ITMI981834A1 - Diagnosi dell'autismo - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "DIAGNOSI DELL'AUTISMO"

La presente invenzione riguarda un metodo di diagnosi di patologie psichiatriche correiabili all'autismo.

Più in particolare, l'invenzione riguarda un metodo di diagnosi di autismo e patologie correlate basato sull'identificazione in un fluido biologico di pazienti di nuovi peptidi che costituiscono un ulteriore oggetto dell'invenzione.

L'autismo infantile è una patologia psichiatrica eterogenea dal punto di vista dei meccanismi patogenetici. Tale malattia, nota anche come sindrome di Kanner, sorge spesso nella prima infanzia, entro i primi due o tre anni di vita, ed è .caratterizzata da disordini nel linguaggio, incapacità a sviluppare relazioni sociali, comportamenti rituali e ripetitivi e, in generale,ritardo nello sviluppo cognitivo La diagnosi dell'autismo viene solitamente effettuata attraverso l'analisi del comportamento del bambino,non esistendo ad oggi parametri biochimici, "marker",di sicuro valore prognostico e/o diagnostico.

La diagnosi è complicata dal fatto che altre patologie del sistema nervoso possono presentarsi con sintomi anche molto simili all'autismo classico ed è solo attraverso l'osservazione ripetuta e prolungata del paziente, da parte di specialisti, che la diagnosi può essere posta. Attualmente,malgrado la forte componente genetica della malattia, non è stato ancora possibile individuare con certezza alterazioni genetiche o biochimiche che possano essere responsabili della patologia.

US 5,686,311 descrive un metodo diagnostico per l'autismo basato sulla determinazione di una serie di metaboliti quali acido citramalico, acido tartarico, acido furan-2,5-dicarbossilico, acido 3-oxo-glutarico, arabinosio, acido diidrossifenilpropionico, furancarbonilglicina, acido carbossicitrico, acido 5-idrossimetil-2-furoico.

Gli elevati livelli di questi metaboliti in pazienti autistici sono in via ipotetica spiegati come una possibile conseguenza di un'infezione fungina, in quanto si è visto che la somministrazione di un farmaco antimicotico a bambini autistici ha comportato una normalizzazione dei livelli di metaboliti e un miglioramento della sintomatologia.

Al di là della correttezza di questa ipotesi, resta comunque indiscutibile che la determinazione di così numerosi metaboliti, ognuno dei quali non sarebbe di per sè sufficiente a discriminare una condizione fisiologica da una patologica, non fornisce ancora una soluzione soddisfacente al problema della diagnosi dell'autismo per mezzo di parametri biochimici.

Reichelt et al. (Biol. Poychiatry, 1986, 21 (13), 1279-90; Adv. Biochem. Psychopharmacol., 1981, 28, p. 627-43; Med. Hypotheses, 1995, 45 (5), p. 498-502) hanno rilevato una peptiduria nei soggetti affetti da autismo infantile e, nel tentativo di identificare pazienti nei quali la sindrome autistica è causata da un medesimo meccanismo patogenetico, hanno purificato alcuni dei peptidi presenti nelle urine di pazienti affètti da autismo.

Si sono ora identificati due peptidi che risultano presenti con frequenza statisticamente significativa in pazienti affetti da autismo e che pertanto rappresentano "marker" sensibili ed affidabili per una diagnosi dell'autismo.

I peptidi dell'invenzione hanno la seguente sequenza:

pyroGlu-Trp-GlyNH2 Gly-Ser-Glu-Asn pyroGlu-Glu-Asp-Ser

E*-W-G° G-S-E-N E-E-D-S

* acido piroglutamico

o glieina amidata

Tali peptidi, purificati fino all'omogeneità con metodi biochimici, acutamente stimolano la ricaptazione di serotonina (5-HT) in vitro in piastrine isolate da sangue umano a concentrazioni picomolari.

La determinazione dei peptidi dell'invenzione ai fini diagnostici può essere effettuata in un qualsiasi fluido biologico, ma preferibilmente nelle urine o nel sangue.

La determinazione quantitativa nelle urine dei peptidi oggetto della presente invenzione può essere convenientemente effettuata, oltre che con tecniche cromatografiche (HPLC), anche con metodiche immunologiche, che impiegano cioè un anticorpo diretto specificamente contro il tripeptide. Queste metodiche sono ben note agli esperti del settore e sono state applicate con successo nell'analisi di campioni biologici (siero, urine, ecc.) per il dosaggio di un gran numero di analiti di natura proteica, polipeptidica, steroidea o di farmaci. Un'ampia trattazione dello stato dell'arte relativamente a queste metodiche può essere trovata nel volume di P. Tijssen "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays",Elsevier,Amsterdam 1985.

I principali vantaggi dei metodi di immunodosaggio risiedono nella loro semplicità esecutiva,nel ridotto tempo di esecuzione e soprattutto nella possibilità di eseguire un elevato numero di analisi con ridotto impiego di personale e strumentazione. Un altro aspetto vantaggioso dei metodi immunologie! rispetto alle tecniche cromatografiche è la loro elevata specificità e sensibilità, il che consente l'analisi diretta dei campioni biologici senza necessità di sottoporli a procedure di estrazione dell'analita.

Per ottenere anticorpi diretti contro sostanze a basso peso molecolare,come nel caso in oggetto, è necessario immunizzare l'animale prescelto con un coniugato chimicamente stabile formato dalla sostanza in oggetto e da una sostanza detta "carrier" ad elevato peso molecolare, che conferisca al coniugato l'immunogenicità richiesta. Come carrier possono essere utilizzate l'albumina sierica bovina (BSA), la Tireoglobulina, 1'Gvoalbumina o proteine sintetiche (polilisina).

I metodi di preparazione di questi coniugati sono da tempo noti e descritti nella letteratura scientifica (Glazer A.N., et al.: Selected Methods and Analytical Procedures, North-Holland, Amsterdam, 19*75; Erlanger B.F., Methods Enzymol. , 22 : 85, 1980; Tateishi K.et al., Steroids, 30 : 25, 1977; Carlsson J.H. et al., Biochem. J. , 123 : 723, 1978).

I coniugati ottenuti secondo i suddetti metodi vengono utilizzati per produrre anticorpi policlonali (generalmente in coniglio) o monoclonali (generalmente in topo); entrambi i tipi di anticorpi possono essere impiegati per sviluppare un metodo di dosaggio immunologico.

Tra i vari metodi di dosaggio immunologico descritti, il più ampiamente applicato per sostanze a basso peso molecolare come il tripeptide oggetto della presente invenzione è il metodo competitivo, nel formato in cui il peptide immobilizzato su una fase solida e quello presente nel campione competono per il legame con una quantità predeterminata di'anticorpo. Per la rivelazione del legame immunologico è necessario che l'anticorpo, preventivamente purificato secondo le tecniche abituali (Steinbuch M. et al, Arch. Biochem. Biophys., 134 : 279, 1969; McKinney M.M. et al., J. Immunol. Methods, 96 : 271, 1987) venga marcato con una sostanza radioattiva (es. 1251), con un enzima (es. perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina), con una molecola fluorescente o chemiluminescente, secondo metodiche descritte in letteratura (Greenwood F. et al., Biochem J./ 89 : 114, 1963;.Nakane P.K.et al., J. Histochem. Cytochem., 22 : 1084, 1974; Kronick M.N., J. Inmunol. Methods, 92 :1,1986).

Come fase solida utilizzabile in un dosaggio immunologico può essere impiegato qualsiasi materiale insolubile in grado di fissare sulla sua superficie il tripeptide coniugato ad un "carrier" e che possa essere messo in contatto con il campione da analizzare e con l'anticorpo specifico marcato come sopra detto. Nelle forme più abitualmente usate, questa fase solida è costituita da materiale plastico (polistirene, polipropilene o altri), in forma di biglie, provette, micropiastre o microsfere in sospensione (lattice). Possono anche essere utilizzate delle materie plastiche modificate, che portano sulla superficie dei gruppi reattivi (carbossilici, aldeidici o ammirici), mediante i quali si può formare un legame covalente diretto tra la fase solida e il tripeptide in oggetto,anche senza l'intermediario del "carrier".

Variando opportunamente le concentrazioni dei reattivi è possibile, nei metodi di immunodosaggio, far variare entro un ampio margine la sensibilità analitica, fino ad adattarla alle necessità specifiche del saggio. Allo scopo di quantificare la concentrazione dell'analita nel campione, è possibile inserire nel dosaggio una curva di calibrazione costituita da concentrazioni note e scalari dell'analita stesso, che consente per confronto di determinare la concentrazione dell'analita nel campione in esame.

I seguenti esempi illustrano l’invenzione in maggior dettaglio.

ESEMPIO 1

Procedura di isolamento dal sangue e dalle urine di oligopeptidi stimolanti l 'uptake piastrinico di serotonina in vitro.

Materiale di partenza:80 mi di sangue oppure 21 di urine.

a) Separazione iniziale dei peptidi da aminoacidi e sali mediante una colonna C-18 preparativa (eseguita solo per le urine);

b) Separazione di macromolecole da molecole a basso peso molecolare mediante gelfiltrazione in colonne G-25;

c) Isolamento delle frazioni con attività stimolante l'uptake piastrinico di serotonina in vitro;

d) Separazione di peptidi da sali, aminoacidi, ammoniaca ed.urea mediante C-18 reverse-phase su colonna preparativa;

e) Liofilizzazione e passaggio del materiale presente nelle frazioni attive su colonna a scambio cationico Dowex 50;

f) Gel filtrazione a basso peso molecolare su Fractogel MG2000 della frazione attiva,non protonabile al punto (e);

g) Scambio anionico, mediante colonne DEAE con filtro di cellulosa, che non ritengono l'attività biologica;

h) Scambio cationico,mediante colonne Dow 50;

i) HPLC analitica effettuata su colonna C-18 reverse phase mediante 4 gradienti diversi;

j) Idrolisi in 6M HCL ed analisi della sequenza aminoacidica mediante amino acid analyzer; spettrometria di massa.

ESEMPIO 2

Stimolazione della captazione di serotonina.

E' stata misurata la capacità del tripeptide pyroGlu-Trp-GlyNI2 di stimolare la ricaptazione di 5-HT in un sistema in vitro costituito da cellule CH0.K1 trasfettate con il cDNA corrispondente al trasportatore umano della serotonina.

Tripeptidi in cui veniva mutato il primo o il secondo amminoacido perdevano del tutto la capacità di stimolare la ricaptazione di 5-HT. I risultati sono riportati in Figura 1.

ESEMPIO 3

Frequenza e quantità di pyroGlu-Trp-Gl^H2 in pazienti autistici.

Un'analisi per mezzo di HPLC di urine di soggetti autistici permette di identificare un picco di assorbenza che presenta le medesime caratteristiche (tempo di ritenzione) del tripeptide sintetico pyroGlu-Trp-GlyNH2· Questo picco è stato quantificato integrando l'area al di

Claims (6)

1. sotto del picco. Un'analisi condotta su urine di gruppi di pazienti provenienti da vari Paesi dimostra che la frequenza dei casi nei quali il tripeptide è riscontrabile nelle urine, e la quantità di tripeptide, è notevolmente aumentata in pazienti affetti da autismo rispetto a controlli normali è a pazienti affetti da sindrome di X-fragile (FraX), una patologia psichiatrica con fenotipo clinico parzialmente simile all'autismo,ma di origine differente (Figura 2a e 2b) RIVENDICAZIONI 1. Peptidi di formula pyroGlu-Trp-GlyNH2, Gly-Ser-Glu-Asn e pyroGlu-Glu-Asp-Ser.
2. 2. Peptidi della rivendicazione 1 come "marker" diagnostici dell'autismo.
3. 3. Metodo di diagnosi dell'autismo che conprende il determinare uno dei peptidi della rivendicazione 1 in un fluido biologico di un soggetto.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 3 in cui il fluido biologico è sangue o urina.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 3 o 4 in cui la determinazione è effettuata con metodo cromatografico.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 3 o 4 in cui la determinazione è effettuata con metodo immunologico.