ITTO940713A1 - Vaccino per la prevenzione della sindrome riproduttiva e respiratoria porcina. - Google Patents

Abstract

E stato isolato un nuovo virus in grado di riprodurre in scrofe le alterazioni riproduttive associate con la sindrome riproduttiva e respiratoria porcina (PRRS) e in maialini, disturbi respiratori. Questo virus può essere impiegato nella formulazione di un vaccino in grado di proteggere le scrofe contro la PRRS. Viene descritto un vaccino che contiene una adatta quantità di antigene virale, inattivato, come pure un adatto coadiuvante.Il vaccino si è dimostrato efficace in esperimenti di prova con virus di PRRS differenti dal ceppo spagnolo. Questo vaccino trova applicazione nella medicina veterinaria.

Description

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un vaccino in grado di prevenire la sindrome riproduttiva e respiratoria porcina, in particolare/ ad un vaccino inattivato contenente il virus causativo di detta malattia in forma inattivata.

La malattia nota come sindrome riproduttiva e respiratoria porcina (PRRS) attacca le scrofe gravide in cui può provocare anoressia, aborti, mortalità fetale, feti mummificati, maialini deboli che muoiono -dopo poche ore o giorni di vita, problemi respiratori post-parto e problemi di allevamento (Loula T., "Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in thè breeding herd and suckling piglets", Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 6 ottobre 1990, Denver, Colorado, Liverstock Conservation Insti tu te, Madison WI , USA). Sono stati descritti alcuni casi in cui scrofe infette presentano macchie blu sulle orecchie, per la quale ragione la malattia è stata pure nota come "aborto blu malattia dell’orecchio blu del maiale" ["Veterinary Record", 130, n. 3, (18 gennaio 1992)]. Altri nomi dati alla ma (MPD) (MSD), "Sindrome riproduttiva misteriosa'' (MRS) , "Sindrome di infettività e respiratoria del maiale". (SIARS) o "Sindrome di aborto epidemico e respiratorio del maiale" (PEARS).

Le prime manifestazioni epizootiche di quésta malattia sono apparse negli Stati Uniti e nel Canada nel 1987. In Europa, la prima manifestazione è stata rilevata in Germania nel 1990, do.cui si è diffusa in Olanda e in Belgio nel tardo 1990 e all’inizio del 1991. In Spagna, i primi casi della malattia sono stati- individuati a metà gennaio del 1991 quando si sono osservate importanti alterazioni respiratorie in una partita di 300 maialini importati dalla Germania [Plana ed al., "Med. Vet.", 8, n. 11 (1991)]. Poco dopo, in due gruppi di allevamento sistemati a 500 metri dal gruppo in cui sono apparsi i primi problemi, si è individuata una malattia caratterizzaya da un numero anormalmente elevato di aborti durante le ultime fasi della gestazione, come anche una mortalità del 70% nei maialini. Analizzando i segni clinici osservati, e tenendo presente che (i) questi gruppi erano stati sottoposti ad un programma di vaccinazione intensivo contro la parvovirosi porcina, la malattia di Aujeszky e l’influenza porcina e che (ii) prove di laboratorio-vevano-sartato-laprseza-di- altremalattie abortive, si è sospettata la presenza clinica di PRRS. In campioni da queste fattorie,.si è isolato l’agente causativo della malattia, come descritto ih seguito in maggiore dettaglio.

Numerosi agenti sono stati correlati con questo processo' infettivo, tra i quali vi sono: virus dell’encefalomiocardite , influenza suina, febbre suina classica, febbre suina africana, malattia mucosale, malattia di Aujeszky, brucellosi, leptospirosi, febbre Q, parvovirosi e malattia clamidiale, sebbene alcuni Autori abbiano correlato questa alla micotossina [Loula T., "Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in thè breeding herd and suckling pìglets", Proceedings of thè Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra, Mengeling, W.L. e Lager K.M., “Mystery Pig Disease: Evidence and considera tionz for its etiology", in Proceedings of thè Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Dea ed al., "Virus isolation from farms in Quebec experiencing severe outbreaks of respiratory and reproductive probìems", Proceedings of thè Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Van Alstine W., " Past diagnostic approaches and findings and potential useful diagnostic strategies" , in Proceedings of thè Mystery Swine Disease Committee Meeting-supra-Loula-T.-Agri-Practice-12(1):23-33

(1991); Woolen N. ed al.,. "J. Am. Vet. Assoc.", 197:600-601 (1990) ..

La richiesta di brevetto PCT pubblicata con il numero di pubblicazione WO 92/21375, a nome di Stitching Centraal Diergeneeskundig_ Instituut (CDI), descrive l’isolamento di un virus denominato "Lelystacl·' Agent" (LA) o "Lelystad Virus" (LV) che viene identificato come l’agente causativo della malattia denominata a quel tempo MSD . Il LV isolato quando inoculato intranasalmente in scrofe gravide produce perdita di appetito ed anche rifiuto di ingestione durante i giorni da 4 a 10-12 dopo l’inoculazione, disturbi riproduttivi, e una colorazione blu sulle orecchie di alcune delle scrofe infettate nei giorni 9-10 dopo inoculazione. Tuttavia, si è pure osservato che in due delle otto scrofe infettate sperimentalmente la malattia non si riproduce (vedere tabella 6 di detta richiesta PCT), poiché in una delle scrofe il numero di maialini nati vivi e che sopravvivono alla prima settimana è grande (6 su 9, scrofa 1305) e un’altra scrofa ha due feti morti mentre già altri nove sopravvivono alla prima settimana (scrofa 1065). Il virus LV isolato da CDI appartiene al genere Arteriviride, ha un genoma formato da una molecola di-RNA poladenilata della lunghezza da 14.5 a 15,5 Kb (determinata in gel di agarosio neutro) che si replica mediante una serie di RNA subgenomici alla estremità 3’ . La suddetta richiesta PCT illustra la sequenza di nucleotidi del genoma LV , le otto possibili basi di lettura aperte (ORF), la sequenza di amminoacidi dedotta dalle ORF identificate e i'siti putativi della N-glicosilazione. Successivamente, sono stati isolati altri virus causativi della PRRS in fattorie tedesche, francesi e spagnole. Il virus isolato in Tubingen, Germania (TV) [ "Virology “, 193.

329.339 (1993)] presenta il 99,3% di omologia con LV al livello di nucleotidi contenuti in ORF da-2 a 7 (vi sono 24 differenti coppie di basi (bp) su un totale di 3216 bp incluse in tale regione). La sequenza di amminoacidi TV dedotta presenta il 99,2% di omologia con LV (vi sono soltanto 10 amminoacidi differenti nelle sequenze di amminoacidi dedotte codificate da ORF da 2 a 5, poiché non vi sono differenze nelle sequenze dedotte da ORF 6 e 7).

D’altra parte, l'omologia riscontrata tra LV e TV contro il virus isolato nel nostro laboratorio (ceppo spagnolo o SV)·è minore. Sinora, soltanto le sequenze di nucleotide e di amminoacidi corrispondenti alle ORF da 3 a 7 sono state confrontate, con i risultati seguenti:

l. vi è il 95,5% di omologia a livello di nucleotidi di SV di fronte a LV:ò TV (su un totale'di"25999'·d bp vi sono 144 che sono differenti); e

2 . vi è il 94,9% di omologia al livello di amnminoacidi di SV di fronte a LV o TV (su un totale di 955 amminoacidi, un totale di 47 amminoacidi sono osservati come differenti).

Queste variazioni negli amminoacidi possono essere correlate alla maggiore patogenicità di un. ceppo in confronto ad un altro, per la ragione che il virus isolato nei nostri laboratori (ceppo spagnolo)'è più patogeno di altri virus PRRS noti. Per esempio, il virus isolato in Francia (ceppo francese), come illustrato nell’esempio 8 di questa descrizione, in cui si può vedere che la percentuale di maialini nati vivi da una scrofa infetta con il ceppo francese è il 75%, mentre la percentuale è il 9,5% quando le scrofe sono infettate con il ceppo spagnolo (tabelle 12 e 14). La percentuale è il 61% quando le scrofe sono infettate con LV (tabella 6 della domanda PCT n. WD 92/21375), poiché 53 maialini sono nati vivi su un totale di 95 maialini.

La malattia provoca gravi perdite nell’industria dell’allevamento di maiali poiché può provocare, in diffusioni acute, una mortalità del 70% dei maial ini in una figliata. Un mezzo per risolvere il problema creato sarebbe quello di eseguire un adatto 'programma di vaccinazione che permetta la prevenzione della comparsa della malattia. A tal fine, verrebbero richiesti vaccini in grado di effettuare una prevenzione efficace della PRRS.

La richiesta di brevettò PCT pubblicata con il numero WO 93/06211 a nome di Collins J.E. e Benfield D.A., si riferisce ad un vaccino contro MSD contenente un agente infettivo isolato da polmoni di maiali infetti con MSD. Tuttavia, detta richiesta PCT non descrive la caratterizzazione o la identificazione dell’agente infettivo, nè è stata depositata presso alcun Istituto di Deposito Autorizzato. Per queste ragioni, la realizzazione della conoscenza derivata da tale richiesta PCT presenta gravi problemi di riproducibilità poiché il prodotto descritto nella richiesta PCT non può essere verificato nè i risultati ottenuti possono essere confrontati con quelli ottenuti dai richiedenti della PCT. Analogamente, in questa richiesta PCT non vengono chiaramente espressi l‘antigeno nè il coadiuvante impiegato nella formulazione del vaccino che, come verrà verificato successivamente, ha una funzione molto importante, nè vengono descritti esempi che dimostrino la potenza e l’efficacia dei detti vaccini.

La richiesta PCT pubblicata con il numero -WO 93/07898 si riferisce, tra le altre cose, alla identificazione dell’agente causativo della PRRS e a vaccini derivati da questa. Il virus isolato presenta caratteristiche simili a LV ma, a.differenza del virus isolato presso il nostro laboratorio, non è in grado di crescere su cellule ST (testicoli di maiali) a livelli rilevabili. Apparentemente, il vaccino è stato efficace, ma il livello di protezione è stato soltanto efficace in approssimativamente il 52% degli animali vaccinati, il che può essere considerato un livello relativamente basso di protezione, specialmente se si tiene presente l’elevato titolo virale impiegato nella dose di vaccino. Inoltre, questa richiesta PCT non fornisce alcuna informazione sulla organizzazione del genoma del virus nè sulle proteine codificate per la quale ragione il confronto tra questo virus e il virus ottenuto nei nostri laboratori non può essere effettuato oppure può essere effettuato ma sercitando un eccessivo sforzo di ricerca. Perciò, esiste la necessità di vaccini in grado di prevenire la PRRS. Allo scopo di risolvere questo problema, la

proteggere efficacemente le scrofe contro la malattia infettiva. La fase antigénica di questo vaccino è composto, da un isolato; .spagnolo inattivato L’invenzione provvede pure combinazioni dell ’antigene virale PRRS isolato (ceppo spagnolo) insieme con differenti patogeni porcini allo scopo di provvedere vaccini bi- o multivalenti.

Le figure da 1 a 5 illustrano le sequenze di cDNA corrispondenti alle ORF da 3 a 7 , rispettivamente, del virus di PRRS (ceppo spagnolo) come anche la sequenza dedotta dagli amminoacidi codificati da ogni ORF;

le figure da 6 a 10 illustrano la omologia e le differenze<' >esistenti tra LV e il virus isolato nei nostri laboratori, al livello delle sequenze di aminoacidi dedotte dalle ORF da 3 a 7 . Gli amminoacidi vengono espressi secondo un codice a una lettera. La riga superiore di ogni due righe corrisponde alla sequenza di amminoacidi di LV, mentre la riga inferiore corrisponde al virus isolato nei nostri laboratori (ceppo spagnolo). Gli amminoacidi omologhi sono rappresentati da due linee verticali, mentre quando vi sono sostituzioni di alcuni amminoacidi con altri , questi sono rappresentati da due punti verticali in casi di sostituzione conservative, cioè la sostituzione di un amminoacido con un altro funzionalmente equivalente .L' assenza di line verticali e di punti tra due- amminoacidi rappresenta l’esistenza di sostituzioni non conservative.

1. Campione

1.1. Animali scelti per l’isolamento del virus Vengono scelti feti mummificati, maialini nati morti e maialini viventi ma deboli dell’età da 1 a 10 giorni, progenie di scrofe di campagna con problemi clinici dovuti a PRRS.

1.2 Preparazione dei campioni

Campioni di polmone, milza, fegato, rene, cervello e cuore dei maialinì vengono ottenuti mediante necropsia. In un caso particolare, campioni vengono preparati dai polmoni di un maialino nato morto da una scrofa sospetta di essere affetta da PRRS- Con tale polmone, viene preparato un omogenato mediante DMEM (GIBCO) (10 g di polmone in 90 mi di DMEM) integrato con una soluzione di antibiotici (PEG) composta da 1000 Ul/ml di penicillina, 1 mg/ml di streptomì cina e 0,5 mg/ml di gentamicina. La sospensione risultante viene lasciata in riposo per un’ora a 4°C, viene congelata e scongelata due volte, centrifugata e il supernatante ottenuto- viene immagazzinato a -70°C per essere impiegato nella infezione di macrofagi alveolari di polmone di maiale. I n un 'altro' caso vengono preparati-campioni-di-polmone da un maialino nato vivo ma che muore entro poche or;e dalla nascita, mediante un.procedimento .simile.

inoltre, sangue viene estratto dagli animali perforando la vena cava in modo da ottenere (i) plasma di sangue, che viene conservato a -60°C e utilizzato per l'isolamento del virus e (ii) siero, che.viene impiegato per effettuare la titolazione dell ' anticorpo .

2. Microfagi alveolari di polmone di maiale

2 .1 Ottenimento

Vengono impiegati maiali sieronegativi alla malattia di Aujeszky, alla parvovirosi porcina, all’afta epizootica, alla febbre suina classica, all’influenza suina (tipi H1N1 e H3N2) e alla gastroenterite trasmissibile. L’età dei maiali utilizzati varia tra 7 e 8 settimane. Gli animali vengono anestetizzati con fenobarbitale di sodio prima della estrazione dei polmoni, che viene effettuata legando dapprima la trachea al di sotto dell’epiglottide e sezionando quindi al di sopra della legatura. Una volta che il polmone è stato estratto, questo viene lavato esternamente -con soluzione salina fisiologica, e quindi soluzioni di PBS e PEG di antibiotici vengono introdotte mediante successivi lavaggi. Le cellule-ottenute da-questi-lavaggi-vengonosottoposte a centrifugazione per 10 minuti a 300 g -e risospese in mezzo-DMEM [(mezzo DMEM integrato con· amminoacidi non essenziali (GIBCO), 1% di piruvato di sodio 1 oM e 1% di glutammina 2 mM)], 10% di siero bovino fetale (FCS) e soluzione in PEG di antibiotici a 1°/°°. Il conteggio delle ,cellule viene.-effettuato' in camere Newbauer.

2.2. Controllo della sterilità

Viene verificato che i macrofagi alveolari del polmone di maiali siano esenti da contaminazione con batteri, funghi ed altri virus, mediante le prove adatte. Analogamente, viene verificato mediante microscopia ottica lo stato generale delle cellule.

L’assenza di contaminazione da micoplasmi viene pure verificata mediante rivelazione citochimica con DAPI (4 ,6-diammidin-2-feni 1-indolo) che sì lega selettivamente a ONA e forma complessi DNA-DAPI con elevata fluorescenza ed elevata specificità.

3. Isolamento del virus

3.1. Isolamento del virus e crescita virale su macrofagi alveolari di polmone di maiale

Una coltura di macrofagi alveolari di polmone di ma iale· prepa rate precedentemente ,in- mezzo DMES/E-FCS al 10%, viene infettata con un omogeneizzato di un campione sospetta di contenere l’agente causativo di; PRRS. Il campione è composto, in un caso, da un isolato di polmone da un maialino nato morto da una scrofa che presenta segni clinici di PRRS, mentre negli altri casi si impiega run isolato di polmone da un maialino nato vivo ma che è morto dopo poche ore, progenie di una scrofa con sintomi di PRRS, come anche un isolato da plasma di sangue. L’omogenato viene mantenuto in contatto con la coltura di macrofagi a 37 °C per un’ora. Successivamente, l’inoculo viene rimosso e si aggiunge DMEM fresco con soluzione di 2% di FCS e 1°/°° di PEG, tamponando la coltura con C02 e lasciando incubare a 37°C per parecchi giorni durante i quali l’effetto citopatico (CPE) prodotto dal virus sui macrofagi viene osservato sotto un microscopio: a 3-4 giorni dopo infezione (dpi) il CPE è 70-80% (appaiono cellule giganti e deformate). La coltura viene congelata a -80°C.

Simultaneamente viene preparata per essere impiegata come controllo negativo una coltura di macrofagi alveolari di polmone di maiale esente da PRR5.

Vengono preparate sottocolture con il virus isolato-e-si-osseva-che-vi-è-il-100%-diCPE-dalla

seconda dpi. Il virus viene congelato a -80°C per-la sua successiva identificazione.è caratterizzazióne.

Analogamente, il virus viene isolato da plasma'di sangue e altri campioni da maialini nati morti o maialini viventi ma deboli nati da scrofe,infettate sperimentalmente.

Uno dei virus isolati, in particolare il virus denominato PRRS-CY-218-JPD-P56-91, viene isolato da polmone di un maialino nato morto. Questo è in grado di riprodurre sperimentalmente la malattia, presenta le caratteristiche citate nella Sezione A e vierie depositato presso la European Collection of Animai Celi Coltures (ECACC), Salisbury (Regno Unito), il 29 giugno 1993, con.il numero di accessione V93070108.

3.2. Crescita virale in altri sistemi di cellule Infezioni con il virus isolato (ceppo spagnolo) sono state effettuate in macrofagi alveolari di polmoni di maiale e in co-colture di cellule ST [linee di cellule continue di testicoli suini (ATCC CRL 1745 SI)], come una prima fase per adattare il virus alle cellule SI. Dopo parecchi passaggi in serie (5-6) sulla cellula ST e co-colture di macrofagi e colture di ST- solo , i titoli infettivi del virus sono dell ’ordine di IO6 TCID50/ml quando co-colture di macrofago-cellula, ST, vengono-infettate-e-dell-ordine

di IO4,5 TCIDc0/ml per il virus ottenuto in cellule ST sole. (TCID50, 50% della,dose infettiva di coLturaidi. tessuto].

Inoltre, macrofagi alveolari di polmone di maiale. possono anche essere immortalizzati fondendoli cellule ST mediante ibridizzazione.

In alternativa, i macrofagi alveolari di polmone di maiale possono essere immortalizzato fondendoli con e o. 2 la linea di cellule L-14 (cellule B di sangue periferico porcino) ECACC n. 91012317, oppure con linea di cellule Jag-1 (linea di cellule trofoblasti porcini) fornite da Dr. Jag Ramsoondar

I procedimenti di fusione vengono eseguiti seguendo le tecniche convenzionali di impiego in questo campo.

In alternativa, virus possono essere coltivati su cellule ST oppure su qualsiasi altra linea di cellule porcine in cui sono stati introdotti geni codificanti per i recettori della membrana del macrofago alveolare di polmone di maiale per il virus PRRS.

I virus prodotti con questi sistemi di cellule sono suscettibili all’impiego nella formulazione sia di vaccini viventi, sia di vaccini inattivati.

4. Identif icazione e caratterizzazione del virus 4.1. Denominazione e deposito -del-virus

Il virus isolato da un polmone di maialino nato morto, denominato.. PRRS-CY-218J.PD-P5-6-91 -è·,stato depositato presso European Collection of Animai Cell Cultures (ECACC), Salisbury (Regno Unito), il 29 giugno 1993 con il nume ro di accessione V93070108 Nella .presente descrizione,' eventualmente, .il virus viene descritto senza distinzione come virus spagnolo (SV) o ceppo spagnolo.

4.2. Caratteristiche del virus isolato

Questo virus (PRRS-CY-218- JPD-P5-6-91.) presenta le seguenti caratteristiche:

a) la produzióne di un leggero CPE su una linea continua di cellule ST (ATCC CRL 1746 ST) (testicolo suino fetale) con un titolo medio di IO4, 5 TciD5Q/ml e su macrofagi alveolari di polmone di maiale con titoli medi di IO5,5 TCID50/ml;

b) quando questo infetta macrofago alveolare di polmone di maiale e co-colture di cellule ST , si ottengono titoli medi di IO6,3 TCID50/ml [i quali titoli rappresentano una unità logaritmica (1 log10) superiore a quando vengono infettati soltanto macrofagi alveolari di polmone di maiale];

c) replicazione citoplasmica;

d), produzione divacuolazioneecitoplasmica

e) involucro di lipide;

f) dimensioni 40-50 nm;

g) non si osserva alcun emoadsorbimento o emoagglutinazione con polli, cavie, maiali o globuli rossi umani gruppo 0;

h) perdita di infettività a pH acido (pH < 5);

i) produzione di lesioni microscopiche (polmonite interstiziale) e macroscopiche in maialini dell’età di due mesi;

j) produzione di effetti riproduttivi negativi in scrofe gravide con mortalità fetale, feti mummificati e maialini vivi ma deboli;

k) reazione crociata con siero di riferimento Lelystad (IPMA = immunodosaggio monostrato di perossidasi);

l) reazione crociata con sieri da animali con infezioni cliniche di campo (IPMA);

m) il siero da scrofe infette con questo virus ha una reazione crociata con IV;

n) genoma poliadenilato di RNA della lunghezza di approssimativamente 15000 bp (gel di agarosio neutro) ;

o) replicazione mediante una serie RNA subgenomica presente alla estremità 3’;

p) sequenza-di-nucleotidi-aventi- 8-ore

q) in una sospensione purificata sottoposta a elettroforesi in gel di poliacrilammide e successivo trasferimento mediante immunoblot si rilevano, mediante un siero specifico preparato in scrofe dal nostro laboratorio e che hanno una reazione crociata con il virus PRRS di Lelystad, 4 bande di maggiorità corrispondenti a proteine con pesi molecolari apparenti di 15.000, 23.000, 54.000 e 66.000 dalton, che non vengono rilevati in controlli negativi (macrofagi non infetti); r) quando le 0RF da 3 a 7 di quésto virus vengono confrontate con quelle di LV e/oppure TV, si osserva il 95,5% di omologia al livello di nucleotidi (vi sono 114 differenti bp su un totale di 2599 b:'.p, e il 94,9% di omologia al livello di amminoacidi (51 differenti amminoacidi su un totale di 955); e

il' virus appartiene al genere Arterivirus .

4.3. Tecniche impiegate per l'identificazione del virus

4.3.1. Riproduzione sperimentale della malattia in scrofe gravide

sierologico sistematico contro i virus della malattia di Aujeszky, dell’afta epizootica, della, parvovirosiporcina, della febbre suina classica, dell’influenza suina (tipo H1N1 e H3N2) e della gastroenterite trasmissibile. Inoltre, viene effettuata la 'prova*·di·. titolazione dell ’anticorpo contro il virus causativo di PRRS. Tra i giorni 77 e 90 di gestazione, gli animali vengono infettati, con un isolato ottenuto su macrofagi alveolari di polmone di maiale in un caso, per via endovenosa (IV) e intranasale (IN), mentre in un altro caso, soltanto tramite la via intranasale (esempio 2.1). Durante tutto l’esperimento vengono controllate l’assorbimento di cibo, la temperatura rettale e la condizione clinica degli animali. Allo scopo di escludere i succitati agenti, campioni di sangue vengono prelevati da tutte le scrofe prima dell 'infezione . Questi risultano essere sieronegativi per tutti gli agenti. Analogamente, dopo l’infezione sperimentale, tutte le scrofe sono ancora sieronegative, a tutti detti virus e sieropositive contro PRRS (verificato con il riferimento LV). I risultati ottenuti sono riportati nella tabella 1.

TABELLA 1

Prove eseguite:

Legenda

AD malattia di Aujeszky

FMD = afta epizootica

PP - parvovirosi porcina

CSF - febbre suina classica

SF Influenza suina (H1N1, H2N3)

TG Gastroenterite trasmissibile

PRRS = sindrome riproduttiva e respiratoria porcina HAI = saggio di emoagglutinazione legato a-perossidasi

NPLA = saggio di neutralizzazione legato a perossidassi ELISA = saggio immunoassorbente legato a enzima

SN = sieroneutralizzazione

IPM immunodosaggio monostrato di perossidasi

(1 Vanni"er ed al., "Rec. Mèd. Vet." 155

158 (1979)

(2) - Charley B., Tesi dottorale, Alfort (1976) (3) Trepsta ed al., "Vet. Microbiol. ", 9, 113-120 (1984)

(4) = Elliot M. , "J. Rech. Poro.", 20141-146

(5) Lucam F., "Diagnostic sero-immunologique des viroses himains et animals", F. Bricout; L; Joubert: J.M. Huraux (1977)

(6) = Jemènez ed al., "J. Virol.", 60, 131-139 (1986) (7) = Wensvoort ed al., "Vet. QUARTERLY", 13, n. 3,

(luglio 1991)

(-) = negativo

(+) positivo

ND = non eseguita

4.3.2. Riproduzione sperimentale della malattia in maialini

L’obiettivo di questo esperimento è di verificare se il virus causativo delle alterazioni riproduttive in scrofe è in grado di produrre in maialini dell’età di due mesi sintomi- respiratori-e-lesioni

macroscopiche e microscopiche a livello dei polmoni. A tal fine, parecchi,maialini vengono infettati con- il virus (ceppo spagnolo), per via IN, i quali vengono uccisi a diversi giorni dopo infezione (esempio 2.2).

I dati risultanti più importanti dimostrano che questo virus produce a livello macroscòpico focolai multipli di consolidazione come anche polmonite interstiziale a livello microscopico'(tabella 4 Dal punto di vista della salute, non si osservano segni clinici rilevanti.

4.3.3. Sensibilità alla prova con cloroformio Questa prova viene eseguita per determinare se il virus isolato ha un involucro di lipidi. A tal fine si impiega il metodo di Feldman H. e Wang S. descritto in "Un-manuale di tecniche virologiche fondamentali", Prentice-Hall Inc., New Jersey, 146-148 (1978). I risultati ottenuti dimostrano che il virus non trattato ha un titolo di 10<5,6 >TCID50/ml, mentre dopo trattamento con cloroformio il titolo è inferiore a 10<1>,<3 >TCID50/ml per cui si può stabilire che il virus isolato ha un involucro lipidico.

4.3.4. Sequenziamento del genoma virale

Vengono effettuate cinque fasi:

i) purificazione del virus

ii) purificazionedelRNAvirale

iii) sintesi di cDNA

iv) clonazione e caratterizzazione dei cloni di cDNA v) sequenziamento e confronto delle sèquenze con quelle di LV

i) Purificazione del virus

Virus replicati in macrofagi alveolari viene chiarificato e concentrato mediante filtrazione impiegando filtri MILLIPORE. Successivamente, il virus viene sottoposto a centrifugazione in gradiente di metrizammide da 10% a 50% (SIGMA). Completata la centrifugazione, si ottiene una banda che viene concentrata mediante centrifugazione. Con il virus purificato, si effettua una elettroforesi in gel di poiiacrilammide e si sviluppa un immunoblot con un siero specifico, illustrante proteine i cui pesi molecolari apparenti sono 15, 23, 54 e 66 K dalton. ii) Purificazione del RNA virale

Si impiega una tecnica per selezionare e purificare il RNA basata sul fatto che il RNA contiene una sequenza poli (A) alla estremità 3’. Per tale scopo , si utilizza un corredo commerciale (Pharmacia) che permette esclusivamente il legame della catena poli (A) del RNA ad una matrice di cel lulosa-oligo (dT) e la sua successiva eluizione.

iii) Sintesi-di-cDNA

si impiega un corredo commerciale (Boehringer, Mannheim), seguendo le distruzioni del produttore: In breve, il RNA genomico virale viene incubato' in" presenza di un oligo (dT), dATP, dCTP, dGTP, dTTP e transcriptasi'. inversa .

iv) Clonazione e caratterizzazione dei cloni di cDNA Il cDNA viene clonato in un vettore derivato da pUC18 e si ottiene una serie di cloni contenenti la sequenza completa di nucleotidi corrispondenti a ORF da 3 a 7.

v) Sequenziamento e confronto della sequenza’ con quelle di LV

v.a.) Sequenziamento

La regione corrispondente alle ORF da 3 a 7 del virus isolato nei nostri laboratori viene sequenziata completamente. Le figure da 1 a 5 illustrano le sequenze di cDNA ottenute, come anche le sequenze dedotte dagli amminoacidi' codificati da ogni ORF: La lunghezza totale della regione sequenziata è di approssimativamente 2599 nucleotidi (nt).

Come si può vedere, la ORF 3 ha una lunghezza di circa 798 nt e codifica per una proteina di 266 residui di amminoacidi.

La ORF 4 ha una lunghezza di approssimativamente 552 nt codifica-per-una proteina-di- 183, residui-di amminoacidi. L'inizio di questa ORF 4 è disposto nel codone ATG sistemato a circa 540 bp dal codone ATG della ORF 3 iniziale. La ORF 3 e la ORF 4 hanno in comune una sequenza di circa 246 nt.

La ORF 5 ha una lunghezza di circa.'.606 nt e codifica per una proteina di 200 residui di amminoacidi. Il codone iniziale di questa ORF 5 praticamente si sovrappone al codone terminale della ORF 4 (queste hanno in comune i nucleotidi TG, il codone ATG all’ inizio della ORF 5 e il codone terminale TGA della ORF 4). Il codone iniziale ATG della ORF 5 è disposto a circa 1092 nt dal codone ATG iniziale della ORF 3.

La ORF 6 ha una lunghezza di circa 522 nt e codifica per una proteina di 173 residui di amminoacidi. Questo codone ATG iniziale della ORF 6 è disposto 8 nt a monte dall’inizio del codone TAG di terminazione della ORF 5 (a circa 1682 nt approssimativamente dal codone ATG iniziale della ORF 3).

La ORF 7 ha una lunghezza di circa 387 nt e codifica per una proteina di 129 residui di amminoacidi. Questo codone ATG iniziale della ORF 7 è disposto 5 nt a monte dall’inizio del codone TAA di terminazione-della-ORF-6.-a-circa-2193-nt

approssimativamente dal codone ATG iniziale -della-ORF

Le proteine codificate da ORF da 3 a 6 sono proteine della membrana, mentre la proteina codificata da ORF 7 è una proteina di nucleocapside .

v.b. ) Confronto con LV

Confrontando le sequenze di cDN A delle ORF da 3 a 7 di LV con quelle del virus isolato nei nostri laboratori si osserva che:

i) al livello di nucleotici, su 2599 nucleotidi confrontati 114 sono differenti, il che rappresenta approssimativamente 95,5%- di omologia ,

ii) al livello di amminoacidi, su 955 amminoacidi confrontati, vi sono 47 differenti, rappresentanti il 94,9% di omologia approssimativamente,

iii) dei 47 aminoacidi differenti ve ne sono 35 considerati come sostituzioni non conservative di cui vi sono :

- 12 nel prodotto del gene di ORF 3 (figura6); - 9 nel prodotto del gene di ORF 4 (figura 7); - 10 nel prodotto del gene di ORF 5 (figura 8); sebbene sia opportuno mettere in evidenza che il prodotto del gene.LV di-ORF- 5 contiene- un-amminocido in più del prodotto del virus spagnolo ORF 5, specificamente 1'amminoacido 35 (Asn) del prodotto del gene LV di ORF 5 non é presente nel prodotto espresso dal virus spagnolo;

- 4 nel prodotto del gene fi ORF 6 (figura,9); mentre

- il prodotto del gene di ORF 7 non contiene alcuna sostituzione non-conservativa (figura 10) iv) parziale omologia di ognuno dei prodotti espressi dalle differenti ORF del virus spagnolo e LV é di 93,6% per i prodotti di ORF 3 e ORF 5, di 94,0% per il prodotto di ORF 4, di 95,6% per il prodotto di ORF 6, e di 99,2% per il prodotto di ORF 7.

Come detto precedentemente, i cambiamenti negl amminoacidi possono essere collegati alla maggiore patogenicità di-un ceppo in confronto con un altro, poiché il virus isolato nei nostri laboratori (ceppo spagnolo) è più patogeno degli altri virus PRRS noti come , pe r esempio il vir us i sol ato -in - Fran c ia (esempio 8) e LV (tabella 6 della domanda PCI n. WO 92/21375.

5. Vaccini

L’invenzione provvede un vaccino capace dipreve ni re la sindrome riproduttiva e respiratorie porcina (PRRS). Il vaccino si è dimostrato efficace nel prevenire le alterazioni riproduttive .in scrofe, quali maialini nati morti, maialini mummificati o maialini vivi ma deboli , ritorno in servizio e problemi simili, prodotti dal virus causativo della PRRS. Analogamente, si è verificato che il vaccino induce una immunità cellulare in animali vaccinati.

Il vaccino contiene una quantità adatta di antigene virale PRRS, ceppo spagnolo, inattivato, come pure un coadiuvante e un preservativo.

Prove eseguite con questi vaccini hanno dimostrato l efficacia del vaccino, quale messo in evidenza dagli esempi 7 e 8. Inoltre, il vaccino ha dimostrato di essere efficace nell'evitare il ritorno in servizio che appare in scrofe infette. In pratica, le scrofe vaccinate con i vaccini risultanti dalla presente invenzione e infettate con il virus causativo di PRRS si accoppiano e diventano gravide alla prima ovulazione post-parto e svezzamento dei maialini.

5.1. Componenti

5.1.a) Fase antigenica

Come componente attivo, il- vaccino contiene antigene virale di PRRS inattivato, ceppo spagnolo, ad una concentrazione superiore o uguale a 10<5,5 >TCID50 per dose vaccinica. La inattivazione può, essere eseguita con mezzi "chimici che comprendono il trattamento con beta-propiolattone o con altri agenti inattivanti convenzionali , quali etilenimmina o formaldeide, oppure mediante mezzi fisici.

5.1.b.) Coadiuvanti

Sebbène sia possibile impiegare coadiuvanti di tipo idrossido di alluminio, Quii A o .loro miscele, come pure coadiuvanti oleosi, per la formulazione del vaccino, è risultato possibile verificare che i migliori risultati vengono ottenuti quando si impiega un coadiuvante oleoso (esempio 4). In particolare, si è verificato che un coadiuvante oleoso costituito da una miscela di Marcol 52, Simulsol 5100 e Montanide 888 fornisce risultati ottimi.

Il Marcol 52 è un olio minerale a bassa densità prodotto il Simulsol 5100 è un etere polietossioleato commercializzato da SEPIC; e il Montanide 888 è un etere ottadecenoato di mannitolo anidro di elevata purezza, commercializzato da SEPIC.

E stato possibile ve rif ica re- che-i l- coadiuvante ha una parte essenziale,nella efficacia del.vaccino. Così, una prova di immunità, (esempio -stata eseguita impiegando scrofe vaccinate cori due differenti vaccini , una scrofa con il coadiuvante oleoso indicato sopra (Rif. 1) e l’altra,scrofa impiegando il coadiuvante munokyn <R >(Rif f2) Sebbene entrambi i vaccini producano una sieroconversione, si verifica in una prova di infezione sperimentale che le scrofe vaccinate con il vaccino Rif . 1 vengono protette contro l’infezione sperimentale da virus di PRRS, mentre le altre scrofe, quelle vaccinate con il vaccino Rif. 2, non vengono-protette nonostante il fatto che al momento della prova di immunità esse abbiano anticorpi contro il virus. Ciò stabilisce il fatto che un coadiuvante adatto può avere una parte molto importante in relazione con la modulazione e la stimolazione della risposta immune, principalmente al livello di immunità cellulare. Inoltre, questo aspetto è stato confermato mediante la prova di immunità effettuala utilizzando il ceppo spagnolo del virus di PRRS, poiché le scrofe vaccinate e rivaccinate con il vaccino di Rif . 1 non presentano una risposta sierologica al momento dell’infezione, ma, tuttavia, vengono protette (esempio 7, tabella 8).

T

vaccino Rif . 2 (con Munokynin ) possa provocare una immunità cellulare: A tal--fine.vsarebbe-necessario -aggiungere sostanze che potenzino la risposta della cellula (CRP), cioè sostanze che potenzino le subpopolazioni di-cellule helper T XTh·, e Th2), quali IL-./ 1 (interleuchina-1) , IL-2, IL-4, IL-5, IL-6;, IL-12, g-IFN (gamma-interferone), fattore di necrosi cellulare e sostanze analoghe. Evidentemente, sarebbe anche possibile aggiungere queste sostanze PRC a vaccini con coadiuvante oleoso, nel qual caso il loro effetto di immunità della cellula verrebbe potenziato.

Si possono anche impiegare altri tipi di coadiuvanti i quali modulino e immunostimolino la risposta della cellula, quali MDP (muramil-dipeptide) , ISCOM (Complesso immuno stimolante) o liposomi.

5.1. c) Preservativi

Si può impiegare uno qualsiasi dei preservativi normalmente impiegati nella formulazione di vaccini. Uno di questi è il Thimerosaì [sale di sodio di (2-carbossi-fenilt.io)-etil-mercurio] (ALDRICH).

5.2. Metodo per la preparazione del vaccino

I vaccini risultanti dalla presente invenzione possono essere ottenuti mescolando una fase antigenica contenente antigene virale inattivato e un altra fase. come coadiuvante,che-può-o- me no-essere-oleoso-a seconda del coadiuvante scelto. Facoltativamente, ad una qualsiasi.-,delle .due fasi sarebbe possibile aggiungere sostanze CRP. Quando il coadiuvante è oleoso, viene formata una emulsione che, in un caso particolare preferibile (quando il coadiuvante è una.. miscela di Marco! 52, Simulsol 5100 e Montanide 888), è una doppia emulsione acqua/olio/acqua.

5.3. Prove di controllo del vaccino

In aggiunta alle prove convenzionali, il vaccino deve superare,prima della sua somministrazione,per (i) purezza (contro batteri, funghi, micoplasmi e virus estranei), (ii) identificazione, (iii) sicurezza, (iv) potenza e (v) controlli fisico-chimici, parecchie prove in campo (esempio 5.b) sono state effettuate in relazione alla sicurezza e all’efficacia del vaccino in un totale di cinque fattorie, di cui 508 scrofe sono state vaccinate e rivaccinate con uno dei vaccini risultanti dalla presente invenzione, mentre le rimanenti 472 scrofe non sono state vaccinate e vengono tenute come scrofe di controllo, rendendo possibile osservare come il vaccino sia sicuro e nello stesso tempo efficace, poiché in alcune delle fattorie si è riscontrata la malattia naturale di PRRS in animali non vaccinati dopo il processo di vaccinazione

5.4. Posologia e istruzioni per la somministrazione del vaccino'

E' stato possibile verificare che una dose di 2 mi di vaccino oleoso con una concentrazione di ahtigene virale inattivato uguale o superiore a 105,5 ' TCID50, somministrata mediante una p rofonda via intramuscolare, è in grado di proteggere una percentuale molto elevata di animali vaccinati contro PRRS.

E’ consigliabile il seguente programma di vaccinazione:

* Prima vaccinazione: si vaccinano tutti gli animali in riproduzione (scrofe e verri) e si rivaccinano dopo 21 giorni. Successivamente, si somministra una dose durante ogni lattazione (scrofe) e ogni 6 mesi (verri).

* Vaccinazione posteriore

- animali previsti per la riproduzione: la prima vaccinazione dovrebbe essere a 6 mesi di età» la rivaccinazione dopo 21 giorni.

- Scrofe: è consigliabile la vaccinazione durante

il periodo di lattazione·, se possibile 15

giorni prima dell’accoppiamento.

Verri: si vaccinano due volte all anno (ogni 6-mesi

In alternativa, se nel vaccino non è stata inclusa alcuna sostanza .CPR, queste sostanze possonoessere iniettate in un sito differente dal sito di inoculazione ma simultaneamente.

6. Vaccini polivalenti

Mediante un obiettivo addizionale realizzato con la presente invenzione, vengono provviste combinazioni

di differenti patogeni porcini contenenti in aggiunta

all antigene di PRRS virale inattivato (ceppo spagnolo) uno o più dei patogeni elencati sotto, allo scopo di permettere la preparazione di vaccini bi-, o multivalenti.

In questo modo possono essere preparati vaccini

bi- o multivalenti contenenti ant-igene di PRRS virale

inattivato e uno o più dei seguenti, patogeni:

Actinobacillus pleuropneumoniae , Haemophilus parasuis.

Porcine Parvovirus. _ Leptospira, Escherichia coli. Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica. Porcine respiratory coronavirus .

Rotavirus , o contro i patogeni causativi della

malattia di Aujeszky, l’influenza suina o la gastroenterite trasmissibile

ESEMPI

Esempio 1. Isolazione del virus

1.A. Preparazione del campione

Dapomonedunmaanonaomooprgne

di una scrofa con i classici sintomi di PRRS [la scrofa era priva di anticorpi .controlla malattia di Aujeszky, la parvovirosi porcina, l’afte epizootica, la febbre suina classica, l’influenza suina (tipi H1N1 e H3N2) e la gas troenterite trasmissibile]...viene. preparata una sospensione al 10% in mezzo,di coltura. DMEM, integrata con una soluzione di antibiotici (PEG) composta da 1000 IU/ml di penicillina, l mg/ml di streptomicina 5 0,5 mg/ml di gentamicina, in un rapporto polmone :soluzione DMEM di 1:10 (peso/volume). La sospensione prodotta viene omogeneizzata e lasciata in riposo per un’ora a temperatura ambiente (20-22*C). L’omogenato viene congelato e scongelato due volte, centrifugato e il supernatante ottenuto conservato a -70°C per essere impiegato nella infezione di macrofagi alveolari di polmone di maiale.

Analogamente, vengono preparati campioni dal polmone di un maialino nato vivo ma che è morto entro poche ore. Inoltre, sangue viene estratto e mescolato con e senza anticoagulante impiegato per l’isolamento del virus (da plasma di sangue) e per ottenere siero, rispettivamente

1.8. Ottenimento di macrofagi alveolari di polmone di maiale

Macrofagi alveolari vengono -ottenuti dai polmoni di maiali sieronegativi a malattia di AuJ.eszky, parvovi rosi porcina afta epizootica , febbre-suina classica, influenza suina (tipi H1N 1 e H 3N 2 ) e gastroenterite trasmissibile. L’età dei maiali impiegati varia tra 7 e 8 settimane, Prima della estrazione dei polmoni, gli animali -vengono anestetizzati con fenobarbitale di sodio e quindi uccisi. Immediatamente, i polmoni insieme con la trachea vengono estratti dopo legamento al di sotto della epiglottide. Il polmone estratto viene lavato esternamente con soluzione salina fisiologica, e in successivi lavaggi vengono introdotti 50 mi di PBS integrata con 27 ” di soluzione di PEG di antibiotici sino a che si è introdotto un totale di 500 mi di PBS. Le cellule ottenute da questi lavaggi vengono centrifugate per 10 minuti a 300 g. Questa fase di lavaggio mediante centrifugazione viene ripetuta altre due volte. Le cellule ottenute vengono lavate con PBS e soluzione in PEG di antibiotici e risospese in mezzo DMEM [DMEM integrato con amminoacidi non essenziali (GIBC0), 1% di piruvato di sodio 1 mM e 1% di glutammina 2 mM], 10% di siero bovino fetale (FCS) e soluzione in PEG di antibiotici all'1 °/°°· il conteggio delle cellule viene eseguito in camere di Newbauer e a tal fine vengono preparate diluizioni 1/10 della sospensione di macrofago aggiungendo 0,4 ml di DMEM e 0,5 mi.di soluzione di blu di tripano a 0,1; mi di sospensione di macrofagi. Si ottiene un numero di cellule variabile tra 1 e 1,2 x 10

1.C. Isolamento del virus

Un pallone per coltura della superficie di 25 cm contenente una coltura di macrofagi alveolari di polmone di maiale precedentemente preparati (3 x 106 cellule/ml) in mezzo DMEM e 10% di FCS viene infettato con 1 ml dell’omogenato di un campione derivato dal polmone di un maialino nato-morto (esempio 1.A). L’omogenato viene lasciato in contatto con la coltura di macrofago a 37°C per un’ora, tamponato con C02 a pH 7,0-7,4 e incubato a 37°C per parecchi giorni,durante i quali il CPE prodotto dal virus sui macrofagi viene osservato. A 3-4 dpi, si osserva che il CPE è 70-80%, per la quale ragione le colture vengono congelate a -80°C.

Simultaneamente, viene preparata una coltura di macrofagi alveolari di polmone di maiale non infetto.

impiegati come controllo negativo.

Vengono effettuate sub-colture con il virus isolato in cui sì osserva che il CPE partendo dal secondo dpi è il 100%. Il virus viene congelato a -80 °C per la sua successiva -ideentificazione-e caratterizzazione. Dopo il quarto .passaggio in. macrofagi,, vengono effettuate, le titolazioni corrispondenti in micropiastre da 96 pozzetti, ottenendo il titolo medio di IO5,6 TCID50/ml in accordo con il metodo di Reed e.Muench ["Am; J. Hug.",.

27, 493-497 (1938)]

Un campione di virus isolato (ceppo spagnolo)· denominato PRRS-CY- 218- JPD- P5-6-9I , isolato da un polmone di maialino nato morto, è in grado di riprodurre sperimentalmente la malattia, e viene depositato presso ECACC il 29 giugno 1993, con il corrispondente numero di accessione V93070108.

In un modo simile, il virus viene isolato in maialini vivi e nati morti, progenie di scrofe infettate sperimentalmente.

Esempio 2. Identificazione e caratterizzazione del virus

Esempio 2.1 Riproduzione sperimentale della .malattia in scrofe gravide

Vengono impiegate 12 scrofe, "German Landrace x Large White cross", originanti da fattorie con controllo sierologico sistematico contro i virus della malattia di Aujeszky, afte epizootica, parvovirosi porcina, febbre suina classica, influenza suina (tipi H1N1 e H3N2),e gastornterite trasmissibile. Inoltre viene eseguita la prova di valutazione dell’anticorpo contro il virus causativo di PRRS."

Le scrofe vengono spostate nelle stalle' di sicurezza del centro di ricerca una settimana prima dell ’ infezione e poste in recinti separaci . .Tra i giorni 77 e 90 di gestazióne',''le scrofe identificate con i numeri 53, 76, 3, 62, 91, 93 e 19 vengono infettate con 5 mi per via endovenosa (IV) e con 5 mi per via intranasale (IN) di virus di PRRS, ceppo spagnolo, isolato su macrofagi alveolari di polmone di maiale identificati come PRRS-CY-218_JPD-P5-6-91, da un quarto passaggio su macrofagi filtrati attraverso un filtro di 200 nm e con un titolo di 10<5 , 6>TCID50/ml. Le cinque scrofe rimanenti (n. 14, 40, 13, 30 3 85) vengono inoculate tra i giorni 65 e 85 di gestazione con 5 mi tramite IN (soltanto) del virus.

Durante l’esperimento, viene controllata giornalmente l’immissione di cibo, la temperatura rettale e lo stato clinico degli animali, come anche le alterazioni riproduttive (parti prematuri, parti ritardati, maialini vivi ma deboli, maialini nati morti , maialini mummificati e maialini sani),

Allo scopo di procedere con l’esclusione dei suddetti patogeni, campioni di sangue vengono prelevati dalle scrofe pre e ,post-infezione

risultato che gli animali sono sieronegativi ai patogeni prima e dopo infezione e sieropositivi contro PRRS dopo infezione (vedere tabella 1, sezione 4.3.1). I risultati riproduttivi compaiono nelle tabelle 2 e 3. Comè illustrato nella tabella 2, dei .93 maialini partoriti, 15 sono mummificati, 35 nati morti, 22 sono nati vivi ma muoiono nel terzo giorno e 21 sopravvivono 7 giorni.

Alcune scrofe manifestano inappetenza per 2-4 giorni, nei' giorni 6 e 8 dopo infezione, mentre altre scrofe manifestano inappetenza nel secondo giorno post-infezione. Non si osserva ipertermia in nessun caso. In 4 scrofe (n. 8, 62 , 92 e 93) il parto è prematuro da 1 a 6 giorni, mentre nelle altre tre scrofe il parto è ritardato di uno o due giorni.

I maialini nati vivi, 1 o 2 per figliata manifestano edema negli occhi. I maialini deboli manifestano in/coordinazione , paresi del quarto posteriore, peli fragili e mioclonia. Nella necropsia effettuata su alcuni dei maialini nati morti e deboli.

si osserva la presenza di abbondante liquido limpido nella cavità toracica. I maialini sani'nati da madri infette uccisi a 8-12 giorni di vita manifestano focolai grigi di consolidazione. All esame microscopico il cambiamento più rilevante è una leggera polmonite interstiziale multifocale- con ingrossamento dei setti- alveolari -a causa dell’infiltrazione di cellule mononucleari. Ques't'è lesioni appaiono in tutti gli animali analizzati nell’esperimento.

Come si vede nella tabella 3, dei 65 maialini partoriti, 36 sono nati morti, 26 sono nati vivi ma deboli, morendo il secondo giorno di vita, e 3 sopravvivono per la prima settimana di vita. Una scrofa partorisce 12 giorni prematuramente (n. 40) mentre le altre partoriscono 1 o 2 giorni prematuramente. I segni clinici dei maialini nati: deboli sono simili a- duelli ottenuti tramite IN-IV. Si osserva pure polmonite Le serofe infette non manifestano inappetenza o ipertermia.

La differenza più rilevante tra i due sistemi di infezione è che tramite IN IV si osservano maialini mummificati e che da 1 a 2 dei maialini nati vivi in ogni figliata manifestano edema intorno agli occhi.

In considerazione dei risultati ottenuti, si può concludere definendo che il modello di infezione

sperimentale in scrofe, a circa 80 giorni di

gestazione tramite entrambe le vie di infezione (IN e

IV) con il virus isolato (ceppo spagnolo) da animali

in scrofe gravide e provoca un’elevata proporzione di

feti mummificati, maialini nati morti e maialini vivi,' ma deboli, in modo molto simile alla 'proporzione

osservata nella diffusione dell’infezione naturale

acuta. E consigliabile infettare artificialmente

tramite la via IN per la ragione che questa è la via

naturale di infezione nel campo e perciò il modo più

opportuno per valutare l’efficacia del vaccino.

Mediante questo esperimento, è stato pure

possibile definire un modello di infezione

sperimentale in scrofe gravide che permetta la

verifica dell’efficacia del vaccino.

A: scrofa

3: tempo di infezione (giorni di gestazione)

C: parto (giorni di gestazione)

0: maialini totali

E: maialini mummificati

F: maialini deboli morti entro 48 ore

G: maialini nati morti

H: maialini apparentemente in buona salute

h1: morti tra i giorni 2 e 7

h2: vivi dopo una settimana

I: polmonite interstiziale

NT: non provato.

Esempio 2.2 Riproduzione sperimentale della malattia in maialini

Questo esperimento è stato ideato allo scopo di verificare che il virus isolato (ceppo spagnolo) che produce alterazioni riproduttive nelle scrofe, è in grado di produrre segni clinici come anche lesioni macroscopiche e microscopiche nei polmoni di maialini dell’.età di 2 mesi. A tal fine, 10 maialini vengono infettati mediante via IN con 5 ml di virus, ceppo spagnolo, con un titolo di 10<5’6 >TCID50/ml e 6 altri maialini vengono lasciati come controllo (tutti questi derivano da due figliate). Gli animali vengono uccisi nei giorni 3, 7, 8, 9 e 11 dopo l'infezione. I risultati ottenuti sono riportati nella tabella 4.

TABELLA 4

No : numero di maiali

T/C: infetti (I) o controllo (C)

DPI: giorni post infezione

I.P.: polmonite interstiziale

v/l.: isolamento del virus

2-t-: leggera polmonite interstiziale

3+: polmonite interstiziale intermedia

4+: grave polmonite interstiziale

NT : non provato

NL: nessuna lesione

Durante gli il giorni dell ’esperimenti}, non si osserva

sebbene vi sia una perdita di peso negli animali infetti in confronto con gli animali non infetti : Sotto osservazione microscopica, l’aspetto più importante è la presenza di focolai multipli di consolidazione nei polmoni, linfonodi congestionati nella mandibola e' alcune emor ragie.' intestinali . A livello microscopico, si osserva polmonite interstiziale .

Il virus viene isolato dalle soluzioni ottenute dai lavaggi di polmoni di animali infetti di una coltura di macrofagi freschi,- ma il virus non viene isolato dagli animali di controllo, in -cui non si osserva una sieroconversione nè lesioni macroscopiche o microscopiche a livello dei polmoni.

Effettuando conteggi di cellule dai lavaggi di polmoni di animali infetti, si osserva il 30% di cellule morte (macrofagi), che possono costituire un fattore d’importanza in infezioni secondarie a causa della distruzione di un elemento di difesa immunologico chiave (macrofagi).

L’assenza di segni respiratori può essere dovuta al fatto che le infezioni sperimentali sono state effettuate in stalle con trattamenti :ontinui di disinfezione e, perciò la concentrazione batterica é

condizioni sul campo .

Esempio 2.3.Sensibilità alla prova con cloroformio Viene impiegato il metodo di Feldman H. e Wang-S. (sezione 4.3.3.) che porta alla conoscenza che il virus isolato ha un involucro di lipidi poiché, vi·."' una caduta nel titolo di 4 log10 dalle co controllo rispetto a quelle trattate con cloroformio. Esempio 2.4. Sequenzamento del genoma virale

i) Purificazione del virus

Il virus, replicato su macrofagi alveolari di polmone di maiale viene purificato mediante filtrazione ’e centrifugazione in gradiente di metrizammide da 10% al 50% (SIGMA), portando ad una banda che viene nuovamente centrifugata come detto nella sezione 4.3.4. Con il virus purificato viene effettuata una elettroforesi in gel di poliacrilammide , e un immunoblot viene sviluppato con un siero specifico, che illustra proteine con pesi molecolari apparenti di 15, 23, 54 e 66 K Dalton. ii) Purificazione del RNA virale

11 RNA virale viene purificato impiegando un corredo commerciale (Pharmacia) che permette il legame della coda del poli (A) RNA ad una matrice di cellulosa-oligo (dT ) e la sua successiva eluizione .

Si impiega -un corredo commerciale (Boehringer Mannheim) (sezione 4. 3. 4 . iii ) .

iv) Clonazione e caratterizzazione-dei cloni di cDNA Il cDNA viene clonato in un vettore derivato da pUC18 e si ottiene una serie ,di cloni contenenti la, sequenza di nucleotidi completa corrispondente alle ORF da 3 a 7.

v) Sequenziamento e confronto delle sequenze con quelle di LV

I risultati del sequenziamento del cDNA del virus isolato nei nostri laboratori (ORF da 3 a 7) come anche dal confronto tra tale sequenza e la sequenza LV, vengono citati nella sezione 4.3.4.V, in cui si può vedere che, al livello di amminoacidi, vi è un grado di approssimativamente 94,9% di omologia e un totale di 47 differenti amminoacidi di cui 35 corrispondono a sostituzioni non conservative. Queste differenze a livello di amminoacidi possono essere responsabili delle differenti patogenicità che esistono fra i vari ceppi di virus di PRR5 isolati.

Esempio 3. Formulazione di un vaccino

Un vaccino, capace di proteggere contro PRRS, viene preparato in forma di emulsione seguendo il procedimento descritto in seguito.

maiale viene infettata con MOI (infezione di ordine di molteplicità) di 0,001 e incubata a 37 ’C per 24 ore,' al termine delle quali il mezzo di coltura viene sostituito con il mezzo di infezione (DMEM integrato con 2% di FCS). La coltura viene incubata per 4 giorni , a. 37<°>C sino a che si osserva il 70-80% di CPE Completato questo periodo, si esegua una prova di IPMA allo scopo di confermare la identificazione. Il virus viene raccolto mediante aspirazione sotto vuoto e congelato a -80<e>C.

La sospensione virale destinata alla formulazione del vaccino dovrebbe avere un titolo minimo di 10<5,5 >TCID50/ml (prima della sua inattivazione) e non dovrebbe essere contaminata da batteri, funghi, micoplasmi Hd altri virus. Nel caso che il titolo possa essere inferiore, questo dovrebbe essere regolato concentrando l’antigene. Per l’inattivazione della sospensione virale, si aggiunge una soluzione al 2°/°° di beta-propiolattone e si agita a 4<e>C per una notte mantenendo il pH a 7,4 mediante aggiunta di NaOH 0,5N . Completato il periodo di inattivazione, la sospensione virale viene mantenuta a 37°C per un’ora.

Si prepara quindi:

a) una fase antigenica dell’antigene virale inattivato con la concentrazione minima di 10<5,5 >TCID50/dose e il conservante; e

b) una fase oleosa composta da.Marcol 52, Simulsol- -1500 e Montanide 888.

La fase acquosa, mantenuta in agitazione, viene aggiunta lentamente al reattore contenente-la-fase oleosa mantenuta pure in agitazione. Dopo che la fase acquosa è stata aggiunta completamente, l’agitazione viene proseguita per 10 minuti.

In un caso particolare preferito, vaccini sono stati preparati in grado di prevenire PRRS, comprendente per dosi di 2 ml:

a) 53% di una fase antigenica, contenente:

i) antigene virale PRRS in mezzo di coltura DMEM, ceppo spagnolo, inattivato con betapropriolattone alla concentrazione minima di 10<5,5 >TCID50, e

ii) thimerosal 0,01%; e

b) 47% di una fase oleosa contenente:

i) Marcol 52 . 790,0 mg

ii) Simulsol 5100 . 70,0 mg

iii) Montanide 888 80,0 mg.

Il rapporto fase oleosa/fase acquosa è un rapporto peso/volume, Questo vaccino è stato denominato MSS Rif . 1. Il vaccino ottenuto viene

dell impiego .

Un altro vaccino viene preparato in modo simile impiegando Munokynin<R >(idrossido di alluminio e Quii A, fornito da American Cyanamid) come coadiuvant mantenendo la stessa quantità di virus inattivato Questo vaccino è stato denominato MSD Rif. 2.

Esempio 4. Valutazione del coadiuvante

Viene eseguita una prova in campo con un totale di 128 scrofe di cui 49 sono vaccinate con una dose del vaccino denominato MSD Rif. 1, 50 scrofe vengono vaccinate con una dose del vaccinò-denominato MSD Rif.

2 (Munokynin ) e le rimanenti 29 non sono vaccinate e vengono tenute come controllo. Dopo 22 giorni, le scrofe vengono rivaccinate con una dose del vaccino corrispondente.

Vengono valutati i parametri seguenti

1. Risposta sierologica mediante determinazione IPMA ai tempi seguenti:

T0 : vaccinazione e salasso

T22 : rivaccinazione e salasso

T51:salasso a 50 giorni post-vaccinazione.

Reazioni di tipo generale (appetenza per cibo, ipertermia, eco.).

I risultati ottenuti sono illustrati nelle tabelle-5

con reazione sierologica positiva (tabella 5) e la media aritmetica ;dei titoli sierologici ,raggiunti (tabella 6).

TABELLA S

% DI ANIMALI -CON- REAZIONE SIEROLOGICA

vaccinate e rivaccinate negli stessi giorni con il vaccino MSD Rif . 2 (dosi di 2 mi, 10<5,5 >TCID50/dose di titolo di virus inattivato).

Durante i primi cinque giorni dopo

osservazioni:

a) Reazione locale

Consiste nell’osservazione macroscopica del- sito di inoculazione e palpazione, notando il grado di infiammazione in confronto con oggetti di dimensione nota.

b) Reazione generale

Consiste nell’osservazione macroscopica degli animali e nella verifica della loro appetenza per il cibo.(In caso negativo, si verifica la temperatura rettale ogni 12 ore sino a che è scomparsa la ipertermia o qualsiasi altro segno sfavorevole.

I risultati ottenuti riflettono il fatto che vi è una leggera reazione infiammatoria in alcune scrofe, prevalenti nel sito di inoculazione, che scompare in ogni caso entro pochi giorni; non si osservano formazioni purulente. Soltanto una delle scrofe rifiuta di ingerire la totalità del cibo nella prima alimentazione post-inoculazione , ma l’ingestione del cibo è normale nelle alimentazioni successive in modeche non è necessario rilevare la temperatura rettale. Non esistono differenze sostanziali nella risposta ai differenti vaccini provati quando individuati, in base a che si può affermare che entrambi i vaccini son-sicuri

Esempio 5.A.2. Scrofe gravide

Vengono scelte a caso sette scrofe, gravide (German Landrace'x Large White cross) da una fattoria di allevamento di maiali: 6 scrofe primipare dèli'età di circa 9 mesi e una scrofa pluripara, dell’età di 3 anni e 7 mesi.

Viene usato successivamente il vaccino denominato MSD Rif. 1-.

Le scrofe vengono vaccinate mediante via IM profonda con una dose di 2 mi di vaccino che contiene virus inattivato al titolo di IO5,5 TCID50/ml, e 15 giorni dòpo vengono rivaccinate con una dose dello stesso titolo.

Durante i primi cinque giorni dopo l’inoculazione, vengono fatte le seguenti osservazioni:

a) Reazioni locali

Consiste in osservazioni macroscopiche del sito di inoculazione e palpazione prendendo nota del grado di infiammazione in confronto con oggetti di dimensioni ben note.

b) Inappetenza

Consiste nell’osservazione macroscopica degli animali e della verifica di perdita di appetenza per-il-cibo

c) Temperatura rettale

Misura della temperatura rettale a 24 ore dopolla. vaccinazione e 24 ore dopo la rivaccinazione.

I risultati ottenuti riflettono il fatto che vi è una leggera reazione locale in due degli animali, la quale non è grave à causa della sua piccola dimensione, scomparendo in pochi giorni. L’inappetenza o la ipertermia non vengono osservate in nessun caso. In base a ciò, si può affermare che il vaccino è sicuro.

Esempio 5.B. Prova in campo di sicurezza e efficacia Questo esperimento viene effettuato nelle 5 fattorie elencate in seguito. Un numero variabile di scrofe da ogni fattoria viene vaccinato mediante IM profonda con una dose di 2 mi del vaccino MSD Rif. 1 contenente un titolo di 10<5,5 >TCID50/dose di virus inattivato, e rivaccinate 21 giorni dopo con un’altra dose dello stesso titolo, mentre le altre scrofe non vengono vaccinate e vengono impiegate come controlli.

FATTORIA VACCINATE CONTROLLO TOTALE

TL = Totale

I : Fattoria "RAMON DEL QUINTA" (Banyoles)

II : Fattoria "CAL SABATER" (Orriols)

III : Fattoria "E: CANELA" (Preixana)

IV : Fattoria "R. CUNILLERA" (L’Albi)

V : Fattoria “INVERSORS PICBER" (Bellpuig)

E’ stato possibile verificare che il vaccino è sicuro in base all'osservazione delle reazioni generali e locali. Le reazioni locali vengono osservate soltanto nell'1% degli animali. In relazione con i parametri produttivi osservati nelle suddette fattorie, non si osservano variazioni in confronto con le loro storie cliniche.

Per quanto riguarda la risposta sierologica, alcune fattorie hanno una sieroconversìone per il vaccino mentre in altre la risposta è negativa. Ciò non è indicativo di un basso livello di protezione poiché nelle prove di infezione sperimentale in laboratorio, animali sieronegativi resistono all’infezione sperimentale (esempi 7 e 8).

In- relazione- con-la-trasmissione-di-immunità -materna da animali vaccinati alla loro progenie, vi una grande caduta nei titoli di anticorpo all’etàldi mese.

In scrofe vaccinate e rivaccinate che sono sierologicamente positive, vi è una grande caduta nei titoli di anticorpo a due mesi dalla rivaccinazione, Esempio 6. Verifica della immunità delle:cellule Vengono impiegate cinque scrofe gravide (German. Landrace x Larga White cross) da una fattoria di allevamento di maiali. Gli animali vengono spostati alle stalle di sicurezza del centro di ricerche.

Le scrofe vengono scelte a caso e. vengono vaccinate con il vaccino denominato MS Rif. 1. Un’altra scrofa viene vaccinata con il vaccino denominato MSD Rif. 2. Le due scrofe rimanenti non vengono vaccinate.

Le scrofe vengono vaccinate per via IM profonda con una dose di 2 mi di vaccino MSD Rif. 1 o di vaccino MSD Rif. 2 contenente virus inattivato con titolo IO5’5 TCIDC,Q, e 20 giorni dopo le scrofe vengono vaccinate con un’altra dose dello stesso titolo.

Successivamente, tra i giorni 7 7 e 90 di gravidanza tutte le scrofe vengono infettate tramite

con il titolo di IO5,8 .. T C I D c Λ/ m 1. Al momento dell’infezione, viene verificato che tutte ile '^scróte vaccinate presentano anticorpi contro ’ il virus causativo della PRRS (sierologia positiva). La tabella 7 illustra i risultati ripo duttivi-ottenutinell ’ insieme: '

(A) numero di scrofe

(B) vaccino impiegato

(C) numero totale di maialini

(0) numero di maialini nati vivi in buona salute (E) numero di maialini nati vivi ma deboli

(F) numero di maialini vivi dopo la prima settimana (G) numero di maialini nati mort i

I risultati ottenuti dimostrano che le scrofe vaccinate con il vaccino MSD Rif. 1 (coadiuvante oleoso) resistono all'infezione meglio delle scrofe vaccinate con il vaccino MSD Rif. 2 (coadiuvante

coadiuvante ha una funzione importante nello-stabilire l’immunità della cellula.

Esempio 7. Efficacia in scrofe gravide

Vengono impiegate 11 scrofe (German Landrace x Large White cross) da una fattoria per l 'allevamento di maiali. Gli animali vengono" spostati alle-stalle di sicurezza del centro di ricerche.

Tre scrofe vengono scelte a caso (scrofe n. 57, 63 e 74)e vengono vaccinate con il vaccino denominato MSD Rif . 1. Tre scrofe (n. 15, 18 e 23) vengono vaccinate con il vaccino denominato MSD "Rif . 2, e le rimanenti 5 scrofe (n. 14, 40, 13, 30 3 85) non vengono vaccinate.

Le scrofe vengono vaccinate mediante via profonda IM con una dose di 2 mi del vaccino denominato MSD Rif. 1 o del vaccino MSD Rif. 2, contenente virus inattivato con titolo di IO5,5 TCID50/dose, e rivaccinate con un’altra dose dello stesso titolo 20 giorni dopo. Si osservano le reazioni locali e generali .

La risposta sierologica negli animali viene verificata mediante la prova IPMA in accordo con il programma seguente:

T0 : Salasso e vaccinazione

T20 salasso-rivaccinazione

42 salasso

78 salasso e-infezione sperimentale

salasso dopo infezione sperimentale

25 salasso dopo infezione sperimentale

50 : salasso dopo infezione sperimentale.

L’infezione, sperimentale Viene effettuata nelle stalle di sicurezza del centro di ricerche. Tutti gli animali vengono infettati nella quantità di 5 mi di virus virulento PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 con titolo di 10<5,8 >TCID50/ml tramite la via IN. Viene notata la risposta sierologica come anche il numero di maialini nati vivi e·nati morti da ogni scrofa. Salassi pre e post-colostro vengono fatti nei maialini, e campioni di. polmone e di cervello vengono prelevati dai maialini nati morti e dai maialini uccisi a giorni differenti per l’isolamento del virus e per tagli istologici.

I risultati ottenuti sono riportati nelle seguenti tabelle da 8 a 10.

TABELLA 8

Risultati sierologici

TABELLA 9

Risultati della figliatura

* : non gravida

queste scrofe sono morte a causa di una temperatura ambientale eccessivamente elevata. Viene effettuato il taglio cesareo a 112 giorni di gestazione.

(A) data di infezione (giorni di gestazione) (B) : figliatura (giorni di gestazione)

(C) numero totale di maialini (taglio cesareo) (D) : numero totale di maialini (nati)

(E):maialini-nati-con-salute-normale

(F) : maialini nati deboli

(G) :maialini nati vivi con gambe storte

(H) : maialini nati morti (morti)

(I) : maialini nati morti (mummificati)

(J) : maialini morti nella prima settimana

TABELLA 10

Sierologia dei maialini A. Scrofe vaccinate

3- Scrofe di controllo (non vaccinate)

Legenda :

*) : Queste scrofe sono morte a causa di una temperatura ambientale eccessivamente elevata. Il taglio cesareo è stato effettuato a 112 giorni di gestazione.

1 : numero attribuito ad ogni animale

2 : Maialini (numero attribuito ad ogni maialino corrisponde all’ordine di nascita)

3 : sierologia pre-colostro

4 : sierologia post-colostro

5 : isolamento del virus

NT: -non-provato

- : negativo

: positivo

H : ore

NP : non gravida

E evidente dai risultati ottenuti che .vi è una sieroconversione positiva contro il virus causativo della PRRS. Inoltre, vi è un comportamento soddisfacente contro l’infezione sperimentale, in confronto con gli animali di controllo in cui la morte viene prodotta nella maggior parte dei feti.

Conseguentemente, si può affermare che questa vaccinazione è una misura efficace per la prevenzione della PRRS

Esempio 8. Efficacia del vaccino contro infezioni sperimentali con un altro agente causativo della PRRS (protezione crociata)

Questo esperimento è stato ideato per la verifica dell’efficacia del vaccino identificato come MSD Rif .

1 in una prova di infezione sperimentale impiegando 2 ceppi patogeni del virus causativo della PRRS.

I ceppi patogeni di PRRS impiegati sono:

i) ceppo spagnolo, PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91; e

iiceppoFrancesceSDRII-8B-provisto-da-D-E-Albina del "Laboratoire Central de Recherches Avicole. et Porcine", Ploufragan,Francia

Il vaccino impiegato è il vaccino denominato MSD Rif. 1 di cui viene data la formula nell’esempio 5.

Vengono impiegate 30

sieri causativi della PRRS, al ciclo riproduttivo non compreso tra 10 giorni prima e 10 giorni dopo l’accoppiamento, e 10 giorni prima e 10 giorni dopo il parto.

Vengono formati quattro gruppi di animali:

A: 10 scrofe vaccinate e rivaccinate tramite la-via IM e infettate tramite la via IN con ceppo spagnolo PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 del virus.

B: 5 scrofe non soggette al alcuna vaccinazione e infettate tramite la via IN con il ceppo spagnolo PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91.

C; 10 scrofe vaccinate e rivaccinate tramite la via IM e infettate tramite la via IN con il ceppo francese SDRP II 8B.

0: 5 scrofe non soggette ad alcuna vaccinazione ed infettate tramite la via IN con il ceppo francese SDRP II 8B.

Esperimento effettuato

Venti scrofe dei gruppi A e C citati sopra vengono vaccinate con una-dosedi 2mldel vaccino denominato MSD Rif. 1.tramite la via profonda IM,e rivaccinate 21 giorni dopo con la stessa dose di vaccino.

Successivamente tra i giorni 70 e 80 di gestazione, tutte, le scrofe ,vengono infettate sperimentalmente con:

Gruppi A e B. 5 mi di virus PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 con un titolo di IO5,8 TCID50/ml tramite la via IN; e

Gruppi C e D. 5 mi di virus SDRP II 88 con un titolo di IO5,8 TCID50/ml tramite 'la via IN.

Parametri valutati

1. Risposta sierologica mediante saggio IPMA a:

TQ: salasso e vaccinazione

T21 : salasso e rivaccinazione

T41: salasso

T1 : salasso e infezione

Tj 7 : salasso 7 giorni dopo infezione.

2. Valutazione della-temperatura rettale, reazione locale e reazione generale durante i 4 giorni successivi alla vaccinazione e alla rivaccinazione, oppure sino a che la temperatura o i segni clinici, se esistono, scompaiano.

3. Valutazione della temperatura rettale, assunzione

seguenti l’infezione sperimentale.

4. Individuazione , di anti corpi nel', siero- e isolamento del virus nel siero e in monociti estratti da sangue intero .

Parametri riproduttivi al momento.del-parto, quale il numero di maialini nati vivi',/ numero di maialini nati morti o mummificati e numero di maialini nati vivi ma deboli che muoiono entro la prima settimana.

6. Determinazione della quantità di virus presente - nel siero mediante titolazione su macrofagi in base a CPE.

7. Determinazione del virus nel liquido pleurico e nei polmoni dei maialini.

I risultati dei parametri riproduttivi vengono illustrati nelle tabelle 11-12 (prova di immunità con PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91) e 13-14 (prova di immunità con SDRP II 8B).

TABELLA 11 (scrofe vaccinate)

Prova di immunità con PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91

^

TL totale

% di maialini vivi- 68% (75 nati/51 sopravvivono) Si osserva una protezione del 68% confrontando i maialini nati vivi con quelli che sopravvivono 7 giorni di vita. Il fatto che l’infezione sperimentale sia molto più potente della infezione naturale nel campo, in aggiunta ai precedenti risultati, rende possibile prevedere che i prospetti per la protezione siano ancora migliori.

TABELLA 12 (scrofe non vaccinate)

Prova di immunità con PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91

TL = totale

% di maialini vivi: 9,5% (42 nati/4 sopravvivono). Il ceppo spagnolo impiegato per l’infezione ha una efficacia patogenica estremamente elevata (90,5%) poiché soltanto 4 maialini sopravvivono nella prima settimana su 42 maialini nati.

TL = Totale

% di maialini vivi: 82% (105 nati/86 sopravvivono) Si osserva una protezione di approssimativamente 1’82%.

TL : totale

% di maialini vivi: 75,7% (66 nati/50 sopravvivono) Si osserva una mortalità di approssimativamente il 24,3%. La-patogenicità del ceppo francese è molto debole (24,3%) confrontata con i risultati ottenuti dalla prova con il ceppo spagnolo (mortalità 90,5%). I risultati .impiegati per riavevaiurazione

confrontando le scrofe vaccinate e non .vaccinate non-. sono molto significativi nel caso del ceppo francese : Tuttavia e-in ogni caso, la patogenicità negli animali vaccinati viene ridotta al 17,8%.

Legenda alle tabelle 11-14 a) una malattia differente (non PRRS)(maialini non sono inclusi)

b) ammalati, muoiono prima dell’infezione

c) ammalati, muoiono per un’altra causa

(l) scrofa di riferimento

(2) numero totale di maialini

C3) numero di maialini nati sani

(4) numero di maialini nati deboli

(5) numero di maialini nati vivi con gambe storte (6) numero di maialini nati morti

(7) : numero di maialini vivi dopo la prima settimana

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. - Vaccino capace-di prevenire la sindrome riproduttiva e respiratoria porcina (PRRS), caratterizzato per il fatto che comprende una quantità spagnolo, inattivato, come anche un adatto coadiuvante e, facoltativamente, un conservante. 2. - Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto virus della PRRS, accessione V9307G108. 3. - Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che contiene una quantità di virus inattivato di almeno 10<5,5 >TCID50/dose. 4. - Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto virus è stato coltivato su una coltura di macrofagi alveolari di polmone di maiale. 5. - Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto virus è stato coltivato su un macrofago alveolare di polmone di maiale e .co-coltura su cellula ST (ATCC CRL 1746 ST). ó. - Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto virus è stato coltivato su coltura di cellule ST (ATCC CRL 1746 ST). 7. - Vaccino secondo la rivendica,:io ne 1, caratter izzato dal fatto,che detto virus è stato coltivato su cellule ibride di macrofago alveolare di polmone di maialefuseconcelluleST- mediante ibridizzazione. 8. .- Vaccino secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal-fatto che detto virus è stato coltivato su cellule ibride di macrofago alveolare di polmone di maiale- fuse-con-la-linea di cellule ,LL-c14 (ECACC n. 91012317');oppure con la linea-di-cellule JAG-1. 9. - Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal-fatto che detto virus è stato coltivato su cellule ST o su un’altra linea di cellule porcine in cui sono stati introdotti geni-codificanti per i recettori della membrana del macrofago alveolare di polmone di maiale per il virus della PRRS. 10. - Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto coadiuvante è un coadiuvante oleoso. 11. - Vaccino secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detto coadiuvante oleoso è costituito da una miscela di Marcol 52, Simulsol 5100 e Montanide 888. 12. - Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che è un’emulsione di (i) una fase antigenica acquosa contenente virus inattivato e (ii) una fase oleosa contenente il coadiuvante. ca ratterizzato dal fatto che de tta emù lsione ,è . composta da 53% in volume; di una -fase acquosa contenente il virus inattivato e da 47% in<‘ >peso di una fase oleosa contenente il coadiuvante. 14.'- Vaccino secóndo una qualsiasi .dèlie, rivendicazioni precedenti, - caratterizzato dal fatto che è in grado di indurre una immunità cellulare nell’animale vaccinato. 15. - Vaccino secondo la rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che contiene inoltre sostanze di potenziamento della risposta delle cellule (CRP) che potenziano l’effetto immune delle cellule, quali IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN, fattore di necrosi delle cellule e sostanze simili. 16. - Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il coadiuvante è un coadiuvante acquoso. 17. - Vaccino secondo la rivendicazione 16, caratterizzato, dal fatto che contiene inoltre sostanze potenziatrici della risposta della cellula (CRP) che inducono un'effetto immune nella cellula, quali IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN, fattore di necrosi delle cellule e sostanze simili. 18. - Vaccino secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato - dal-fatto che-il-coadiuvante -è-un coadiuvante che può modulare e immunostimolare via risposta. delle cellule, quali MDP, ISCOM o liposomi. -19 . - Vaco ino secondo una qualsiasi delle rivendicaz ioni p recedenti, caratterizzato dal fatto che è in grado di evitare il ritorno in servizio nell’animale'vaccinato 20. - Vaccino in grado dì prevenire la sindrome riproduttiva e respiratoria porcina (PRRS) caratterizzato dal fatto che è un’emulsione comprendente: a) 53% di una fase acquosa contenente l’antigene virale della PRRS in mezzo di coltura DMEM, ceppo spagnolo, inattivato, alla concentrazione minima di IO5’5 TCIDS0/dose, e b) 47% di una fase oleosa contenente una miscela di Marcol 52, Simulsol 5100 e Montanide 888. 21. - Vaccino secondo la rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che detto antigene virale è il virus della PRRS, ceppo spagnolo, denominato PRRS-CY-2.18-JPD-P5-6-91, depositato presso ECACC, con il numero di accessione V93070108. 22. - Vaccino secondo una delle rivendicazioni 20 o 21, caratterizzato dal fatto che è in grado di indurre l ’ immunità della cellula nell ’animale 23. - Vaccino secondo la. rivendicazione 22, caratterizzato dal fatto che contiene inoltre sostanze potenziatrici della risposta della cellula (CRP) che potenziano l’effetto immune della cellula, quali IL-1, IL-2 , IL-4, IL-.5, IL-6, IL-12, g-IFN, fattore di necrosi della cellula e sostanze simili " 24. - Vaccino secondo una delle rivendicazioni da 20 a 23, caratterizzato dal fatto che è in grado di evitare in ritorno in servizio dell’animale vaccinato. 25. - Vaccino bi- o multivalente capace di prevenire; la sindrome riproduttiva e respiratoria porcina e un’altra o altre infezione porcine, caratterizzato dal fatto che contiene una quantità adatta di antigene virale o virus della PRRS, ceppo spagnolo, inattivato, più uno o più patogeni porcini. 26. - Vaccino secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che detto antigene virale è il virus della PRRS, ceppo spagnolo, denominato PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, depositato presso ECfìCC, con il numero di accessione V93070108. 27 . Vaccino secondo la rivendicazione caratterizzato dal fatto che comprende almeno un patogeno porcino scelto dal gruppo costituito da Actinobacillus pleuropneumoniae. Haemophilus parasuis. Porcine’parvovirusvt-Laptospirap Escherichia coli; Erysipelothrix rhuziopathiae. Pasteurella multocida. Bordetella bronchisèptica. Procine respiratory : coronavirus. Rotavirus. o contro i patogeni causativi della malattia di Aujeszky, dell’influenza suina o della gastroenterite trasmissibile. 28. - Procedimento per la preparazione di un vaccino capace di prevenire la sindrome riproduttiva e respiratoria porcina (PRRS), contenente una quantità adatta di virus della PRRS , ceppo spagnolo, inattivato , più un coadiuvante adatto e, facoltativamente, un preservante, caratterizzato dal fatto che comprende: 1) la coltura del virus causativo della PRRS, ceppo spagnolo, in un adatto sistema di cellule, 2) la raccolta del virus da detto sistema di cellule quando è stato raggiunto il titolo minimo di 10<5,5 >TCID50/ml, 3) la inattivazione del virus mediante metodi fisici o chimici, e A) la miscelazione del virus inattivato con coadiuvante e con il preservativo. 29. - Procedimento secondo la rivendicazione 28, caratterizzato dal fatto che detto virus della PRRS, ceppo spagnolo, è il virus denominato PRRS-CY-218-JPD-P5691depositato-presso-la-ECAC-con-il-numero-di accessione V93070108. 30. - Procedimento secóndo la rivendicazione 28, caratterizzato dal fatto che detto virus è stato coltivato su: i) coltura di macrofagi alveolari di polmone di maiale, oppure su ii) una co-coltura di macrofagi alveolari di polmone di maiale e cellule ST (ATCC CRL 1746 ST), oppure su iii) coltura di cellule ST (ATCC CRL 1746 ST), oppure su iv) cellule ibride di macrofagi alveolari di polmone di maiale fuse con cellule ST, oppure su v) cellule ibride di macrofagi alveolari di polmone di maiale fuse con linea di cellule L-14 (ECACC n. 91012317) o con linea di cellule Jag-1, oppure su vi) cellule ST o qualsiasi altra linea di cellule porcine in cui siano stati introdotti geni codificanti per il recettore della membrana dei macrofagi alveolari di polmone di maiale per il virus PRR5 -31. - Sequenza di DNA del virus causativo delia PRR5, ceppo spagnolo, comprendente essenzialmente le sequenze di DNA illustrate nelle figure da 1 a 5. 32. - Virus causativo della PRRS, ceppo spagnolo, le cui caratteristiche corrispondono essenzialmente a quelle .del virus denominato PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, depositato presso 1a ECACC, con il numero di accessione V93070108. 33. - Virus secondo la rivendicazione 32, inattivato, capace di essere utilizzato nella formulazione di vaccini in grado di prevenire la sindrome riproduttiva e respiratoria porcina. 34. - Virus secondo :la rivendicazione 32, inattivato, capace di essere impiegato nella formulazione di vaccini bi- o multivalenti capaci di prevenire la sindrome riproduttiva e respiratoria porcina ed altre infezioni eorcine.