HUT78056A

HUT78056A - Eljárás donorszerv xenotranszplantációt követő káros hatásának kimutatására vagy meghatározására donorszerv-eredetű anyag vizsgálata alapján

Info

Publication number: HUT78056A
Application number: HU9901060A
Authority: HU
Inventors: John Martin Doyle; Cormac Gerard Kilty
Original assignee: Biotrin Intellectual Properties Limited
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 1999-07-28
Also published as: AU710668B2; CA2239882A1; BR9510669A; EP0871881B1; ES2172601T3; EP0871881A1; DE69525661T2; CZ288968B6; CA2239882C; AU4122996A; JP2000502182A; PL328156A1; WO1997022003A1; ATE213835T1; CZ9801553A3; PL180437B1; DE69525661D1

Description

Eljárás donorszerv xenotranszplantációt követő káros hatásának kimutatására vagy meghatározására donorszerv-eredetű anyag vizsgálata alapján

A találmány tárgya eljárás xenotranszplantációt követő szervkárosodást jelző, donorszerv-eredetű anyag jelenlétének kimutatására vagy meghatározására biológiai folyadékban .

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható xenotranszplantáció után az átültetett szövet károsodásának kimutatására, vagy arra, hogy különbséget tegyünk a gazdaszervezet és/vagy az átültetett szövet károsodása között.

Világszerte hiány mutatkozik allotranszplantációra (például máj, vese vagy szív transzplantációjára) alkalmas donorszervekben, és felmerült, valamint kísérletileg igazolódott, hogy ez a probléma - hacsak ideiglenesen is - megoldható állati eredetű szervek alkalmazásával az ortotopikus szervátültetés előtt. Chari, R.S. és mtsai. [The New England Journal of Medicine, 33, (4) 234-237 (1994)] májbajt kezeltek sertésből származó máj ex vivő perfúziójával, ami után ortotopikus májátültetést alkalmaztak. Az egyik beteg állapotát 10 napon keresztül stabilan

Aktaszámunk: 87912-7042/SG • ·· · • · · tartották, és ezután hajtották végre a sikeres ortotopikus májátültetést. A fajok közötti szervátültetésre (xenotranszplantáció) tett korábbi kísérletek azonban nem jártak eredménnyel a hiperakut (rendkívül heveny lefolyású) kilökődésnek nevezett jelenség miatt. Ezt az jellemzi, hogy az újonnan beültetett szervet elárasztja és kilöki a gazdaszervezet immunrendszere, órákkal a beültetést követően. A molekuláris genetika legújabb eredményei lehetővé tették transzgenikus állatok (ebben az esetben főleg sertések) létrehozását, amelyek szerveit génsebészeti úton úgy módosították, hogy más fajba (azaz emberbe vagy más főemlősbe) való átvitel során kevésbé immunogének legyenek [Transplant News, 5 (9), (1995)]. Ebben a beszámolóban feltételezték, hogy az immuntolerancia az emberi „bomlást felgyorsító faktor génjének a transzgenikus szervben végbemenő expressziója által valósul meg, amely faktor úgy hat, hogy megakadályozza a komplement rendszer összetevőinek (például a Cb3-komplexnek) az aktiválódását a gazdaszervezetben, ezáltal minimumra csökkentve a hiperakut kilökődést. Azonban - éppúgy, mint a fajon belüli szervátültetésnél (allitranszplantáció) - a xenograft kilökődés továbbra is olyan problémát jelent, amellyel az átültetést végző orvosnak meg kell küzdenie. Ezt, ebben az esetben tovább bonyolítja az a nyilvánvaló tény, hogy különböző fajokból származó szövetek vannak jelen az átültetett szövet befogadójában .

A hagyományos májfunkció-vizsgálatok nem képesek különbséget tenni a donor és a befogadó (például sertéseredetű és emberi) szerveiből származó, vizsgálható anyagok kö• · · .· ·..· ·’ί zött. Például, a szérumalanin-aminotranszferáz (ALT) és az aszpartát-aminotranszferáz (AST) mérése nem tesz különbséget a sertéseredetű és az emberi enzimek között, ami hiábavalóvá tesz minden kísérletet az enzim forrásának azonosítására a transzplantáció után. Hasonló lenne a helyzet a vese xenotranszplantáció utáni vizsgálata során is. Valójában jelenleg nem létezik a vese épségének általánosan elfogadott fehérjemarkere.

A glutation-S-transzferázok (GST-k) a fehérjék egy, több gén által kódolt családját alkotják, amely család fő tagjai az alfa- (ocGST), a mű- (pGST), a pi- (πΰΞΤ) és théta-osztályba (ÖGST) tartozó izoformák, amelyeket izoelektromos pontjuk határoz meg. A család tagjai egy sor ί xenobiotikum (idegen eredetű anyag) eltávolítását végzik, főleg glutationhoz konjugálva azokat [Beckett, G.J. és Hayes, J.D.: Advances in Clinical Chemistry, 30, 281-380 (1993)]. Emberben az aGST egyenletesen oszlik el a májban, és koncentrációja ott viszonylag magas, miközben a plazmában fél életideje csekély (körülbelül egy óra). Ez azt jelenti, hogy ez az enzim az aminotranszferázoknál érzékenyebb jelzője a májátültetés, illetve valamilyen kémiai anyag által kiváltott károsodás utáni állapotának.

Az EP-A-0,640-145 számú európai közzétételi irat egy olyan eljárást tár fel, amely az átültetett máj befogadójában a kilökődés korai diagnózisában segít, és amely során a befogadóból származó aGST plazma vagy szérumbeli mennyiségének növekedését mérik, a plazma vagy szérum transzaminázszintjében bekövetkező bármely változást megelőzően vagy annak hiányában.

• · ·· ···· ·« · .· ··»

A pi-glütation-S-transzferáz a májban, az epevezeték epiteliális sejtjeinek citoplazmájában helyezkedik el, és feltételezések szerint csupán homodimer formában létezik. Abból, hogy a GST májbeli eloszlása ilyen heterogén, sejthetjük, hogy a különböző izoenzimeknek azonos az in vivő funkciójuk a máj különböző területein, és ebből levonhatjuk azt a következtetést, hogy a plazma vagy az epe GSTszintjének mérése elősegíti egy személy mája állapotának nyomon követését. A vese szöveteiben hasonlóan egyedi eloszlás figyelhető meg, itt az aGST a vese proximális tubulusaiban, a mGST a nephron disztális tubulusaiban helyezkedik el [Campbell J.A.H. és mtsai., Cancer (Philadelphia) 67, 1608-1613 (1991)]. Egy új beszámolóban felvetették, hogy az a- és a KGST egyidejű mérése az emberi vizeletben alkalmas lehet arra, hogy különbséget tegyenek a ciklosporin-A nephrotoxicitása és az átültetett szövetek kilökődése között, mivel a kétféle szövetkárosodás helye különböző [Sundberg, A.G.M. és mtsai., Nephron 67, 308-316 (1994)].

A fentiek értelmében tehát szükség van egy olyan eljárásra, amely alkalmas a gazdaszervezet-eredetű és a beültetett szövetből származó mérhető anyagok között különbségtételre, és ezáltal az átültetett szövet károsodásának kimutatására, vagy arra, hogy különbséget tehessünk a gazdaszervezet és/vagy az átültetett szövet károsodása között.

A találmány tárgyát képezi tehát egy eljárás xenotranszplantációt követő donorszerv-károsodást jelző donorszerv-eredetű anyag jelenlétének kimutatására vagy meghatározására lényegében nem donoreredetű biológiai folya•··· ··»· dákban, a vizsgálandó anyag befogadó szervezetből származó megfelelőjének jelenlétében vagy távollétében, amely eljárás ezáltal lehetővé teszi xenograft szervkárosodás azonosítását a befogadó szervezetben, amely eljárást az jellemez, hogy egy

a) donorszerv-eredetű anyagra specifikus, vagy

b) a donorszerv-eredetű anyaggal keresztreakcióra képes antitesttel a vizsgálandó, donorszerv-eredetű anyagot befogjuk vagy kimutatjuk, és közvetlenül vagy közvetett módon meghatározzuk.

Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képező eljárás lehetővé teszi, hogy különbséget tegyünk a gazdaszervezetből származó és a donor szervezetből származó vizsgált anyagok között, és ezáltal információt nyerjünk a xenotranszplantátum állapotáról és esetleg a kilökődés lehetőségéről, ezáltal megkezdhetjük a megfelelő kiigazító terápiát, amint azonosítottuk a donorszerv-eredetű vizsgált anyagot a befogadó szervezetből származó biológiai mintában .

A leírásban használt értelemben „biológiai folyadék alatt többek között testfolyadékokat értünk, például epét, plazmát, szérumot és vizeletet, továbbá szövetet fenntartó közegeket és átáramoltatott folyadékokat. A biológiai folyadékokra a leírásban általános értelemben mint „mátrixokra is hivatkozunk.

A „donorszerv-eredetű kifejezés a leírásban jelenti a szerveket magukat, továbbá a szerv részeit képező vagy abból származó szövetet és sejteket.

·»«*···· · · ·· · • · · · · · · • ··· ··· · · · • · · · · · ···· • · ·»· · · ·· ·

Hasonlóképpen a „donoranyag kifejezés jelenti a szerveket magukat, továbbá a részüket képező és a belőlük származó szövetet és sejteket.

így például a donorszerv lehet máj, a máj egy része, például egy lebenye vagy hepatociták. A hepatociták esetében jellemző módon egy hepatocita töltetet („hepatocyte cartridge) alkalmazhatunk. Általában a befogadó ember, vagy embertől különböző főemlős. Ennek megfelelően a donoranyag előnyösen embertől különböző főemlősből vagy emberhez fiziológiásán és biokémiailag hasonló állatból, például sertésből származik.

A donorállat lehet transzgenikus állat is. A xenotranszplantáció történhet in vivő vagy ex vivő egyaránt. A xenotranszplantáció során alkalmazott szerv lehet szív, vese vagy máj . A donorszerv-eredetű vizsgált anyag (analit) előnyösen fehérje, előnyösebben enzim.

A donorszerv-eredetű vizsgálandó anyag előnyösen donorspecifikus. Abban az esetben, amikor a donorszervből származó vizsgálandó anyag mellett egy annak megfelelő, befogadó szervezetből származó anyag is jelen van, a befogadó szervezetből származó vizsgálandó anyag kismértékű homológiát mutat a donor szervezetből származó vizsgálandó anyaggal. Előfordulhat azonban, hogy a donor szervezetből származó vizsgálandó anyag nagymértékű homológiát mutat (például 80%-os homológiánál nagyobbat) a neki megfelelő befogadó szervezetből származó anyaggal, azonban mégis kimutatható a találmány szerinti módon, amint az alábbiakban ismertetjük.

·» · • · « ·· · · • · ···· ·* I ·««« ···« »· • · · · • ··· ··· • · · · ·· ··« «·

Az enzim előnyösen glutation-S-transzferáz, előnyösebben aGST.

A befogott donorszerv-eredetű vizsgált anyag meghatározását továbbá, előnyösen, immunológiai vizsgálati eljárással végezzük. Alkalmas immunológiai vizsgálati módszerek például az enzimes immunológiai vizsgálati eljárások.

így tehát sertéseredetű aGST emberi biológiai folyadékban történő mérésekor a sertéseredetű aGST-t befoghatjuk IgG-vel (sertéseredetű aGST elleni IgG-vel), amelyet előzőleg közvetlenül vagy közvetve szilárd fázishoz kötöttünk, vagy olyan (emberi aGST elleni) IgG-vel, amely keresztreaktivitást mutat.

Nyulakban olyan (sertéseredetű aGST elleni) IgG-t termeltettünk, amely nagymértékben specifikus sertéseredetű aGST-re. Abban az esetben, amennyiben az antitest kismértékű (körülbelül 5-10%-os) keresztreaktivitást mutat emberi eredetű aGST-vel szemben, például emberi aGST magas koncentrációban való jelenléte esetén, az emberi aGST-t külön meghatározhatjuk és a sertéseredetű aGST mennyiségét ezután helyesen kiszámolhatjuk az alább leírt módon.

Azonosítottunk egy monoklonális emberi aGST elleni antitestet, amely majdnem 100%-os keresztreaktivitást mutatott a sertéseredetű aGST-vel, amint azt a 3. példában leírtuk .

Az enzimes immunológiai vizsgálati eljárás lehet szendvics-elrendezésű vagy félkompetitív enzimes immunológiai vizsgálati eljárás, amint azt rendre az 1. és a 2. példában ismertetjük.

»··· ··*· ·· ϋ'9 » • · · · · · « • ··· ·«· « • · · · · · ·<

• · · · · · * ·»

A találmány egy további szempontja szerint a donoranyagot a xenotranszplantáció előtt megvizsgáljuk életképesség szempontjából.

A találmány szerinti megoldás tehát kitanítást nyújt a donoranyag életképességének vizsgálatára is, azáltal, hogy a donoranyagon átáramló biológiai folyadékban mérjük a donorszerv-eredetú vizsgált anyagot az alább leírt eljárás alkalmazásával.

A találmány szerinti megoldás ezen szempontja szerint a találmány szerinti eljárások mellett bármely ismert eljárással kimutathatjuk a vizsgált anyagot. Például, amennyiben a szerveredetú vizsgált anyag enzim, akkor az enzim szubsztrátjának alkalmazásán alapuló enzimes vizsgálati eljárást használhatunk a szervből származó vizsgált anyag kimutatására .

A találmány tárgyát képezi egy vizsgálati reagenskészlet vagy csomag is a találmány szerinti eljárás megvalósítása során való alkalmazásra, például a fent leírt módon.

Az alábbiakban megadjuk a leíráshoz tartozó ábrák rövid ismertetését.

Az 1. ábra az 1. példában ismertetett szendvicselrendezésű enzimes immunológiai vizsgálati eljárás vázlata .

A 2. ábra az 1. példa szerinti, sertéseredetű aGST mérésére kidolgozott szendvics-elrendezésű immunométriás enzimes immunológiai vizsgálat során a 450 nm-en mért és 630 nm-en mért abszorbancia értékek arányát mutatja az aGST-koncentráció (pg/l) függvényében.

«·»· ·♦·· ··

- 9 A 3. ábra a 2. példában ismertetett félkompetitív enzimes immunológiai vizsgálatot mutatja be vázlatosan.

A 4. ábra a 2. példa szerinti, sertéseredetű aGST mérésére kidolgozott szendvics-elrendezésű immunometriás enzimes immunológiai vizsgálat során a 450 nm-en mért és 630 nm-en mért abszorbancia értékek arányát mutatja az aGSTkoncentráció (pg/l) függvényében.

Az 5. ábra az emberi és sertéseredetű aGST SDS-PAGE analízisét mutatja be.

A 6. ábra az emberi és sertéseredetű aGST immunoblotanalízisét mutatja be, amely során (emberi aGST elleni) IgG-t és (nyúleredetű IgG elleni) kecskeeredetű IgG-ből és HRP-ből készített konjugátumot alkalmaztunk.

A 7. ábra az emberi és sertéseredetű aGST immunoblotanalízisét mutatja be, amely során (sertéseredetű aGST elleni) IgG-t és (nyúleredetű IgG elleni) kecskeeredetű IgGből és HRP-ből készített konjugátumot alkalmaztunk.

A 8. ábra az emberi és sertéseredetű aGST immunoblotanalízisét mutatja be, amely során (emberi aGST elleni) IgG-t és (egéreredetű IgG elleni) kecskeeredetű IgG-ből és HRP-ből készített konjugátumot alkalmaztunk.

A találmány szerinti megoldás az alábbiakban példák segítségével részletesebben is ismertetjük.

(A) előállítási példa

Sertéseredetű aGST tisztítása

Az aGST-t sertésmájból tisztítottuk affinitáskromatográfia és kromatofókuszálás (pH 9,5-6,0) segítségével. Az alábbiakban megadjuk a tisztítási eljárás pontos körülményeit.

a) 30 g sertésmájat homogenizáltunk 2 percen keresztül homonegizáló pufferben egy rész májhoz 3 rész puffért adva, egy Waring (a Waring egy védjegy) turmixgépet alkalmazva. A homogenizáló puffer összetétele a következő volt:

mM Tris-HCl

250 mM szaharóz mM EDTA pH 7,8 2 μς/πιΐ leupeptin 2 pg/ml pepsztatin.

b) A májból készült homogenizátumot lOOOOxg-vel centrifugáltuk 60 percig.

c) A felülúszót ezután egy glutation-sepharoseaffinitási oszlopra, amelyet előzőleg 10 mM Tris-pufferrel ekvilibráltunk, pH 9,1-en. A minta felvitele után az oszlopot újra ekvilibráló pufferrel mostuk, hogy eltávolítsuk a nem kötött fehérjét. Végül 5 mM glutationt (GSH) tartalmazó 50 mM Tris-puffert (pH 9,1) alkalmaztunk a kötött GST affinitási oszlopról való eluálására.

d) Az eluált anyagot ezután 25 mM etanolamin (pH 9,5) ellenében dializáltuk, majd egy kromatofókuszáló oszlopra (PBE94 Pharmacia) vittük fel. Elúciós pufferként Polybuffer-96-ot (a Polybuffer 96 védjegy) alkalmaztunk, amelyet a gyártó utasításai szerint készítettünk el.

(B) előállítási példa

Antitest termelése és tisztítása

A tisztított aGST-t „Új Zéland-i fehér nyulakba injektáltuk szubkután (s.c.) az alábbiakban megadott „menetrend szerint, és a szérumot otGST-vel szembeni reaktivitás szempontjából értékeltük. Amikor a (sertéseredetű aGST el• · · · · ·· · • ··· ··· · · ·· • · · ·· ····· ·· ··· ·· ·· ·

-Illeni) IgG titere - félkvantitatív „dot-blot-analízissel meghatározva elegendőnek bizonyult, az állatokat elvéreztettük és szérumot összegyűjtöttük. A nyúlszérumból a teljes IgG mennyiséget Protein-A-affinitáskromatográfia segítségével tisztítottuk, majd mikrotitertálca burkolására (félkompetitív EIA, 2. példa) és biotiniálásra (szendvicsEIA, 1. példa) használtuk fel. A monoklonális (emberi aGST elleni) IgG-t, aszcitesz formájában, a Nijmegeni Egyetemi Kórháztól Hollandia) kaptuk és felhasználás előtt nem tisztítottuk tovább.

Az immunizálás menetrendje (általában):

1. nap: 5 ml előszérumot nyertünk próbavéreztetéssel a nyúl füléből, majd 0,5 ml sertéseredetű aGST-antigént (100 μg) elegyítettünk azonos térfogatú Freund-féle teljes adjuvánssal. Az antigént és az adjuvánst homogenizáltuk, amíg jó emulziót nem kaptunk. Ezt a keveréket injektáltuk aztán s.c. a nyúl hátába, több helyre, amelyek környékét előzőleg leborotváltuk.

28. nap: próbavéreztetéssel 5 ml szérumot vettünk a nyúl füléből, majd 0,5 ml antigént (100 μg) összekevertünk azonos térfogatú Freund-féle teljes adjuvánssal. Az antigént és az adjuvánst homogenizáltuk, amíg jó emúlziót nem kaptunk. Ezt a keveréket injektáltuk azután s.c. a nyúl hátába, több helyre.

42. nap: próbavéreztetéssel 10 ml vért vettünk a nyúl füléből.

56. nap: egy második, megerősítő immunizálást adtunk a nyúlnak, a 28. napival azonos módon.

• · · · ·

70. nap: próbavéreztetéssel 10 ml vért vettünk a nyúl füléből. Amennyiben a titer elegendően nagy volt, a nyulat feláldoztuk és annyi vért gyűjtöttünk belőle, amennyit csak lehetséges volt.

(C) előállítási példa

Immunbiottolás

Minden poliklonális és monoklonális IgG-t, amelyet az alábbi példákban alkalmaztunk, előzőleg leellenőriztünk emberi és sertéseredetű aGST-vel szembeni reaktivitás és keresztreaktivitás szempontjából, az alábbi immunoblotkombinációk segítségével:

(a) (Emberi aGST elleni) nyúleredetű IgG-t alkalmaztuk próbaként emberi és sertéseredetű immobilizált aGST-t tartalmazó nitrocellulóz membránokkal szemben.

(b) (Sertéseredetű aGST elleni) nyúleredetű IgG-t alkalmaztunk próbaként immobilizált emberi és sertéseredetű aGST-t tartalmazó nitrocellulóz membránokkal szemben.

(c) (Emberi aGST elleni) egéreredetű IgG-t alkalmaztunk próbaként immobilizált emberi és sertéseredetű aGST-t tartalmazó nitrocellulóz membránokkal szemben.

Az immunobiot során a kimutatási eljárás a következő volt:

1. Mind az emberi, mint a sertéseredetű aGST-t (0,5 pg/sáv) elektroforézisnek vetettünk alá 15%-os SDSpoliakrilamid gélen, molekulatömeg-markerek mellett.

2. Az elektroforézis után a poliakrilamid kettévágtuk és az egyik felén fehérjékkel szembeni festést végeztünk, a • · • ·· · · ···· ···· ·· ·· • · · · · • ··· ·· · ·· • · · · · másik feléről a fehérjéket pedig nitrocellulóz membránra vittük át.

3. Az elektroforetikus átvitel után a nitrocellulóz membránokat egy órán keresztül - 0,05 v% Tween-20-at tartalmazó sós foszfátpufferben (PBST) oldott 5 v%-os Marvei (a Marvei védjegy) tartalmú - blokkoló pufferrel blokkoltuk .

4. Ezután az alábbi oldatokat állítottuk elő:

(i) (Emberi aGST elleni) nyúleredetű IgG 1 v%-os, PBST-ben oldott Marvel-ben.

(ii) (Sertéseredetű aGST elleni) Nyúleredetű IgG 1 v%-os, PBST-ben oldott Marvel-ben.

(iii) (Emberi eredetű aGST elleni) egéreredetű IgG 1 v%-os, PBST-ben oldott Marvelben .

Ezeket - miután a blokkoló puffért dekantáltuk - a membránokhoz adtuk. Az antitestek oldataival végzett inkubálást egy órán keresztül végeztük.

5. A nitrocellulóz membránokat ezután PBST-vel mostuk (2x5 perc, minden mosás esetében).

6. Nyúleredetű IgG elleni ellenanyagból és HRP-ből készült konjugátumot állítottunk elő 1 v% Marvel-t tartalmazó PBS-ben 1/1000 arányban oldva és a fenti, 4. pont szerinti (i) és (ii) oldatokhoz adtuk őket. Egéreredetű IgG elleni ellenanyagból és HRP-ből is készítettünk konjugátumot (1/1000), ezt a 4. pont szerinti (iii) oldathoz adtuk. A fajok elleni (nyúl, egér) konjugátumokat, ame. · · · · · * • ··· ··· ·· ·· • * · ······· ·· ··· ·· ·· ·

- 14 lyeket az immunológiai mérések során kimutatásra használtunk, a Bio-Rad Laboratories Limited-től szereztük be.

7. Miután faj elleni konjugátokkal egy órán át inkubáltunk, a reagenseket eltávolítottuk és a membránokat az 5. pontban leírtak szerint mostuk.

8. Diaminobenzidin-szubsztrátot állítottunk elő, és a membránhoz adtunk. A pozitív reakciókat barna csapadék jelezte a nitrocellulóz membránon.

(D) előállítási példa

Sertéseredetű_aGST-ből és_tormaperoxidázból („horseradish peroxidase, HRP) készült konjugátum szintézise

Az cxGST-HRP-konjugátumokat a tioéteres konjugálási módszer alkalmazásával szintetizáltuk. Reaktív maleimidcsoportokat kötöttünk az aGST-molekulákra SMCC [sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) ciklohexán-l-karboxilát] alkalmazásával, a HRP-re pedig védett szulfidrilcsoportokat kötöttünk [Duncan R.J.S. és mtsai., Anal. Biochem. 132, 6873 (1983)] . A védőcsoport eltávolítása után reaktív szulfidrilcsoportokat kaptunk, majd a maleimid-aktivált aGST-t és a HRP-SH-t összekevertük és 4,5 órán keresztül hagytuk végbemenni a reakciót. A kapott aGST-HRPkonjugátumot, amelyben az egyes molekulák tioéter kötéssel kapcsolódnak, 50 t%-os glicerinbe vittük át és -20 °C-on tároltuk a félkompetitív EIA során való alkalmazásig, amelyet a 2. példában írtunk le.

• · ···· · ·· « · · ·· • · · · · · • ··· ··· ·· • · · ······ • « ··· · · · · · (E) előállítási példa

A (sertéseredetű aGST elleni) IgG biotiniálása A biotinilált (sertéseredetű aGST elleni IgG-t úgy állítottuk elő, hogy - az előzőleg nyulak tisztított aGSTvel végzett immunizálásával [a (B) előállítási példában leírt módon] előállított - tisztított poliklonális (sertéseredetű aGST elleni) IgG-t kapcsoltunk N-hidroxiszukcinimid-biotin-hoz (NHS-biotin), alkálikus körülmények között. Az NHS-biotinnak azt a részét, amely nem reagált el, alapos dialízissel eltávolítottuk, a biotinilált IgG-t meghatározott térfogatú adagokra osztottuk szét, és -20 °Con tároltuk felhasználásig.

1. példa

Szendvics elrendezésű enzimes immunológiai vizsgálati élj árás

Az eljárás lépéseit az 1. ábra szemlélteti vázlatosan .

a) Egy Nunc Maxísorp (a Nunc Maxisorp egy védjegy) mikrotitertálcát (emberi aGST elleni) egéreredetű monoklonális IgG-vel burkoltuk [lásd a (B) előállítási példát], amelyeket (egéreredetű IgG-elleni) kecskeeredetű F (ab) ₂-fragmenseken keresztül immobilizáltunk. Az antitesttel való burkolásnak ez a módszere szolgál arra, hogy a monoklonális antitestek kötőhelyeit orientálja, továbbá javítsa a vizsgálati eljárás érzékenységét azáltal, hogy minimalizálja a befogó antitest tapadás által kiváltott denaturációját. A mikrotitertálcákat fehérjét és cukrot tartalmazó oldattal blokkoltuk.

b) A sertéseredetű aGST-t - amelyet az (A) előállítási példában leírt módon májból tisztítottunk, a tisztítást azonnal az állat halála után megkezdve - 2 és 8 °C között vagy -20 °C-on tároltuk, és a vizsgálati eljárás során kalibrálásra használtuk.

c) Biotinilált (sertéseredetű aGST elleni) IgGkonjugátumokat használtunk arra, hogy elősegítsük a befogott/immobilizált aGST kimutatását.

d) Ezután egy sztreptavidin-tormaperoxidáz (HRP)konjugátumot alkalmaztunk a teljes antigén-szendvicskomplex kimutatására tetrametilbenzidin-szubsztrát (TMB) felhasználásával

e) Az enzimreakciót 1 N H₂SO₄ hozzáadásával állítottuk le, és az abszorbanciát 450 nm-en mértük meg a 630 nmes hullámhosszot használva referenciaként. A szín intenzitása egyenesen arányos az aGST koncentrációjával, és miután ábrázoljuk az A₄₅o/63onm értékeket a koncentráció (pg/l) függvényében, az ismeretlen minták koncentrációja meghatározható (lásd 2. ábra). A vizsgálat teljes ideje 3,5 óra volt.

2, példa

Félkompetitlv enzimes immunológiai vizsgálati eljárás

Az eljárás lépéseit a 3. ábra szemlélteti vázlatosan, a) Ebben az esetben Nunc Maxisorp tálcákat burkoltunk (sertés aGST elleni) poliklonális IgG-vel, amelyet proteinA-n keresztül ímmobilizáltunk, mivel azt tapasztaltuk, hogy a poliklonális IgG-vel való közvetlen burkolás nem segítette elő az aGST-hez való kötődést, feltehetőleg az IgG mikrotitertálcához való kötődése következtében bekövetkező denaturációja miatt.

«··· ···· ·· ·* · • · · » · · · • ··· ··· ·· · « ·· · ·©··» ·· ··· ·· ·· »

b) Ebben az esetben a HRP-vel jelölt otGST-t használtuk konjugátűmként, amit a jelöletlen kalibrálószer vagy minta után adtunk hozzá a mikrolyukakhoz. Ezen a módon egy kompetíció típusú reakciót értünk el a HRP-vel jelölt és a nem jelölt aGST-k között.

c) Megfelelő hosszúságú inkubálási idő, általában 60 perc után a mikrotitertálcát mostuk, és TMB-szubsztrátot adtunk hozzá.

d) Az enzimreakciót 1 N-os H2SO4 hozzáadásával állítottuk le és az abszorbancíát 450 nm-en mértük meg, referenciaként a 630 nm-es hullámhosszon végzett mérést alkalmazva. A szín intenzitása fordítottan arányos a sertéseredetű aGST koncentrációjával, és miután a A4₅₀/₆30nm értékeket ábrázoltuk a koncentráció (pg/l) függvényében, elvégezhettük az ismeretlen minták mennyiségi értékelését (lásd 4. ábra).

. példa

Az immunológiai vizsgálati eljárás során alkalmazott reagensek tisztaságának értékelése

Az immunoblottolást a (C) előállítási példában leírtak szerint végeztük. Az eredményeket az 5-8. ábrákon mutatjuk be.

Az 5-8. ábrákon a gélek egyes sávjaiban látható minták leírása:

1. sáv: molekulatömeg-markerek

2. sáv: emberi aGST (0,5 pg)

3. sáv: sertéseredetű aGST (0,5 pg) ···· ···· · · ··· ·· ··· ·· ·

- 18 Az 5. ábra szemlélteti (a gélen minden esetben egyetlen csík látható) az emberi és a sertéseredetű aGST tisztaságát a nyúlban végzett immunizálás előtt, és megerősíti, hogy a minták mentesek voltak minden más emberi vagy sertéseredetű fehérjétől, amelyek a vizsgálati eljárás specifitásának csökkenését eredményezhették volna. Az antitestek reaktivitásának immunobiott-analízise azt mutatja, hogy az (emberi aGST elleni) IgG nagymértékben specifikus az emberi aGST-re, és nem mutat semmilyen szignifikáns keresztreaktivitást a sertéseredetű aGST-vel (6. ábra), amit az emberi aGST-nek megfelelő jel nagy intenzitása szemléltet a sertéseredetű aGST jelének kis intenzitásához képest. Ezt az eredményt támasztotta alá az is, hogy az emberi aGST-re aGSTh-ra specifikus enzimes immunológiai vizsgálati reagenskészlet - amelyet a Biotrin International Limited (Mount Merrion, County Doublin, Írország) forgalmaz HEPKIT márkanév alatt - nem mutat reaktivitást sertéseredetű aGST-vel szemben (aGSTp). Az eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze, amely az aGSTp reaktivitását mutatja a Biotrin HEPKIT alkalmazása során. Nyilvánvaló, hogy nem tapasztalunk keresztreaktivitást, amennyiben az ocGSTp-t HEPKIT-tel vizsgáljuk.

·· ·· · • · · · · ··· ·· · · • · · ···

1.táblázat

aGSTp (pg/l)	A4 5o/630nm
0,00	0,069
1,25	0, 156
2,50	0, 332
5, 00	0, 627
10, 0	1,088
20, 0	1,495
40, 0	1,762
pozitív kontroll	0.839 (6.9 pg/l)

aGSTh (pg/l)	A4 50/'630nm
8	0, 012
40	0,010
200	0,012
1000	0,014

Ennek a ténynek a jelentőségét nem lehet túlbecsülni, mivel arról tanúskodik, hogy az emberi aGST mennyiségi mérésére használt enzimes immunológiai vizsgálati eljárás emberi aGST kimutatása szempontjából specifikus. így tehát bármennyi emberi aGST van jelen olyan mintákban, amelyekben a sertéseredetű aGST-t is mérjük, azt (az emberi aGST-t) specifikusan kimutatjuk a sertéseredetű antigénnel való „keresztszennyeződés nélkül. Az emberi aGST enzimes immunológiai vizsgálata során a keresztreaktivitásnak ez a hiánya, ··. ϊ ···· ···· ·· « · · · • ··· ·«· továbbá az a megfigyelés, hogy 5-10%-os keresztreaktivitás magától értetődő a (sertéseredetű aGST elleni) IgG és az emberi aGST között (7. ábra) - amit az emberi aGST által adott (a sertéseredetű aGST által mutatott nagy intenzitású jelhez képest) kis intenzitású jel mutat - azt jelenti, hogy az emberi aGST (HEPKIT enzimes immunológiai vizsgálattal történő) és a sertéseredetű aGST (sertéseredetű aGST-re kifejlesztett enzimes immunológiai vizsgálattal történő) egyidejű mennyiségi mérése alkalmas arra, hogy a sertéseredetű aGST vizsgálatára szolgáló immunológiai vizsgálati eljárásban az emberi aGST hozzájárulására korrigálhassunk.

Például, amennyiben egy minta értékelésekor a következő eredményeket kapjuk:

Vizsgálati eljárás	aGST (μς/1)
sertés EIA (sertéseredetű aGST)	10000
ΗΕΡΚΙΤ-ΈΙΑ (emberi aGST)	1000

akkor az emberi aGST körülbelül 7%-os keresztreaktivitását feltételezve a sertés-EIA során, azt kapjuk, hogy az emberi aGST hozzájárulása [(1000/100) x 7 = 70 μg/l] a sertéseredetű aGST okozta jelnagysághoz. így tehát 10000-70 = 9930 ^g/l sertéseredetű aGST van jelen a mintában.

Továbbá, amint azt fent leírtuk, az (emberi aGST elleni) egéreredetű IgG és a sertéseredetű aGST között nagymértékű keresztreaktivítás áll fenn, amely világosan látható a 8 . ábrán, mivel a megfelelő csíkok intenzitása összehasonlítható. Ezt a jelenséget kihasználhatjuk úgy, hogy ezt az antitestet alkalmazzuk az 1. példában leírt szend• · ·· · ···« ·*·· ·· ·· • · · · · · • ··· ··· ·· • · · · · · ·· ··· 99 99 vicselrendezésű, sertéseredetű aGST elleni immunológiai vizsgálati eljárásban (1. példa), „befogó antitestként, vagy tálca burkolására használt antitestként.

4. példa

A vizsgálati eljárás specifitása

Mivel az 1. és a 2. példában bemutatott vizsgálati eljárásokat elsődlegesen arra használhatjuk, hogy sertéseredetű aGST-t mutassunk ki nem sertéseredetű biológiai folyadékokban, lényeges, hogy értékeljük a vizsgálati eljárás érzékenységét és specifitását sertéseredetű aGST mérésekor a következő mátrixokban:

- emberi vizelet

- emberi szérum

- emberi plazma

- emberi epe

- szövetet fenntartó közeg.

Ezen vizsgálat elvégzése érdekében a sertéseredetű aGST-t hozzáadtuk a fenti mátrixok mindegyikéhez, majd elvégeztük az így kapott mintákon az 1. és 2. példákban leírt immunológiai vizsgálati eljárásokat. Amellett, hogy kvantitatíven kimutattuk az aGST-t, a vizsgálati eljárások linearitását (paralel mivoltát) is értékeltük, nem különben a vizsgálati eljárások érzékenységét. Szükséges továbbá, hogy a vizsgálati eljárások specifitása csupán a sertéseredetű aGST kimutatását segítse elő, és hogy az emberi aGST nem okozzon jelentős mértékű interferenciát az immunológiai vizsgálati eljárás során. Ebből a célból megvizsgáltuk az emberi aGST potenciális keresztreaktivitását azáltal, hogy „meghamisítottuk a sertéseredetű aGST-t tartalmazó mintá• · ··· ··<->» »··· ·· kát különböző mennyiségű emberi aGST-k hozzáadásával a potenciális keresztreaktivitás kiértékelése érdekében. Mivel ilyen jelentős mértékű szekvenciális homológia van a két izoenzim között, a fent vázolt probléma egyáltalán nem triviális, és csupán a (sertéseredetű aGST elleni) antiszérum alapos, az emberi aGST-vel való potenciális keresztreaktivitást célzó analízisével oldható meg.

A sertéseredetű aGST különböző mátrixokban végzett mennyiségi mérésének eredményét a 2. táblázat mutatja be. Az eredményeket szendvicselrendezésű és félkompetitív enzimes immunológiai vizsgálati eljárásokkal határoztuk meg.

2. táblázat

Hozzáadott sertéseredetű aGST mérése különböző mintákban szendvicselrendezésű és félkompetitív, sertéseredetű aGST mérésére alkalmas vizsgálati eljárásokkal

Várt	Hígított	Emberi	MÉM	TC-100	Emberi
érték	mintaoldat	pia	zma	(teljes)	(telj es)	vizelet
(úg/l)	(Hg/l)	(pg/i)	(ng/D	(μς/ΐ)	(μ-g/l)
	szén.	komp.	szén.	komp .	szén.	komp.	szén.	komp.	szén.	komp.
0	61,4	19,4	0	-	0	46, 8	0	73	0	84
4000	4530	3853	4299	m. t.	4135	3643	4754	3889	4189.5	3936
2000	2980	2699	2500	m. t.	2262	2420	2059	2071	2165.2	1912
1000		-	1041	m. t.	1180	1247	983	953	844.5	857
500	507	46	249	m. t.	512	485	540	562	392.8	454
250	279	260	85	m. t.	290	211	273	266	151.9	218
125	128	140	0	m. t.	136	188	197	163	17.9	126

99·9 ·♦♦· 99 ·· _ • 9 9 9 9 9

9·9 99· ··

9 9 9 9 9

9 ····

- 23 Magyarázat:

1. Szend.: szendvics elrendezésű enzimes immunológiai vizsgálati eljárás.

2. Komp.: félkompetitív enzimes immunológiai vizsgálati elj árás.

3. A mintákat 1/5 arányban hígítottuk, hogy koncentrációjuk a kompetitív vizsgálati eljárás mérési tartományába essen (0-1000 μg/l), majd tovább hígítottuk 100-szorosára, hogy a szendvicselrendezésű vizsgálati eljárás mérési tartományába essen (0-40 μg/l).

A 2. táblázatból világosan látható, hogy a sertéseredetű aGST kvantitatív mérése minden vizsgált mátrixban megvalósítható. Nyilvánvalóan lényeges, hogy az aGST kimutatható legyen mind az emberi plazmában, ami a beültetett idegen eredetű máj állapotának értékelését teszi lehetővé, mind a vizeletben, ami a beültetett vese állapotának értékelését segíti elő. A kísérletek bizonyítják, hogy az aGST valóban mérhető ezekben a biológiai folyadékokban. Figyelemre méltó azonban, hogy a plazmamátrix inkompatibilisnek látszik a félkompetitív immunológiai vizsgálati elrendezéssel, feltehetően az IgG kölcsönhatása miatt az immobilizált Protein-A-val, ami anomális jeleket eredményez. Ettől eltekintve minden más folyadék kompatibilisnek látszik mindkét féle vizsgálati eljárással. Különösen nagy jelentősége van annak, hogy lehetséges a sertéseredetű aGST-k kimutatása a szövetet fenntartó közegekben („tissue support média). Ez lehetőséget nyújt arra, hogy értékeljük az idegen eredetű átültetendő szervet az átültetés előtt, illetve lehetőséget ♦ »«» ·»»* ·* *· · • · · · · ί>

• ··» ··· ·» · · • · · · · · ·»» ·· ··· ·· *'* » nyújt az izolált sertéseredetű hepatociták életképességének vizsgálatára töltetben („cartridges), mivel ezeket a rendszereket általában hagyományos fenntartó közegekben őrzik meg. Ezenfelül ez a mátrix-minta-kompatibilitás nagymértékben elősegíti az aGST-k kimutatását olyan közegekben, amelyeket ex vivő donorszervek folyamatos fenntartására használnak, ahol a donorszervet (például májat) testen kívül tartják fent a tápközeggel érintkeztetve azt.

5. példa

Emberi aGST zavaró hatásának (interferenciájának) értékelése a sertéseredetű aGST mérésére szolgáló szendvicselrendezésű enzimes immunológiai vizsgálati eljárás során

Az emberi aGST zavaró hatásának értékelését az 1. példában leírt, sertéseredetű aGST mérésére szolgáló szendvicselrendezésű enzimes immunológia vizsgálati eljárás során, szintén elvégeztük. A megnövekedett abszorbanciaértékek alapján mérve, nem figyeltünk meg egyértelmű zavaró hatást (interferenciát) a vizsgálati eljárás során, amenynyiben a mikrolyukakban a koncentráció 25 pg/l-nél kevesebb volt (ez 125 pg/l mintakoncenrációinak felel meg a minták 1/5 arányú hígítása esetén). Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be.

• •W ·»♦» »· »» ’ • · 4 · · · · • ··* ·»· ·» · * • · · · * » ·»»· ·« ««· ·· V* »

3. táblázat

(aGSTp)	(aGSTh)	Abszorbancia₄5o/630nm
(μσ/1)
20	-	0.869
20	6	0.875
20	12	0.875
20	25	0.881
20	50	0.975

Magyarázat:

aGSTp - sertéseredetű aGSTh - emberi eredetű

A 3. táblázatban bemutatott eredmények jól szemléltetik a sertéseredetű aGST kimutatására szolgáló immunológiai vizsgálati eljárások specifitását. Az adatokból egyértelmű, hogy az emberi aGST nem vesz részt zavaró kölcsönhatásban az enzimes immunológiai vizsgálati eljárás során, még viszonylag nagy, akár 125 μg/l (25 μg/l x 5) mintakoncentrációknál sem. Ez az érték valójában 15-szöröse az aGST normális szintje felső határának emberi szérumban és 6-szorosa a felső határa vizeletben. Az emberi aGST nagyobb koncentrációja esetén (>250 μg/l; 50 μg/l x 5) látható, hogy bekövetkezik egy bizonyos mértékű zavaró hatás, amiből kiszámoltuk, hogy körülbelül 5-10%-os keresztreaktivitás mutatkozik az emberi aGST és a (sertéseredetű aGST elleni) IgG között. Azonban, amennyiben együttesen mérjük az aGSTszinteket emberi és sertéseredetű aGST-k mérésére szolgáló »·>· ····

J • · ♦ • k k » ·*ί »» »·· kvantitatív immunológiai vizsgálatokkal egyaránt, a mérés eredménye alapján ki kell, hogy tudjuk számolni a jelenlévő emberi aGST pontos mennyiségét, és igy azt figyelembe vehetjük a sertéseredetű aGST emberi, biológiai folyadékokban történő mennyiségi mérése során.

Meg kell hogy jegyezzük továbbá, hogy a találmány szerinti immunológiai vizsgálati eljárások alkalmasak sertéseredetű GST mérésére sertéseredetű biológiai folyadékokban, továbbá sertés vagy sertésszervek in vitro vagy in vivő toxikológiai vizsgálatai során. Ez igen jelentős felismerés, mivel ismeretes, hogy a sertés és az ember fiziológiailag és biokémiailag meglehetősen hasonló, ezért a sertéseket gyakran használják állati modellként hatóanyagok toxicitásának jóslására emberben.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás xenotranszplantációt követő donorszervkárosodás jelzésére alkalmas donorszerv-eredetű vizsgálandó anyag meghatározására vagy jelenlétének kimutatására lényegében nem donoreredetű biológiai folyadékban, a vizsgálandó anyag befogadó szervezetből származó megfelelőjének jelenlétében vagy távollétében, továbbá ezáltal befogadó szervezetben xenograft szervkárosodás kimutatására, azzal jellemezve, hogy egy,

a) a donorszerv-eredetű vizsgálandó anyagra specifikus, vagy

b) a donorszerv-eredetű vizsgálandó anyaggal szemben keresztreakcióra képes antitesttel a donorszerv-eredetű vizsgálandó anyagot befogjuk vagy kimutatjuk, és közvetlenül vagy közvetve meghatározzuk .
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szervkárosodást befogadó szervezetként emberben mutatjuk ki.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szervkárosodást befogadó szervezetként embertől különböző főemlősben mutatjuk ki.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy donorszervként sertésből származó donorszervet alkalmazunk.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szervként vesét alkalmazunk.
6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szervként májat alkalmazunk.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy donorszerv-eredetű vizsgálandó anyagként fehérjét határozunk meg vagy annak jelenlétét mutatjuk ki.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy donorszerv-eredetű vizsgálandó anyagként enzimet alkalmazunk .
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként glutation-S-transzferázt (GST-t) alkalmazunk .
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként aGST-t alkalmazunk.
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amennyiben donorszervként sertéseredetű donorszervet alkalmazunk, akkor antitestként sertéseredetű aGST elleni poliklonálís antitestet alkalmazzuk.
12. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amennyiben a szervkárosodást befogadó szervezetként emberben mutatjuk ki, akkor antitestként sertéseredetű aGST-vel szemben lényegében 100%-os keresztreaktivitást mutató, emberi aGST elleni antitestet alkalmazunk.
13. A 11. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy emberi aGST elleni specifikus antitest alkalmazásával egy külön vizsgálati eljárásban a jelenlévő összes emberi aGST-t kimutatjuk.

• · • <

•ν te·»· ·♦*· • · * »·· > 9 ··· •·
14. Αζ 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy donor eredetű anyagot xenotranszplantáció előtt életképesség szempontjából megvizsgálunk .
15. Reagenskészlet vagy -csomag az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárások kivitelezése során való alkalmazásra .