JP2000191700A - 持続型消化管運動ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ポリアルキレングリコール類が消化管運動活
性を有するペプチドに結合した化合物、および該ポリア
ルキレングリコール誘導体を提供する。さらに、ポリア
ルキレングリコール類で結合したモチリン誘導体を含む
消化管蠕動促進剤、消化管蠕動障害治療剤を提供する。 【解決手段】 少なくとも１個のポリアルキレングリコ
ール類が消化管運動活性を有するペプチドに直接もしく
はスペーサーを介して結合した化合物またはその薬理学
的に許容される塩を提供すること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリアルキレング
リコール類が消化管運動活性を有するペプチドに結合し
た化合物、および該ポリアルキレングリコール類に関す
る。さらに、ポリアルキレングリコール類が結合したモ
チリン誘導体を含む消化管蠕動促進剤、消化管蠕動障害
治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】消化管運動刺激活性を有するペプチド
は、消化管運動活性の基礎レベルが低下することを特徴
とする病状の治療に有効である。中でも、モチリンは哺
乳類の血中に存在する生理活性ペプチドで、腸管蠕動を
活発にする作用を持つことが知られている。開腹手術を
受けた患者の血中モチリン濃度は低下するが、術後の血
中モチリン濃度の正常値への復帰は患者の腸管の蠕動運
動の回復と相関関係があり、術後にモチリンを投与する
と腸管の蠕動運動が活発化することが知られている［W.
Y. Cheyら、クリニックス イン ガストロエンテロロ
ジイ(Clinics in Gastroenterology)、3巻、645頁、198
0年］。

【０００３】また、モチリンのN末から13番目のアミノ
酸残基であるメチオニンをロイシンに変換したペプチド
（［Leu¹³］モチリン）がモチリンと同等以上の活性を
有し、該ペプチドを用いることにより酸化による活性の
低下を克服できることが知られている（特開平6-9075
9）。しかし、天然のモチリンおよび［Leu¹³］モチリン
は分子量が3000以下と小さく、血中における半減期が極
めて短く、これを血中に投与した場合には腎臓における
糸球体より速やかに体外へ排泄されてしまう。モチリン
類の1回の投与では腸管の蠕動運動を持続させることが
困難である。従って、少ない回数の投与によって腸管の
蠕動運動を持続させるような物質が望まれている。

【０００４】一方、これらの問題を回避する技術の一つ
として、1分子以上の不活性型ポリマー鎖を問題となる
ペプチドや蛋白質に化学的に結合させることが知られて
いる。多くの場合、ポリエチレングリコールなどのポリ
アルキレングリコール類を蛋白質やペプチドに化学的に
結合させることによって、該ペプチドや蛋白質に望まし
い特性が付与された例が示されている。例えば、ポリエ
チレングリコールで修飾されたスーパーオキシドジスム
ターゼ（SOD）では血中の半減期が著しく延長されてい
る［A. Confortiら、ファーマシューティカル リサー
チ コミュニケーション（Pharm. Research Commu
n.）、19巻、287頁、1987年］。また、G−CSF（顆粒球
コロニー刺激因子）のポリエチレングリコール修飾も知
られている［M.Yamazakiら、ジャーナル オブ バイオ
ケミストリー(J. Biochem.)、115巻、814頁、1994
年］。しかし、ペプチドや蛋白質中のアミノ酸残基にラ
ンダムに化学修飾を行なった場合には該生理活性物質の
活性が著しく損なわれてしまう場合も多い［D. K. Pett
itら、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミス
トリー（J. Biol. Chem.）、272巻、2312頁、1997
年］。そこで、ペプチドや蛋白質中の特定のアミノ酸残
基に特異的にポリエチレングリコールを結合し、該ペプ
チドまたは蛋白質の生物活性を損なわずに血中安定性を
向上させた例も知られている。ペプチド中のアミノ酸残
基特異的なポリエチレングリコール修飾の例として成長
ホルモン放出因子（Growth Hormone-releasing Facto
r）のカルボキシ末端にノルロイシンのスペーサーを介
してポリエチレングリコールを結合した例が知られてお
り［R. M. Campbellら、ジャーナル オブ ペプチド
リサーチ（J. Peptide Res.）、49巻、527頁、1997
年］、カルボキシ末端にポリエチレングリコールを結合
することで高活性かつ持続性を有する成長ホルモン放出
因子が得られることが示されている。同様の位置特異的
なポリエチレングリコール修飾でサイトカイン等の蛋白
質を修飾した例も知られている。インターロイキン−２
のN末から３番目の残基に遺伝子組換えによってシステ
インを導入し、この部位に特異的にポリエチレングリコ
ールを結合し、血中からの消失速度を著しく減少させた
例が知られている［Robert J. Goodsonら、バイオテク
ノロジー（Bio / Technology）、8巻、343頁、1990
年］。

【０００５】一方、ペプチドや蛋白質とポリアルキレン
グリコール類との結合方法に関しても例が示されている
［Samuel Zalipsky、バイオコンジュゲート ケミスト
リー（Bioconjugate Chem.）、6巻、150頁、1995年］。
しかし、前記腸管蠕動活性を有するペプチドのポリアル
キレングリコール類による修飾および修飾された該ペプ
チドが生理活性を有することは知られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は消化管
蠕動促進活性、消化管蠕動障害治療活性等の消化管運動
活性を有するペプチドにポリアルキレングリコール類を
結合することによって、持続性に優れた消化管運動活性
ペプチドを提供することである。また、持続型消化管運
動活性ペプチドを得るための製造方法、および修飾試薬
を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、少なくとも1
個のポリアルキレングリコール類が消化管運動活性を有
するペプチドに直接もしくはスペーサーを介して結合し
た化合物またはその薬理学的に許容される塩、該化合物
の製造方法、該化合物の有効量および必要に応じて担体
を含有する消化管蠕動促進剤または消化管蠕動障害治療
剤、並びに該消化管蠕動促進剤または該消化管蠕動障害
治療剤を製造するための該化合物の使用に関する。ま
た、本発明は、新規ポリアルキレングリコール類に関す
る。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳しく説明す
る。なお、以下の式（Ｉ）で表される化合物を化合物
（Ｉ）と称する。また、他の式番号の化合物についても
同様とする。本発明の消化管運動活性を有するペプチド
としては天然型モチリン、［Leu¹³］モチリン、［Va
l¹³］モチリン等のアミノ酸置換型モチリン（特開平6-9
0759、特開平2-57192）、モチリン誘導体等があげられ
る。なお、本発明で用いるペプチドの消化管運動活性と
しては、消化管蠕動運動促進、消化管蠕動障害治療等が
あげられる。

【０００９】ポリアルキレングリコール類としては、式
（Ｉ） R¹−M¹ _n−X¹−R² （Ｉ） ［式中、R¹はアルキル基またはアルカノイル基を表し、
M¹は−(OCH₂CH₂)_r−(OCH ₂CH₂CH₂)_s−（式中、rおよびs
は同一または異なって0以上の任意の整数を表す。ただ
し、rおよびsは同時には0を表さない）を表し、nは1以
上の任意の整数を表し、X¹は単結合または(CH₂)_t（式
中、tは1〜5の整数を表す）を表し、R²は消化管運動活
性を有するペプチド分子またはスペーサー中のカルボキ
シ末端あるいはリジン、システイン、アルギニン、ヒス
チジン、セリンまたはスレオニン残基のいずれかと結合
する反応性を有する基を表す］、式（II）

【００１０】

【化３】

【００１１】［式中、R³はアルキル基またはアルカノイ
ル基を表し、M²は−(OCH₂CH₂)_r−(OCH ₂CH₂CH₂)_s−（式
中、rおよびsは同一または異なって0以上の任意の整数
を表す。ただし、rおよびsは同時には0を表さない）を
表し、n'は1以上の任意の整数を表し、X²は単結合また
は(CH₂)_t（式中、tは1〜5の整数を表す）を表し、R⁴は
消化管運動活性を有するペプチド分子またはスペーサー
中のカルボキシ末端あるいはリジン、システイン、アル
ギニン、ヒスチジン、セリンまたはスレオニン残基のい
ずれかと結合する反応性を有する基を表す］等で表され
る化合物があげられ、好ましくは、式（IIa）

【００１２】

【化４】

【００１３】［式中、R³はアルキル基またはアルカノイ
ル基を表し、R^4aはマレイミド基またはアミノ基を表
し、M²は−(OCH₂CH₂)_r−(OCH₂CH₂CH₂)_s−（式中、rおよ
びsは同一または異なって0以上の任意の整数を表す。た
だし、rおよびsは同時には0を表さない）を表し、n'は1
以上の任意の整数を表し、X²は単結合または(CH₂)_t（式
中、tは1〜5の整数を表す）を表す］で表わされる化合
物である。式（IIa）で表されるポリアルキレングリコ
ール類は本願によりはじめて開示された新規物質であ
る。該ポリアルキレングリコール類の平均分子量は、好
ましくは約1,000〜1,000,000であり、より好ましくは50
0〜100,000である。

【００１４】式（Ｉ）および式（II）の各基の定義にお
いて、アルキル基およびアルカノイル基のアルキル部分
としては、直鎖状または分岐状の炭素数1〜5の、例えば
メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチ
ル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチ
ル、ネオペンチル等があげられる。消化管運動活性を有
するペプチド分子またはスペーサー中のカルボキシ末端
あるいはリジン、システイン、アルギニン、ヒスチジ
ン、セリンまたはスレオニン残基のいずれかと反応性を
有する基としては、N−ヒドロキシスクシンイミドの活
性エステル、エポキシド、カルボニルイミダゾール、ｐ
−ニトロフェニルカーボネート、トレシル、イソシアネ
ート、酸無水物、ビニルスルホン、マレイミド、o−ピ
リジルジスルフィド、チオール、トシル、トリフラー
ト、5−ピリジル、アジリジン等が挙げられる。より好
ましくはマレイミド、チオール、トリフラート、5−ピ
リジル、アジリジン等のシステイン残基と反応性を有す
るものがあげられる。

【００１５】本発明の化合物の薬理学的に許容される塩
としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、有
機塩基付加塩等が包含される。酸付加塩としては、塩酸
塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン
酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩等の
有機酸塩があげられ、金属塩としては、リチウム塩、ナ
トリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシ
ウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミ
ニウム塩、亜鉛塩等があげられる。有機塩基付加塩とし
ては、メチルアミン、エチルアミン、アニリン等の一級
アミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジ
ン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン等の二級アミ
ン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、N,N−ジメ
チルアニリン、ピリジン等の三級アミンとで形成される
塩、アンモニウム塩等が包含される。

【００１６】本発明で用いられる消化管運動活性を有す
るペプチドは動物臓器から抽出する方法でも得られる
が、通常のペプチド合成法または遺伝子組換法を用いる
こともできる。遺伝子組換法は特許第2634132号公報に
記載されている。ペプチド合成法としては通常用いられ
る液相法または固相法（ペプチド合成の基礎と実験、泉
屋信夫ら、丸善、1985年）を用いることができ、この生
成物を出発物質として活性化したポリアルキレングリコ
ール類、またはポリアルキレングリコール類とPyBOP、D
CC等の縮合剤を用いて縮合反応を行うことにより本発明
の化合物が得られる。

【００１７】さらに、ペプチド合成機および液相法の両
方を適宜組み合わせて、化学修飾に用いられるペプチド
を得ることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの
合成は、島津製作所製ペプチド合成機、Applied Biosys
tems, Inc., U.S.A.（ABI社）製ペプチド合成機等の市
販のペプチド合成機上で、適当に側鎖保護したNα−9−
フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸を用い、
それぞれの合成プログラムに従い、実施することができ
る。

【００１８】該ペプチドの原料となる保護アミノ酸及び
担体樹脂は、島津製作所、ノバビオケム（Nova bioche
m）社、渡辺化学 (株)またはペプチド研究所（株）等か
ら入手することができる。このようにして得られたペプ
チドは、C−4、C−8またはC−18逆相シリカゲルカラム
を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）あるいは
分配、吸着樹脂、シリカゲル、化学修飾シリカゲル、逆
相シリカゲル、アルミナ、珪藻土、珪酸マグネシウム、
イオン交換樹脂、あるいはゲル濾過等のカラムクロマト
グラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーにより精製
することができる。

【００１９】ポリアルキレングリコール類は前記ペプチ
ドのアミノ酸残基に直接結合させることもできるが、ス
ペーサーを介して結合させてもよい。スペーサーとして
はアミノ酸やペプチドが好ましいが、ポリアルキレング
リコール類を結合することができればそれ以外であって
もよい。アミノ酸としてはリジン、システイン等の天然
アミノ酸等を用いることができ、オルニチン、ジアミノ
プロピオン酸、ホモシステイン、グリセロール、エチレ
ングリコール、糖等を用いることもできる。より好まし
くは、システインが挙げられる。ここで、糖としては、
グルコース、ガラクトース、ソルボース、ガラクトサミ
ン、ラクトース等の単糖類や二糖類が挙げられる。ペプ
チドとしては、アミノ酸残基2〜10からなるものが好ま
しい。

【００２０】これらのスペーサーは消化管運動活性を有
するペプチド分子中のリジン、システイン、アルギニ
ン、ヒスチジン、セリン、スレオニン等の残基の側鎖と
アミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等を介し
て結合するか、ペプチドのカルボキシ末端とアミド結合
やエステル結合する。また、前記の通常のペプチド合成
法や遺伝子組換法を用いて結合することができる。この
場合、消化管運動活性を有するペプチドを合成するのと
同時にカルボキシ末端にスペーサーとなるアミノ酸また
はペプチドを導入することが望ましいが、消化管運動活
性を有するペプチドを合成した後にスペーサーを結合し
てもよい。また、前記消化管運動活性を有するペプチド
のカルボキシ末端を化学合成的に活性化してスペーサー
に結合することができる。また、ポリアルキレングリコ
ール類を予め結合したスペーサーを前記の方法で消化管
運動活性を有するペプチドに結合することもできる。

【００２１】例えば、スペーサーとしてリジン、オルニ
チン、ジアミノプロピオン酸等を用いる場合は、本発明
で用いられる消化管運動活性を有するペプチドのカルボ
キシ末端とスペーサー中のアミノ基がペプチド結合し、
式（Ｉ）または式（II）で表されるポリアルキレングリ
コール類のR²またはR⁴の部分がペプチドに結合したスペ
ーサーの側鎖、即ちβ、δ、ε−アミノ基と結合する。
スペーサーとしてシステイン、ホモシステイン等を用い
る場合は、本発明で用いられる消化管運動活性を有する
ペプチドのカルボキシ末端とスペーサー中のアミノ基が
ペプチド結合し、式（Ｉ）または式（II）で表されるポ
リアルキレングリコール類のR²またはR⁴の部分がペプチ
ドに結合したスペーサーの側鎖、即ちチオール基と結合
する。

【００２２】スペーサーとしてグリセロール、エチレン
グリコール、糖等を用いる場合は、本発明で用いられる
消化管運動活性を有するペプチドのカルボキシ末端とス
ペーサー中の水酸基がエステル結合し、スペーサー中の
残りの水酸基とポリアルキレングリコール類がエーテル
結合する。また、例えば、J. Pithaらの方法［ヨーロピ
アン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Eur.
J. Biochem.）、94巻、11頁、1979年］に従ってポリア
ルキレングリコール類を1個所以上の水酸基に結合する
ことができる。このポリアルキレングリコール類が結合
したスペーサーを用い、例えばさらに残った水酸基をT.
Mironらの方法［バイオコンジュゲートケミストリー
（Bioconjugate Chem.）、4巻、568頁、1993年］に従っ
て活性化し、前記消化管運動活性を有するペプチドのア
ミノ酸残基と反応させるなどしてポリアルキレングリコ
ール類を結合することができる。

【００２３】上記ポリアルキレングリコール類は、Samu
el Zalipskyの方法［バイオコンジュゲート ケミスト
リー（Bioconjugate Chem.）、6巻、150頁、1995年］に
従って、容易に製造することが可能である。例えば、反
応性を有する基が活性エステルであるカルボキシメチル
モノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルはFradet,Aらの方法［ポリマー
ブレタン（Polym. Bull.）、4巻、205頁、1981年］
や、Geckeler, Kらの方法［ポリマー ブレタン（Poly
m. Bull.）、1巻、691頁、1979年］でモノメトキシポリ
エチレングリコールの末端にカルボキシル基を導入した
後、通常のカルボン酸の活性化方法（ペプチド合成の基
礎と実験、泉屋信夫ら、丸善、1985年）でスクシンイミ
ドエステルとし、得ることができる。

【００２４】他の例として、反応性を有する基がマレイ
ミドであるメトキシポリエチレングリコール−マレイミ
ドはTimothy P. Koganらの方法［シンセティック コミ
ュニケーション（Shynthetic Commun.）、22巻、2417
頁、1992年］で容易に製造可能である。また、反応性を
有する基がビニルスルホンであるメトキシポリエチレン
グリコール−ビニルスルホンはMargherita Morpurgoら
の方法［バイオコンジュゲートケミストリー（Bioconju
gate Chem.）、7巻、363頁、1996年］で製造が可能であ
る。

【００２５】また、上記ポリアルキレングリコール類と
しては、市販のものを用いることもできる。次に、本発
明の化合物の製造方法について詳しく説明する。 製造法１：化合物（II）の製造法 化合物（II）のうち、R⁴がマレイミドである化合物は、
以下のようにして製造することができる。

【００２６】式（III）

【００２７】

【化５】

【００２８】（式中、R³、M²およびn'は前記と同義であ
る）で表される化合物にジアミン類H₂N−X²−NH₂（式
中、X²は前記と同義である）を縮合する。この際、化合
物（III）は市販のものを使用することができるが、小
野らの方法（タンパク質ハイブリッド、3巻、277頁、19
90年）で容易に製造することもできる。また、上記ジア
ミン類はエチレンジアミン、1,3−ジアミノプロパン、
1,4−ジアミノ−n−ブタン等のいずれでもよい。これら
のジアミン類と化合物（III）との縮合はpH 7〜12の緩
衝液中過剰量、好ましくは1〜100当量のジアミン類を用
いることによって行われる。あるいはジアミン類の１つ
のアミノ基をベンジルオキシカルボニル基、tert−ブチ
ルオキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカル
ボニル基等の通常のアミノ基の保護基で保護し、等量の
Ｎ−保護ジアミンを塩化メチレン、N,N−ジメチルホル
ムアミド、ジオキサン等の有機溶媒中で反応させ、反応
後に保護基を通常の保護基の除去方法［プロテクティブ
グループス イン オーガニック シンセシス(Prote
ctive Groups in Organic Synthesis)、グリーン(T. W.
Greene)著、ジョン ワイリー アンド サンズ イン
コーポレイテッド(JohnWiley & Sons Inc.)（1981
年）］により除去することによっても行なうことができ
る。

【００２９】以上のような方法で得られた式（IV）

【００３０】

【化６】

【００３１】（式中、R³、M²、n'およびX²は前記と同義
である）で表される化合物は以下の工程によってマレイ
ミド体とすることができる。Oskar Kellerらの方法［ヘ
ルベチカ キミカ アクタ（Helv. Chim. Acta）、58
巻、531頁、1975年］に従い、N−アルコキシカルボニル
マレイミドを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中で化合物
（IV）と反応させることで、目的のマレイミド体を得る
ことができる。N−アルコキシカルボニルマレイミドと
してはＮ−エトキシカルボニルマレイミドやＮ−メトキ
シカルボニルマレイミドを用いることができる。

【００３２】前記により製造された化合物（II）のマレ
イミド体、およびその中間体である化合物（IV）は、逆
相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、純そうクロマトグラフィ
ー、シリカゲルクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー、透析、抽出、二層分配、再結晶等の既知の
手段により、任意の純度のものとして単離、精製するこ
とができる。

【００３３】製造法２：ポリアルキレングリコール類を
ペプチドのアミノ酸残基に直接結合して得られる化合物
の製造法 例えば、本発明の化合物は公知の化合物（Ｉ）または化
合物（II）を、公知の［Leu¹³］モチリンを用いて、ペ
プチド1モルあたり1〜1000モル程度、より好ましくは1
〜50モル程度用いて反応させることによって得られる。
ポリアルキレングリコール類のペプチドへの修飾の度合
いはペプチドに対するポリアルキレングリコール類のモ
ル比、反応温度、pH、反応時間等を調節することによっ
て、任意に選択することができる。また、反応に使用す
る溶媒は反応を妨害しないものであればいずれでもよ
く、例えばりん酸緩衝液、ほう酸緩衝液、トリス−塩酸
緩衝液、炭酸水素ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム緩
衝液、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルスル
ホキシド、メタノール、アセトニトリル、ジオキサン等
を選択することができる。反応温度、pH、反応時間はペ
プチドの活性が損なわれない条件であればいずれでもよ
く、例えば反応温度は0〜50℃、反応時間は10分〜100時
間、pHは4〜10が好ましい。

【００３４】製造法３：スペーサーとしてシステイン、
リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ホモシス
テイン等を用いてポリアルキレングリコール類を結合し
て得られる化合物の製造法 例えば、本発明の化合物は、スペーサーを前記のペプチ
ド合成の段階でペプチド鎖中に導入し、化合物（Ｉ）ま
たは化合物（II）をスペーサーを含むペプチド1モルあ
たり1〜1000モル程度、より好ましくは1〜50モル程度用
いて反応させることによって得られる。ポリアルキレン
グリコール類のペプチドへの修飾の度合い、反応条件は
製造法２に準じて調節することが可能である。

【００３５】製造法４：スペーサーとしてグリセロー
ル、エチレングリコール、糖等を用いてポリアルキレン
グリコール類を結合して得られる化合物の製造法 例えば、化合物（Ｉ）または化合物（II）1モル当た
り、1〜100モル、望ましくは1〜10モルのスペーサーと
反応させ、まずポリアルキレングリコール類にスペーサ
ーが1分子結合した化合物を合成する。スペーサーとポ
リアルキレングリコール類との結合はエステル結合やエ
ーテル結合を用いることができる。当該反応は塩化メチ
レン、クロロホルム、アセトニトリル、トルエン、N,N
−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオ
キサン、ピリジン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒
中にスペーサーを溶解、あるいは懸濁し、スペーサー1
〜10モルに対して、1〜10モルの塩基、例えば、水素化
ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸
カリウム、トリエチルアミン、N−メチルモルホリン、
酸化亜鉛等の適当な塩基の存在下、化合物（Ｉ）または
化合物（II）を1モル加え、-20℃〜150℃で1時間〜一昼
夜反応させることによって行われる。この様にして反応
させて得られたポリアルキレングリコール類にスペーサ
ーが１分子結合した化合物は、反応が終了した段階で、
逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、抽出、再結晶等の精製操作によって任意の純度に
調整し、次のペプチドとの結合に用いることができる。

【００３６】ペプチドとポリアルキレングリコール類に
スペーサーが1分子結合した化合物との結合は、例え
ば、以下の様にして行なうことができる。即ち、ポリア
ルキレングリコール類にスペーサーが1分子結合した化
合物を塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、
トルエン、N,N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、ジオキサン、ピリジン、テトラヒドロフラン
等の適当な溶媒に溶解し、1〜50モルのN,N'−ジスクシ
ンイミジルカーボネートやN−ヒドロキシスクシンイミ
ジルクロロホルメート等の活性化剤を加え、T. Mironら
の方法［バイオコンジュゲートケミストリー（Bioconju
gate Chem.）、4巻、568頁、1993年］に準じてスペーサ
ー部分を活性化した後に、ペプチドと反応させる。例え
ば、公知の［Leu¹³］モチリンを用いて、ペプチド1モル
あたり1〜1000モル程度、より好ましくは1〜50モル程度
の活性化したポリアルキレングリコール類にスペーサー
が1分子結合した化合物を反応させることによって行わ
れる。当該反応は製造法２に準じて行なうことができ
る。

【００３７】原料となる粗合成ペプチドおよび製造法２
〜４に示された化合物の精製は常法に従って、ゲル濾
過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
限外濾過等により行なうことができる。以上により合成
もしくは精製されたペプチド、またはポリアルキレング
リコール修飾ペプチドが当該ペプチドの構造を有するも
のであることの確認は、質量分析、核磁気共鳴（NMR）
およびアミノ酸組成をアミノ酸分析計により、またアミ
ノ酸配列を気相プロテインシーケンサーによりエドマン
分解して得られたフェニルチオヒダントイン（PTH）ア
ミノ酸を逆相HPLC分析すること等により行なうことがで
きる。

【００３８】本発明の化合物は人間または動物用の薬剤
組成物の形態で投与することができ、該組成物は通常の
薬剤調製法によって製造することができる。経口、静脈
内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻内または他の許容される
方法での投与に適する組成物を用いることができる。例
えば、注射剤は、本発明の化合物と蒸留水、塩溶液、グ
ルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物から
成る担体とを用いて液剤として調製することができる。
この際、常法に従い、適当な助剤を用いて、溶液、懸濁
剤または分散剤として調製される。また、当該液剤を凍
結乾燥し、凍結乾燥剤として調製することもできる。凍
結乾燥の条件はとくに限定しないが、通常は-50℃以下
で1〜5時間凍結し、棚温-20℃〜0℃、真空度50〜150mTo
rrで24〜48時間乾燥し、ついで棚温10〜30℃、真空度50
〜100mTorrで16〜24時間乾燥し、凍結乾燥品を得る。

【００３９】なお、本発明の化合物を含有する製剤は、
通常の各種製薬担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤あるい
は吸着防止剤などを含むことができる。本発明の化合物
を含有する製剤の場合、例えば、本発明の化合物の投与
量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、対
象となる疾患および患者の病状にあわせて決められる
が、通常、成人一人当り15μg〜1.5mg、好ましくは25〜
500μgの本発明の化合物を含有する製剤を１週間当り1
〜7回投与する。

【００４０】

【実施例】以下の実施例は本発明を説明するものであ
り、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈すべ
きでない。本願明細書中の略号はそれぞれ以下のことを
意味する。 HPLC: High Performance Liquid Chromatography MALDI-TOF MS: Matrix Assisted Laser Desorption Ion
ization Time of FlightMass FAB MS: Fast Atom Bombered Mass UV: Ultra Violet RI: Refractive Index NMR: Nuclear Magnetic Resonance また、本明細書において使用したアミノ酸およびその保
護基に関する略号は、生化学命名に関するIUPAC−IUB委
員会（IUPAC-IUB Commission on BiochemicalNomenclat
ure）の勧告［ヨーロピアン ジャーナル オブ バイ
オケミストリー（Eur. J. Biochem.）、138巻、9頁、19
84年］に従った。

【００４１】以下の略号は、特に断らない限り対応する
下記のアミノ酸、保護基および試薬を表す。 Phe：L−フェニルアラニン Val：L−バリン Pro：L−プロリン Ile：L−イソロイシン Thr：L−スレオニン Tyr：L−チロシン Gly：グリシン Glu：L−グルタミン酸 Leu：L−ロイシン Gln：L−グルタミン Arg：L―アルギニン Met：L−メチオニン Lys：L−リジン Asn：L−アスパラギン Cys：L−システイン Fmoc：Nα−9−フルオレニルメチルオキシカルボニル Trt：トリフェニルメチル Boc：tert−ブチルオキシカルボニル Pmc：2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−６−スルホニ
ル tBu：tert−ブチル DMF：N,N−ジメチルホルムアミド PyBOP：ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリピロリ
ジノホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート DCC：ジシクロヘキシルカルボジイミド HOBt：N−ヒドロキシベンゾトリアゾール NMM：N−メチルモルホリン

【００４２】実施例１： モチリン−Cys−NH₂（ペプチ
ド1）の調製 ＜アミノ酸配列＞ H−Phe−Val−Pro−Ile−Phe−Thr−Tyr−Gly−Glu−Le
u−Gln−Arg−Met−Gln−Glu−Lys−Glu−Arg−Asn−Ly
s−Gly−Gln−Cys−NH₂ ＜合成方法＞ペプチド1は、市販の自動化された固相ペ
プチド合成機（PSSM−8、島津製作所）を用いてアミノ
酸の逐次カップリングにより調製した。アミノ酸結合部
位としてのアミノ基を550μmol有する担体樹脂（Rinkア
ミドMBHAレジン）50mgを自動合成機の反応容器に入れ、
島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。 （ａ）担体樹脂をDMFにより3分間洗浄し、該溶液を排出
した。 （ｂ）Fmoc−Cys(Trt)−OH 275μmol、PyBOP 275μmo
l、HOBt 275μmol及びNMM413μmolをDMF 900μl中で5分
間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を30分間
攪拌し、溶液を排出した。 （ｃ）担体樹脂をDMFを用いて1分間洗浄し、これを5回
繰り返した。こうして、Fmoc−Cys(Trt)が担体上に合成
された。

【００４３】再度（ａ）の操作後、以下の操作を行い、
脱保護、洗浄を行った。 （ｄ）30％ピペリジン−DMF溶液を加えて混合物を4分間
攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう一度繰り返し
た。 （ｅ）担体樹脂をDMFで1分間洗浄し、該溶液を排出し、
この操作を5回繰り返した。

【００４４】次に、（ｂ）の工程でFmoc−Gln(Trt)−OH
を用いて縮合反応を行い、次いで（ｃ）の洗浄工程を経
て、Fmoc−Gln(Trt)−Cys(Trt)が担体上に合成された。
以下、工程（ｂ）においてFmoc−Gly−OH、Fmoc−Lys(B
oc)−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Arg(Pmc)−OH、F
moc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Glu
(OtBu)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmo
c−Arg(Pmc)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Leu−O
H、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−
Ile−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Phe−
OHを順次用いて、（ａ）→（ｄ）→（ｅ）→（ｂ）→
（ｃ）の操作を繰り返した。最終工程の後に、エタノー
ル、ブチルエーテルで洗浄し保護ペプチドの結合した担
体樹脂を得た。これに、チオフェノール（2%）、エチル
メチルスルフィド（3%）、エタンジチオール（2.5%）、
チオアニソール（5%）、水（5%）、トリフルオロエタノ
ール（82.5%）の混合溶液0.8mlを加えて室温で8時間放
置し、樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾過後、
得られた溶液にエーテルを加え、生成した白色沈殿を遠
心させて回収し乾燥した。得られた白色粉末に2M酢酸を
加え、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.
D.×250mm）を用いた下記の条件で精製した。標記化合
物を含む画分を取得後、凍結乾燥した。これまでの操作
を2回繰り返し、標記化合物42.3mg（アミノ酸分析から
算出したペプチド純度47.7％）を得た。

【００４５】ペプチドの構造は質量分析およびアミノ酸
分析で確認した。アミノ酸分析はウオーターズ・アミノ
酸分析装置（Waters Amino Acid Analyzer）で行なっ
た。質量分析は日本電子JMS−HX／HX110A質量分析装置
で測定した。 ＜逆相HPLC精製条件＞ 装置：GILSON HPLC SYSTEM 分離カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK TYPE−C18, SG120
A, S−5μm（内径30mm×250mm）（資生堂） ガードカラム：SHISEIDO CAPCELL PAK TYPE−C18、SG12
0、S−5μm（内径20mm×50mm）（資生堂） 移動相：0〜90％アセトニトリル含有0.1％トリフルオロ
酢酸水溶液 流量：15ml／分 検出：UV 220nm ＜質量分析（FAB MS）＞ 実測値：2802.2[M+H] 理論値：C₁₂₃H₁₉₄O₃₅N₃₆S₂＝2801.3 ＜アミノ酸分析（カッコ内は理論値）＞ Phe 1.8(2), Val 0.9(1), Pro 1.0(1), Ile 1.0(1), Th
r 1.0(1), Tyr 1.0(1),Gly 2.0(2), Glx 6.3(6), Leu
1.0(1), Arg 2.0(2), Met 0.9(1), Lys 2.0(2),Asx 1.0
(1), Cys 1.4(1) (AsxはAsnおよびAsp、GlxはGlnおよび
Gluを示し、Trpは分析せず、Leuを1として算出した） ＜逆相HPLC分析＞ カラム：Cosmosil 5C18MS（4.6×250mm）（ナカライテ
スク） 移動相：0〜90％アセトニトリル含有0.1％トリフルオロ
酢酸水溶液 流量：0.5ml／分 カラム温度：30℃ 検出：UV 220nm グラジエントプログラム：

【００４６】

【表１】

【００４７】保持時間：30.5分

【００４８】実施例２： ［Leu¹³］モチリン−Cys−NH
₂（ペプチド2）の調製 ＜アミノ酸配列＞ H−Phe−Val−Pro−Ile−Phe−Thr−Tyr−Gly−Glu−Le
u−Gln−Arg−Leu−Gln−Glu−Lys−Glu−Arg−Asn−Ly
s−Gly−Gln−Cys−NH₂ ＜合成方法＞実施例１と同様の手順でペプチド2の凍結
乾燥粉末30.1mg（ペプチド純度47.1％）を得た。 ＜質量分析（FAB MS）＞ 実測値：2784.3[M+H] 理論値：C₁₂₄H₁₉₆O₃₅N₃₆S₁＝2783.2

【００４９】＜アミノ酸分析（カッコ内は理論値）＞Ph
e 1.8(2), Val 0.9(1), Pro 1.0(1), Ile 0.9(1), Thr
1.0(1), Tyr 1.0(1),Gly 2.0(2), Glx 6.4(6), Leu 2.0
(2), Arg 1.9(2), Lys 2.0(2), Asx 1.2(1),Cys 1.4(1)
(AsxはAsnおよびAsp、GlxはGlnおよびGluを示し、Trp
は分析せず、Leuを2として算出した） ＜逆相HPLC分析＞実施例１と同様の方法によって分析を
行なった。 保持時間：30.8分

【００５０】実施例３： 直鎖型ポリエチレングリコー
ル結合モチリン−Cys（化合物1）の調製 4.99mgのペプチド1の凍結乾燥粉末を50mMりん酸緩衝液
（pH6.0）に溶解し、氷冷下メトキシポリエチレングリ
コール−マレイミド試薬（平均分子量20,000、Shearwat
er Polymers, Inc.製）を34.0mg（ペプチド1モルに対し
て2モル）添加した。4℃で2時間静置した後、逆相HPLC
を用いて分取した。目的物を含む画分を凍結乾燥して目
的物（収量10.0mg、収率50.9％、ペプチド量1.21mg）を
取得した。

【００５１】＜逆相HPLCの分取条件＞ 装置：GILSON HPLC SYSTEM 分離カラム：TSK gel ODS−120T(内径21.5mm×300mm)
（東ソー） ガードカラム：TSK guard column ODS(内径21.5mm×75m
m)（東ソー） 移動相：0〜90％アセトニトリル含有0.1％トリフルオロ
酢酸水溶液 流量：10ml／分 カラム温度：室温 検出：UV220nm サンプル量：100mg／ml×0.25ml グラジエントプログラム：

【００５２】

【表２】

【００５３】＜逆相HPLC分析＞実施例１と同様の方法に
よって分析を行なった。 保持時間：35.4分 ＜質量分析（MALDI−TOF MS）＞ 装置：Bruker社製TOF−MS装置Model REFLEX マトリックス：シナピン酸 加速電圧：30kV モード：Reflector 分子量標準品：シトクロムC（分子量12360.08） 測定値：25093（ピークトップ） ＜ゲル濾過HPLC＞ 装置：LC−10A HPLC SYSTEM（島津製作所） 分離カラム：TSK gel G−4000SW_XL(内径7.8mm×300mm×
2本連結）（東ソー） ガードカラム：TSK guard column SW_XL(内径6.0mm×40m
m)（東ソー） 移動相：150mM 塩化ナトリウム、20mM酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ4.5） 流量：0.5ml／分 検出：UV220nm、RI 保持時間：38.8分（UV220nm）、39.1分（RI）

【００５４】実施例４： 直鎖型ポリエチレングリコー
ル結合［Leu¹³］モチリン−Cys（化合物2）の調製 4.99mgのペプチド2の凍結乾燥粉末を50mMりん酸緩衝液
（pH6.0）に溶解し、氷冷下メトキシポリエチレングリ
コール−マレイミド試薬（平均分子量20,000、Shearwat
er Polymers, Inc.製）を33.8mg（ペプチド1モルに対し
て2モル）添加した。4℃で2時間静置した後、逆相HPLC
を用いて分取した（分取条件は実施例３と同様であ
る）。目的物を含む画分を凍結乾燥して目的物（収量9.
2mg、収率47.1％、ペプチド量1.11mg）を取得した。 ＜逆相HPLC分析＞実施例１と同様の方法によって分析を
行なった。 保持時間：35.4分 ＜質量分析（MALDI−TOF MS）＞実施例３と同様の方法
で測定した。 測定値：24954（ピークトップ） ＜ゲル濾過HPLC＞実施例３と同様の方法で分析した。 保持時間：39.7分(UV220nm)、39.9分（RI）

【００５５】実施例５： 分岐型ポリエチレングリコー
ル結合モチリン−Cys（化合物3）の調製 5.08mgのペプチド1の凍結乾燥粉末を50mMりん酸緩衝液
（pH6.0）に溶解し、氷冷下、実施例８で得られる分岐
型ポリエチレングリコール誘導体を34.6mg（ペプチド1
モルに対して3.3モル）添加した。4℃で2時間静置した
後、実施例３と同様の方法で逆相HPLCを用いて分取し
た。目的物を含む画分を凍結乾燥して目的物（収量8.38
mg、収率65.4％、ペプチド量1.56mg）を取得した。 ＜逆相HPLC分析＞実施例１と同様の方法によって分析を
行なった。 保持時間：35.7分 ＜質量分析（MALDI−TOF MS）＞実施例３と同様の方法
で測定した。 測定値：15045（ピークトップ） ＜ゲル濾過HPLC＞実施例３と同様の方法で分析した。 保持時間：42.9分（UV220nm）、43.1分（RI）

【００５６】実施例６： 分岐型ポリエチレングリコー
ル結合［Leu¹³］モチリン−Cys（化合物4）の調製 4.96mgのペプチド2の凍結乾燥粉末を50mMりん酸緩衝液
（pH6.0）に溶解し、氷冷下実施例８で得られる分岐型
ポリエチレングリコール誘導体を20.1mg（ペプチド1モ
ルに対して2モル）添加した。4℃で2時間以上静置した
後、実施例３に準じて逆相HPLCを用いて分取した。目的
物を含む画分を凍結乾燥して目的物（収量7.74mg、収率
61.1％、ペプチド量1.44mg）を取得した。 ＜逆相HPLC分析＞実施例１と同様の方法によって分析を
行なった。 保持時間：35.5分 ＜質量分析（MALDI−TOF MS）＞実施例３と同様の方法
で測定した。 測定値：15060（ピークトップ） ＜ゲル濾過HPLC＞実施例３と同様の方法で分析した。 保持時間：42.9分（UV220nm）、43.1分（RI）

【００５７】実施例７： 直鎖型ポリエチレングリコー
ル結合［Leu¹³］モチリン（化合物5）の調製 参考例１で得られる7.7mgの［Leu¹³］モチリン（ペプチ
ド3）の凍結乾燥粉末を50mMりん酸緩衝液（pH7.5）に溶
解し、氷冷下、モノメトキシポリエチレングリコールプ
ロピオン酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル（M
−SPA−20,000、Shearwater Polymers, Inc.製）115mg
を添加し、4℃で一昼夜放置した。その後、実施例３と
同様にして逆相ＨＰＬＣを用いて分取し、分取した画分
を凍結乾燥することで目的物（収量8.7mg、収率12.7
％、ペプチド量0.97mg）を取得した。 ＜逆相HPLC分析＞実施例１と同様の方法によって分析を
行なった。 生成物の保持時間：36.3分 ペプチド3の保持時間：30.5分 ＜質量分析（MALDI−TOF MS）＞実施例３と同様の方法
で測定した。 測定値：23801（ピークトップ） ＜ゲル濾過HPLC＞実施例３と同様の方法で分析した。 保持時間：39.0分（UV280nm ）、39.2分（RI）

【００５８】実施例８： 分岐型ポリエチレングリコー
ル誘導体の合成以下の経路で合成を行なった。

【００５９】

【化７】

【００６０】（式中、nは０以上の任意の整数を表す） 第１段階：2,4−ビス（メトキシポリエチレングリコー
ル）−6−（3−アミノプロピルアミノ）−s−トリアジ
ン［化合物B］の調製 2.0mlの1,3−ジアミノプロパン（20当量、24mmol）を0.
1Mのほう酸緩衝液（pH10）600mlに溶解し、氷冷下6gの
活性化ポリエチレングリコール｛2,4−ビス（メトキシ
ポリエチレングリコール）−6−クロロ−s−トリアジン
［化合物A］（活性化PEG₂、平均分子量約12000、生化学
工業社製）｝(12mmol)を加えて攪拌した。その後、室温
に戻して一昼夜攪拌した。2Nの塩酸を加えてpH1〜2に調
整し、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和塩化ナト
リウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し
た。溶媒を減圧下除去し、残さに塩化メチレン少量を加
えて溶解した後、ジエチルエーテルに滴下し、生成した
白色沈殿を濾別し、減圧乾燥して目的物を4.48g得た
（収率75％）。¹ H-NMR(CDCl₃, 400MHz)(δ(ppm)): 6.02(1H, brt, J=5.
7Hz), 4.49(2H, brt, J=5.1Hz), 4.44(2H, brt, J=5.0H
z), 3.64(8n'H, s), 3.38(6H, s), 2.83(2H, t,J=6.5H
z), 1.71(2H, m)

【００６１】第２段階：N−エトキシカルボニルマレイ
ミド［化合物C］の調製 676mg(8mmol)のマレイミドを酢酸エチル40mlに溶解し、
氷冷下、N−メチルモルホリンを878μl(8mmol)加え、続
いてエトキシカルボニルクロライドを946μl（9.6mmo
l、1.2 当量）加えて30分間攪拌した。反応液を濾過
し、濾液を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫
酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、酢酸エチ
ルージエチルエーテル系で再結晶して目的物を654mg得
た（収率55.6％）。¹ H-NMR(CDCl₃, 400MHz)(δ(ppm)): 6.82(2H, s), 4.42
(2H, q, J=7.0Hz), 1.42(3H, t, J=7.1Hz)

【００６２】第３段階：2,4−ビス（メトキシポリエチ
レングリコール）−6−（3−マレイミドプロピルアミ
ノ）−s−トリアジン［化合物D］の合成 4.48g（0.448mmol）の化合物Bを氷冷下飽和炭酸水素ナ
トリウム水溶液45mlに溶解し、151.5mg（0.90mmol、2当
量）の化合物Cを加えて0℃で10分間攪拌した。常温の水
を180ml加え、さらに室温で15分間攪拌した。クロロホ
ルムで3回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒
を減圧除去した。残さを少量の塩化メチレンに溶解し、
10倍量のジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾
別し、減圧乾燥して目的物を3.9g得た（収率86.7％）。¹ H-NMR(CDCl₃, 400MHz)(δ(ppm)): 6.73(2H, s), 4.46
(4H, brm), 5.76(1H, brt, J=5.7Hz), 3.66(8n'H, s),
3.38(6H, s), 2.61(2H, brt, J=7.2Hz), 1.85(2H,m) ＜逆相HPLC分析＞実施例１と同様の分析条件で分析し
た。 保持時間：41.3分 ＜質量分析（MALDI−TOF MS）＞実施例３と同様の方法
で分析した。 測定値：12054.6（ピークトップ）

【００６３】参考例１： ペプチド3の調製 特許公報第2634132号に示された方法に従って調製し
た。

【００６４】モチリン重合体発現プラスミドPMTOII4を
用いて大腸菌W3110strA株を形質転換した。得られたAp^r
コロニーの培養液を7000rpmで、5分間遠心して菌体を回
収した。この菌体をPSG（97mMりん酸二ナトリウム、1.5
mMりん酸二水素カリウム、137mM塩化ナトリウム、2.7mM
塩化カリウム）で洗浄した後、PBS［等張りん酸緩衝液
（塩化ナトリウム8g/L、りん酸水素二ナトリウム12水和
物2.9g/L、塩化カリウム0.2g/L、りん酸一カリウム0.2g
/L）］に溶解し超音波で菌体を破砕して、遠心操作、パ
ーコールの密度勾配、洗浄操作を繰り返して、モチリン
重合体の顆粒約5mgを得た。この顆粒を70％ぎ酸2mlに溶
解し、42mgの臭化シアンを70％ぎ酸0.4mlに溶解した溶
液を加え、37℃で一日放置し、再び42mgの臭化シアンを
含む70％ぎ酸溶液0.4mlを加え、37℃で一夜放置した。
生成したスペーサーとしてのペプチドの結合したペプチ
ド3単量体をHPLCにより単離した。単離したペプチドの
一部約100μgを0.2MのN−エチルモルホリン−酢酸緩衝
液（pH8.0）0.4mlに溶解して37℃で21時間放置した後、
2μgのカルボキシペプチダーゼＡ（Sigma社）を加え37
℃で30分放置した。さらに、0.2MのＮ−エチルモルホリ
ン−酢酸緩衝液（pH8.0）0.2mlに溶解しカルボキシペプ
チダーゼＢ（Sigma社）1μgを加え37℃で10分間放置し
た後、0.1％トリフルオロ酢酸溶液0.2mlを加え、目的物
を得た。このペプチド3の構造はアミノ酸配列の決定と
質量分析により確認した。次に、本発明の化合物の薬理
作用を試験例で示す。

【００６５】試験例１： ポリエチレングリコール結合
モチリン誘導体類のウサギ摘出十二指腸標本に対する収
縮効果の比較 日本白色在来種ウサギ（体重2.0〜3.0kg）にペントバル
ビタールナトリウム(sodium pentobarbital)を30mg/kg
耳静脈内投与し、麻酔導入後に放血致死させた。開腹し
て、胃幽門部を起点に約10cm遠位の部分までの腸管を十
二指腸として摘出し、この十二指腸から約2cmの標本を4
本切り出した。標本をアイソトニックトランスデューサ
ー［TD−112S、日本光電（株）、東京］に懸垂し、28℃
で混合ガス(95%O₂+5%CO₂)を通気したTyrode液(136mmol/
L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 1.8mmol/L CaCl₂, 1.0mmol/L
MgCl₂, 0.4mmol/L NaH₂PO₄, 11.9mmol/L NaHCO₃, 5.6mm
ol/L glucose, pH7.4)を満たした10mLの浴槽に入れ、4g
の負荷をかけた。60分間安定させた後、アセチルコリン
(final 100mol/L)を適用し、アセチルコリンによる収縮
高が一定になるまで15分ごとに繰り返した。次いで、下
記の実験ＡまたはＢに従って被験薬を累積適用した。い
ずれの実験も標本を摘出する動物を変えて3回行った。

【００６６】実験Ａ：4本の標本に各々ペプチド1、化合
物1、化合物3およびペプチド3を最終的にペプチドの濃
度が0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000nmol/Lに
なるように累積適用して収縮高を測定した。 実験Ｂ：4本の標本に各々ペプチド2、化合物2、化合物4
およびペプチド3を最終的にペプチドの濃度が0.1、0.
3、1、3、10、30、100、300、1000nmol/Lになるように
累積適用して収縮高を測定した。

【００６７】各被験薬について、累積適用の直前のアセ
チルコリンによる収縮高の半分の収縮高を示す濃度をpr
obit法［吉村功著、毒性・薬効データの統計解析、サイ
エンティスト社（1987年）］により算出し、AC₅₀値とし
た。第３表に被験薬の摘出ウサギ十二指腸標本の収縮亢
進作用を示す。

【００６８】

【表３】

【００６９】ペプチド1、ペプチド２およびペプチド3
は、ほぼ同じ濃度で摘出ウサギ十二指腸標本を収縮させ
た。一方、化合物1、化合物２、化合物３および化合物4
はペプチド3に比較して高濃度ではあるが摘出ウサギ十
二指腸標本を収縮させた。AC₅₀値で比較すると、ペプチ
ド3の約1/10〜1/3の活性であった。 試験例２： ポリエチレングリコール結合モチリン誘導
体類を麻酔下ウサギの静脈内に投与した際の消化管運動
に及ぼす影響 日本白色在来種ウサギ（体重2.0〜3.0kg）にウレタン
（urethane）を1.0g/kg腹腔内投与し、麻酔導入後に実
験台に背位に固定した。気管にカニューレを挿入し、人
工呼吸器を接続して人工呼吸を行った。右大腿動脈にカ
ニューレを挿入し、血圧測定用アンプ［AP−621G、日本
光電（株）］を用いて血圧を測定した。また、右前肢、
左後肢および右後肢に刺したステンレス製の注射針より
心電図（標準四肢第二誘導）を心電図用アンプ［AB−62
1G、日本光電（株）］を用いて測定し、心電図・心拍計
ユニット［AT−601G、日本光電（株）］を用いて心拍数
を測定した。さらに、タイゴンチューブにゴムを接続し
たバルーン（手製）を胃幽門前庭部（幽門から4 cm近
位）および下行結腸（肛門から10cm近位）に挿入した。
バルーン内は水で満たして内圧を5〜15cm H₂O(490〜147
0Pa)として低圧用トランスデューサー［LPU−0.1−360
−0−IIIおよびLPU−0.1−350−0−II、日本光電
（株）］に接続し、ひずみ圧力用アンプ［AP−621G、日
本光電（株）］を用いて消化管運動を内圧変化により測
定した。すべてのパラメーターはポリグラフシステム
［日本光電（株）］により波形を抽出し、サーマルアレ
イレコーダー［日本光電（株）］に記録した。

【００７０】手術後1時間程度安定させてから生理食塩
液（被験薬の溶媒）または被験薬を耳静脈内投与した。
実験Ａでは、投与用量は0.1mL/kgで、生理食塩液投与群
および各被験薬投与群について3例ずつ行い、実験Ｂで
は、投与用量は0.2mL/kgで、生理食塩液投与群および各
被験薬投与群について2例ずつ行った。 実験Ａ：生理食塩液またはペプチド1(3g/kg)、ペプチド
2(3g/kg)およびペプチド3(3g/kg)を投与した。 実験Ｂ：生理食塩液または化合物1(300μgペプチド/k
g)、化合物2 (300μgペプチド/kg)、化合物3(100μgペ
プチド/kg)および化合物4(100μgペプチド/kg)を投与し
た。

【００７１】生理食塩液または被験薬投与10および1分
前、投与1、3、5、10、20、30、45および60分後に血圧
および心拍数を測定した。また、生理食塩液または被験
薬投与直前の10分間、および投与0〜10分後、10〜20分
後、20〜30分後、30〜40分後、40〜50分後、50〜60分後
の各10分間の消化管の内圧変化の波形と基線に囲まれた
部分の面積（波形下面積）をデジタイザー［KD−3200、
グラフテック（株）、東京］を用いて測定し、この値を
1分間当たりの圧力に換算して、運動係数とした。

【００７２】結果を第４表〜第７表に示す。

【００７３】

【表４】

【００７４】

【表５】

【００７５】

【表６】

【００７６】

【表７】

【００７７】麻酔下ウサギへの生理食塩液および被験薬
の投与は血圧および心拍数にほとんど影響を及ぼさなか
った。また、麻酔下ウサギへの生理食塩液の投与は胃幽
門前庭部および下行結腸の運動にほとんど影響を及ぼさ
なかった。ペプチド3は3μg/kg (i. v.)で麻酔下ウサギ
の胃幽門前庭部および下行結腸の運動係数を投与後約10
分まで増加させた（第４表および第５表）。ペプチド1
およびペプチド2は、3μg/kg(i. v.)で胃幽門前庭部お
よび下行結腸の運動係数を投与後約10分まで増加させ、
ペプチド３と同程度の活性を示した（第４表および第５
表）。一方、化合物3および化合物4は100μgペプチド/k
g (i. v.)で、化合物1は300μgペプチド/kg (i. v.)で
下行結腸の運動係数を投与後約20〜30分まで増加させた
（第６表および第７表）。また、化合物2は300gペプチ
ド/kg(i. v.)で胃幽門前庭部および下行結腸の運動係数
を投与後約30分まで増加させた（第６表および第７
表）。

【００７８】以上により、化合物1、化合物2、化合物3
および化合物4は、ペプチド3と同様の消化管運動の亢進
作用を保持し、特に下行結腸において、作用持続時間が
顕著に延長されることが明らかになった。

【００７９】

【発明の効果】本発明のポリアルキレングリコール修飾
ペプチドは、非修飾ペプチドと同様の消化管運動促進活
性を保持しているだけでなく、長時間有効にその生理活
性を示し、糖尿病の胃麻痺、麻痺性の腸閉塞、手術後の
腸閉塞等の胃腸運動活性の基礎レベルが低下するような
症状の消化管蠕動促進剤、消化管蠕動障害治療剤として
の利用に有効である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０８Ｇ 65/329 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 唐沢 啓 東京都千代田区大手町一丁目６番１号 協 和醗酵工業株式会社本社内 Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA07 BA37 BA44 CA59 DB44 MA17 MA22 MA23 MA44 MA52 MA56 MA59 MA66 NA05 NA12 ZA662 4H045 AA10 AA30 BA17 BA51 BA57 CA40 EA25 FA34 FA70 FA74 GA25 HA03 HA05 4J005 AA04 AA12 BD05

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１個のポリアルキレングリコ
   ール類が消化管運動活性を有するペプチドに直接もしく
   はスペーサーを介して結合した化合物またはその薬理学
   的に許容される塩。
2. 【請求項２】 ポリアルキレングリコール類が消化管運
   動活性を有するペプチドのカルボキシ末端にスペーサー
   を介して結合した請求項１記載の化合物またはその薬理
   学的に許容される塩。
3. 【請求項３】 スペーサーがシステインである請求項２
   記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
4. 【請求項４】 消化管運動活性を有するペプチドがモチ
   リンである請求項１〜請求項３のいずれかに記載の化合
   物またはその薬理学的に許容される塩。
5. 【請求項５】 消化管運動活性を有するペプチドが¹³ロ
   イシン置換モチリンである請求項１〜請求項３のいずれ
   かに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
6. 【請求項６】 ポリアルキレングリコール類が式（Ｉ） R¹−M¹ _n−X¹−R² （Ｉ） ［式中、R¹はアルキル基またはアルカノイル基を表し、
   M¹は−(OCH₂CH₂)_r−(OCH ₂CH₂CH₂)_s−（式中、rおよびs
   は同一または異なって0以上の任意の整数を表す。ただ
   し、rおよびsは同時には0を表さない）を表し、nは1以
   上の任意の整数を表し、X¹は単結合または(CH₂)_t（式
   中、tは1〜5の整数を表す）を表し、R²は消化管運動活
   性を有するペプチド分子またはスペーサー中のカルボキ
   シ末端あるいはリジン、システイン、アルギニン、ヒス
   チジン、セリンまたはスレオニン残基のいずれかと結合
   する反応性を有する基を表す］で表される化合物である
   請求項１〜請求項５のいずれかに記載の化合物またはそ
   の薬理学的に許容される塩。
7. 【請求項７】 ポリアルキレングリコール類が式（II） 【化１】 ［式中、R³はアルキル基またはアルカノイル基を表し、
   M²は−(OCH₂CH₂)_r−(OCH ₂CH₂CH₂)_s−（式中、rおよびs
   は同一または異なって0以上の任意の整数を表す。ただ
   し、rおよびsは同時には0を表さない）を表し、n'は1以
   上の任意の整数を表し、X²は単結合または(CH₂)_t（式
   中、tは1〜5の整数を表す）を表し、R⁴は消化管運動活
   性を有するペプチド分子またはスペーサー中のカルボキ
   シ末端あるいはリジン、システイン、アルギニン、ヒス
   チジン、セリンまたはスレオニン残基のいずれかと結合
   する反応性を有する基を表す］で表わされる化合物であ
   る請求項１〜請求項５のいずれかに記載の化合物または
   その薬理学的に許容される塩。
8. 【請求項８】 ポリアルキレングリコール類の平均分子
   量が、1,000〜1,000,000である請求項１〜請求項７のい
   ずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される
   塩。
9. 【請求項９】 式（IIa） 【化２】 ［式中、R³はアルキル基またはアルカノイル基を表し、
   R^4aはマレイミド基またはアミノ基を表し、M²は−(OCH₂
   CH₂)_r−(OCH₂CH₂CH₂)_s−（式中、rおよびsは同一または
   異なって0以上の任意の整数を表す。ただし、rおよびs
   は同時には0を表さない）を表し、n'は1以上の任意の整
   数を表し、X²は単結合または(CH₂)_t（式中、tは1〜5の
   整数を表す）を表す］で表わされるポリアルキレングリ
   コール類。
10. 【請求項１０】 請求項１〜請求項８のいずれかに記載
    の化合物またはその薬理学的に許容される塩の有効量お
    よび必要に応じて担体を含有する医薬。
11. 【請求項１１】 請求項１〜請求項８記載の化合物また
    はその薬理学的に許容される塩の有効量および必要に応
    じて担体を含有する消化管蠕動促進剤または消化管蠕動
    障害治療剤。