同酵素活性が欠損したコリネ型
Ｌ−グルタミン酸生産菌が、過剰量のビオチンを含有す
る培地に培養する際、界面活性剤やペニシリンのような
ビオチン作用抑制物質を培地に添加することなく著量の
Ｌ−グルタミン酸を生成蓄積することが開示されている
（WO 95/34672号）。
【０００４】Ｌ−グルタミン酸の生合成は、好気的条件
下では、グルコース等の糖から解糖系を経て、同経路で
生成するピルビン酸からアセチル−ＣｏＡを経由してト
リカルボン酸サイクルに入り、トリカルボン酸サイクル
の中間体であるα−ケトグルタル酸から分岐し、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼあるいはグルタミンシンセター
ゼ／グルタミン酸シンターゼによる反応によって生合成
される。このような知見から、グルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸
ヒドラターゼ及びクエン酸シンターゼをコードする遺伝
子を含む組換え体ＤＮＡを保有するコリネ型グルタミン
酸生産菌を用いるＬ−グルタミン酸の製造法が開示され
ている（特開昭６３−２１４１８９号）。
【０００５】上記のような微生物の育種や製造法の改良
により、Ｌ−グルタミン酸の生産性は高まってはいる
が、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに
微生物のＬ−グルタミン酸の生産性を高める技術の開発
が求められている。
【０００６】一方、コリネバクテリウム・グルタミカム
のピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（py
c遺伝子）はすでにクローニングされ、同遺伝子を発現
しピルビン酸カルボキシラーゼ活性が高められたコリネ
バクテリウム・グルタミカム、あるいは同遺伝子が不活
性化されたコリネバクテリウム・グルタミカムが知られ
ている（Peters-Wendisch, P. G. et al., Microbiolog
y, 144, 915-927 (1998)）。しかし、これらの微生物
は、グルコースでの生育に必要な酵素に関する研究材料
として創製されたものであり、ピルビン酸カルボキシラ
ーゼ活性とＬ−グルタミン酸生産性との関係については
知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、効率のよいＬ−グルタミン酸の
製造法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、前述のＬ−グル
タミン酸の生合成経路から分岐するアナプレロティック
経路の反応を触媒する酵素であるピルビン酸カルボキシ
ラーゼの活性を増強することにより、コリネ型細菌のＬ
−グルタミン酸生産能を向上させることができることを
見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち本発明は、細胞中のピルビン酸カ
ルボキシラーゼ活性が増強され、かつＬ−グルタミン酸
生産能を有するコリネ型細菌を培地に培養し、該培養物
中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、該培養物から
Ｌ−グルタミン酸を採取することを特徴とするＬ−グル
タミン酸の製造法である。
【００１０】本発明はまた、前記方法において、ピルビ
ン酸カルボキシラーゼ活性が、前記細菌細胞内のピルビ
ン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のコピー数を
高めること、又は同遺伝子の発現調節配列の機能が強化
されることにより増強されたことを特徴とする方法を提
供する。
【００１１】本発明はさらに、前記方法において、前記
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子がコリ
ネ型細菌由来であることを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法においては、細胞中のピルビン酸カルボキ
シラーゼ活性が増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能
を有するコリネ型細菌が用いられる。本発明にいうコリ
ネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されてい
たが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み
（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)）、また
コリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウ
ム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以
下のものが挙げられる。
【００１３】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００１４】具体的には、下記のような菌株を例示する
ことができる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１
５８０６ コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２
１５１１ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２
０、１３０３２、１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６
５ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３
４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９） コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
８ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０
６７ ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１
４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、Ａ
ＴＣＣ１３８６９、 ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１
４０６６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１ ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１ ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１
５３５４
【００１５】コリネ型細菌細胞中のピルビン酸カルボキ
シラーゼ活性を増強するには、ピルビン酸カルボキシラ
ーゼをコードする遺伝子断片を、コリネ型細菌で機能す
るベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結
して組換えＤＮＡを作製し、これをＬ−グルタミン酸生
産能を有するコリネ型細菌宿主に導入して形質転換すれ
ばよい。形質転換株の細胞内のピルビン酸カルボキシラ
ーゼをコードする遺伝子（以下、「pyc遺伝子」と略す
る）のコピー数が上昇する結果、ピルビン酸カルボキシ
ラーゼ活性が増強される。
【００１６】pyc遺伝子は、コリネ型細菌の遺伝子を用
いることも、エシェリヒア・コリ等の他の生物由来の遺
伝子を用いることも可能である。コリネ型細菌のpyc遺
伝子の塩基配列は報告されている（Peters-Wendisch,
P. G. et al., Microbiology,144, 915-927 (1998)）こ
とから、その塩基配列に基づいてプライマーを合成し、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等の微生物
の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（polymerase cha
in reaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 5,
185 (1989)参照）により、pyc遺伝子を取得することが
可能である。このようなプライマーとして、配列表配列
番号１、２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げら
れる。
【００１７】pyc遺伝子のクローニングに使用されるプ
ラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物におい
て複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、
pTWV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。
【００１８】コリネ型細菌で機能するベクターとは、例
えばコリネ型細菌で自律複製出来るプラスミドである。
具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。 ｐＡＭ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照 ｐＨＭ１５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照 ｐＡＪ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照 ｐＡＪ６１１ 同 上 ｐＡＪ１８４４ 同 上 ｐＣＧ１ 特開昭５７−１３４５００号公報参照 ｐＣＧ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照 ｐＣＧ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照 ｐＣＧ１１ 同 上 ｐＨＫ４ 特開平５−７４９１号公報参照
【００１９】ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする
pyc遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結し
て組換えＤＮＡを調製するには、pyc遺伝子の末端に合
うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であ
る。
【００２０】上記のように調製した組換えＤＮＡをコリ
ネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形
質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・
コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1
970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告され
ているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを
調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,
G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。
あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母に
ついて知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組
換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフ
ェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌
に導入する方法（ Chang,S.andChoen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Ho
pwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hick
s,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75
1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例で用いた
形質転換の方法は、電気パルス法（特開平2-207791号公
報参照）である。
【００２１】ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強
は、pyc遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー
存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌の
染色体ＤＮＡ上にpyc遺伝子を多コピーで導入するに
は、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利
用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピ
ー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因
子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用
できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開
示されているように、pyc遺伝子をトランスポゾンに搭
載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入
することも可能である。いずれの方法によっても形質転
換株内のpyc遺伝子のコピー数が上昇する結果、ピルビ
ン酸カルボキシラーゼ活性が増強される。
【００２２】ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強
は、上記の遺伝子増幅による以外に、pyc遺伝子のプロ
モーター等の発現調節配列を強力なものに置換すること
によっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。
たとえば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプ
ロモーター、tacプロモーター、ラムダファージのPRプ
ロモーター、PLプロモーター等が強力なプロモーターと
して知られている。これらのプロモーターへの置換によ
り、pyc遺伝子の発現が強化されることによってピルビ
ン酸カルボキシラーゼ活性が増強される。発現調節配列
の増強は、pyc遺伝子のコピー数を高めることと組み合
わせてもよい。
【００２３】本発明に用いるコリネ型細菌は、ピルビン
酸カルボキシラーゼの増強による効果を損なわない限
り、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性に加えて、他のＬ
−グルタミン酸生合成を触媒する酵素の活性が増強され
ていてもよい。このようなＬ−グルタミン酸生合成を触
媒する酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
グルタミンシンターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソ
クエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラター
ゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムター
ゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソ
メラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が
ある。
【００２４】また、本発明に用いるコリネ型細菌は、ピ
ルビン酸カルボキシラーゼの増強による効果を損なわな
い限り、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ
−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する
酵素の活性が低下あるいは欠損させてもよい。このよう
な酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナー
ゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフ
ェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンター
ゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェ
ラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙
げられる。
【００２５】さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する
コリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができ
る（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌とし
ては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ130
29株は、1994年９月２日付けで通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14501として
寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づ
く国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与さ
れている。
【００２６】染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブ
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採
用することができる。これらの方法は、Sambrook, J.,F
ritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されてい
る。
【００２７】上記のようにして細胞内のピルビン酸カル
ボキシラーゼ活性が増強されたコリネ型細菌を培地に培
養し、該培養物中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せし
め、該培養物からＬ−グルタミン酸を採取することによ
り、Ｌ−グルタミン酸を効率よく製造することができ
る。
【００２８】培養に用いる培地は特に制限されず、炭素
源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微
量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。
【００２９】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースや澱粉加水分解物など
の糖類、エタノールやイノシトールなどのアルコール
類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類を用いることができる。尚、炭素源として、上記糖
類、好ましくはグルコースとともにエタノールを併用す
ると、Ｌ−グルタミン酸生産量が向上する。炭素源中に
占めるエタノールの量としては、好ましくは５％以上、
より好ましくは１０〜７５％、特に好ましくは２０〜３
０％である。
【００３０】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
【００３１】無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。
【００３２】培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施
するのがよく、培養温度は２０℃〜４５℃に、培養中ｐ
Ｈは５〜８．５に制御する。尚、ｐＨ調整には無機ある
いは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニ
アガス等を使用することができる。
【００３３】培養物からのＬ−グルタミン酸の採取は通
常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み
合わせることにより実施できる。
【００３４】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
【実施例１】＜１＞ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が
増強されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
の創製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
のpyc遺伝子をPCR法（Polymerase Chain Reaction; Whi
te,T.J. et al., Trends Genet. (1990) 224, 317-324
参照）により増幅した。公知のコリネバクテリウム・グ
ルタミカム由来pyc遺伝子の塩基配列（Peters-Wendisc
h, P. G. et al., Microbiology, 144, 915-927 (199
8)）に基づいて配列番号１及び２に示す塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドのプライマーを合成し、ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869染色体DNA
を鋳型とし、PCRを行った。PCRは、宝酒造（株）製ＤＮ
ＡサーマルサイクラーMP型を用い、ExTaqＤＮＡポリメ
ラーゼ（宝酒造（株）製）を用いて、94℃×30秒、55℃
×1秒、72℃×2.5分を25サイクルの条件で行った。
【００３５】次に、PCRで増幅した遺伝子断片（3622b
p）をアガロース電気泳動の後、ゲルから切り出し常法
により精製し、stratagene社のpCR-Script Ampキットを
使用して供給者に指定された方法にて、プラスミドpPCR
-Script SK(+)のSrfI部位に挿入し、得られた組換えプ
ラスミドでキットに付属している宿主を形質転換し、プ
ラスミドpPYC6を得た（図１）。
【００３６】クローニングされた配列が目的の遺伝子で
あることを、サンガー等の方法（F.Sanger et al ;Pro
c.Natl.Acad.Sci.74,5463(1977)などがある）によりＤ
ＮＡ塩基配列を調べることによって確認した。
【００３７】上記のようにして得られたpyc遺伝子をコ
リネ型細菌に導入するためのベクターには、新規に構築
したコリネ型細菌用クローニングベクターpVC7を用い
た。pVC7は、以下のようにして、エシェリヒア・コリ用
ベクターであるpHSG399（クロラムフェニコール耐性;Ta
keshita, S. et al., Gene, 61,63-74 (1987)参照）に
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプテ
ィックプラスミドであるpAM330を結合することによって
構築した（図１）。pAM330はブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムATCC13869より調製した。pHSG399を一
箇所切断酵素であるBsaAI（ニューイングランドバイオ
ラボズ社製）にて切断したのち、HindIII（宝酒造
（株）製）にて切断しＴ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑
末端化したpAM330と接続した。pHSG399に対するpAM330
の挿入方向により、生成した２種類のプラスミドをpVC
6、pVC7と命名した。２種類のプラスミドをHaeII（宝酒
造（株）製）で切断したとき、1.7kbと5.0kbの断片を生
じる方がpVC6であり、2.8kbと3.9KBの断片を生じる方が
pVC7である。pVC6、pVC7はエッシェリヒア・コリ及びブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞内で自
己複製可能であり、かつ、pHSG399由来のマルチクロー
ニングサイトとlacZ'を保持している。
【００３８】pyc遺伝子が組み込まれたプラスミドpPYC6
をKpnI（宝酒造（株）製）とNspI（宝酒造（株）製）で
消化してpyc遺伝子断片を切り出し、平滑化を行った。
平滑化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を使用し
た。平滑化されたＤＮＡ断片をpVC7のSmaI部位へ導入
し、pBPYC6を構築した（図１）。その後、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869をpBPYC6で形
質転換した。また、コントロールとして、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869をpVC7で形質
転換した。形質転換は、電気パルス法（特開平２−２０
７７９１号公報参照）により行った。
【００３９】＜２＞Ｌ−グルタミン酸生産性の評価 得られたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAT
CC13869/pBPYC6とブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムATCC13869/pVC7について、Ｌ−グルタミン酸の生
産性を調べた。使用した培地の組成は、グルコース 1.5
g/dl、リン酸２水素１カリウム 0.1g/dl、硫酸マグネシ
ウム７水和物 0.1g/dl、硫酸鉄７水和物0.001g/dl、硫
酸マンガン４〜５水和物 0.001g/dl、ビオチン 300μg/
l、大豆加水分解物 48mg/dl(総窒素として）、硫酸アン
モニウム 2.0g/dl、消泡剤（GD-113）0.01ml/dl、エタ
ノール 0.3g/dl、ポリオキシエチレンソルビタンモノパ
ルミテート 0.2g/dl、炭酸カルシウム 5.0g/dl、クロラ
ムフェニコール 5μg/mlであった。培養は坂口フラスコ
を用いて行った。
【００４０】前培養は、上記の培地のうちポリオキシエ
チレンソルビタンモノパルミテートを除いた培地で、3
1.5℃、７時間行った。また、主培養は、31.5℃で１６
時間行った。培養評価の結果を表１に示す。尚、初発培
地のアミノ酸組成は豆濃含有量から算出した。
【００４１】pyc遺伝子を増幅した菌株では、コントロ
ールと比較してグルタミン酸の蓄積が3.8%向上し、対糖
収率も2.1%向上した。
【００４２】
【表１】 表１ ──────────────────────────────── ク゛ルタミン酸 収率 アスハ゜ラキ゛ン酸 アラニン 培養液 [mg/dl] [%] [mg/dl] [mg/dl] ──────────────────────────────── 初発培地 60 − 36.0 18.5 ──────────────────────────────── ATCC13869/pVC7 1012 52.9 5.16 4.68 ──────────────────────────────── ATCC13869/pBPYC6 1050 55.0 10.31 4.19 ────────────────────────────────
【００４３】
【実施例２】グルコースとエタノールの量を表２に示す
比率（合計2g/dl）で加えた以外は実施例１＜２＞と同
様にしてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAT
CC13869/pBPYC6とブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムATCC13869/pVC7を培養した。培養後、培地中に蓄
積したＬ−グルタミン酸の量を測定した。結果を表２に
示す。
【表２】 表２ Ｌ−グルタミン酸収率 ───────────────────────────── 炭素源に占めるエタノールの比率 培養液 ─────────────────── 5% 10% 25% 75% 100% ───────────────────────────── ATCC13869/pVC7 51.8% 54.3% 55.5% 48.0% 45.1% ───────────────────────────── ATCC13869/pBPYC6 52.0% 59.3% 72.5% 59.3% 54.1% ─────────────────────────────
【００４４】
【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌を用いた効
率のよいＬ−グルタミン酸の製造法が提供される。ま
た、本発明は、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌
の育種に利用することができる。
【００４５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> Ｌ−グルタミン酸の製造法（Method for producing L-glutamic acid） <130> P-6030 <141> 1998-01-13 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００４６】 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 tggggcgggg ttagatcctg gggg 24
【００４７】 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 ctttttacag aaaggtttag gaaa 24
【図面の簡単な説明】
【図１】 コリネ型細菌用クローニングベクターpVC7、
及び同プラスミドにピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
（pyc）が組み込まれたプラスミドpPYC6の構築を示す
図。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１月１１日（２０００．１．１
１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】本発明はさらに、前記方法において、前記
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子がコリ
ネ型細菌由来であることを特徴とする方法を提供する。
本発明はまた、前記方法において、前記培地は炭素源と
して糖類及びエタノールを含むことを特徴とする方法を
提供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４３】
【実施例２】グルコースとエタノールの量を表２に示す
比率（合計2g/dl）で加えた以外は実施例１＜２＞と同
様にしてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAT
CC13869/pBPYC6とブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムATCC13869/pVC7を培養した。培養後、培地中に蓄
積したＬ−グルタミン酸の量を測定した。結果を表２に
示す。エタノールを炭素源として用いることにより、Ｌ
−グルタミン酸の蓄積が増加した。細胞中のピルビン酸
カルボキシラーゼ活性を増強させることによるＬ−グル
タミン酸生産への効果は、炭素源中のエタノールの比率
が５％以上、好ましくは１０から７５％、より好ましく
は２０から３０％のときに大きくなる。
【表２】 表２ Ｌ−グルタミン酸収率 ───────────────────────────── 炭素源に占めるエタノールの比率 培養液 ─────────────────── 5% 10% 25% 75% 100% ───────────────────────────── ATCC13869/pVC7 51.8% 54.3% 55.5% 48.0% 45.1% ───────────────────────────── ATCC13869/pBPYC6 52.0% 59.3% 72.5% 59.3% 54.1% ─────────────────────────────
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 コリネ型細菌用クローニングベクターpVC7、
及び同プラスミドにピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
（pyc）が組み込まれたプラスミドpBPYC6の構築を示す
図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 杉本 雅一 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 三輪 治文 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 AA07 BA07 CA04 DA10 EA04 FA13 HA20 4B064 AE19 CA02 CA19 CA21 CC03 CC24 CD06 CD09 DA01 DA10 DA11 4B065 AA22X AB01 AC14 AC20 BA02 CA17 CA41 CA44 CA47

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞中のピルビン酸カルボキシラーゼ活
    性が増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコ
    リネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−グルタミ
    ン酸を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−グルタミン酸
    を採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造
    法。
  2. 【請求項２】 前記ピルビン酸カルボキシラーゼ活性
    が、前記細菌細胞内のピルビン酸カルボキシラーゼをコ
    ードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子
    の発現調節配列の機能が強化されることにより増強され
    たことを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ピルビン酸カルボキシラーゼをコー
    ドする遺伝子がコリネ型細菌由来である請求項２記載の
    方法。
  4. 【請求項４】 前記培地は炭素源として糖類及びエタノ
    ールを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
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