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JP7249591B2 - 分解性ポリエチレングリコール結合体 - Google Patents

分解性ポリエチレングリコール結合体 Download PDF

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Description

本発明は、細胞内で分解する分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質に関する発明である。
ホルモンやサイトカイン、抗体、酵素などの生体関連物質を用いた医薬品は、通常生体内へ投与されると腎臓における糸球体濾過や肝臓や脾臓などにおけるマクロファージによる取り込みによって、生体内から速やかに排出されてしまう。そのため血中半減期が短く、十分な薬理効果を得ることが困難であることが多い。この問題を解決するため、生体関連物質を糖鎖やポリエチレングリコールなどの親水性高分子やアルブミンなどによって化学修飾する試みが行われている。その結果、分子量の増大や水和層の形成などにより生体関連物質の血中半減期を延長することが可能となる。また、ポリエチレングリコールで修飾することで、生体関連物質の毒性や抗原性の低下、難水溶性薬剤の溶解性向上などの効果が得られることも良く知られている。
ポリエチレングリコールで修飾された生体関連物質は、ポリエチレングリコールのエーテル結合と水分子との水素結合で形成される水和層で覆われ、分子サイズが大きくなることから、腎臓における糸球体濾過を回避することができる。さらにオプソニンや各組織を構成する細胞表面との相互作用が低下し、各組織への移行が減少することが知られている。ポリエチレングリコールは生体関連物質の血中半減期を延長させる優れた素材であり、その性能は分子量が大きいほど効果が高いことが分っている。これまで、分子量4万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質の研究が多数行なわれており、有意にその血中半減期を延長できる結果が得られている。
ポリエチレングリコールは生体関連物質の性能改善に用いられる修飾剤の中で至適基準とされており、現在ではポリエチレングリコール修飾製剤が複数上市され、医療現場で使用されている。一方で、2012年に欧州医薬品庁(EMA)から、分子量4万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質を一定の投与量以上で長期間動物に投与すると、一部の組織の細胞内に空胞が発生するとの現象が報告された(非特許文献１)。現時点において、空胞の発生自体が人体に悪影響を与えるとの報告はなく、また、先のEMAの報告において用いられた投与量は、医療現場において一般的に適用される投与量と比べて極めて高用量であること等を考慮すれば、現在製造販売されている分子量が4万以上のポリエチレングリコールで修飾された治療製剤の安全性は問題ないといえる。しかしながら、非常に特殊な疾患（例えば、小人症など）の治療においては、ポリエチレングリコール修飾製剤を高用量、且つ、長期間に患者へ投与する治療プロトコルが採用されることも想定され得る。従って、かかる特殊な状況においても適用可能な、細胞に空胞を発生させないポリエチレングリコール修飾製剤の開発には潜在的な需要があると予想される。
非特許文献２においては、通常のポリエチレングリコール修飾製剤の投与量に比べ、大過剰量のポリエチレングリコールを単独で動物に長期間投与したところ、分子量2万では空胞は見られず、分子量4万において空胞の発生が確認されている。空胞を抑制する手段の一つとして、ポリエチレングリコールの分子量を小さくすることが考えられるが、分子量を小さくすると生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないという問題が生じる。
高分子量のポリエチレングリコールを体内で低分子量のポリエチレングリコールに分解し、腎臓からの排出を促進する技術については報告例がある。
特許文献１には、生体内で切断されるスルフィド結合やペプチド結合部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的な分解に関するデータは全く示されておらず、腎臓からの排出が促進されたというデータもない。さらに細胞の空胞に関する記載はない。
特許文献２には、生体内の低pH環境下において加水分解可能なアセタール部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的に腎臓からの排出が促進されたというデータは無く、さらに細胞の空胞に関する記載もない。また、これら加水分解が可能なアセタール部位は血中でも徐々に分解することが知られており、修飾した生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないと予想される。
一方で、薬物を効果的にリリースするために分解性のオリゴペプチドを導入したポリエチレングリコール誘導体や体内で分解するハイドロゲルなどの報告例はある。
非特許文献３には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは抗癌剤とポリエチレングリコールの間のリンカーとして導入されており、腫瘍周辺に特異的に発現している酵素によってオリゴペプチドが分解し、効率よく抗癌剤をリリースすることが報告されている。目的は抗癌剤のリリースであり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
非特許文献４には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有した架橋分子と多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を用いたハイドロゲルに関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を繋ぎ合わせる架橋分子として用いられ、さらに酵素による分解性をハイドロゲルに付与することができる。目的は分解性のハイドロゲルの調製であり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
特許文献３には、オリゴペプチドを骨格とした分岐型のポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドはポリエチレングリコール誘導体の基本骨格として用いられており、酵素による分解性を付与するものではない。また、オリゴペプチドにリジンやアスパラギン酸など、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を有したアミノ酸を含むことが特徴であり、それらを反応に利用した分岐型のポリエチレングリコール誘導体を合成することが目的である。細胞の空胞を抑制する目的のポリエチレングリコール誘導体ではない。
以上のように、血中では安定で、修飾した生体関連物質の血中半減期を十分に改善し、細胞に取り込まれた際に細胞内で特異的に分解し、細胞の空胞の発生を抑制することができる高分子量のポリエチレングリコール誘導体が求められている。
特表２００９－５２７５８１号公報 ＷＯ２００５／１０８４６３ ＷＯ２００６／０８８２４８
EMA/CHMP/SWP/647258/2012 Daniel G. Rudmann, et al.,Toxicol. Pathol., 41, 970－983(2013) Francesco M Veronese, et al., Bioconjugate Chem., 16, 775－784(2005) Jiyuan Yang, et al., Marcomol. Biosci., 10(4), 445－454(2010)
本発明の課題は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質を提供することにある。より具体的には、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解される分解性ポリエチレングリコール誘導体にて修飾され、十分に血中半減期が改善された生体関連物質を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞内にて分解するオリゴペプチドを有した分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質を発明した。
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］ 下式（Ａ）：
Figure 0007249591000001
（式中、ｍは１～７であり、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐは１～４であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドであり、Ｑは２～５個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Ｄは生体関連物質であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、単結合または２価のスペーサーであり、ｙは１～４０である。）
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
［２］ 下式（１）：
Figure 0007249591000002
（式中、ｍは１～７であり、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐは１～４であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドであり、Ｑは２～５個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Ｄは生体関連物質であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、単結合または２価のスペーサーである。）
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、［１］記載の生体関連物質。
［３］ Ｑが、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基である［１］または［２］記載の生体関連物質。
［４］ Ｑが、オリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドが、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか１つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる４～８残基のオリゴペプチドである［１］または［２］記載の生体関連物質。
［５］ Ｑのオリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［４］記載の生体関連物質。
［６］ Ｑのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［４］または［５］記載の生体関連物質。
［７］ Ｚのオリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［１］～［６］のいずれか１記載の生体関連物質。
［８］ Ｚのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［１］～［７］のいずれか１記載の生体関連物質。
［９］ Ｄに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量が３０，０００以上である［１］～［８］のいずれか１記載の生体関連物質。
［１０］ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である［１］～［９］のいずれか１記載の生体関連物質。
［１１］ Ｄの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、［１］～［１０］のいずれか１記載の生体関連物質。
［１２］ Ｄの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである［１］～［１１］のいずれか１記載の生体関連物質。
［１３］ 式（１）中のＺが、Ｚ１、Ａおよびグリシン残基で構成される、下式（２）：
Figure 0007249591000003
（式中、ｍは１～７であり、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐは１～４であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚ１はシステインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドであり、Ａはシステインを除く中性アミノ酸であり、ａ及びｂはそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり、Ｑは２～５個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Ｄは生体関連物質であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、単結合または２価のスペーサーである。）
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、［２］記載の生体関連物質。
［１４］ Ｑが、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基である［１３］記載の生体関連物質。
［１５］ Ｑが、オリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドが、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか１つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる４～８残基のオリゴペプチドである［１３］記載の生体関連物質。
［１６］ Ｑのオリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［１５］記載の生体関連物質。
［１７］ Ｑのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［１５］または［１６］記載の生体関連物質。
［１８］ Ｚ１のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［１３］～［１７］のいずれか１記載の生体関連物質。
［１９］ Ａの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸である［１３］～［１８］のいずれか１記載の生体関連物質。
［２０］ Ｄに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量が３０，０００以上である［１３］～［１９］のいずれか１記載の生体関連物質。
［２１］ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である［１３］～［２０］のいずれか１記載の生体関連物質。
［２２］ Ｄの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、［１３］～［２１］のいずれか１記載の生体関連物質。
［２３］ Ｄの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである［１３］～［２２］のいずれか１記載の生体関連物質。
［２４］ 式（２）中のｍが１である、下式（３）：
Figure 0007249591000004
（式中、ｎ３及びｎ４はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐは１～４であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚ１はシステインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドであり、Ａはシステインを除く中性アミノ酸であり、ａ及びｂはそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり、Ｑは２～５個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Ｄは生体関連物質であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、単結合または２価のスペーサーである。）
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、［１３］記載の生体関連物質。
［２５］ Ｑが、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基である［２４］記載の生体関連物質。
［２６］ Ｑが、オリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドが、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか１つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる４～８残基のオリゴペプチドである［２４］記載の生体関連物質。
［２７］ Ｑのオリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［２６］記載の生体関連物質。
［２８］ Ｑのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［２６］または［２７］記載の生体関連物質。
［２９］ Ｚ１のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［２４］～［２８］のいずれか１記載の生体関連物質。
［３０］ Ａの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸である［２４］～［２９］のいずれか１記載の生体関連物質。
［３１］ Ｄに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量が３０，０００以上である［２４］～［３０］のいずれか１記載の生体関連物質。
［３２］ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である［２４］～［３１］のいずれか１記載の生体関連物質。
［３３］ Ｄの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、［２４］～［３２］のいずれか１記載の生体関連物質。
［３４］ Ｄの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである［２４］～［３３］のいずれか１記載の生体関連物質。
［３５］ 式（１）中のＱがエチレングリコールの残基であり、Ｌ１がＣＨ２ＣＨ２Ｏであり、かつｐが１である、下式（４）：
Figure 0007249591000005
（式中、ｍは１～７であり、ｎ５及びｎ６はそれぞれ独立して１１３～６８２であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドであり、Ｄは生体関連物質であり、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、単結合または２価のスペーサーである。）
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、［２］記載の生体関連物質。
［３６］ Ｚのオリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［３５］記載の生体関連物質。
［３７］ Ｚのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［３５］または［３６］記載の生体関連物質。
［３８］ Ｄに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量が３０，０００以上である［３５］～［３７］のいずれか１記載の生体関連物質。
［３９］ Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である［３５］～［３８］のいずれか１記載の生体関連物質。
［４０］ Ｄの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、［３５］～［３９］のいずれか１記載の生体関連物質。
［４１］ Ｄの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである［３５］～［４０］のいずれか１記載の生体関連物質。
［４２］ 式（２）中のＱがエチレングリコールの残基であり、Ｌ１がＣＨ２ＣＨ２Ｏであり、かつｐが１である、下式（５）：
Figure 0007249591000006
（式中、ｍは１～７であり、ｎ５及びｎ６はそれぞれ独立して１１３～６８２であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚ１はシステインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドであり、Ａはシステインを除く中性アミノ酸であり、ａ及びｂはそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり、Ｄは生体関連物質であり、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、単結合または２価のスペーサーである。）
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、［１３］記載の生体関連物質。
［４３］ Ｚ１のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［４２］記載の生体関連物質。
［４４］ Ａの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸である［４２］または［４３］記載の生体関連物質。
［４５］ Ｄに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量が３０，０００以上である［４２］～［４４］のいずれか１記載の生体関連物質。
［４６］ Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である［４２］～［４５］のいずれか１記載の生体関連物質。
［４７］ Ｄの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、［４２］～［４６］のいずれか１記載の生体関連物質。
［４８］ Ｄの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである［４２］～［４７］のいずれか１記載の生体関連物質。
［４９］ 式（３）中のＱがエチレングリコールの残基であり、Ｌ１がＣＨ２ＣＨ２Ｏであり、かつｐが１である、下式（６）：
Figure 0007249591000007
（式中、ｎ７及びｎ８はそれぞれ独立して２２６～６８２であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚ１はシステインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドであり、Ａはシステインを除く中性アミノ酸であり、ａ及びｂはそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり、Ｄは生体関連物質であり、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、単結合または２価のスペーサーである。）
で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、［２４］記載の生体関連物質。
［５０］ Ｚ１のオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［４９］記載の生体関連物質。
［５１］ Ａの中性アミノ酸が、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸である［４９］または［５０］記載の生体関連物質。
［５２］ Ｄに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量が３０，０００以上である［４９］～［５１］のいずれか１記載の生体関連物質。
［５３］ Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である［４９］～［５１］のいずれか１記載の生体関連物質。
［５４］ Ｄの生体関連物質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素である、［４９］～［５２］のいずれか１記載の生体関連物質。
［５５］ Ｄの生体関連物質が、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたは抗体フラグメントである［４９］～［５４］のいずれか１記載の生体関連物質。
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、該分解性ポリエチレングリコール誘導体が生体内の血中では安定であり、細胞内の酵素によって分解するオリゴペプチドをポリエチレングリコール鎖の間に有しているため、血中では安定であり、従来の分解性を有さないポリエチレングリコール誘導体と同等の血中半減期を生体関連物質に付与することができるので、細胞内に取り込まれた場合、ポリエチレングリコール鎖の間のオリゴペプチド部位が速やかに分解されるため、これまで課題とされていた細胞の空胞の発生を抑制することができる。
実施例１のＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＰＡのＧＰＣ分析結果を示す。 実施例１５の細胞を用いた分解性試験において、細胞内から回収したＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＰＡのＧＰＣ分析結果を示す。 実施例１６のサーモンカルシトニンとＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬとの結合体、サーモンカルシトニンとメトキシＰＥＧアルデヒド４０ｋＤａとの結合体のＲＰＬＣ分析結果を示す。 実施例２で得られたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬと、実施例１６で得られたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの分析結果を示す。 メトキシＰＥＧアルデヒド４０ｋＤａと、実施例１６で得られたメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの分析結果を示す。 実施例１６のサーモンカルシトニンとＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬとの結合体、サーモンカルシトニンとメトキシＰＥＧアルデヒド４０ｋＤａとの結合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥの分析結果を示す（左図：ＣＢＢ染色、右図：ヨウ素染色）。 実施例１７のヒト成長ホルモンとＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬとの結合体のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの分析結果を示す。 実施例１７のヒト成長ホルモンとメトキシＰＥＧアルデヒド４０ｋＤａとの結合体のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの分析結果を示す。 実施例１７のヒト成長ホルモンとＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬとの結合体、ヒト成長ホルモンとメトキシＰＥＧアルデヒド４０ｋＤａとの結合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥの分析結果を示す（左図：ＣＢＢ染色、右図：ヨウ素染色）。 実施例１９のサーモンカルシトニンと、ＰＥＧ化サーモンカルシトニンの生理活性 (血中カルシウム濃度)の評価結果を示す。 実施例２０の放射性同位体をラベル化したサーモンカルシトニンと、放射性同位体をラベル化したＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴと、放射性同位体をラベル化したメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴの体内動態（血中濃度）の評価結果を示す。 実施例２０の放射性同位体をラベル化したサーモンカルシトニンと、放射性同位体をラベル化したＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴと、放射性同位体をラベル化したメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴの肝臓への滞留量を示す。 実施例２０の放射性同位体をラベル化したサーモンカルシトニンと、放射性同位体をラベル化したＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴと、放射性同位体をラベル化したメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴの腎臓への滞留量を示す。 実施例２０の放射性同位体をラベル化したサーモンカルシトニンと、放射性同位体をラベル化したＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴと、放射性同位体をラベル化したメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴの脾臓への滞留量を示す。 実施例２０の放射性同位体をラベル化したサーモンカルシトニンと、放射性同位体をラベル化したＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴと、放射性同位体をラベル化したメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴの肺への滞留量を示す。 実施例２１のメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤaを長期投与したマウスの脳脈絡叢の切片の画像（矢印は空胞を示す）を示す。 実施例２１のＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＰＡを長期投与したマウスの脳脈絡叢の切片の画像を示す。 実施例２２のＰＢＳ、メトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａ、メトキシＰＥＧアミン２０ｋＤa、ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＰＡを長期投与したマウスの脳脈絡叢の切片の画像（茶色に染色された部分がＰＥＧの蓄積を示す）を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、下式（Ａ）で示される。
Figure 0007249591000008
（式中、ｍは１～７であり、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐは１～４であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドであり、Ｑは２～５個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Ｄは生体関連物質であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、単結合または２価のスペーサーであり、ｙは１～４０である。）
本発明において、生体関連物質に結合する分解性ポリエチレングリコール誘導体の分子数は、式（Ａ）中のｙで示され、通常１～４０であり、好ましくは１～２０であり、より好ましくは１～１０であり、特に好ましくは１である。
生体関連物質に結合する分解性ポリエチレングリコール誘導体の分子数を増やすことで得られる効果としては、血中半減期の延長、抗原性の低減などが挙げられるが、生体関連物質によっては活性が低下する可能性がある。酵素などの生体関連物質においては、複数のポリエチレングリコール誘導体を結合させても活性が低下しないことが知られている。
以下、生体関連物質に結合する分解性ポリエチレングリコール誘導体の分子数が１である場合、すなわち、式（Ａ）中のｙが１である場合について説明する。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、下式（１）で示される。
Figure 0007249591000009
（式中、ｍは１～７であり、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐは１～４であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドであり、Ｑは２～５個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Ｄは生体関連物質であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、結合または２価のスペーサーである。）
本発明の式（１）の生体関連物質Ｄに結合したポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は、通常４，０００～１６０，０００であり、好ましくは１０，０００～１２０，０００であり、更に好ましくは３０，０００～８０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（１）におけるポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は３０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
式（１）中のｎ１とｎ２は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して４５～６８２であり、好ましくはそれぞれ独立して１１３～５６８であり、さらに好ましくはそれぞれ独立して１８０～５２５である。ｎ１とｎ２は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
式（１）中のｐは１～４である。ｐが１である場合、式（１）におけるポリエチレングリコール誘導体部分は直鎖型であり、ｐが２～４である場合、式（１）におけるポリエチレングリコール誘導体部分は分岐型である。
式（１）中のＲは、炭素数１～４のアルキル基であり、具体的な例としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、t－ブチル基などが挙げられ、好ましくは炭素数１～３のアルキル基、より好ましくはメチル基またはエチル基であり、更に好ましくはメチル基である。
式（１）中のＺは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、システインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドが好ましく、システインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドがより好ましく、システインを除く中性アミノ酸からなる２～４残基のオリゴペプチドが更に好ましい。
また、式（１）中のＺは、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸、具体的には、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含まない中性アミノ酸で構成されるオリゴペプチドであることが好ましい。本発明の式（１）におけるポリエチレングリコール誘導体部分の合成においては、ポリエチレングリコール誘導体にオリゴペプチドを導入する際、オリゴペプチドのＮ末端のアミノ基、またはＣ末端のカルボキシル基をポリエチレングリコール誘導体との反応に利用している。しかし、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸がオリゴペプチドに含まれると、ポリエチレングリコール誘導体が目的であるＮ末端のアミノ基やＣ末端のカルボキシル基だけでなく、側鎖のアミノ基やカルボキシル基にも導入された不純物が発生する。この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。ここで使用されるアミノ酸は、α－アミノ酸であり、また基本的にはＬ型である。
さらに、中性アミノ酸であるシステインはチオール基を有しており、他のチオール基とジスルフィド結合を形成するため、式（１）中のＺは、システインを含まない中性アミノ酸からなるオリゴペプチドであることが望ましい。
加えて、式（１）中のＺは、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。Ｃ末端のカルボキシル基とポリエチレングリコール誘導体を反応させる際は、基本的にＣ末端のカルボキシル基を縮合剤などで活性化する必要がある。この活性化の工程にて、グリシン以外のアミノ酸ではエピメリ化が起こりやすく、立体異性体が副生することが知られている。オリゴペプチドのＣ末端のアミノ酸をアキラルなグリシンとすることで、立体異性体の副生の無い、高純度な目的物を得ることができる。
さらに、式（１）中のＺは、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸、具体的には、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンを少なくとも１つ有するオリゴペプチドであることが好ましく、フェニルアラニンを有するオリゴペプチドであることが更に好ましい。Kyte と Doolittleにより作成された、アミノ酸の疎水性を定量的に示すハイドロパシー指標(hydropathy index)は、値が大きいほど疎水的なアミノ酸であることを示す（Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157:105－132.）。
式（１）中のＺは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、システインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、グリシン－グリシン－グリシン、フェニルアラニン－グリシンなどであり、好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－グリシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、フェニルアラニン－グリシンであり、より好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、フェニルアラニン－グリシンであり、さらにより好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、フェニルアラニン－グリシンである。
式（１）中のＱは２～５個の活性水素を持つ化合物の残基である。活性水素としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基などの水素があげられる（但し、本発明においては、１級アミノ基（－ＮＨ２）の場合、活性水素は１個と数える。）。「２個の活性水素を持つ化合物の残基」としては、エチレングリコールなどの残基が挙げられ、「３個の活性水素を持つ化合物の残基」としては、オリゴペプチド、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリンなどの残基が挙げられ、「４個の活性水素を持つ化合物の残基」としては、ペンタエリスリトール、ジグリセリンなどの残基が挙げられ、「５個の活性水素を持つ化合物の残基」としては、キシリトールなどの残基が挙げられ、好ましくはエチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、より好ましくはエチレングリコール、リジン、グルタミン酸、グリセリン、オリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはエチレングリコール、リジンの残基である。
また、Ｑの活性水素の数であるｖと、式（１）におけるポリエチレングリコール誘導体部分のポリエチレングリコール鎖の本数を表すｐとの関係は、好ましくはｖ＝ｐ＋１であり、ｐ＝１の場合はｖ＝２で、Ｑはエチレングリコールなどの残基であり、ｐ＝２の場合はｖ＝３で、Ｑはグリセリン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの残基であり、ｐ＝３の場合はｖ＝４で、Ｑはペンタエリスリトール、ジグリセリンなどの残基であり、ｐ＝４の場合はｖ＝５で、Ｑはキシリトールなどの残基である。
Ｑがオリゴペプチドの残基である場合、該オリゴペプチドは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか１つを含み、かつそれ以外のアミノ酸がシステインを除く中性アミノ酸からなる４～８残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グルタミン酸－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グルタミン酸－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グルタミン酸－グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グルタミン酸－フェニルアラニン－グリシン、グルタミン酸－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グルタミン酸－グリシン－ロイシン－グリシン、グルタミン酸－バリン－シトルリン－グリシン、グルタミン酸－バリン－アラニン－グリシン、グルタミン酸－フェニルアラニン－グリシンなどであり、好ましくはグルタミン酸－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グルタミン酸－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グルタミン酸－バリン－シトルリン－グリシン、グルタミン酸－バリン－アラニン－グリシンであり、より好ましくはグルタミン酸－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グルタミン酸－バリン－シトルリン－グリシンである。該オリゴペプチドはまた、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。該オリゴペプチドはさらに、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドであることが好ましい。なお、該オリゴペプチドの詳細な説明については、上記Ｚのオリゴペプチドの説明を参照されたい。
式（１）中のＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、それぞれ独立して、単結合または２価のスペーサーであるが、これらのスペーサーは共有結合を形成し得る基であれば特に制限は無いが、好ましくは、単結合、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基であり、より好ましくは、単結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基と１～３個のアルキレン基とが結合して形成される基であり、特に好ましい態様は、下記の群（Ｉ）に示されるものである。エステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
群（Ｉ）：
Figure 0007249591000010
式（式（ｚ１）～式（ｚ１３））において、式中のｓは０～１０の整数を示し、好ましくは０～６の整数、更に好ましくは０～３の整数を示す。また、式（ｚ２）～式（ｚ１３）において、式中の２～３個のｓは同一でも、異なっていてもよい。
式（１）中のＬ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４はそれぞれ独立して、上記の群（Ｉ）の（ｚ１）、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）、（ｚ１１）が好ましく、（ｚ１）、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）がより好ましい。
式（１）中のＬ５は、上記の群（Ｉ）の（ｚ１）、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）、（ｚ９）、（ｚ１０）、（ｚ１２）、（ｚ１３）が好ましく、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ１０）、（ｚ１２）、（ｚ１３）がより好ましく、（ｚ３）、（ｚ５）、（ｚ１２）が特に好ましい。
本発明の１つの好ましい実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、単結合、フェニレン基、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、トリアジン基、マレイミドとチオールの結合、オキシム結合、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基である。
本発明の別の好ましい実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－、－ＮＨ－）であり、より好ましくはＬ１が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－）であり、Ｌ２がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基（例、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－）であり、Ｌ３が２級アミノ基（－ＮＨ－）であり、Ｌ４がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基（例、－（ＣＨ２）３－Ｏ－）であり、Ｌ５が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基（例、単結合、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－）である。
式（１）中のｍは、ポリエチレングリコール鎖とオリゴペプチドの結合体を１つの構成単位とした繰り返しユニット数であり、１～７が好ましく、１～５がより好ましく、１～３が更に好ましい。
式（１）中のＤは、生体関連物質であり、特に制限はないが、ヒト又は他の動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療または予防に関わる物質である。具体的にはタンパク質、ペプチド、核酸、細胞、ウィルスなどを含み、好適なタンパク質またはペプチドとしては、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマー、酵素などが挙げられる。
より具体的には、サイトカインとしては、免疫を調整するインターフェロンタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩや、インターロイキンや腫瘍壊死因子、それらの受容体アンタゴニストなどが挙げられる。成長因子としては、造血因子であるエリスロポエチンや刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）などが挙げられ、血液凝固因子としては、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子などが挙げられる。ホルモンとしては、カルシトニンやインスリン、そのアナログやエキセンジン、ＧＬＰ－１、そしてソマトスタチンやヒト成長ホルモンなどが挙げられる。抗体としては、その断片の抗体フラグメントとして、ＦａｂやｓｖＦＶなどが挙げられ、アプタマーとしては、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーなどが挙げられ、酵素としては、スーパーオキシドディスムターゼやウリカーゼなどが挙げられる。これらタンパク質は、血中での安定性が低く、ポリエチレングリコールで修飾し、血中半減期を延長させることが望ましい。好適なタンパク質としては、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、ＧＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、カルシトニン、インスリン、エキセンジン、ヒト成長ホルモン、抗体フラグメントであり、より好ましくは、インスリン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、ＧＣＳＦ、エリスロポエチン、抗体フラグメント（特にＦａｂ）であり、さらに好ましくは、カルシトニン（特にサーモンカルシトニン）、インスリン、ヒト成長ホルモン、ＧＣＳＦであり、特に好ましくはカルシトニン（特にサーモンカルシトニン）、ヒト成長ホルモン、ＧＣＳＦである。
下式（２）は、式（１）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質において、オリゴペプチドであるＺがＣ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴぺプチドである、すなわち、式（１）中のＺがＺ１、Ａおよびグリシン残基で構成される、好適態様のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質を示している。
Figure 0007249591000011
（式中、Ｚ１はシステインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドであり、Ａはシステインを除く中性アミノ酸であり、ａ及びｂはそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり、ｍ、ｎ１及びｎ２、ｐ、Ｒ、Ｑ、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、前記と同義である。）
本発明の式（２）の生体関連物質Ｄに結合したポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は、通常４，０００～１６０，０００であり、好ましくは１０，０００～１２０，０００であり、更に好ましくは３０，０００～８０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（２）におけるポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は３０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
式（２）中のＺ１は、システインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドであり、システインを除く中性アミノ酸からなる２～４残基のオリゴペプチドが好ましく、システインを除く中性アミノ酸からなる２～３残基のオリゴペプチドがより好ましく、また、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸、具体的には、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンを少なくとも1つ有するオリゴペプチドであることが好ましく、フェニルアラニンを有するオリゴペプチドであることが更に好ましい。
式（２）中のＺ１は、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであるが、具体的な例としては、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン、グリシン－フェニルアラニン、バリン－シトルリン、バリン－アラニン、グリシン－グリシンであり、好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン、グリシン－フェニルアラニン、グリシン－グリシン、バリン－シトルリン、バリン－アラニンであり、より好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－フェニルアラニン、バリン－シトルリン、バリン－アラニンであり、さらにより好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン、バリン－シトルリンである。
式（２）中のＡは、システインを除く中性アミノ酸であり、好ましくはハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸であり、具体的にはフェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンであり、より好ましくはフェニルアラニン、ロイシンである。
なお、ｍ、ｎ１及びｎ２、Ｒ、Ｑ、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５の好ましい態様は、上記の式（１）について説明した通りである。
また、下式（３）は、式（２）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質において、ｍ＝１である、好適態様のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質を示している。
Figure 0007249591000012
（式中、ｎ３及びｎ４はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐ、Ｒ、Ｚ１、Ａ、ａ、ｂ、Ｑ、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、前記と同義である。）
本発明の式（３）の生体関連物質Ｄに結合したポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は、通常４，０００～１６０，０００であり、好ましくは１０，０００～１２０，０００であり、更に好ましくは３０，０００～８０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（３）におけるポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は３０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
式（３）中のｎ３とｎ４は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して４５～６８２であり、好ましくはそれぞれ独立して１１３～５６８である。
なお、Ｒ、Ｚ１、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５の好ましい態様は、上記の式（１）および（２）について説明した通りである。
［式（１）の直鎖型のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質］
下式（４）は、式（１）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質において、Ｑがエチレングリコールの残基であり、Ｌ１がＣＨ２ＣＨ２Ｏであり、かつｐが１である、好適態様の直鎖型のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質を示している。
Figure 0007249591000013
（式中、ｎ５及びｎ６はそれぞれ独立して１１３～６８２であり、ｍ、Ｒ、Ｚ、Ｄ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、前記と同義である。）
本発明の式（４）の生体関連物質Ｄに結合したポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は、通常２０，０００～１２０，０００であり、好ましくは２５，０００～８０，０００であり、更に好ましくは３０，０００～６０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（１）におけるポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は３０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
式（４）中のｎ５とｎ６は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して１１３～６８２であり、好ましくはそれぞれ独立して１８０～５２５である。ｎ５とｎ６は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
なお、ｍ、Ｒ、Ｚ、Ｄ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５の好ましい態様は、上記の式（１）について説明した通りである。
また、下式（５）は、式（２）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質において、Ｑがエチレングリコールの残基であり、Ｌ１がＣＨ２ＣＨ２Ｏであり、かつｐが１である、好適態様の直鎖型のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質を示している。
Figure 0007249591000014
（式中、ｎ５及びｎ６はそれぞれ独立して１１３～６８２であり、ｍ、Ｒ、Ｚ１、Ａ、ａ、ｂ、Ｄ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、前記と同義である。）
式（５）中のｎ５とｎ６は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して１１３～６８２であり、好ましくはそれぞれ独立して１８０～５２５である。ｎ５とｎ６は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
本発明の式（５）の生体関連物質Ｄに結合したポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は、通常２０，０００～６０，０００であり、好ましくは２５，０００～５５，０００であり、更に好ましくは３０，０００～５０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（５）におけるポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は３０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
なお、ｍ、Ｒ、Ｚ１、Ａ、Ｄ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５の好ましい態様は、上記の式（１）および（２）について説明した通りである。
また、下式（６）は、式（３）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質において、Ｑがエチレングリコールの残基であり、Ｌ１がＣＨ２ＣＨ２Ｏであり、かつｐが１である、好適態様の直鎖型のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質を示している。
Figure 0007249591000015
（式中、ｎ７及びｎ８はそれぞれ独立して２２６～６８２であり、Ｒ、Ｚ１、Ａ、ａ、ｂ、Ｄ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、前記と同義である。）
本発明の式（６）の生体関連物質Ｄに結合したポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は、通常２０，０００～６０，０００であり、好ましくは２５，０００～５５，０００であり、更に好ましくは３０，０００～５０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（３）におけるポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量は３０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
式（６）中のｎ７とｎ８は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して２２６～６８２であり、好ましくはそれぞれ独立して３４０～５６８である。ｎ７とｎ８は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
なお、Ｒ、Ｚ１、Ａ、Ｄ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５の好ましい態様は、上記の式（１）および（２）について説明した通りである。
［式（１）の分岐型のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質］
式（１）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質のうち、ｐが２～４であり、かつＱが３～５個の活性水素を持つ化合物の残基であるポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、好適態様の分岐型のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である。
Ｑの３～５個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式（１）について説明した通りである。
なお、ｍ、Ｒ、Ｚ、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５の好ましい態様は、上記の式（１）について説明した通りである。
また、式（２）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質のうち、ｐが２～４であり、かつＱが３～５個の活性水素を持つ化合物の残基であるポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、好適態様の分岐型のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である。
Ｑの３～５個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式（１）について説明した通りである。
なお、ｍ、Ｒ、Ｚ１、Ａ、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５の好ましい態様は、上記の式（１）および（２）について説明した通りである。
さらに、式（３）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質のうち、ｎ３及びｎ４がそれぞれ独立して１１３～６８２であり、ｐが２～４であり、かつＱが３～５個の活性水素を持つ化合物の残基であるポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、好適態様の分岐型のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である。
ｎ３とｎ４は、それぞれ、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、好ましくはそれぞれ独立して２２６～４５５である。ｎ３とｎ４は、異なっていても良く、また同じであっても良い。
Ｑの３～５個の活性水素を持つ化合物の残基は、好ましくは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基、あるいはオリゴペプチドの残基であり、特に好ましくはリジン、グルタミン酸の残基である。ここで、該オリゴペプチドの好ましい態様は、上記の式（１）について説明した通りである。
なお、Ｒ、Ｚ１、Ａ、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５の好ましい態様は、上記の式（１）および（２）について説明した通りである。
本発明の式（１）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（１－１）］
ｍが１～３であり；
ｎ１及びｎ２がそれぞれ独立して１１３～５６８であり；
ｐが１または２であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚがシステインを除く中性アミノ酸からなる２～４残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－グリシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、フェニルアラニン－グリシン）であり；
Ｑがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007249591000016
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ５）および（ｚ６）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）から選ばれるスペーサー］（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－、－ＮＨ－）である；
式（１）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（１－２）］
ｍが１～３であり；
ｎ１及びｎ２がそれぞれ独立して１１３～５６８であり；
ｐが１または２であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚがシステインを除く中性アミノ酸からなる２～４残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－グリシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、フェニルアラニン－グリシン）であり；
Ｑがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ１が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000017
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ２）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）］（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－）であり；
Ｌ２がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000018
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－）であり；
Ｌ３が２級アミノ基（－ＮＨ－）であり；
Ｌ４がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000019
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－（ＣＨ２）３－Ｏ－）であり；
Ｌ５が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000020
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ３）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）］（例、単結合、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－）である；
式（１）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
本発明の式（２）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質が挙げられる。［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（２－１）］
ｍが１～３であり；
ｐが１または２であり；
ｎ１及びｎ２がそれぞれ独立して１１３～５６８であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚ１がシステインを除く中性アミノ酸からなる２～３残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン、グリシン－フェニルアラニン、グリシン－グリシン、バリン－シトルリン、バリン－アラニン）であり；
Ａがフェニルアラニンまたはロイシンであり；
ａ及びｂがそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり；
Ｑがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007249591000021
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ５）および（ｚ６）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）から選ばれるスペーサー］（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－、－ＮＨ－）である；
式（２）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（２－２）］
ｍが１～３であり；
ｐが１または２であり；
ｎ１及びｎ２がそれぞれ独立して１１３～５６８であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚ１がシステインを除く中性アミノ酸からなる２～３残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン、グリシン－フェニルアラニン、グリシン－グリシン、バリン－シトルリン、バリン－アラニン）であり；
Ａがフェニルアラニンまたはロイシンであり；
ａ及びｂがそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり；
Ｑがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ１が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000022
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ２）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）］（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－）であり；
Ｌ２がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000023
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－）であり；
Ｌ３が２級アミノ基（－ＮＨ－）であり；
Ｌ４がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000024
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－（ＣＨ２）３－Ｏ－）であり；
Ｌ５が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000025
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ３）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）］（例、単結合、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－）である；
式（２）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
本発明の式（３）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質が挙げられる。［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（３－１）］
ｐが１または２であり；
ｎ３及びｎ４がそれぞれ独立して３４０～５６８であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚ１がシステインを除く中性アミノ酸からなる２～３残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン、グリシン－フェニルアラニン、グリシン－グリシン、バリン－シトルリン、バリン－アラニン）であり；
Ａがフェニルアラニンまたはロイシンであり；
ａ及びｂがそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり；
Ｑがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007249591000026
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ５）および（ｚ６）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）から選ばれるスペーサー］（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－、－ＮＨ－）である；
式（３）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（３－２）］
ｐが１または２であり；
ｎ３及びｎ４がそれぞれ独立して３４０～５６８であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚ１がシステインを除く中性アミノ酸からなる２～３残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン、グリシン－フェニルアラニン、グリシン－グリシン、バリン－シトルリン、バリン－アラニン）であり；
Ａがフェニルアラニンまたはロイシンであり；
ａ及びｂがそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり；
Ｑがエチレングリコールの残基またはリジンの残基であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ１が単結合、エーテル結合またはエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000027
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ２）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）］（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－）であり；
Ｌ２がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000028
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－）であり；
Ｌ３が２級アミノ基（－ＮＨ－）であり；
Ｌ４がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000029
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－（ＣＨ２）３－Ｏ－）であり；
Ｌ５が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000030
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ３）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）］（例、単結合、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－）である；
式（３）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
本発明の式（４）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質が挙げられる。［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（４－１）］
ｍが１～３であり；
ｎ５及びｎ６がそれぞれ独立して１８０～５２５であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚがシステインを除く中性アミノ酸からなる２～４残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－グリシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、フェニルアラニン－グリシン）であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007249591000031
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ５）および（ｚ６）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）から選ばれるスペーサー］（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－、－ＮＨ－）である；
式（４）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（４－２）］
ｍが１～３であり；
ｎ５及びｎ６がそれぞれ独立して１８０～５２５であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚがシステインを除く中性アミノ酸からなる２～４残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－グリシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、フェニルアラニン－グリシン）であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ２がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000032
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－）であり；
Ｌ３が２級アミノ基（－ＮＨ－）であり；
Ｌ４がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000033
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－（ＣＨ２）３－Ｏ－）であり；
Ｌ５が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000034
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ３）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）］（例、単結合、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－）である；
式（４）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
本発明の式（５）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質が挙げられる。［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（５－１）］
ｍが１～３であり；
ｎ５及びｎ６がそれぞれ独立して１８０～５２５であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚ１がシステインを除く中性アミノ酸からなる２～３残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン、グリシン－フェニルアラニン、グリシン－グリシン、バリン－シトルリン、バリン－アラニン）であり；
Ａがフェニルアラニンまたはロイシンであり；
ａ及びｂがそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007249591000035
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ５）および（ｚ６）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）から選ばれるスペーサー］（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－、－ＮＨ－）である；
式（５）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（５－２）］
ｍが１～３であり；
ｎ５及びｎ６がそれぞれ独立して１８０～５２５であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚ１がシステインを除く中性アミノ酸からなる２～３残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン、グリシン－フェニルアラニン、グリシン－グリシン、バリン－シトルリン、バリン－アラニン）であり；
Ａがフェニルアラニンまたはロイシンであり；
ａ及びｂがそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ２がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000036
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－）であり；
Ｌ３が２級アミノ基（－ＮＨ－）であり；
Ｌ４がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000037
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－（ＣＨ２）３－Ｏ－）であり；
Ｌ５が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000038
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ３）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）］（例、単結合、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－）である；
式（５）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
本発明の式（６）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質の好適な例としては、以下のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質が挙げられる。
［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（６－１）］
ｎ７及びｎ８がそれぞれ独立して３４０～５６８であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚ１がシステインを除く中性アミノ酸からなる２～３残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン、グリシン－フェニルアラニン、グリシン－グリシン、バリン－シトルリン、バリン－アラニン）であり；
Ａがフェニルアラニンまたはロイシンであり；
ａ及びｂがそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５がそれぞれ独立して、単結合、アミド結合、エーテル結合、２級アミノ基、カルボニル基、またはこれらの結合および基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、それぞれ独立して、
Figure 0007249591000039
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ５）および（ｚ６）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）から選ばれるスペーサー］（例、単結合、－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－、－ＮＨ－）である；
式（６）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
［ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質（６－２）］
ｎ７及びｎ８がそれぞれ独立して３４０～５６８であり；
Ｒが炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）であり；
Ｚ１がシステインを除く中性アミノ酸からなる２～３残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン、グリシン－フェニルアラニン、グリシン－グリシン、バリン－シトルリン、バリン－アラニン）であり；
Ａがフェニルアラニンまたはロイシンであり；
ａ及びｂがそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり；
Ｄがカルシトニン、ヒト成長ホルモンまたは顆粒球コロニー刺激因子であり；
Ｌ２がカルボニル基またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000040
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－ＣＯ－、－（ＣＨ２）５－ＣＯ－）であり；
Ｌ３が２級アミノ基（－ＮＨ－）であり；
Ｌ４がエーテル結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000041
（式中、２個のｓは同一でも異なっていてもよく、０～６の整数である。）］（例、－（ＣＨ２）３－Ｏ－）であり；
Ｌ５が単結合またはアミド結合を含んでいてもよいアルキレン基［好ましくは、
Figure 0007249591000042
（式中、ｓは０～６の整数であり、（ｚ３）中の２個のｓは同一でも異なっていてもよい。）］（例、単結合、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）３－）である；
式（６）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
本発明の式（１）のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、下式（７）で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体と生体関連物質を反応させることによって得ることができる。
Figure 0007249591000043
（式中、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、ｍ、ｎ１及びｎ２、ｐ、Ｒ、Ｚ、Ｑ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は前記と同義である。）
式（７）中のＸは、化学修飾の対象となる生理活性タンパク質、ペプチド、抗体、核酸などの生体関連物質に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基であれば特に制限されない。例えば、「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」、「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」および「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland, 2009」などに記載されている官能基が挙げられる。
式（７）中のＸで示される「生体関連物質と反応可能な官能基」は、生体関連物質が有するアミノ基、メルカプト基、アルデヒド基、カルボキシル基、不飽和結合またはアジド基などの官能基と化学結合可能な官能基であれば特に制限されない。具体的には、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ジチオピリジル基、置換スルホネート基、ビニルスルホン基、アミノ基、オキシアミノ基、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、アクリル基、スルホニルオキシ基、α－ハロアセチル基、アリル基、ビニル基等が挙げられ、好ましくは、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、チオール基、ジチオピリジル基、α－ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基であり、より好ましくは活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基であり、特に好ましくはアルデヒド基、マレイミド基およびアミノ基である。
好適な実施形態において、かかる官能基Ｘは、下記の群（ＩＩ）、群（ＩＩＩ）、群（ＩＶ）、群（Ｖ）、群（ＶＩ）および群（ＶＩＩ）に分類することができる。
群（ＩＩ）：生体関連物質が有するアミノ基と反応可能な官能基
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、(k)
群（ＩＩＩ）：生体関連物質が有するメルカプト基と反応可能な官能基
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)
群（ＩＶ）：生体関連物質が有するアルデヒドと反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(n)、(p)
群（Ｖ）：生体関連物質が有するカルボキシル基と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(n)、(p)
群（ＶＩ）：生体関連物質が有する不飽和結合と反応可能な官能基
下記の(h)、(m)、(o)
群（ＶＩＩ）：生体関連物質が有するアジド基と反応可能な官能基
下記の(l)
Figure 0007249591000044
官能基(j)において、式中のＷは塩素原子（Ｃｌ）、臭素原子（Ｂｒ）またはヨウ素原子（Ｉ）などのハロゲン原子を示し、好ましくはＢｒ、Ｉ、より好ましくはＩである。
また、官能基(e)及び官能基(l)において、式中のＹ１、Ｙ３は、それぞれ独立して、水素原子または炭素数１～５の炭化水素基を示し、好ましくは炭素数１～５の炭化水素基である。炭素数１～５の炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基である。
また、官能基(k)において、式中のＹ２はフッ素原子を含んでいてもよい炭素数が１～１０の炭化水素基を示し、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、４－メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、４－（トリフルオロメトキシ）フェニル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、４－メチルフェニル基、２，２，２－トリフルオロエチル基である。
活性エステル基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したエステル基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性エステル基は、好ましくはＮ－ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したエステル基である。
活性カーボネート基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したカーボネート基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール等から誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性カーボネート基は、好ましくはニトロフェノールまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したカーボネート基である。
置換マレイミド基とは、マレイミド基の二重結合の片方の炭素原子に炭化水素基が結合しているマレイミド基である。炭化水素基は、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基である。
置換スルホネート基とは、スルホネート基の硫黄原子にフッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基が結合しているスルホネート基である。フッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、４－メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、４－（トリフルオロメトキシ）フェニル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、４－メチルフェニル基、２，２，２－トリフルオロエチル基である。
本発明のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質に用いられる分解性ポリエチレングリコール誘導体は、例えば、直鎖型である場合、次のような工程図（工程図（Ｉ））に示すルートにより製造することができる。
工程図（Ｉ）
Figure 0007249591000045
（工程中、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２はポリエチレングリコール誘導体であり、Ｐｅｐｔｉｄｅはオリゴペプチドであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はポリエチレングリコール誘導体のオリゴペプチドと反応することができる官能基であり、Ｐｒｏは保護基であり、Ｒは前記と同義である。）
工程図（Ｉ）のＰＥＧ１、ＰＥＧ２は、ポリエチレングリコール誘導体であり、それぞれの分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるｎ１、ｎ２で定義したとおりであり、つまりｎが１１３～６８２であることから、その分子量の範囲は、５０００～３００００である。
工程図（Ｉ）のＰｅｐｔｉｄｅは、前記Ｚと同義のオリゴペプチドである。工程図（Ｉ）では、Ｎ末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチド、またはＣ末端のカルボキシル基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いる。
工程図（Ｉ）のＸ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｐｅｐｔｉｄｅのカルボキシル基、またはアミノ基と反応可能なポリエチレングリコール誘導体の官能基である。
工程図（Ｉ）のＰｒｏは、保護基であり、ここで保護基とは、ある反応条件下で分子中の特定の化学反応可能な官能基の反応を防止または阻止する成分である。保護基は、保護される化学反応可能な官能基の種類、使用される条件および分子中の他の官能基もしくは保護基の存在により変化する。保護基の具体的な例は多くの一般的な成書に見出すことができるが、例えば「Wuts, P. G. M.; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley－Interscience: New York, 2007」に記載されている。また、保護基で保護された官能基は、それぞれの保護基に適した反応条件を用いて脱保護、すなわち化学反応させることで、元の官能基を再生させることができる。保護基の代表的な脱保護条件は前述の文献に記載されている。
工程図（Ｉ）のポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドとの反応については、特に制限は無く、ポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドは化学反応によって共有結合で結合される。オリゴペプチドとポリエチレングリコールとの結合は、反応に使用される官能基の組み合わせによって決定されるが、基本的には、前記Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５で示した２価のスペーサーであるウレタン結合やアミド結合を含むアルキレン基などによる結合である。
工程図（Ｉ）の反応Ａ－１は、片末端を保護基で保護されたオリゴペプチドと、片末端がＲであるポリエチレングリコール誘導体の反応であり、続く脱保護Ｂ－１にて、片末端にＲ、片末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図（Ｉ）の反応Ｃ－１は、片末端を保護基で保護されたポリエチレングリコール誘導体と、脱保護Ｂ－１にて得られた末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護Ｄ－１にて、２つのポリエチレングリコール鎖と１つのオリゴペプチドが連結したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図（Ｉ）の反応Ａ－２は、片末端を保護基で保護されたオリゴペプチドと、脱保護Ｄ－１にて得られた２つのポリエチレングリコール鎖と１つのオリゴペプチドが連結したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護Ｂ－２にて、末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図（Ｉ）の反応Ｃ－２は、片末端を保護基で保護されたポリエチレングリコール誘導体と、脱保護Ｂ－２にて得られた末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護Ｄ－２にて、３つのポリエチレングリコール鎖と２つのオリゴペプチドが連結したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図（Ｉ）の反応Ａ→脱保護Ｂ→反応Ｃ→脱保護Ｄのサイクルを繰り返すことで、本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の２価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体を合成する典型的な例としては、以下のような工程が挙げられる。ここでは工程図（Ｉ）の代表例として、Ｎ末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いた合成方法を説明する。以降の工程のスペーサーＬ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２は、前記Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５で示した２価のスペーサーと同義である。
Figure 0007249591000046
反応Ａ－１は、Ｎ末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、片末端がＲであるポリエチレングリコール誘導体（４）のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体（５）を得る工程である。
オリゴペプチドのＮ末端のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびｔ－ブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
縮合反応としては、特に制限は無いが、縮合剤を用いる反応が望ましい。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミド系の縮合剤を単独で使用しても良く、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）等の試薬と併用しても良い。また、より反応性の高いＨＡＴＵやＨＢＴＵ、ＴＡＴＵ，ＴＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＤＭＴ－ＭＭ等の縮合剤を使用しても良い。また反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したオリゴペプチドや縮合剤などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
Figure 0007249591000047
脱保護Ｂ－１は、反応Ａ－１で得られたポリエチレングリコール誘導体（５）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（６）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ６の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
Figure 0007249591000048
反応Ｃ－１は、脱保護Ｂ－１で得られたポリエチレングリコール誘導体（６）のアミノ基と、ポリエチレングリコール誘導体（７）の活性エステル基または活性カーボネート基を反応で結合させ、２本のポリエチレングリコール鎖がオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体（８）を得る工程である。
ポリエチレングリコール誘導体（７）は、片末端に保護基で保護されたアミノ基を有し、もう片末端に活性エステル基または活性カーボネート基などを有する。活性エステル基と活性カーボネート基の脱離基としては、スクシンイミジルオキシ基、フタルイミジルオキシ基、4－ニトロフェノキシ基、1－イミダゾリル基、ペンタフルオロフェノキシ基、ベンゾトリアゾール－1－イルオキシ基および7－アザベンゾトリアゾール－1－イルオキシ基などが挙げられる。また、ポリエチレングリコール誘導体（７）は、必ずしも活性化された官能基を有している必要は無く、末端にカルボキシル基を有する場合は、反応Ａ－１と同様に、縮合剤を用いた反応を用いることができる。反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。ポリエチレングリコール誘導体（７）の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9－フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびｔ－ブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体（８）の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開２０１４－２０８７８６、特開２０１１－７９９３４に記載の精製技術を用いることができる。
Figure 0007249591000049
脱保護Ｄ－１は、反応Ｃ－１で得られたポリエチレングリコール誘導体（８）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（９）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ６、Ｌ７、Ｌ８の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
Figure 0007249591000050
反応Ａ－２は、Ｎ末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、脱保護Ｂ－１で得られたポリエチレングリコール誘導体（９）のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体（１０）を得る工程である。前記反応Ａ－１と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007249591000051
脱保護Ｂ－２は、反応Ａ－２で得られたポリエチレングリコール誘導体（１０）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（１１）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ６、Ｌ７、Ｌ８の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護Ｂ－１と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007249591000052
反応Ｃ－２は、脱保護Ｂ－２で得られたポリエチレングリコール誘導体（１１）のアミノ基と、ポリエチレングリコール誘導体（７）の活性エステル基または活性カーボネート基を反応で結合させ、３本のポリエチレングリコール鎖が２つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体（１２）を得る工程である。前記反応Ｃ－１と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007249591000053
脱保護Ｄ－２は、反応Ｃ－２で得られたポリエチレングリコール誘導体（１２）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（１３）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ６、Ｌ７、Ｌ８の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護Ｄ－１と同条件で反応と精製が可能である。
以上の反応をまとめると、以下の工程図（ＩＩ）になる。反応Ａ→脱保護Ｂ→反応Ｃ→脱保護Ｄのサイクルを繰り返すことで、（９）、（１３）、（１４）、（１５）の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図（ＩＩ）
Figure 0007249591000054
工程図（ＩＩ）で得られた（９）、（１３）、（１４）、（１５）の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、具体的に以下に該当する。
ポリエチレングリコール誘導体（９）：２本のポリエチレングリコール鎖が１つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体（１３）：３本のポリエチレングリコール鎖が２つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体（１４）：４本のポリエチレングリコール鎖が３つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体（１５）：５本のポリエチレングリコール鎖が４つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
得られた（９）、（１３）、（１４）、（１５）の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、末端にアミノ基を有しており、これを利用して様々な官能基に変換が可能である。その反応については後述する。
また、工程図（ＩＩ）の反応Ｃ－１、反応Ｃ－２、反応Ｃ－３、反応Ｃ－４において使用したポリエチレングリコール誘導体（７）のアミノ基の保護基を、例えば、アルデヒド基の保護基であるアセタール基（具体的には、３，３－ジエトキシプロピル基等）や、カルボキシル基の保護基であるアルキルエステル系保護基（具体的には、メチルエステル、t－ブチルエステル、ベンジルエステル等）などに変更することで、異なる官能基を有した分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。この場合、脱保護Ｄ－１、脱保護Ｄ－２、脱保護Ｄ－３、脱保護Ｄ－４において、それぞれの保護基に適した従来公知の方法を用いて脱保護を行うことで、目的物を得ることができる。
ポリエチレングリコール誘導体（７）に替わるポリエチレングリコール誘導体については、例えば以下の構造のものが挙げられる。
Figure 0007249591000055
Figure 0007249591000056
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体の異なる製法としては、例えば次のような工程図（工程図（ＩＩＩ））に示すルートによっても製造することができる。
工程図（ＩＩＩ）
Figure 0007249591000057
（工程中、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３はポリエチレングリコール誘導体であり、Ｐｅｐｔｉｄｅはオリゴペプチドであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５はポリエチレングリコール誘導体の官能基であり、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３は保護基であり、Ｒは前記と同義である。）
工程図（ＩＩＩ）のＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３は、ポリエチレングリコール誘導体であり、それぞれの分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるｎ１、ｎ２で定義したとおりであり、つまりｎが１１３～６８２であることから、その分子量の範囲は、５０００～３００００である。
工程図（ＩＩＩ）のＰｅｐｔｉｄｅは、前記Ｚと同義のオリゴペプチドである。工程図（ＩＩＩ）では、Ｎ末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチド、またはＣ末端のカルボキシル基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いる。
工程図（ＩＩＩ）のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５は、Ｐｅｐｔｉｄｅのカルボキシル基、またはアミノ基と反応可能なポリエチレングリコール誘導体の官能基である。
工程図（ＩＩＩ）のＰｒｏ、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ３は、保護基であり、工程図（ＩＩＩ）では、ＰｒｏはＰｒｏ２の脱保護条件で安定な保護基であり、また、Ｐｒｏ２はＰｒｏ３の脱保護条件で安定な保護基である。これら保護基の組み合わせは、例えば「Wuts, P. G. M.; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley－Interscience: New York, 2007」に記載されている保護基から選択することができる。
工程図（ＩＩＩ）のポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドとの反応については、特に制限は無く、ポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドは化学反応によって共有結合で結合される。オリゴペプチドとポリエチレングリコールとの結合は、反応に使用される官能基の組み合わせによって決定されるが、基本的には、前記Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５で示した２価のスペーサーであるウレタン結合やアミド結合を含むアルキレン基などによる結合である。
工程図（ＩＩＩ）の反応Ｅは、片末端を保護基Ｐｒｏ３で保護されたオリゴペプチドと、片末端を保護基Ｐｒｏ２で保護されたポリエチレングリコール誘導体の反応である。続く脱保護Ｆにて、ペプチド側の保護基Ｐｒｏ３のみを脱保護して、片末端にオリゴペプチド、片末端に保護基Ｐｒｏ２を有したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図（ＩＩＩ）の反応Ｇ－１は、片末端を保護基Ｐｒｏで保護されたポリエチレングリコール誘導体と、脱保護Ｆにて得られた片末端にオリゴペプチド、片末端に保護基Ｐｒｏ２を有したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護Ｈ－１にて、ポリエチレングリコール誘導体の片側の保護基Ｐｒｏ２のみを脱保護して、２つのポリエチレングリコール鎖と１つのオリゴペプチドが連結したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図（ＩＩＩ）の反応Ｇ－２は、脱保護Ｈ－１にて得られた片末端を保護基Ｐｒｏで保護されたポリエチレングリコール誘導体と、脱保護Ｆにて得られた片末端にオリゴペプチド、片末端に保護基Ｐｒｏ２を有したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護Ｈ－２にて、ポリエチレングリコール誘導体の片側の保護基Ｐｒｏ２のみを脱保護して、３つのポリエチレングリコール鎖と２つのオリゴペプチドが連結したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図（ＩＩＩ）の反応Ｅ後の脱保護Ｆによって得られた片末端にオリゴペプチド、片末端に保護基Ｐｒｏ２を有したポリエチレングリコール誘導体を反応Ｇ－１、Ｇ－２、Ｇ－３の工程で原料として用い、反応Ｇと脱保護Ｈの反応を繰り返すことで、本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体の前駆体を効率良く得ることができる。
工程図（ＩＩＩ）の反応Ａ－１と脱保護Ｂ－１は、前記の工程図（Ｉ）と同じであり、片末端にＲ、片末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
工程図（ＩＩＩ）の反応Ｊは、反応Ｇと脱保護Ｈの反応を繰り返して得られた片末端を保護基Ｐｒｏで保護されたポリエチレングリコール誘導体（前駆体）と、脱保護Ｂ－１にて得られた片末端にＲ、片末端にオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体との反応である。続く脱保護Ｋにて、本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の２価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体を合成する典型的な例としては、以下のような工程が挙げられる。ここでは工程図（ＩＩＩ）の代表例として、Ｎ末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いた合成方法を説明する。
Figure 0007249591000058
反応Ｅは、Ｎ末端のアミノ基が保護基Ｐｒｏ３で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、片末端のカルボキシル基が保護基Ｐｒｏ２で保護されたポリエチレングリコール誘導体（１６）のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体（１７）を得る工程である。
オリゴペプチドのＮ末端のアミノ基の保護基Ｐｒｏ３は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、9－フルオレニルメチルオキシカルボニル基等が挙げられる。次にポリエチレングリコール誘導体（１６）のカルボキシル基の保護基Ｐｒｏ２は、特に制限はないが、ｔ－ブチル基などが挙げられる。
前記反応Ａ－１と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007249591000059
脱保護Ｆは、反応Ｅで得られたポリエチレングリコール誘導体（１７）のアミノ基の保護基Ｐｒｏ３を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（１８）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、保護基Ｐｒｏ２やオリゴペプチドやＬ９、Ｌ１０の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。例えば、具体的には、Ｐｒｏ３が９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、Ｐｒｏ２がｔ－ブチル基の場合、ピペリジンなどの適切な塩基化合物を用いることで、Ｐｒｏ３を選択的に脱保護することができる。前記脱保護Ｂ－１と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007249591000060
反応Ｇ－１は、脱保護Ｆで得られたポリエチレングリコール誘導体（１８）のアミノ基と、ポリエチレングリコール誘導体（７）の活性エステル基または活性カーボネート基を反応で結合させ、２本のポリエチレングリコール鎖が１つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体（１９）を得る工程である。ポリエチレングリコール誘導体（７）は前記のとおりである。前記反応Ｃ－１と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007249591000061
脱保護Ｈ－１は、反応Ｇ－１で得られたポリエチレングリコール誘導体（１９）のカルボキシル基の保護基Ｐｒｏ２を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（２０）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、保護基ＰｒｏやオリゴペプチドやＬ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。例えば、具体的には、Ｐｒｏがトリフルオロアセチル基、Ｐｒｏ２がｔ－ブチル基の場合、適切な酸性化合物を用いた条件にて、Ｐｒｏ２を選択的に脱保護することができる。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
Figure 0007249591000062
反応Ｇ－２は、脱保護Ｆで得られたポリエチレングリコール誘導体（１８）のアミノ基と、脱保護Ｈ－１で得られたポリエチレングリコール誘導体（２０）のカルボキシル基を縮合反応させ、３本のポリエチレングリコール鎖が２つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体（２１）を得る工程である。前記反応Ｃ－１と同条件で反応と精製が可能である。
前記反応Ａ－１と同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体（２１）の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開２０１４－２０８７８６、特開２０１１－７９９３４に記載の精製技術を用いることができる。
Figure 0007249591000063
脱保護Ｈ－２は、反応Ｇ－２で得られたポリエチレングリコール誘導体（２１）のカルボキシル基の保護基Ｐｒｏ２を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（２２）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、保護基ＰｒｏやオリゴペプチドやＬ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。
以上の反応をまとめると以下の工程図（ＩＶ）になる。反応Ｅと脱保護Ｆで得られたポリエチレングリコール誘導体（１８）を原料に用いて、反応Ｇ→脱保護Ｈのサイクルを繰り返すことで、例えば４本のポリエチレングリコール鎖が３つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体（２３）や、５本のポリエチレングリコール鎖が４つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体（２４）等、本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体の中間体を得ることができる。
工程図（ＩＶ）
Figure 0007249591000064
工程図（ＩＶ）で得られた（２０）、（２２）、（２３）、（２４）のポリエチレングリコール誘導体は、具体的に以下に該当する。
ポリエチレングリコール誘導体（２０）：２本のポリエチレングリコール鎖が１つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体（２２）：３本のポリエチレングリコール鎖が２つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体（２３）：４本のポリエチレングリコール鎖が３つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
ポリエチレングリコール誘導体（２４）：５本のポリエチレングリコール鎖が４つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体
次に、工程図（ＩＶ）で得られた（２０）、（２２）、（２３）、（２４）のポリエチレングリコール誘導体を原料に、以下の反応Ｊおよび脱保護Ｋを行うことで、分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。以下の工程は、ポリエチレングリコール誘導体（２４）を用いた場合を示す。
Figure 0007249591000065
反応Ｊは、前記脱保護Ｂ－１で得られたポリエチレングリコール誘導体（６）のアミノ基と、脱保護Ｈ－４で得られたポリエチレングリコール誘導体（２４）のカルボキシル基を縮合反応させ、６本のポリエチレングリコール鎖が５つのオリゴペプチドで繋がれた構造であるポリエチレングリコール誘導体（２５）を得る工程である。前記反応Ｃ－１と同条件で反応と精製が可能である。
前記反応Ａ－１と同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
ポリエチレングリコール誘導体（２５）の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開２０１４－２０８７８６、特開２０１１－７９９３４に記載の精製技術を用いることができる。
Figure 0007249591000066
脱保護Ｋは、反応Ｊで得られたポリエチレングリコール誘導体（２５）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（２６）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護Ｄ－１と同条件で反応と精製が可能である。
本発明のポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質に用いられる分解性ポリエチレングリコール誘導体の異なる製法としては、例えば、分岐型である場合、次のような工程図（工程図（Ｖ））に示すル－トによって製造することができる。ここでは、工程（Ｉ）または工程（ＩＩＩ）で得られた分解性ポリエチレングリコールと、３～５個の活性水素を持つ化合物の残基であるＱとの反応により、分岐型の分解性ポリエチレングリコールを得るものである。
工程図（Ｖ）
Figure 0007249591000067
（工程中、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２はポリエチレングリコール誘導体であり、Ｐｅｐｔｉｄｅはオリゴペプチドであり、Ｑは３～５個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Ｘ６、Ｘ７は官能基であり、Ｐｒｏは保護基であり、ｐは２～４であり、Ｒは前記と同義である。）
工程図（Ｖ）のＰＥＧ１、ＰＥＧ２は、ポリエチレングリコール誘導体であり、それぞれの分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるｎ１、ｎ２で定義したとおりであり、つまりｎが４５～６８２であることから、その分子量の範囲は、２０００～３００００である。
工程図（Ｖ）のＰｅｐｔｉｄｅは、前記Ｚと同義のオリゴペプチドである。
工程図（Ｖ）のＱは、前記Ｑと同義の３～５個の活性水素を持つ化合物の残基である。
工程図（Ｖ）のＸ６は、Ｑの活性水素を有した官能基である水酸基、カルボキシル基、またはアミノ基などと反応可能なポリエチレングリコール誘導体の官能基であり、Ｘ７はＱに結合した生体関連物質と反応可能な官能基である。
工程図（Ｖ）のＱと分解性ポリエチレングリコール誘導体との反応については、特に制限は無いが、Ｑと分解性ポリエチレングリコール誘導体とは化学反応によって共有結合で結合される。Ｑと分解性ポリエチレングリコール誘導体との結合は、反応に使用される官能基の組み合わせによって決定されるが、基本的には、前記Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５などで示した２価のスペーサーであるウレタン結合やアミド結合を含むアルキレン基などによる結合である。
工程図（Ｖ）の反応Ｌは、３～５個の活性水素を持つ化合物の残基であるＱの活性水素を有した１つの官能基を保護基Ｐｒｏで保護されたＱと、前記工程（Ｉ）または工程（ＩＩＩ）で得られた片末端がＲである分解性ポリエチレングリコール誘導体の反応である。続く脱保護Ｍにて、Ｑの保護基Ｐｒｏを脱保護して、分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の２価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体を合成する典型的な例としては、以下のような工程が挙げられる。ここでは工程図（Ｖ）の代表例として、３個の活性水素を持つ化合物であるグルタミン酸の残基をＱとして用いた場合の合成方法を説明する。
Figure 0007249591000068
反応Ｌは、例えば、脱保護Ｄ－１で得られたポリエチレングリコール誘導体（９）のアミノ基と、アミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、２本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である分岐型のポリエチレングリコール誘導体（２７）を得る工程である。前記反応Ｇ－２と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007249591000069
脱保護Ｍは、反応Ｌで得られたポリエチレングリコール誘導体（２７）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（２８）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ６、Ｌ７、Ｌ８の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護Ｄ－１と同条件で反応と精製が可能である。
本発明の分岐型である分解性ポリエチレングリコール誘導体の異なる製法としては、例えば次のような工程図（工程図（ＶＩ））に示すル－トによって製造することができる。ここでは、工程（Ｉ）と工程（ＩＩＩ）で得られた片末端にペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体と、３～５個の活性水素を持つ化合物の残基であるＱにポリエチレングリコールが結合した分岐型ポリエチレングリコール誘導体との反応により、分岐型の分解性ポリエチレングリコールを得るものである。
工程図（ＶＩ）
Figure 0007249591000070
（工程中、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３はポリエチレングリコール誘導体であり、Ｐｅｐｔｉｄｅはオリゴペプチドであり、Ｑは３～５個の活性水素を持つ化合物の残基であり、Ｘ８、Ｘ９は官能基であり、Ｐｒｏは保護基であり、ｐは２～４であり、Ｒは前記と同義である。）
工程図（ＶＩ）のＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３は、ポリエチレングリコール誘導体であり、それぞれの分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるｎ１、ｎ２で定義したとおりであり、つまりｎが４５～６８２であることから、その分子量の範囲は、２０００～３００００である。
工程図（ＶＩ）のＰｅｐｔｉｄｅは、前記Ｚと同義のオリゴペプチドである。
工程図（ＶＩ）のＸ８は、Ｐｅｐｔｉｄｅのカルボキシル基、またはアミノ基と反応可能なポリエチレングリコール誘導体の官能基であり、Ｘ９はＱに結合した生体関連物質と反応可能な官能基である。
工程図（ＶＩ）の片末端にペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体と、３～５個の活性水素を持つ化合物の残基であるＱにポリエチレングリコールが結合した分岐型ポリエチレングリコール誘導体との反応については、特に制限は無いが、これらポリエチレングリコール誘導体は化学反応によって共有結合で結合される。分岐型ポリエチレングリコール誘導体と分解性ポリエチレングリコール誘導体との結合は、反応に使用される官能基の組み合わせによって決定されるが、基本的には、前記Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５などで示した２価のスペーサーであるウレタン結合やアミド結合を含むアルキレン基などによる結合である。
工程図（ＶＩ）の反応Ｎは、３～５個の活性水素を持つ化合物の残基であるＱの１つの官能基を保護基Ｐｒｏで保護された分岐型ポリエチレングリコール誘導体と、前記工程（Ｉ）または工程（ＩＩＩ）で得られた片末端にペプチドを有し、もう片末端がＲであるポリエチレングリコール誘導体の反応である。続く脱保護Ｐにて、Ｑの保護基Ｐｒｏを脱保護して、分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、必要に応じて末端官能基を化学変換することができる。この官能基変換に用いられる反応は、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドや、前記の２価のスペーサーが分解しない条件を適切に選択しなければならない。
当該分解性ポリエチレングリコール誘導体を合成する典型的な例としては、以下のような工程が挙げられる。ここでは工程図（ＶＩ）の代表例として、Ｑがグリセリン残基である分岐型のポリエチレングリコール誘導体を原料に用いた合成方法を説明する。
Figure 0007249591000071
反応Ｎは、例えば、特許文献特開２０１２－２５９３２の実施例に従い得られる分岐型のポリエチレングリコール誘導体（２９）の二つのカルボキシル基と、脱保護Ｂ－１で得られたポリエチレングリコール誘導体（６）のアミノ基を縮合反応で結合させ、分岐型のポリエチレングリコール誘導体（３０）を得る工程である。前記反応Ｇ－２と同条件で反応と精製が可能である。
Figure 0007249591000072
脱保護Ｐは、反応Ｎで得られたポリエチレングリコール誘導体（３０）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（３１）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ６、Ｌ１１、Ｌ１２の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護Ｄ－１と同条件で反応と精製が可能である。
次に、脱保護Ｄ、脱保護Ｋ、脱保護Ｍ、脱保護Ｐで得られたポリエチレングリコール誘導体は、末端にアミノ基を有しており、これを利用して様々な官能基に変換が可能である。
ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基を他の官能基に変換する工程については、特に制限は無いが、基本的には、アミノ基と反応可能な活性エステル基を有した化合物、または酸無水物、酸クロライド等の一般的な反応試薬を用いることで、様々な官能基に容易に変換することが出来る。
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基をマレイミド基に変換したい場合は、以下のような試薬と反応させることで、目的物を得ることができる。
Figure 0007249591000073
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基をカルボキシル基に変換したい場合は、無水コハク酸や無水グルタル酸と反応させることで、目的物を得ることができる。
これら反応試薬は、低分子量の試薬であり、ポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析等の一般的な精製方法にて容易に除去が可能である。
以上のような工程を経て、得られた分解性ポリエチレングリコールは、血中で安定であり、細胞内でのみ分解する性能を有することが求められる。その性能を適切に評価するため、例えば、以下に示すような試験を実施し、分解性ポリエチレングリコールの血中での安定性、そして細胞内での分解性を評価することができる。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の血中での安定性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、マウス、ラット、ヒトなどの血清を用いた試験等が挙げられる。具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように血清に溶解し、３７℃で９６時間インキュベート後、血清中に含まれるポリエチレングリコール誘導体を回収し、ＧＰＣを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験前のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％と、安定性試験後のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％から算出する。具体的には以下の式を用いる。
分解率 ＝ （試験前のピーク面積％ － 試験後のピーク面積％） ÷ 試験前のピーク面積％ × １００
例えば、安定性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９５％であり、試験後のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９０％だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 ＝ （９５－９０）÷９５×１００ ＝ ５．２６（％）
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中で分解してしまうと、目的とする血中半減期を得ることができないため、安定性試験において、９６時間後の分解率は、１０％以下が好ましく、５％以下がさらに好ましい。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞内での分解性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、分解性ポリエチレングリコール誘導体を含有した培地を用いて、細胞を培養させる試験等が挙げられる。ここで使用する細胞や培地については、特に制限は無いが、具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１～２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように培地であるＲＰＭＩ－１６４０に溶解し、この培地を用いて、マクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を３７℃で９６時間培養後、細胞中のポリエチレングリコール誘導体を回収し、ＧＰＣを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験と同様に、試験前後のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％を用いて算出する。
例えば、細胞を用いた分解性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９５％であり、試験後のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が５％だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率 ＝ （９５－５）÷９５×１００ ＝ ９４．７（％）
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内で効率よく分解されないと、目的とする細胞の空胞を抑制できないため、分解性試験において、９６時間後の分解率は、９０％以上が好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
得られた分解性ポリエチレングリコール誘導体を生体関連物質に結合させる方法としては、特に制限は無いが、例えば「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 3rd ed.;Academic Press: San Diego, CA, 2013」や「Mark, Sonny S. Bioconjugate protocols, strategies and methods; 2011」に記載の方法を用いることができる。その中でも例えば、生体関連物質であるタンパク質やペプチドなどのリジン残基のアミノ基をターゲットとする場合は、活性化エステル基や活性化カーボネート基を有したポリエチレングリコール誘導体が用いられる。また、生体関連物質であるタンパク質やペプチドなどのシステイン残基のチオール基をターゲットとする場合は、マレイミド基やヨードアセトアミド基を有したポリエチレングリコール誘導体が用いられる。天然の生体関連物質に含まれるフリーのシステイン残基の数は極めて少ないため、この方法ではより選択的にポリエチレングリコールを生体関連物質に結合させることができる。さらにチオール基を発生、または導入する方法として、生体関連物質のジスルフィド結合を切断させる方法や、遺伝子工学的に生体関連物質を改変してシステイン残基を導入する方法などがあり、これらの技術と組み合わせることで、生体関連物質の目的とする場所に、目的とする数のポリエチレングリコール誘導体を結合できることが知られている。
次に、生体関連物質であるタンパク質やペプチドなどのＮ末端のアミノ基をターゲットとする場合は、アルデヒド基を有したポリエチレングリコール誘導体が用いられる。具体的には、低ｐＨの緩衝溶液中で、アルデヒド基を有したポリエチレングリコール誘導体と適切な還元剤を用いることで、タンパク質やペプチドのＮ末端のアミノ基に、選択的にポリエチレングリコール誘導体を結合させることができる。
これらポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、一般的な方法として知られている、透析やゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）などで精製することができる。また、得られた生体関連物質は、一般的に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）などの分析方法にて評価することができる。
分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質の生理活性を評価する方法については、特に制限は無いが、例えば生体関連物質がインスリンであれば血中糖濃度、カルシトニンであれば血中カルシウム濃度など、投与した動物から定期的に採血し、血中の物質を適切な分析機器を用いて測定することで評価できる。具体的には、インスリンであれば、グルコース測定キットを使用して、投与後のグルコース濃度の低下をモニタリングし、カルシトニンであれば、カルシウム測定キットを使用して、投与後のカルシウム濃度の低下をモニタリングすることで評価することができる。
分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質の血中半減期や体内分布を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、放射性同位体や蛍光物質をラベル化し、マウスやラットに投与して、モニタリングする試験等が挙げられる。
ポリエチレングリコール誘導体に導入した分解性ペプチドは、ポリエチレングリコールに細胞内での分解性を付与するが、そのペプチド構造によってポリエチレングリコールを結合させた生体関連物質の体内動態を変化させる可能性が考えられる。そこで、導入したペプチド構造の体内動態への影響を確認するため、血中半減期および、その体内分布について、分解性を持たない同分子量のポリエチレングリコール誘導体を修飾した生体関連物質と比較する必要がある。具体的には、放射性同位体でラベル化した生体関連物質に、分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体と分解性ポリエチレングリコール誘導体をそれぞれ結合させ、得られた２種の生体関連物質をマウスに投与し、複数のタイムポイントで、血液、各臓器の放射線量を測定し、定量測定を行うことができる。
分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞の空胞抑制を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、非特許文献２に記載があるように、長期間、高頻度、高投与量でマウスやラットに投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている臓器や器官の切片画像を確認する試験等が挙げられる。
具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１０～２５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように生理食塩水に溶解し、マウス尾静脈より週３回、４週間以上、２０～１００μＬ投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などのパラフィン切片を作製して染色後、切片画像を病理学的手法により確認し、空胞抑制の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
非特許文献２では、高分子量のポリエチレングリコールによる細胞の空胞化は、ポリエチレングリコールの組織への蓄積と関係があるとの記載がある。分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞への蓄積性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、上記の空胞の評価と同じ方法で作成した切片画像より評価することができる。ポリエチレングリコールが蓄積しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などの染色した切片画像を病理学的手法により確認し、ポリエチレングリコールの蓄積性の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
下記実施例で得られた１Ｈ－ＮＭＲは、日本電子データム（株）製ＪＮＭ－ＥＣＰ４００またはＪＮＭ－ＥＣＡ６００から得た。測定にはφ５ｍｍチューブを用い、重水素化溶媒には、Ｄ２Ｏまたは内部標準物質としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を含有するＣＤＣｌ３およびｄ６－ＤＭＳＯを用いた。得られたポリエチレングリコール誘導体の分子量およびアミン純度は、液体クロマトグラフィー（ＧＰＣおよびＨＰＬＣ）を用いて算出した。液体クロマトグラフィーのシステムは、ＧＰＣには東ソー（株）製「ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣ ＥｃｏＳＥＣ」を用い、ＨＰＬＣにはＷＡＴＥＲＳ社製「ＡＬＬＩＡＮＣＥ」を用いた。以下、ＧＰＣおよびＨＰＬＣの分析条件を示す。
ＧＰＣ分析（分子量測定）
検出器：示差屈折計
カラム：ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ５００およびｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ２５０（ＷＡＴＥＲＳ）
移動相：１００ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ＋０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ５．２）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル量：５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ
カラム温度：３０℃
ＨＰＬＣ分析（アミン純度測定）
検出器：示差屈折計
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ（東ソー）
移動相：１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ
カラム温度：４０℃
［実施例１］
化合物（ｐ１）（ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000074
［実施例１－１］
Figure 0007249591000075
Ｎ末端をｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護したグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－ロイシル－グリシン（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ）（０．１９７ｇ、４．０×１０－４モル、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（５７．５ｍｇ、５．０×１０－４モル、みどり化学（株）製）を脱水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（１．０ｇ）に溶解後、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１０３ｇ、５．０×１０－４モル、タマ化学工業（株）製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。脱水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（３．０ｇ）を添加して希釈した後、末端にプロピルアミノ基を有するメトキシＰＥＧ（２．０ｇ、９．５×１０－５モル、平均分子量＝約２１，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ－２０Ｔ」）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。その後、酢酸エチル（２０ｇ）を加えて反応液を希釈し、ＬＳ１００ろ紙を敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。ろ液に酢酸エチル（３０ｇ）を加えて、均一になるように攪拌した後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（５０ｇ）に溶解し、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（２５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ２）（ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－Ｂｏｃ）を得た。収量１．８ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９２ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．３６ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．５５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．８０ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、３．１３ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．２１ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６５ｐｐｍ（ｍ、約２,０００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．９１ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、４．４３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、４．５５ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、５．７７ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．８６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．１４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．３２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例１－２］
Figure 0007249591000076
実施例１－１で得られたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－Ｂｏｃ（１．８ｇ、８．６×１０－５モル）をジクロロメタン（９．０ｇ）に溶解し、メタンスルホン酸（５８４μＬ、９．０×１０－３モル、関東化学（株）製）を加えて、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。その後、反応液をトルエン（１８ｇ）で希釈し、イオン交換水（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し、水層に生成物を抽出した。得られた水層に１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、ｐＨを１２に調整した後、塩化ナトリウム（４．５ｇ）を溶解した。そこに、クロロホルム（１８ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム（１８ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を４０℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（３６ｇ）を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム（０．９０ｇ）を加えて、３０℃で１５分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（１８ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ３）（ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－ＮＨ ２ ）を得た。収量１．４ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．５３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１，７０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．８０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．１０ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、７Ｈ）、３．７４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、４．３１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、４．５５ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．９１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２８ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．９８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例１－３］
Figure 0007249591000077
実施例１－２で得られたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－ＮＨ２（１．２ｇ、５．７×１０－５モル）をクロロホルム（１４．４ｇ）に溶解した後、トリエチルアミン（１０μＬ、７．１×１０－５モル、関東化学（株））と、片末端にｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能ＰＥＧ（１．３ｇ、６．２×１０－５モル、平均分子量＝約１９，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＢＯ－２００ＴＳ」）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応後、４０℃にて濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル（４８ｇ）を添加して溶解した後、ヘキサン（２４ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物を再度酢酸エチル（４８ｇ）に溶解し、ヘキサン（２４ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。析出物を回収後、ヘキサン（２４ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ４）（ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００Ｂｏｃ）を得た。収量２．０ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．６４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．７６ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）、３．２０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．３２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、５．０２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．４５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．１３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例１－４］
Figure 0007249591000078
実施例１－３で得られたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００Ｂｏｃ（１．８ｇ、４．３×１０－５モル）をジクロロメタン（９．０ｇ）に溶解し、メタンスルホン酸（２９２μＬ、４．５×１０－３モル、関東化学（株）製）を加えて、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。その後、反応液をトルエン（１８ｇ）で希釈し、イオン交換水（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し、水層に生成物を抽出した。特開２０１４－２０８７８６に記載の条件に従い、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて水層のｐＨを２．０に調整し、トルエンとクロロホルム混合溶液で水層を洗浄して、アミノ基を持たないポリエチレングリコール不純物を除去した。続いて水層に１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、ｐＨ１２に調整した後、塩化ナトリウム（４．５ｇ）を溶解した。そこに、クロロホルム（１８ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム（１８ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を４０℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（２７ｇ）を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム（０．９０ｇ）を加えて、３０℃で３０分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（１８ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ１）（ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＰＡ）を得た。収量１．５ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９１％。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、１．６２ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、１．７１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．３４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、６．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例２］
化合物（ｐ５）（ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬ）の合成
Figure 0007249591000079
［実施例２－１］
Figure 0007249591000080
特許第３５０８２０７号などに記載の製法を用いて合成した片末端に３，３－ジエトキシプロピル基、片末端に水酸基を有するヘテロ二官能ＰＥＧ（１５．０ｇ、７．５×１０－４モル、平均分子量＝約２０，０００）を脱水ジクロロメタン（７５ｇ）に溶解した後、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（１．２ｇ、４．７×１０－３モル、東京化成工業（株）製）とトリエチルアミン（８３６μＬ，６．０×１０－３モル、関東化学（株））を添加し、室温にて窒素雰囲気下で５時間反応させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、４０℃でろ液を濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル（１５０ｇ）と２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－ｐ－クレゾール（３０ｍｇ）を添加して均一になるまで攪拌した。ヘキサン（７５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、析出物を回収し、再度酢酸エチル（１５０ｇ）と２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－ｐ－クレゾール（３０ｍｇ）を添加して溶解した。ヘキサン（７５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。同様の操作を４回行った後、得られた析出物をヘキサン（９０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、真空乾燥して、上記化合物（ｐ６）を得た。収量１１．８ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．２０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＣＨ２ ＣＨ ３ ）２）、１．９０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２）、２．８４ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－ＮＣ ４ Ｈ ４ Ｏ ２ ）、３．６５ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ ＣＨ ２ Ｏ）ｎ－ＣＨ２－）、４．４６ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－）、４．６４ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２）
［実施例２－２］
Figure 0007249591000081
実施例１－２で得られたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－ＮＨ２（１．９ｇ、９．０×１０－５モル）をクロロホルム（１８ｇ）に溶解した後、トリエチルアミン（１３μＬ、９．３×１０－５モル、関東化学（株））と、実施例２－１で得られたスクシンイミジル基－ＰＥＧ－３，３－ジエトキシプロピル基（１．５ｇ、７．５×１０－５モル、平均分子量＝約２１，０００）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応後、４０℃にて濃縮し、特開２０１１－７９９３４に記載の条件に従い、得られた濃縮物をトルエンとクロロホルム混合溶液に溶解し、５％食塩水で有機層を洗浄して、分子量約２１，０００のポリエチレングリコール不純物を除去した。有機層を４０℃にて濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル（６０ｇ）を添加して溶解した後、ヘキサン（３０ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物を再度酢酸エチル（６０ｇ）に溶解し、ヘキサン（３０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。析出物を回収後、ヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ７）（ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＤＥ）を得た。収量３．１ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．２０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＣＨ２ ＣＨ ３ ）２）、１．４７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．６１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．９０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２）、２．５８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．３８ｐｐｍ（－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、４．２９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、４．６４ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２）、６．３８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．８９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．１０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２９ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）
［実施例２－３］
Figure 0007249591000082
実施例２－２で得られたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＤＥ（１．０ｇ、２．４×１０－５モル）を注射用蒸留水（２０ｇ）に溶解した後、８５％リン酸（０．４６ｇ）でｐＨを１．５０に調整し、２０～２５℃で2時間反応させた。反応後、４００ｇ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を０．６９ｇ添加し、ｐＨを６．７０に調整した後、塩化ナトリウム（４．０ｇ）を添加し溶解した。得られた溶液に１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１．７６ｇ）を滴下し、ｐＨを７．０５に調整した後、予め２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－ｐ－クレゾール（１．５ｍｇ）を溶解したクロロホルム（１５ｇ）を添加して、室温で２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、水層に再度予め２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－ｐ－クレゾール（１．５ｍｇ）を溶解したクロロホルム（１５ｇ）を添加して、室温で２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を５０℃で濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル（１０ｇ）を添加して、均一になるまで攪拌した後、硫酸マグネシウム（０．２５ｇ）を加えて、３０℃で１５分攪拌し、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過し、酢酸エチル（１０ｇ）で洗浄した。得られたろ液にヘキサン（１５ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、予め２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－ｐ－クレゾール（１．０ｍｇ）を溶解したヘキサン（１０ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ５）（ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬ）を得た。収量０．６５ｇ。分子量は表１に示す。アルデヒド純度は８６％（１Ｈ－ＮＭＲ）。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．６１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．８４ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）、２．６８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．３８ｐｐｍ（－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、４．０６ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－）、４．１２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－）、４．３２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５１ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、６．３６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．８７ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．１４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２９ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）、９．８０ｐｐｍ（ｓ、１Ｈ、－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＨＯ）
［実施例３］
化合物（ｐ８）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000083
［実施例３－１］
Figure 0007249591000084
実施例１と同製法にて、Ｎ末端をｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護したグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－ロイシル－グリシン（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ）、末端にプロピルアミノ基を有するメトキシＰＥＧ（平均分子量＝約１０，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ－１０Ｔ」）、片末端にｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能ＰＥＧ（平均分子量＝約１０，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＢＯ－１００ＴＳ」）を原料に用いて、上記化合物（ｐ９）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＰＡ）を得た。収量１．０ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、１．６２ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、１．７１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．３４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、６．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例３－２］
Figure 0007249591000085
実施例３－１で得られたＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＰＡ（１．０ｇ、５．０×１０－５モル）とＢｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（０．９９ｇ、２．０×１０－４モル、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に脱水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（１０ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（６５μＬ、３．８×１０－４モル、関東化学（株）製）と（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）（０．１０６ｇ、２．５×１０－４モル、シグマアルドリッチ社製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。反応終了後、クロロホルム（１００ｇ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られた有機層に硫酸マグネシウム（１．０ｇ）を添加し、３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を４０℃にて濃縮し、濃縮物に酢酸エチル（５０ｇ）を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（５０ｇ）に溶解し、室温にてヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（２５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１０）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－Ｂｏｃ）を得た。収量０．９ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、１２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．６４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．７６ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）、３．２０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，８００Ｈ、－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．３２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ）、５．０２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、６．４５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、６．９３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．０６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．１３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例３－３］
Figure 0007249591000086
実施例３－２で得られたＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－Ｂｏｃ（０．９ｇ、４．５×１０－５モル）を、実施例１－２と同製法にて、Ｂｏｃ基の脱保護を行い、上記化合物（ｐ１１）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－ＮＨ ２ ）を得た。収量０．８ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．５３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１，７０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．８０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）、３．１０ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１８ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、１４Ｈ）、３．７４ｐｐｍ（ｍ、約１，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－）、４．３１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、４．５５ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．９１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２８ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．９８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）
［実施例３－４］
Figure 0007249591000087
実施例３－３で得られたＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－ＮＨ２（０．８ｇ、４．０×１０－５モル）を、実施例１－３と同製法にて、片末端にｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能ＰＥＧ（平均分子量＝約１０，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＢＯ－１００ＴＳ」）と反応させ、上記化合物（ｐ１２）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００Ｂｏｃ）を得た。収量１．０ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、１２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．６４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．７６ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ）、３．２０ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約２，７００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．３２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ）、５．０２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、６．４５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、６．９３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．０６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．１３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例３－５］
Figure 0007249591000088
実施例３－４で得られたＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００Ｂｏｃ（１．０ｇ、３．３×１０－５モル）を、実施例１－４と同製法にて、Ｂｏｃ基の脱保護を行った。得られた粗生成物を、陽イオン交換樹脂であるＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥヘルスケア製）を充填したイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、上記化合物（ｐ１３）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＰＡ）を得た。収量０．８ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、１２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、１．６２ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ）、１．７１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．１２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、４Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約２，７００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ）、６．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、６．９４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例３－６］
Figure 0007249591000089
実施例３－５で得られたＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＰＡ（０．８ｇ、２．７×１０－５モル）を原料に用いて、実施例３－２、実施例３－３、実施例３－４、実施例３－５の順に同製法にて反応を繰り返すことで、上記化合物（ｐ８）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＰＡ）を得た。収量０．４ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９０％。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、１８Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、１．６２ｐｐｍ（ｔ、３Ｈ）、１．７１ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、３．１２ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，６００Ｈ、－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、４．３４ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、３Ｈ）、６．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、６．９４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、３Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、１５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例４］
化合物（ｐ１４）（ＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－２００ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000090
［実施例４－１］
Figure 0007249591000091
Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－バリル－Ｌ－シトルリル－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－（Ｃｉｔ）－Ｇｌｙ）（０．２９９ｇ、５．４×１０－４モル、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）と末端にプロピルアミノ基を有するメトキシＰＥＧ（２．７ｇ、１．３×１０－４モル、平均分子量＝約２１，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ－２０Ｔ」）に脱水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（２７ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（１７２μＬ、１．０×１０－３モル、関東化学（株）製）と（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）（０．２８９ｇ、６．８１０－４モル、シグマアルドリッチ社製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。反応終了後、クロロホルム（２７０ｇ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０８ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０８ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られた有機層に硫酸マグネシウム（２．７ｇ）を添加し、３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を４０℃にて濃縮し、濃縮物に酢酸エチル（１０８ｇ）を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン（５４ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（１０８ｇ）に溶解し、室温にてヘキサン（５４ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（５４ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１５）（ＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－Ｆｍｏｃ）を得た。収量２．３ｇ。
ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８４ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．８５ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．３７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．５２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．６３ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、１．９８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ３）２）、２．９３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．０９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ２）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．８９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．２５ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ＜）、５．３５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ ２ ）、５．９１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．３３ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、Ａｒ）、７．４１ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、７．７３ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、７．８９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、８．１０ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ）、８．２０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例４－２］
Figure 0007249591000092
実施例４－１で得られたＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－Ｆｍｏｃ（２．１ｇ、１．０×１０－４モル）にＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（１２．６ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。ピペリジン（０．６６ｇ、７．８×１０－３モル、和光純薬工業（株）製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル（１５０ｇ）を加えて均一になるまで攪拌し、ヘキサン（７５ｇ）を添加して、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（１５０ｇ）に溶解し、ヘキサン（７５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（７５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１６）（ＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－ＮＨ ２ ）を得た。収量１．８ｇ。
ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．７７ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．８７ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．３５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．５１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．６４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、１．９３ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ３）２）、２．９６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ２）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ 、）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、４．２１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、５．３４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ ２ ）、５．９１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．２３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）
［実施例４－３］
Figure 0007249591000093
実施例４－２で得られたＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－ＮＨ２（１．２ｇ、５．７×１０－５モル）をクロロホルム（７．２ｇ）に溶解した後、トリエチルアミン（９．２μＬ、６．７×１０－５モル、関東化学（株）製）と、片末端にｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能ＰＥＧ（１．２ｇ、５．２×１０－５モル、平均分子量＝約２３，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＢＯ－２００ＴＳ」）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応後、４０℃にて濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル（１２０ｇ）を添加して溶解した後、ヘキサン（６０ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物をヘキサン（１２ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ１７）（ＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－２００Ｂｏｃ）を得た。収量２．１ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９６ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．０１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．５９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．７６ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ）、１．９２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．０９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．２３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ２）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．０７ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ）、４．１５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．３１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．３８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、５．０２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、５．２４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ ２ ）、５．７４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、５．８１ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ）、７．０５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例４－４］
Figure 0007249591000094
実施例４－３で得られたＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－２００Ｂｏｃ（２．０ｇ、４．５×１０－５モル）をジクロロメタン（１０ｇ）に溶解し、メタンスルホン酸（２９１μＬ、４．５×１０－３モル、関東化学（株）製）を加えて、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。その後、反応液をトルエン（２０ｇ）で希釈し、イオン交換水（２０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し、水層に生成物を抽出した。特開２０１４－２０８７８６に記載の条件に従い、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて水層のｐＨを２．０に調整し、トルエンとクロロホルム混合溶液で水層を洗浄して、アミノ基を持たないポリエチレングリコール不純物を除去した。続いて水層に１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、ｐＨ１２に調整した後、塩化ナトリウム（５．０ｇ）を溶解した。そこに、クロロホルム（１０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム（１０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を４０℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（１００ｇ）を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム（２．０ｇ）を加えて、３０℃で１５分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン（５０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（２０ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ１４）（ＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－２００ＰＡ）を得た。収量１．７ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９２％。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９６ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．０１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．６０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．７５ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．９３ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．２３ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．８２ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ ２ ）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．３０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．９５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．０７ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ）、４．１５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．３１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．３８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、５．２４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ ２ ）、５．７９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、５．８２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例５］
化合物（ｐ１８）（ＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－２００ＭＡ）の合成
Figure 0007249591000095
実施例４－４で得られたＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－２００ＰＡ（０．２ｇ、４．５×１０－６モル）にトルエン（１．１ｇ）とアセトニトリル（０．１６ｇ）を添加し４０℃で加温溶解した。得られた溶液にＮ－メチルモルホリン（２．５μＬ、２．２×１０－５モル、関東化学（株）製）とＮ－スクシンイミジル－３－マレイミドプロピオネート（１．８ｍｇ、６．８×１０－６モル、（株）大阪合成有機化学研究所製）を添加し、４０℃、窒素雰囲気下で１時間反応させた。反応溶液に酢酸エチル（６．０ｇ）を添加し、均一になるまで攪拌した後、１７℃でヘキサン（８．０ｇ）を加えて、１７℃にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（８．０ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ１８）（ＭＥ－２００Ｇ（Ｃｉｔ）Ｖ－２００ＭＡ）を得た。収量０．１２ｇ。分子量は表１に示す。マレイミド純度は８８％（１Ｈ－ＮＭＲ）。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９６ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．０１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．５９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、１．７６ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）、２．４６ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ４ＮＯ２Ｈ２）、３．１２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．０２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．１３ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．２８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．３７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、５．８６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．４２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．６８ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ ４ ＮＯ ２ Ｈ ２ ）、７．０４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．２０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例６］
化合物（ｐ１９）（ＭＥ－２００ＧＧＧ－２００ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000096
［実施例６－１］
Figure 0007249591000097
グリシル－グリシル－グリシン（２．０ｇ、１．１×１０－２モル、関東化学（株）製）にイオン交換水（６０ｇ）と炭酸水素ナトリウム（４．５ｇ）を加えて溶解した後、テトラヒドロフラン（６０ｇ）とジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（Ｂｏｃ２Ｏ）（４．６ｇ、２．１×１０－２モル、東京化成工業（株）製）を添加し、４０℃で２３時間反応させた。反応溶液に水（１２０ｇ）を添加し、５℃まで冷却した後、リン酸を適量加えて、ｐＨを７に調整し、ヘキサン（１２０ｇ）を加えて室温で１５分攪拌した。有機層と水層を分離後、水層に再度ヘキサン（１２０ｇ）を加えて室温で１５分攪拌した。水層を回収後、エタノール（１００ｇ）を加えて５０℃で濃縮し、再度エタノール（１００ｇ）を加えて５０℃で濃縮した。得られた濃縮物にエタノール（１００ｇ）を添加し、５０℃で加温溶解した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を５０℃で濃縮した後、真空乾燥し、Ｂｏｃ－グリシル－グリシル－グリシンを得た。収量１．５ｇ。
ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：１．４５ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、３．７８ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．８４ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）、４．００ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）
［実施例６－２］
Figure 0007249591000098
Ｂｏｃ－グリシル－グリシル－グリシン（０．１７４ｇ、６．０×１０－４モル）と末端にプロピルアミノ基を有するメトキシＰＥＧ（３．０ｇ、１．４×１０－４モル、平均分子量＝約２１，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ－２０Ｔ」）に脱水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（２７ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（１９１μＬ、１．１×１０－３モル、関東化学（株）製）と（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）（０．３２１ｇ、７．５×１０－４モル、シグマアルドリッチ社製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。反応終了後、クロロホルム（３００ｇ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１２０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１２０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った後、有機層を回収した。得られたクロロホルム溶液に硫酸マグネシウム（３．０ｇ）を添加し、３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を４０℃にて濃縮し、濃縮物に酢酸エチル（１２０ｇ）を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン（６０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（１２０ｇ）に溶解し、ヘキサン（６０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（６０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ２１）（ＭＥ－２００ＧＧＧ－Ｂｏｃ）を得た。収量２．６ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．４５ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．８０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．３８ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．８６ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．９１ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、３．９９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、５．６９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．１０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．４４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）
［実施例６－３］
Figure 0007249591000099
実施例６－２で得られたＭＥ－２００ＧＧＧ－Ｂｏｃ（２．４ｇ、１．１×１０－４モル）をジクロロメタン（１２ｇ）に溶解し、メタンスルホン酸（７２３μＬ、１．１×１０－２モル、関東化学（株）製）を加えて、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。その後、反応液をトルエン（２４ｇ）で希釈し、イオン交換水（２４ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し、水層に生成物を抽出した。得られた水層に１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、ｐＨを１２に調整した後、塩化ナトリウム（６．０ｇ）を溶解した。そこに、クロロホルム（１２ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム（１２ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を４０℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（１２０ｇ）を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム（２．４ｇ）を加えて、３０℃で１５分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン（６０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（２４ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ２２）（ＭＥ－２００ＧＧＧ－ＮＨ ２ ）を得た。収量２．２ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．５３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、１．７９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．３８ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．９２ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、４．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．８６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例６－４］
Figure 0007249591000100
実施例６－３で得られたＭＥ－２００ＧＧＧ－ＮＨ２（１．５ｇ、７．１×１０－５モル）をクロロホルム（７．５ｇ）に溶解した後、トリエチルアミン（１１．６μＬ、８．４×１０－５モル、関東化学（株）製）と、片末端にｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能ＰＥＧ（１．８ｇ、７．８×１０－５モル、平均分子量＝約２３，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＢＯ－２００ＴＳ」）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応後、４０℃にて濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル（１５０ｇ）を添加して溶解した後、ヘキサン（７５ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物をヘキサン（７５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ２３）（ＭＥ－２００ＧＧＧ－２００Ｂｏｃ）を得た。収量３．０ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．７８ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．２３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．３５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６５ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．９７ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、４.２３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、５．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．２１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．４７ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．６１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例６－５］
Figure 0007249591000101
実施例６－４で得られたＭＥ－２００ＧＧＧ－２００Ｂｏｃ（２．５ｇ、５．８×１０－５モル）をジクロロメタン（１２．５ｇ）に溶解し、メタンスルホン酸（３６５μＬ、５．６×１０－３モル、関東化学（株）製）を加えて、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。その後、反応液をトルエン（２５ｇ）で希釈し、イオン交換水（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し、水層に生成物を抽出した。特開２０１４－２０８７８６に記載の条件に従い、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて水層のｐＨを２．０に調整し、トルエンとクロロホルム混合溶液で水層を洗浄して、アミノ基を持たないポリエチレングリコール不純物を除去した。続いて水層に１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、ｐＨ１２に調整した後、塩化ナトリウム（６．３ｇ）を溶解した。そこに、クロロホルム（１２．５ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム（１２．５ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を４０℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（１２５ｇ）を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム（２．５ｇ）を加えて、３０℃で１５分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン（６２．５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（２５ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ１９）（ＭＥ－２００ＧＧＧ－２００ＰＡ）を得た。収量２．４ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９１％。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．７９ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＮＨ２）、２．９１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、３．３７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）、３．６５ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．９０ｐｐｍ（ｔ、３Ｈ）、３．９７ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、４．２３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、６．１９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．４５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．６１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例７］
化合物（ｐ２４）（ＭＥ－２００ＧＦ－２００ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000102
［実施例７－１］
Figure 0007249591000103
Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－フェニルアラニル－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）（０．５３３ｇ、１．２×１０－３モル、渡辺化学工業（株）製）と末端にプロピルアミノ基を有するメトキシＰＥＧ（６．０ｇ、２．９×１０－４モル、平均分子量＝約２１，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ－２０Ｔ」）に脱水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（６０ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（３８３μＬ、２．３×１０－３モル、関東化学（株）製）と（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）（０．６４２ｇ、１．５×１０－３モル、シグマアルドリッチ社製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。反応終了後、クロロホルム（６００ｇ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２４０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２４０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られたクロロホルム溶液に硫酸マグネシウム（２．４ｇ）を添加し、３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を４０℃にて濃縮し、濃縮物に酢酸エチル（２４０ｇ）を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン（１２０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（２４０ｇ）に溶解し、ヘキサン（１２０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（１２０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ２５）（ＭＥ－２００ＧＦ－Ｆｍｏｃ）を得た。収量５．１ｇ。
ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、２．８０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．０４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、４．２０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、７．３３ｐｐｍ（ｍ、９Ｈ）、７．６６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、Ａｒ）、７．８８ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、８．２７ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）
［実施例７－２］
Figure 0007249591000104
実施例７－１で得られたＭＥ－２００ＧＦ－Ｆｍｏｃ（４．９ｇ、２．３×１０－４モル）にＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（２９．４ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。ピペリジン（１．５５ｇ、１．８×１０－２モル、和光純薬工業（株）製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル（３００ｇ）を加えて均一になるまで攪拌し、ヘキサン（１５０ｇ）を添加して、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（３００ｇ）に溶解し、ヘキサン（１５０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（１５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ２６）（ＭＥ－２００ＧＦ－ＮＨ ２ ）を得た。収量３．９ｇ。
ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ 、－ＮＨ－）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例７－３］
Figure 0007249591000105
実施例７－２で得られたＭＥ－２００ＧＦ－ＮＨ２（０．９８ｇ、４．７×１０－５モル）をクロロホルム（４．９ｇ）に溶解した後、トリエチルアミン（７．５μＬ、５．４×１０－５モル、関東化学（株）製）と、片末端にｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基を有し、もう片末端に炭酸スクシンイミジル基を有するヘテロ二官能ＰＥＧ（１．３ｇ、６．２×１０－５モル、平均分子量＝約２３，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＢＯ－２００ＴＳ」）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応後、４０℃にて濃縮し、得られた濃縮物に酢酸エチル（９８ｇ）を添加して溶解した後、ヘキサン（４９ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物をヘキサン（４９ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ２７）（ＭＥ－２００ＧＦ－２００Ｂｏｃ）を得た。収量２．０ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．７７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ３）３）、３．０２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．２１ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、３．３６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．６５ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．３９ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、５．０３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、５．５５ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ）、６．８６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例７－４］
Figure 0007249591000106
実施例７－３で得られたＭＥ－２００ＧＦ－２００Ｂｏｃ（１．８ｇ、４．１×１０－５モル）をジクロロメタン（９．０ｇ）に溶解し、メタンスルホン酸（２６２μＬ、４．３×１０－３モル、関東化学（株）製）を加えて、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。その後、反応液をトルエン（１８ｇ）で希釈し、イオン交換水（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し、水層に生成物を抽出した。特開２０１４－２０８７８６に記載の条件に従い、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて水層のｐＨを２．０に調整し、トルエンとクロロホルム混合溶液で水層を洗浄して、アミノ基を持たないポリエチレングリコール不純物を除去した。続いて水層に１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、ｐＨ１２に調整した後、塩化ナトリウム（４．５ｇ）を溶解した。そこに、クロロホルム（１８ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム（１８ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を４０℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（９０ｇ）を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム（１．８ｇ）を加えて、３０℃で１５分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン（４５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（１８ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ２４）（ＭＥ－２００ＧＦ－２００ＰＡ）を得た。収量１．７ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度８７％。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．７７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＮＨ２）、２．８７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．０７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．３０ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．３２ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、５．５６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．８３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例８］
化合物（ｐ２８）（ＭＥ－２００ＧＡＶ－２００ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000107
実施例４と同製法にて、Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－バリン－Ｌ－アラニン－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）を原料に使用し、上記化合物（ｐ２８）（ＭＥ－２００ＧＡＶ－２００ＰＡ）を得た。収量１．０ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９０％。
ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：０．８２ｐｐｍ（ｄｄ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．２１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＣＨ３）－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＮＨ２）、１．９５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．２３ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６０ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．０５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．２２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、７．２４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．６９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．１０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）
［実施例９］
化合物（ｐ２９）（ＭＥ－２００ＧＦＧＧ－２００ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000108
実施例４と同製法にて、Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したグリシン－グリシン－Ｌ－フェニルアラニン－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）を原料に使用し、上記化合物（ｐ２９）（ＭＥ－２００ＧＦＧＧ－２００ＰＡ）を得た。収量１．２ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９１％。
ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＮＨ２）、２．８０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．２３ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６０ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．０５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．４７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．４３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．６２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．２４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例１０］
化合物（ｐ３０）（ＭＥ－２００ＧＦＧ－２００ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000109
実施例４と同製法にて、Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したグリシン－Ｌ－フェニルアラニン－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）を原料に使用し、上記化合物（ｐ３０）（ＭＥ－２００ＧＦＧ－２００ＰＡ）を得た。収量１．１ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度８９％。
ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＮＨ２）、２．８０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．２３ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６０ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．０５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．４７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．３４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．１０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例１１］
化合物（ｐ３１）（ＭＥ－２００ＧＦ－２００ＰＡ（ａｍｉｄｅ））の合成
Figure 0007249591000110
実施例７と同製法にて、Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－フェニルアラニル－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）、片末端にｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基で保護したプロピルアミノ基、もう片末端にヘキサン酸Ｎ－スクシンイミジル活性エステルを有するヘテロ二官能ＰＥＧ（平均分子量＝約２１，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＢＯ－２００ＨＳ」）を原料に使用し、実施例７のウレタン結合ではなく、アミド結合でヘテロ二官能ＰＥＧを導入した上記化合物（ｐ３１）（ＭＥ－２００ＧＦ－２００ＰＡ（ａｍｉｄｅ））を得た。収量１．０ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９１％。
ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．１１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）、１．３８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＮＨ２）、２．０２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）、２．８０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．２３ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６０ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．４７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．２６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．１０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例１２］
化合物（ｐ３２）（ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｄ）－２００ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000111
実施例１と同製法にて、Ｎ末端をｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護したグリシン－Ｄ－フェニルアラニン－Ｄ－ロイシン－グリシンを原料に使用し、光学異性体であるＤ型のアミノ酸を有した上記化合物（ｐ３２）（ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｄ）－２００ＰＡ）を得た。収量１．１ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９３％。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、１．６２ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、１．７１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．３４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、６．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例１３］
化合物（ｐ３４）（ＬＹ－（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００） ２ －ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000112
［実施例１３－１］
Figure 0007249591000113
Ｎ末端をｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護したグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－ロイシル－グリシン（Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ）（０．４３８ｇ、８．８×１０－４モル、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（０．１２８ｇ、１．１×１０－３モル、みどり化学（株）製）を脱水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（１．０ｇ）に溶解後、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２２９ｇ、１．１×１０－３モル、タマ化学工業（株）製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。脱水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（３．０ｇ）を添加して希釈した後、末端にプロピルアミノ基を有するメトキシＰＥＧ（２．０ｇ、２．２×１０－４モル、平均分子量＝約９，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ－１０Ｔ」）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。その後、酢酸エチル（２０ｇ）を加えて反応液を希釈し、ＬＳ１００ろ紙を敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。ろ液に酢酸エチル（３０ｇ）を加えて、均一になるように攪拌した後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（５０ｇ）に溶解し、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（２５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ３５）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－Ｂｏｃ）を得た。収量１．８ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９２ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．３６ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）１．４８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．５５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．８０ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、３．１３ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．２１ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６５ｐｐｍ（ｍ、約８２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．９１ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、４．４３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、４．５５ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、５．７７ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．７６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．８６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．１４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．３２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例１３－２］
Figure 0007249591000114
実施例１３－１で得られたＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－Ｂｏｃ（１．８ｇ、２．０×１０－４モル）をジクロロメタン（９．０ｇ）に溶解し、メタンスルホン酸（１．３ｍＬ、２．０×１０－２モル、関東化学（株）製）を加えて、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。その後、反応液をトルエン（１８ｇ）で希釈し、イオン交換水（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し、水層に生成物を抽出した。得られた水層に１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、ｐＨを１２に調整した後、塩化ナトリウム（４．５ｇ）を溶解した。そこに、クロロホルム（１８ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム（１８ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を４０℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（３６ｇ）を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム（０．９０ｇ）を加えて、３０℃で１５分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（１８ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ３６）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－ＮＨ ２ ）を得た。収量１．４ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．５３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ（ＣＨ３）２）、１，７０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．８０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．１０ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、７Ｈ）、３．７４ｐｐｍ（ｍ、約８２０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、４．３１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、４．５５ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．９１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２８ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．９８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例１３－３］
Figure 0007249591000115
非特許文献（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２１（２０１０），ｐｐ．２４８－２５４）などに記載の製法を用いて合成した片末端にテトラヒドロピラニル基、片末端にヒドロキシ基を有するヘテロ二官能ＰＥＧ（５ｇ、６．０×１０－５モル）をジクロロメタン（１２ｇ）に溶解後、炭酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）（０．５１３ｇ、２．０×１０－３モル、東京化成工業（株）製）とピリジン（２４３μＬ、３．０×１０－３モル、関東化学（株）製）を添加し、２７℃にて窒素雰囲気下で７時間反応させた。その後、反応液をジクロロメタン（２０ｇ）で希釈して５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、得られたろ液に２,６－ジｔｅｒｔブチル－ｐ－クレゾール（４．３ｍｇ）を加えて５分間攪拌した。その後、５ｗｔ％ 塩化ナトリウム水溶液（６ｇ、ｐＨ５）を加えて、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層に分離した後、有機層に硫酸マグネシウム（１．０ｇ）を加えて、室温で３０分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を３５℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（５０ｇ）を添加して溶解した。溶解後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物にヘキサン（２５ｇ）を加えて３０分間攪拌し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ３７）（ＴＨＰ－１０ＴＳ）を得た。収量４．３ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．５２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、-tetrahydropyranyl）、１．５９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、-tetrahydropyranyl）、１．７３ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、-tetrahydropyranyl）、１．８５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、-tetrahydropyranyl）、２．８５ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、-succinimide）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約８２０Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．８０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．８８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、-tetrahydropyranyl）、４．４７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．６４ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、-tetrahydropyranyl）
［実施例１３－４］
Figure 0007249591000116
実施例１３－２で得られたＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－ＮＨ２（３．６４ｇ、３．４×１０－４モル）をクロロホルム（１７ｇ）に溶解した後、トリエチルアミン（５６．５μＬ、４．１×１０－４モル、関東化学（株））と、実施例１３－３で得られたＴＨＰ－１０ＴＳ（２．８０ｇ、３．１×１０－４モル）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応後、４０℃にて濃縮し、得られた濃縮物に０．１ｍｏｌ/Ｌクエン酸ナトリウム水溶液（１２０ｇ、ｐＨ２．５）を加えて溶解した後、室温にて窒素雰囲気下で４時間反応させた。反応後、クロロホルム（５０ｇ）と２,６－ジｔｅｒｔブチル－ｐ－クレゾール（５．０ｍｇ）を加えて１０分間攪拌した。水層と有機層に分離した後、有機層に硫酸マグネシウム（３．２ｇ）を加えて、４０℃で３０分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（５０ｇ）を添加して溶解した。溶解後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物にヘキサン（２５ｇ）を加えて１５分間攪拌し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ３８）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＨＯ）を得た。収量５．３０ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、１．６２ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、１．７１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約８２０Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．３４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、６．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例１３－５］
Figure 0007249591000117
実施例１３－４で得られたＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＨＯ（５．０ｇ、２．８×１０－４モル）をジクロロメタン（１２ｇ）に溶解後、炭酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）（０．２８５ｇ、１．１×１０－３モル、東京化成工業（株）製）とピリジン（１３５μＬ、１．７×１０－３モル、関東化学（株）製）を添加し、２７℃にて窒素雰囲気下で７時間反応させた。その後、反応液をジクロロメタン（２０ｇ）で希釈して５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、得られたろ液に２,６－ジｔｅｒｔブチル：４－ｐ－クレゾール（４．３ｍｇ）を加えて５分間攪拌した。その後、５ｗｔ％ 塩化ナトリウム水溶液（６ｇ、ｐＨ５）を加えて、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層に分離した後、有機層に硫酸マグネシウム（１．０ｇ）を加えて、室温で３０分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を３５℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（５０ｇ）を添加して溶解した。溶解後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られた析出物にヘキサン（２５ｇ）を加えて３０分間攪拌し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ３９）（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＴＳ）を得た。収量４.２ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ（ＣＨ ３ ） ３ ）、１．６４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、１．７６ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ）、２．８５ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、-succinimide）、３．２０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約８２０Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．３２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、５．０２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．４５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．１３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例１３－６］
Figure 0007249591000118
実施例１３－５で得られたＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００ＴＳ（３．６ｇ、２．０×１０－４モル）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（７．０ｇ）に溶解し、Ｌ－リシンエチルエステル・２塩酸塩（２６ｍｇ、１．１×１０－４モル、シグマアルドリッチ社製）、トリエチルアミン（７３ｍｇ、７．２×１０－４モル）を加えて、窒素雰囲気下で４０℃、５時間反応させた。反応液を酢酸エチル（３６ｇ）で希釈した後、５Ａろ紙を敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（１８ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ４０）（ＬＹ－（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００） ２ －ＣＥ）を得た。収量３．１ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．２８ｐｐｍ（ｔ、３Ｈ、－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ ３ ）、１．３６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、１．５２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．６２ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、１．７０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、３．１５ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，６００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．２１ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、４．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、４．９０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、５．３７ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ）、６．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例１３－７］
Figure 0007249591000119
実施例１３－６で得られたＬＹ－（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００）２－ＣＥ（１．８ｇ、５．０×１０－５モル）を０．１３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１８ｇ）に溶解し、窒素雰囲気下で室温、３時間反応させた。反応液に塩化ナトリウム（４．５ｇ）を溶解した後、８５％りん酸を用いて水層のｐＨを８．５に調整し、そこに、ジクロロメタン（１１ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度ジクロロメタン（１１ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を４０℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（３６ｇ）を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸マグネシウム（０．９０ｇ）を加えて、３０℃で３０分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（１８ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ４１）（ＬＹ－（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００） ２ －Ｃ２）を得た。収量１．４ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．３６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、１．５２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．６２ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、１．７０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、３．１５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，６００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．２１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、４．９０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、５．３７ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ）、６．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例１３－８］
Figure 0007249591000120
実施例１３－７で得られたＬＹ－（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００）２－Ｃ２（１．５ｇ、４．０×１０－５モル）および２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－ｐ－クレゾール（１．２ｍｇ）をトルエン（６．０ｇ）に溶解し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（１６ｍｇ、１．４×１０－４モル）、１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド（２０ｍｇ、１．０×１０－４モル）を加えて、窒素雰囲気下で４０℃、４時間反応させた。次に、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－１，３－ジアミノプロパンを加えて、窒素雰囲気下で４０℃、４時間反応させた。反応液をトルエン（１２ｇ）で希釈した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を酢酸エチル（１８ｇ）で希釈した後、ヘキサン（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（１８ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ４２）（ＬＹ－（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００） ２ －Ｂｏｃ）を得た。収量１．１ｇ。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．３６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．４４ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ）、１．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、１．５２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、１．７０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、３．１５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、３．２９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，６００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、４．２１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．３４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、５．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、５．５６ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ）、６．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［実施例１３－９］
Figure 0007249591000121
実施例１３－８で得られたＬＹ－（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００）２－Ｂｏｃ（０．９０ｇ、２．５×１０－５モル）をジクロロメタン（４．５ｇ）に溶解し、メタンスルホン酸（１６２μＬ、２．５×１０－３モル）を加えて、窒素雰囲気下で室温、２時間反応させた。反応液をトルエン（９．０ｇ）で希釈した後、イオン交換水（２３ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し、水層に生成物を抽出した。その後、トルエンとクロロホルム混合溶液で水層を洗浄して、アミノ基を持たないポリエチレングリコール不純物を除去した。続いて水層に１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を適量添加し、ｐＨ１２に調整した後、塩化ナトリウム（２．３ｇ）を溶解した。そこに、クロロホルム（９．０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。水層と有機層を分離した後、水層に再度クロロホルム（９．０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を４０℃にて濃縮した後、得られた濃縮物に酢酸エチル（３６ｇ）を添加した。得られた酢酸エチル溶液に、硫酸ナトリウム（０．９０ｇ）を加えて、３０℃で３０分撹拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液にヘキサン（１８ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させ、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した後、ヘキサン（１８ｇ）で析出物を洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行い、真空乾燥して、上記化合物（ｐ３４）（ＬＹ－（ＭＥ－１００ＧＬＦＧ（Ｌ）－１００） ２ －ＰＡ）を得た。収量０．８ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９２％。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ ３ ）２）、１．３７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．４８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、１．５２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、１．７０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、２．８４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、３．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，６００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、４．１０ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、４．２１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．３４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５０ｐｐｍ（ｑ、１Ｈ）、５．５８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．４６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）
［比較例１］
化合物（ｐ３３）（ＭＥ－２００Ｆ－２００ＰＡ）の合成
Figure 0007249591000122
実施例４と同製法にて、Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－フェニルアラニン（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ）を原料に使用し、上記化合物（ｐ３３）（ＭＥ－２００Ｆ－２００ＰＡ）を得た。収量１．８ｇ。分子量は表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９２％。
ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＮＨ２）、２．８０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．２３ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ ３ ）、３．６０ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ３、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．９５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．１３ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、７．２０ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．３８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．９１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
以上、実施例１～１３と比較例１で得られたポリエチレングリコール誘導体の平均分子量を示す。
Figure 0007249591000123
［実施例１４］
血清中での安定性試験
１．５ｍLのエッペンドルフチューブに、マウスまたはヒト血清１ｍLを加え、各種ポリエチレングリコール誘導体を５．０ｍｇ／ｍLの濃度になるように添加した。３７℃で９６時間インキュベーション後、２００μLをサンプリングし、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、血清中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸等の疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、血清中からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。その後、ＧＰＣ分析を行い、分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
分解率は以下の式にて算出した。
分解率 ＝ (試験前の40kDaのピーク面積％ － 試験後の40kDaのピーク面積％) ÷ (試験前の40kDaのピーク面積％) × １００
結果を以下の表２に示す。
Figure 0007249591000124
本試験より、どの分解性ポリエチレングリコール誘導体も９６時間後の分解率が２０％以下であり、特にＧＬＦＧ（Ｌ）やＧ（ｃｉｔ）Ｖなどは分解率が低く、血中では安定であることを示した。
［実施例１５］
細胞を用いた分解性試験
培地ＲＰＭＩ－１６４０（１０％ＦＢＳ Ｐｎ／Ｓｔ）１０ｍＬを用いて、１００ｍｍディッシュにＲＡＷ２６４．７を１０×１０６ｃｅｌｌ播種し、３７℃で２４時間培養後、各種ポリエチレングリコール誘導体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解した培地に交換し、３７℃で９６時間培養した。培養後、細胞を１％ＳＤＳ溶液にて溶解し、ＰＢＳにて希釈し、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、細胞溶解液中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸等の疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、細胞内からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
また、細胞培養に使用した培地中での分解を確認するため、各種ポリエチレングリコール誘導体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解した培地のみで３７℃で９６時間培養し、上記と同操作にてポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
その後、回収した各種ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣ分析を行い、実施例１４と同じ計算式にて分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
結果を以下の表３に示す。また、細胞実験の前後のＧＰＣチャートを図１と図２に示す。
Figure 0007249591000125
分解性リンカーとしてオリゴペプチドを有したポリエチレングリコール誘導体においては、細胞内にて効果的に分解し、分子量４万から２万に分解することが確認できた。また、天然に多く存在しないＤ型のアミノ酸を用いたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｄ）－２００ＰＡにおいても、分解率は低いが、分解することを確認した。一方で、比較例１のフェニルアラニンをリンカーとして用いたポリエチレングリコール誘導体、および非分解性のメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａは、細胞内での分解が確認できなかった。
［実施例１６］
サーモンカルシトニン（ｓＣＴ）のＰＥＧ化
アミノ酸配列：
ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧ ＫＬＳＱＥＬＨＫＬＱ ＴＹＰＲＴＮＴＧＳＧ ＴＰ（配列番号：１）
であるサーモンカルシトニン（ｓＣＴ）（５ｍｇ、１．５×１０－６モル、株式会社ピーエイチジャパン製）を１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、実施例２で得られたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬまたはメトキシＰＥＧアルデヒド４０ｋＤａ（１８０ｍｇ、４．５×１０－６モル）、および還元剤である２－ピコリルボラン（２．０×１０－５モル）を加え、ｓＣＴ濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに調整し、４℃にて２４時間反応させた。その後、反応液を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて透析し、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（５ｍＬ、ＧＥヘルスケア製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴまたはメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴを得た。モル収率４４％。
ＲＰＬＣ分析
装置：ＷＡＴＥＲＳ社製「ＡＬＬＩＡＮＣＥ」
検出器：ＵＶ（２８０ｎｍ）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｃ１８（ＧＬサイエンス）
移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．０５％ＴＦＡ－ＡＣＮ
グラジエント：Ｂ３０％（０ｍｉｎ）→Ｂ４０％（５ｍｉｎ）→Ｂ５０％（１５ｍｉｎ）→Ｂ１００％（１６ｍｉｎ）→Ｂ１００％（２０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
上記ＲＰＬＣ分析条件にて、ＰＥＧ化ｓＣＴの純度を算出した。結果を図３に示す。
ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴのＲＰＬＣ純度 ９９％
メトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴのＲＰＬＣ純度 ９９％
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析
装置：Ｂｒｕｋｅｒ社製「ａｕｔｏｆｌｅｘ３」
サンプル：０．５ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ溶液
マトリクス：α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）飽和溶液（０．０１％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ＝２：１）
サンプル（１μＬ）とマトリクス（１９μＬ）を混合し、１μＬをターゲットにスポット
上記ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析条件にて、原料のＰＥＧおよびＰＥＧ化ｓＣＴの分子量を測定した。
図４には、原料であるＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬと、ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を合わせて示す。
ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴの分子量４６，２８９
ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬの分子量４３，２１０
図５には、原料であるメトキシＰＥＧアルデヒド４０ｋＤａと、メトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を合わせて示す。
メトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴの分子量４６，４２７
メトキシＰＥＧアルデヒド４０ｋＤａの分子量４３，３０３
ＰＥＧ化ｓＣＴの分子量は、原料のＰＥＧ誘導体の分子量に比べ、おおよそｓＣＴの分子量の分だけ増加していることが確認できた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
キット：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（ゲル濃度４－１２％）
染色液：クマシーブリリアントブルー溶液（ＣＢＢ溶液）またはヨウ素染色溶液（ＢａＣｌ２＋Ｉ２溶液）
上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥキットの推奨測定条件に従い、ＰＥＧ化ｓＣＴの評価を行った。結果を図６に示す。ＰＥＧ化ｓＣＴにおいては、タンパク質やペプチドを選択的に染色させるＣＢＢ染色でバンドがみられ、さらに、ポリエチレングリコールを染色させるヨウ素染色においてもバンドが見られた。両方の染色でバンドがみられ、ポリエチレングリコール誘導体がｓＣＴに結合していることを確認した。
［実施例１７］
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＰＥＧ化
アミノ酸配列：
ＭＦＰＴＩＰＬＳＲＬ ＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲ ＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱ ＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥ ＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱ ＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰ ＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱ ＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳ ＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰ ＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮ ＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮ ＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥ ＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥ ＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦ ＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮ ＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮ ＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤ ＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩ ＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣ ＧＦ（配列番号：２）
であるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（４ｍｇ、１．８×１０－７モル、Shenandoah Biotechnology社製）を１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、実施例２で得られたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬまたはメトキシＰＥＧアルデヒド４０ｋＤａ（３６ｍｇ、９．０×１０－７モル）、および還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（９．０×１０－６モル）を加え、ｈＧＨ濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに調整し、２５℃にて２４時間反応させた。その後、反応液を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）を用いて透析し、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（５ｍＬ、ＧＥヘルスケア製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｈＧＨまたはメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｈＧＨを得た。モル収率３０％。
ＲＰＬＣ分析
装置：ＷＡＴＥＲＳ社製「ＡＬＬＩＡＮＣＥ」
検出器：ＵＶ（２８０ｎｍ）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｃ１８（ＧＬサイエンス）
移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．０５％ＴＦＡ－ＡＣＮ
グラジエント：Ｂ４０％(０ｍｉｎ)→Ｂ８０％(２５ｍｉｎ)→Ｂ９０％(２７ｍｉｎ)→Ｂ４０％(２７．１ｍｉｎ)
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
上記ＲＰＬＣ分析条件にて、ＰＥＧ化ｈＧＨの純度を算出した。
ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｈＧＨのＲＰＬＣ純度 ９０％
メトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｈＧＨのＲＰＬＣ純度 ９７％
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析
装置：Ｂｒｕｋｅｒ社製「ａｕｔｏｆｌｅｘ３」
サンプル：０．５ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ溶液
マトリクス：ケイ皮酸（ＳＡ）飽和溶液（０．０１％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ＝２：１）
サンプル（１μＬ）とマトリクス（１９μＬ）を混合し、１μＬをターゲットにスポット
上記ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析条件にて、ＰＥＧ化ｈＧＨの分子量を測定した。結果を図７と図８に示す。
ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｈＧＨの分子量６５，１５３
メトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｈＧＨの分子量６５，２６３
ＰＥＧ化ｈＧＨの分子量は、原料のＰＥＧ誘導体（図４と図５参照）の分子量に比べ、おおよそｈＧＨの分子量の分だけ増加していることが確認できた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
キット：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（ゲル濃度４－１２％）
染色液：クマシーブリリアントブルー溶液（ＣＢＢ溶液）またはヨウ素染色溶液（ＢａＣｌ２＋Ｉ２溶液）
上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥキットの推奨測定条件に従い、ＰＥＧ化ｈＧＨの評価を行った。結果を図９に示す。ＰＥＧ化ｈＧＨにおいては、タンパク質やペプチドを選択的に染色させるＣＢＢ染色でバンドがみられ、さらに、ポリエチレングリコールを染色させるヨウ素染色においてもバンドが見られた。両方の染色でバンドがみられ、ポリエチレングリコール誘導体がｈＧＨに結合していることを確認した。
［実施例１８］
顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のＰＥＧ化
アミノ酸配列：
ＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰ ＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱ ＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡ ＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫ ＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬ ＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰ ＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱ ＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳ ＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱ ＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧ ＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶ ＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱ ＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬ ＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦ ＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧ ＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦ ＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨ ＬＡＱＰ（配列番号：３）
である顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）（１００μｇ、５．３×１０－９モル、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６、５％ソルビトール含有）に溶解し、実施例２で得られたＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＡＬおよび還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（５．３×１０－７モル）を加え、ＧＣＳＦ濃度を２．０ｍｇ／ｍＬに調整し、４℃にて２４時間反応させた。その後、反応液を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）を用いて希釈し、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（５ｍＬ、ＧＥヘルスケア製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ＧＣＳＦを得た。モル収率６４％。
ＲＰＬＣ分析
装置：ＷＡＴＥＲＳ社製「ＡＬＬＩＡＮＣＥ」
検出器：ＵＶ（２８０ｎｍ）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｃ１８（ＧＬサイエンス）
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ－ＡＣＮ
グラジエント：Ｂ４０％(０ｍｉｎ)→Ｂ７０％(２５ｍｉｎ)→Ｂ９０％(２７ｍｉｎ)→Ｂ４０％(２９ｍｉｎ)
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
上記ＲＰＬＣ分析条件にて、ＰＥＧ化ＧＣＳＦの純度を算出した。
ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ＧＣＳＦのＲＰＬＣ純度 ９７％
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析
装置：Ｂｒｕｋｅｒ社製「ａｕｔｏｆｌｅｘ３」
サンプル：０．５ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ溶液
マトリクス：ケイ皮酸（ＳＡ）飽和溶液（０．０１％ＴＦＡ－Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ＝２：１）
サンプル（１μＬ）とマトリクス（１９μＬ）を混合し、１μＬをターゲットにスポット
上記ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析条件にて、ＰＥＧ化ＧＣＳＦの分子量を測定した。ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ＧＣＳＦの分子量６２，２６６ＰＥＧ化ＧＣＳＦの分子量は、原料のＰＥＧ誘導体の分子量に比べ、おおよそＧＣＳＦの分子量の分だけ増加していることが確認できた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
キット：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（ゲル濃度４－１２％）
染色液：クマシーブリリアントブルー溶液（ＣＢＢ溶液）またはヨウ素染色溶液（ＢａＣｌ２＋Ｉ２溶液）
上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥキットの推奨測定条件に従い、ＰＥＧ化ＧＣＳＦの評価を行った。ＰＥＧ化ＧＣＳＦにおいては、タンパク質やペプチドを選択的に染色させるＣＢＢ染色でバンドがみられ、さらに、ポリエチレングリコールを染色させるヨウ素染色においてもバンドが見られた。両方の染色でバンドがみられ、ポリエチレングリコール誘導体がＧＣＳＦに結合していることを確認した。
［実施例１９］
ＰＥＧ化サーモンカルシトニン（ｓＣＴ）の生理活性評価
実施例１６で得られた、分子量４万の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合したｓＣＴであるＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴと、非分解性であるメトキシＰＥＧ４０ｋＤａが結合したメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴ、未修飾のｓＣＴ、および生理食塩水の４群にて、これらの生理活性を動物実験にて比較評価した。マウス種はＢａｌｂ／ｃ（８週齢、雄）、ｓＣＴ溶液およびＰＥＧ化ｓＣＴ溶液は、生理食塩水を用いてｓＣＴ濃度として０．５ｍｇ／ｍＬになるようにそれぞれ調製し、ｓＣＴの投与量として４０μｇ／ｋｇとなるように投与した。１、３、６、２４時間でマウスから微量の血液を採取し、カルシウムＥ－テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いてカルシウム濃度を測定した。その結果を図１０に示す。
生理食塩水（ＰＢＳ）の群と比べ、すべてのｓＣＴは有意にカルシウム濃度を低下させた。投与後６時間において、未修飾のｓＣＴではカルシウム濃度の上昇がみられたが、ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴと、メトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴにおいては、継続して低いカルシウム濃度を維持することが分った。ＰＥＧ化によってｓＣＴの血中半減期が長くなり、生理活性が延長されたことが示された。
［実施例２０］
動物実験による体内動態試験（放射性同位体）
実施例１６で得られた、分子量４万の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合したｓＣＴであるＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴと、非分解性であるメトキシＰＥＧ４０ｋＤａが結合したメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴを、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、そこにＢｏｌｔｏｎ－Ｈｕｎｔｅｒ試薬（０．４６２５ＭＢｑ）を添加し、ボルテックスにて撹拌後、室温で一晩反応させた。反応溶液をＰＤ－１０カラムにて分画し、各フラクションをポリエチレングリコール呈色試薬（チオシアン酸アンモニウムと硝酸コバルト）とガンマカウンターを用いて、１２５Ｉの含まれるフラクションを確認し、回収した。
得られた放射性同位体をラベル化した２種のＰＥＧ化ｓＣＴと、同様にラベル化したｓＣＴを用いて、体内動態を動物実験にて評価した。マウス種はＢａｌｂ／ｃ（８週齢、雄）、ＰＥＧ化ｓＣＴ溶液は、生理食塩水を用いてそれぞれラベル化していないＰＥＧ化ｓＣＴを５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製し、放射性同位体をラベル化したＰＥＧ化ｓＣＴを微量添加し、マウス尾静脈より２０μＬ投与した。その後、１、３、６、４８時間でマウスから血液、各臓器（肝臓、腎臓、脾臓、肺、脳、心臓、胃、すい臓、腸、睾丸、甲状腺など）を取り出し、ガンマカウンターを用いてラベル化したＰＥＧ化ｓＣＴの滞留量を測定した。
放射性同位体をラベル化した、分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合したｓＣＴであるＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴと非分解性であるメトキシＰＥＧ４０ｋＤａが結合したｓＣＴであるメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴの体内動態試験の結果として、図１１に血中濃度、図１２～１５に代表的な臓器として肝臓、腎臓、脾臓、肺への滞留量を示す。
この結果より、ＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００－ｓＣＴは、通常の分解性を有さないメトキシＰＥＧ４０ｋＤａ－ｓＣＴと比較して、同程度の血中半減期を示し、また体内における分布も同じ傾向であることを証明できた。
［実施例２１］
動物実験による空胞形成評価試験
実施例１で得られた、末端にアミノ基を有した分子量４万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＰＡと、非分解性であるメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａを用いて、動物実験による空砲形成評価を行った。マウス種はＢａｌｂ／ｃ（８週齢、雄）、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてポリエチレングリコール誘導体を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製し、マウス尾静脈より２０μＬ投与した。週３回、４週間連続投与を続け、投与終了後、マウスを４％パラホルムアルデヒド水溶液で灌流固定し、パラフィン切片を作製した。ＨＥ染色、および抗ＰＥＧ抗体による免疫染色を行い、脳の脈絡叢上皮細胞における空胞形成を評価した。免疫染色としては、免疫染色キット(BOND Refine Polymer Detection Kit、ライカ社製)と抗ＰＥＧ抗体(B-47抗体、アブカム社製)を用いて実施した。抗ＰＥＧ抗体による免疫染色を行った脳の脈絡叢切片の画像を図１６と図１７に示す。
その結果、メトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａに比べ、分解性ポリエチレングリコールであるＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＰＡは有意に空胞の形成を抑制した。
なお、本実施例において投与したポリエチレングリコールの量は、あくまで空胞化を評価するために最適化した量であり、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、極めて多量である。
［実施例２２］
動物実験によるポリエチレングリコールの蓄積性評価試験
末端にアミノ基を有した分子量４万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＰＡと、非分解性であるメトキシＰＥＧアミン２０ｋＤａ、メトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａ、コントロールであるＰＢＳを用いて、動物実験によるポリエチレングリコールの蓄積性評価を行った。マウス種はＢａｌｂ／ｃ（８週齢、雄）、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてポリエチレングリコール誘導体を６２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製し、マウス尾静脈より１００μＬ投与した。週３回、４週間連続投与を続け、投与終了後、マウスを４％パラホルムアルデヒド水溶液で灌流固定し、パラフィン切片を作製した。抗ＰＥＧ抗体による免疫染色を行い、脳の脈絡叢上皮細胞における蓄積性を評価した。免疫染色を行ったそれぞれの脳の脈絡叢切片の画像を図１８に示す。
ポリエチレングリコールが含まれないＰＢＳを投与したマウスの脈絡叢切片では染色されないのに対し、非分解性であるメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａでは、切片の広範囲で茶色に染色される結果となった。この染色部分はＰＥＧが蓄積していることを示す。その一方で、分解性ポリエチレングリコールであるＭＥ－２００ＧＬＦＧ（Ｌ）－２００ＰＡの切片においては、茶色に染色された部分が少なく、分子量が半分のメトキシＰＥＧアミン２０ｋＤａと同等の蓄積を示した。結果として、分解性ポリエチレングリコールはその分解性により、同分子量の非分解性であるメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａに比べ、有意に組織へのポリエチレングリコールの蓄積を抑制した。
これらの蓄積を定量化するため、以下の解析ソフトを用いて画像解析を行い、スコアを算出した。
装置：Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＢＺ－Ｘ７１０
解析ソフト：ＢＺ－Ｘ Ａｎａｌｙｚｅｒ
具体的には、画像中の脈絡叢組織の面積、そして蓄積を示す茶色の染色部分の面積を解析ソフトで抽出し、以下の計算式にてスコアリングを実施した。算出したスコアを表４に示す。
蓄積率 ＝ 茶色の染色部分の面積 ／ 脈絡叢組織の面積
スコア ＝ 蓄積率 ／ ＰＢＳの蓄積率
その結果、分解性ポリエチレングリコールは有意に組織へのポリエチレングリコールの蓄積を抑制できることが示された。
なお、本実施例において投与したポリエチレングリコールの量は、あくまで蓄積性を評価するために最適化した量であり、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、極めて多量である。
Figure 0007249591000126
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質は、該分解性ポリエチレングリコール誘導体が生体内の血中では安定であり、細胞内の酵素によって分解するオリゴペプチドをポリエチレングリコール鎖の間に有しているため、血中では安定であり、従来の分解性を有さないポリエチレングリコール誘導体と同等の血中半減期を生体関連物質に付与することができるので、細胞内に取り込まれた場合、ポリエチレングリコール鎖の間のオリゴペプチド部位が速やかに分解されるため、これまで課題とされていた細胞の空胞の発生を抑制することができる。

Claims (11)

  1. 下式（Ａ）：
    Figure 0007249591000127
    （式中、ｍは１～７であり、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐは１～４であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドであり、Ｚのオリゴペプチドは、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドであり、Ｑは、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基であるか、またはオリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドは、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか１つを含み、かつそれ以外のアミノ酸はシステインを除く中性アミノ酸からなる４～８残基のオリゴペプチドであり、Ｄは生体関連物質であり、Ｄの生体関連物質は、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、
    Figure 0007249591000128
    （式（ｚ１）～式（ｚ１３）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、また、式（ｚ２）～式（ｚ１３）において、式中の２～３個のｓは同一でも、異なっていてもよい。）であり、ｙは１～４０である。）
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質。
  2. 下式（１）：
    Figure 0007249591000129
    （式中、ｍは１～７であり、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐは１～４であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドであり、Ｚのオリゴペプチドは、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドであり、Ｑは、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基であるか、またはオリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドは、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか１つを含み、かつそれ以外のアミノ酸はシステインを除く中性アミノ酸からなる４～８残基のオリゴペプチドであり、Ｄは生体関連物質であり、Ｄの生体関連物質は、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、
    Figure 0007249591000130
    （式（ｚ１）～式（ｚ１３）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、また、式（ｚ２）～式（ｚ１３）において、式中の２～３個のｓは同一でも、異なっていてもよい。）である。）
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項１記載の生体関連物質。
  3. Ｑのオリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項１または２記載の生体関連物質。
  4. Ｑのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである請求項１～３のいずれか１項記載の生体関連物質。
  5. Ｚのオリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項１～４のいずれか１項記載の生体関連物質。
  6. Ｄに結合した分解性ポリエチレングリコール誘導体１分子の分子量が３０，０００以上である請求項１～５のいずれか１項記載の生体関連物質。
  7. 式（１）中のＺが、Ｚ１、Ａおよびグリシン残基で構成される、下式（２）：
    Figure 0007249591000131
    （式中、ｍは１～７であり、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐは１～４であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚ１はシステインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドであり、Ａはシステインを除く中性アミノ酸であり、Ｚ １ およびＡの中性アミノ酸の少なくとも１つはハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸であり、ａ及びｂはそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり、Ｑは、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基であるか、またはオリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドは、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか１つを含み、かつそれ以外のアミノ酸はシステインを除く中性アミノ酸からなる４～８残基のオリゴペプチドであり、Ｄは生体関連物質であり、Ｄの生体関連物質は、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、
    Figure 0007249591000132
    （式（ｚ１）～式（ｚ１３）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、また、式（ｚ２）～式（ｚ１３）において、式中の２～３個のｓは同一でも、異なっていてもよい。）である。）
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項２記載の生体関連物質。
  8. 式（２）中のｍが１である、下式（３）：
    Figure 0007249591000133
    （式中、ｎ３及びｎ４はそれぞれ独立して４５～６８２であり、ｐは１～４であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚ１はシステインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドであり、Ａはシステインを除く中性アミノ酸であり、Ｚ １ およびＡの中性アミノ酸の少なくとも１つはハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸であり、ａ及びｂはそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり、Ｑは、エチレングリコール、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリセリン、ペンタエリスリトール、ジグリセリンまたはキシリトールの残基であるか、またはオリゴペプチドの残基であり、該オリゴペプチドは、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のいずれか１つを含み、かつそれ以外のアミノ酸はシステインを除く中性アミノ酸からなる４～８残基のオリゴペプチドであり、Ｄは生体関連物質であり、Ｄの生体関連物質は、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、
    Figure 0007249591000134
    （式（ｚ１）～式（ｚ１３）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、また、式（ｚ２）～式（ｚ１３）において、式中の２～３個のｓは同一でも、異なっていてもよい。）である。）
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項７記載の生体関連物質。
  9. 式（１）中のＱがエチレングリコールの残基であり、Ｌ１がＣＨ２ＣＨ２Ｏであり、かつｐが１である、下式（４）：
    Figure 0007249591000135
    （式中、ｍは１～７であり、ｎ５及びｎ６はそれぞれ独立して１１３～６８２であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドであり、Ｚのオリゴペプチドは、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドであり、Ｄは生体関連物質であり、Ｄの生体関連物質は、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素であり、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、
    Figure 0007249591000136
    （式（ｚ１）～式（ｚ１３）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、また、式（ｚ２）～式（ｚ１３）において、式中の２～３個のｓは同一でも、異なっていてもよい。）である。）
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項２記載の生体関連物質。
  10. 式（２）中のＱがエチレングリコールの残基であり、Ｌ１がＣＨ２ＣＨ２Ｏであり、かつｐが１である、下式（５）：
    Figure 0007249591000137
    （式中、ｍは１～７であり、ｎ５及びｎ６はそれぞれ独立して１１３～６８２であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚ１はシステインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドであり、Ａはシステインを除く中性アミノ酸であり、Ｚ １ およびＡの中性アミノ酸の少なくとも１つはハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸であり、ａ及びｂはそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり、Ｄは生体関連物質であり、Ｄの生体関連物質は、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素であり、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、
    Figure 0007249591000138
    （式（ｚ１）～式（ｚ１３）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、また、式（ｚ２）～式（ｚ１３）において、式中の２～３個のｓは同一でも、異なっていてもよい。）である。）
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項７記載の生体関連物質。
  11. 式（３）中のＱがエチレングリコールの残基であり、Ｌ１がＣＨ２ＣＨ２Ｏであり、かつｐが１である、下式（６）：
    Figure 0007249591000139
    （式中、ｎ７及びｎ８はそれぞれ独立して２２６～６８２であり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｚ１はシステインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドであり、Ａはシステインを除く中性アミノ酸であり、Ｚ １ およびＡの中性アミノ酸の少なくとも１つはハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸であり、ａ及びｂはそれぞれ独立して０または１であり、かつ（ａ＋ｂ）≧１であり、Ｄは生体関連物質であり、Ｄの生体関連物質は、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマーまたは酵素であり、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５はそれぞれ独立して、
    Figure 0007249591000140
    （式（ｚ１）～式（ｚ１３）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、また、式（ｚ２）～式（ｚ１３）において、式中の２～３個のｓは同一でも、異なっていてもよい。）である。）
    で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体が結合した生体関連物質である、請求項８記載の生体関連物質。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12403199B2 (en) * 2019-09-26 2025-09-02 Nof Corporation Asymmetrically branched degradable polyethylene glycol derivative
CN112843242B (zh) * 2019-11-28 2024-03-01 重庆阿普格雷生物科技有限公司 一种聚乙二醇偶联药物、其制备方法及应用
CN114042148B (zh) * 2022-01-13 2022-04-15 浙江湃肽生物有限公司深圳分公司 一种盐酸依特卡肽稳定剂

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003104913A (ja) 2001-06-04 2003-04-09 Nobex Corp ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマー結合体の混合物、その使用及びその製造方法
WO2005094898A2 (en) 2004-03-23 2005-10-13 Amgen Inc. Chemically modified protein compositions and methods
WO2006088248A1 (ja) 2005-02-18 2006-08-24 Nof Corporation ポリオキシアルキレン誘導体
CN106421806A (zh) 2016-11-14 2017-02-22 四川大学 一种逐级响应纳米自组装树枝状前药及制备方法和应用
WO2017100725A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Tianxin Wang Methods to treat diseases with protein, peptide, antigen modification and hemopurification

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3514017A (en) 1969-03-03 1970-05-26 Afa Corp Pressure regulating structure for piston pump
US6214966B1 (en) * 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
AUPQ014799A0 (en) 1999-05-04 1999-05-27 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
WO2001017515A1 (en) * 1999-09-03 2001-03-15 School Of Pharmacy, University Of London Degradable polymers
US6828412B1 (en) 1999-09-03 2004-12-07 School Of Pharmacy, University Of London Degradable polymers
US7060498B1 (en) * 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
WO2005108463A2 (en) 2004-05-03 2005-11-17 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polyethylen glycol derivates comprising an acetal or ketal branching point
WO2006121819A1 (en) * 2005-05-06 2006-11-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for fabricating nano and microparticles for drug delivery
JP2007112924A (ja) 2005-10-21 2007-05-10 National Institute For Materials Science 高分子架橋剤及びこの架橋剤を用いたリポソーム又は細胞の架橋体
WO2007082331A1 (en) * 2006-01-20 2007-07-26 Starpharma Pty Limited Modified macromolecule
CA2642905C (en) 2006-02-21 2015-04-28 Nektar Therapeutics Al, Corporation Segmented degradable polymers and conjugates made therefrom
JP5618248B2 (ja) 2009-10-06 2014-11-05 日油株式会社 カルボキシル基含有ポリオキシエチレン誘導体の精製方法
JP5825507B2 (ja) 2010-06-25 2015-12-02 日油株式会社 分岐型ヘテロポリエチレングリコール
JP5949037B2 (ja) * 2011-03-30 2016-07-06 日油株式会社 末端に複数の水酸基を有するポリオキシエチレン誘導体
WO2012142659A1 (en) * 2011-04-19 2012-10-26 Baker Idi Heart And Diabetes Institute Holdings Limited Site-selective modification of proteins
ES2834992T3 (es) * 2011-06-06 2021-06-21 Starpharma Pty Ltd Macromoléculas
WO2014157117A1 (ja) 2013-03-27 2014-10-02 日油株式会社 アミノ基を一つ有するポリエチレングリコールの精製方法
JP6475374B2 (ja) 2018-01-30 2019-02-27 日本電気株式会社 信号構成装置、信号構成システム、信号構成方法、および信号構成用プログラム
EP3778705B1 (en) * 2018-03-29 2024-08-07 NOF Corporation Degradable polyethylene glycol derivative

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003104913A (ja) 2001-06-04 2003-04-09 Nobex Corp ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマー結合体の混合物、その使用及びその製造方法
WO2005094898A2 (en) 2004-03-23 2005-10-13 Amgen Inc. Chemically modified protein compositions and methods
WO2006088248A1 (ja) 2005-02-18 2006-08-24 Nof Corporation ポリオキシアルキレン誘導体
WO2017100725A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Tianxin Wang Methods to treat diseases with protein, peptide, antigen modification and hemopurification
CN106421806A (zh) 2016-11-14 2017-02-22 四川大学 一种逐级响应纳米自组装树枝状前药及制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioconjugate Chem.，2005年，Vol.16，p.775-784

Also Published As

Publication number Publication date
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JP2019172673A (ja) 2019-10-10
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