ITMI962241A1

ITMI962241A1 - Uso di derivati tetraidro-beta-carbolinici come agenti antimetastatici

Info

Publication number: ITMI962241A1
Application number: IT96MI002241A
Authority: IT
Original assignee: Boehringer Mannheim Italia
Priority date: 1996-10-29
Filing date: 1996-10-29
Publication date: 1998-04-29
Also published as: IT1286060B1

Description

"USO DI DERIVATI TETRAIDRO-BETA-CARBOLI NI CI COME AGENTI ANTI-METASTATICI "

La presente invenzione riguarda l’uso di derivati beta-carbolinici per la preparazione di omposizioni farmaceutiche aventi proprietà antimetastatiche.

Le cellule di tumori metastatizzanti sono in grado di migrare dal tumore originario verso altri organi bersaglio per mezzo di un meccanismo che prevede la penetrazione attraverso le pareti dei capillari sanguigni, l’ingresso delle cellule tumorali nel flusso sanguigno, seguito da un successivo riattraversamento delle pareti dei vasi fino a raggiungere l’organo bersaglio.

La penetrazione attraverso il tessuto connettivo dei vasi avviene grazie alla degradazione della matrice extracellulare ad opera di metalloproteinasi rilasciate da cellule del tessuto connettivo residente ed attivate dalle cellule tumorali Tale meccanismo, comune anche ai tessuti non tumorali è però normalmente in equilibrio dinamico con la rigenerazione del tessuto connettivo, mentre si manifesta in maniera non controllata nelle cellule invadenti quali appunto le cellule tumorali o infiammatorie ed è coinvolto in numerose altre patologie quali artrite reumatoide, osteo artrite, artrite settica, ulcerazioni della cornea, epidermiche o gastriche, trombosi coronarica, proteinuria (WO 95/13289). _ _ In detti processi sono coinvolti tre tipi di metallo proteinasi: collagenasi, gelatinasi e stromelisine. In condizioni normali il loro rilascio e la loro attività sono strettamente regolati da inibitori delle proteinasi endogeni, come ad esempio a2-macroglobulina.

Inibitori di metalloproteinasi possono quindi essere utili nella cura delle condizioni patologiche sopra descritte nonché delle conseguenze patologiche di traumi o anche come agenti contraccettivi, in quanto le metallo proteinasi sono implicate nei fenomeni di ovulazione e del successivo impianto dell’ovulo sulla parete uterina. In particolare, rinibizione della metastasi tumorale ad opera di inibitori delle metalloproteinasi è descritta in Matrisian et al, PNAS USA, 83, 9413-7 (1986); Wilhelm et al., PNAS USA, 84, 6725-29 (1987); Werb et al., J. Celi Biol., 109, 872-89 (1989); Liotta et al, Lab. Invest., 49, 636-49 (1983).

Inibitori di metallo proteinasi sono descritti in US 4,511,504, US 4,568,666, US 4,771,037, WO 95/13289.

Derivati beta-carbolinici sono descritti avere varie attività farma colo giche, quali ad esempio attività antitumorale [Anticancer Res., 13(6A1, 2301-8 (1993); J. Antibiot., 46(111, 1672-7 (1993); EP 357.122], antiulcera [WO 92/04348 (19.03.92)], antimalarica [J. Nat. Prod., 54(51, 1360-7 (1991)] o sono descritti come agenti favorenti l’assorbimento di farmaci antitumorali (JP 04275221).

Per nessuna di queste molecole è però descritta un’attività antimetastatica.

Abbiamo sorprendentemente trovato che le tetraidro-beta-carboline di formula (I) sono dotate di ima notevole attività di inibizione del processo metastatico:

U)

R è scelto nel gruppo comprendente idrogeno, (Ci-Cj)alchile lineare o ramificato, fenile (eventualmente sostituito da un gruppo (Ci-C5)alcossi), -(CH2)n-COOH, dove n è un intero da 1 a 3;

Ri è idrogeno o un gruppo -COOR4, dove R4 è idrogeno o (Ci-Csjalchile;

R2 è idrogeno o un gruppo -COOR4 come sopra definito;

R3 è scelto nel gruppo comprendente idrogeno, alogeno (cloro, bromo, fluoro o iodio), (Cj-C4)alcossi, benzilossL

Oggetto della presente invenzione è l’uso dei composti di formula (I), come agenti antimetastatici ed inibitori del processo di invasione tumorale.

Sono compresi nella presente invenzione anche gli enantiomeri, i racemati ed i diastereoisomeii dei composti di formula (I), nonché i loro sali con acidi o basi farmaceuticamente accettabili.

Esempi preferiti di composti di formula (I) sono:

6-metossi-l,2,3,4-tetraidronorharmano;

acido 1,2,3 ,4-tetraidronorharman- 3- carb o ssilico ;

acido 6-metossi- 1,2, 3, 4-tetraidronorharman- 1-carbossilico;

acido l-(4-metossifenil)- 1,2,3, 4-tetraidronorharman-3-carbossilico;

acido 1-metil- 1,2, 3, 4-tetraidronorharman-3-carbossilico;

acido 1-metil- 1,2,3, 4-tetraidronorharman- 1,3-dicarbossilico;

acido l-(dietilmetil)-l,2,3,4-tetraidronorharman-3-carbossilico;

acido (6-bromo- 1,2, 3, 4-tetraidronorharman- 1 -il)-3-propionico;

acido 1-isobutil- l,2,3,4-tetraidronorharman-3-carbossilico;

acido 1-fenil- 1,2,3, 4-tetraidronorharman-3-carbossilico;

acido 1-propil- 1,2,3, 4-tetraidronorharman-3-carbossilico;

1-metil- l-metossicarbonil-6-benzilossi- 1,2,3, 4-tetraidronorharmano;

1-metil- l-metossicarbonil-6-metossi- 1,2, 3, 4-tetraidronorharmano;

l-metil-l-metossicarbonil-6-idrossi-l,2,3,4-tetraidronorhannano;

1-metil- l-metossicarbonil-6-cloro- 1,2,3, 4-tetraidronorharmano;

1-metil- 1 -metossicarbonil-6-bromo- 1 ,2,3 ,4-tetraidronorharmano ;

1-metil- 1-metossicarbonil- 1,2,3,4-tetraidronorfiannano.

I composti compresi nella presente invenzione sono composti noti e sono disponibili in commercio o possono essere ottenuti per estrazione da matrici vegetali o sintetizzati secondo metodi riportati in letteratura (vedi ad esempio WO 92/04348).

1 composti della presente invenzione sono stati saggiali in un test fàrmacologico “in vitro” di inibizione di MMP8 (collagenasi dei neutrofili umani). Il test prevede la determinazione per fluorescenza dell’inibizione dell’attività di degradazione di un substrato fluorescente (DNP-Pro-Leu-Gly-Leu-Tip-Ala-D-Arg-NH2, M1855 Bachem) ad opera del dominio catalitico di MMP8.

Reagenti :

1) DNP- sub strato = DNP-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2 (MI 855 Bachem), P.M.

977.1 g/mol, concentrazione 25 μΜ in DMSO; 2) tampone di misurazione - 50 mM TRIS / 100 mM NaCl / 10 mM CaCl2.2H20, aggiustato a pH 7.6 con acido cloridrico. 3) Enzima = dominio catalitico di MMP8 (92 KDa), concentrazione 0.055 mg/ml in tampone TRIS. Substrato ed enzima sono mantenuti a 0°C con ghiaccio.

Prova di inibizione:

Volume totale = 1 mi di soluzione mantenuto sotto agitazione in una cuvetta.

Controllo: 0. 98 mi DMSO

0.01 mi di DNP-substrato

0.01 mi di enzima

Esperimento: 0.98 mi DMSO

0.01 mi DNP- sub strato

0.01 mi enzima

0.01 mi inibitore (10 pg/ml)

Viene misurata la fluorescenza a 346 nm sia della soluzione di controllo (senza inibitore) che della soluzione contenente l’inibitore. L’inibizione dell’attività catalitica di MMP8 provoca una diminuzione della lisi di DNP-substrato, con conseguente diminuzione della fluorescenza.

La percentuale di inibizione viene espressa dalla seguente formula:

Inibizione % = 100 - (unità rekt./tempOcon bibit/unità relat./tempOcon<«>iio x 100) Ripetendo l’esperimento a varie concentrazioni di inibitore è possibile calcolarne la rispettiva ICso-La tabella I mostra i dati di inibizione enzimatica per alcuni composti rappresentativi dell’invenzione.

Tabella I

I composti della presente invenzione sono anche risultati attivi in un test “in vivo” di chemoinvasione. Nel test di chemoinvasione delle camere Costar Transwell per coltura cellulare (diametro: 6.5 mm; diametro pori: 8 μιη) sono rivestite sul fondo con 100 μΐ di collagene tipo IV (soluzione diluita 50 pg/ml, quindi evaporazione per una notte). Con Io stesso procedimento si ricoprono le camere di un secondo strato di collagene tipo IV (100 μΐ di soluzione a concentrazione 50 pg/ml). Prima dell’uso, le camere sono lavate due volte con acqua sterile ed incubate per circa 1 ora a 37°C in un mezzo (DMEM) privato di siero. Le cellule di fibrosarcoma umano HT1080 sono raccolte per trattamento con tripsina-EDTA, lavate con DMEM 10% FCS ed incubate per almeno 30 minuti a 37°C nello stesso mezzo. Le cellule sono qundi lavate con DMEM privato di siero e risospese in DMEM privato di siero addizionato di 0.1% BSA (frazione V), contate e diluite fino ad ottenere una densità finale di 3xl05 cellule/ml.

Dalle camere preincubate viene rimosso per aspirazione il mezzo privo di siero. H comparto inferiore delle camere è riempito con 600 μΐ di DMEM 20% FCS 1% BSA (frazione V) composto da testare. 200 μΐ di sospensione cellulare (6x104 cellule) contenenti il composto da testare sono aggiunti nel comparto superiore e le camere sono incubate a 37°C in atmosfera umida con C02. Dopo ima prima incubazione di 24 ore i mezzi dei comparti inferiore e superiore sono rimpiazzati con sospensioni fresche e le camere sono incubate per altre 24 ore.

I filtri incubati sono quindi lavati con PBS, le cellule sono fissate per 15 minuti in paraformaldeide 4%, penneabilizzate in metanolo (10 minuti, -20°C) e colorate con May-Grunwald-Giemsa. Le cellule che aderiscono alla faccia superiore dei filtri sono rimosse con un tampone di cotone, i filtri vengono staccati dal fondo delle camere ed analizzati al microscopio per determinare il numero di cellule sulla faccia inferiore dei filtri.

In un esperimento di controllo, in assenza di inibitore di metallo proteinasi, le cellule HT1080, che iper-metallo-proteinasi, sono in grado di degradare il collagene tipo IV e di migrare sulla faccia inferiore dei filtri. Nell’esperimento con l’inibitore invece Γ attività delle metallo-proteinasi è parzialmente o totalmente inibita, con un conseguente minor numero di cellule che migrano sulla faccia inferiore dei filtri La lettura dell’esperimento consiste quindi nella determinazione della differenza tra cellule contate sulla faccia inferiore del filtro nell’esperimento di controllo e nell’esperimento con l’inibitore.

La tabella Π mostra i dati relativi a due composti rappresentativi dell’invenzione.

Tabella II

Da quanto detto sopra è evidente che i composti dell’invenzione possono anche essere usati nella cura di tutte le condizioni associate all’azione delle metallo-proteinasi della matrice, quali artrite reumatoide, osteoartrite, artrite settica, ulcerazioni della cornea, epidermiche o gastriche, trombosi coronarica, proteinuria, conseguenze patologiche di traumi o anche come agenti contraccettivi.

I composti della presente invenzione possono essere somministrati in quantità variabili tra 0.01 mg e 0.4 g per chilogrammo di peso corporeo al giorno. Un regime di dosaggio preferito al fine di ottenere risultati ottimali è quello che prevede l’uso da circa 1 mg a circa 50 mg per chilogrammo dipeso corporeo al giorno, impiegando dosi unitarie così da somministrare da circa 70 mg a circa 3.5 g del composto attivo ad un soggetto di circa 70 kg di peso corporeo in un periodo di 24 ore. Questo regime di dosaggio può essere regolato per fornire la risposta terapeutica ottimale. Per esempio, possono essere somministrate dosi suddivise a seconda delle esigenze della situazione terapeutica. Il composto attivo può essere somministrato per via orale, endovenosa, intramuscolare o sottocutanea.

Le composizioni farmaceutiche cui la presente invenzione fa riferimento contengono almeno un composto dell’invenzione in quantità terapeuticamente efficaci in miscela con eccipienti farmaceuticamente compatibili.

Composizioni per via orale includeranno generalmente un diluente inerte o un carrier edibile. Esse possono essere incluse in capsule di gelatina o compresse in tavolette. Altre forme di somministrazioni orali sono capsule, pillole, elisir, sospensioni o sciroppi.

Le tavolette, pillole, capsule e composizioni similari possono contenere i seguenti ingredienti (in aggiunta al principio attivo): un legante quale cellulosa microcristallina, gomma adragante o gelatina; un eccipiente quale amido o lattosio; un agente disgregante quale acido alginico, primogel, amido di mais e simili; un lubrificante quale magnesio stearato; un fluidificante quale biossido di silicio colloidale; un agente dolcificante quale sucrosio o saccarina o un agente aromatizzante quale aroma di menta, metil salicilato o aroma di arancio. Quando la composizione scelta è in forma di capsule, essa può contenere in aggiunta un carrier liquido quale un olio grasso. Altre composizioni possono contenere vari materiali che ne alterano la forma fisica, quali agenti ricoprenti (per tavolette e pillole) come zucchero e gommalacca. I materiali usati nella preparazione delle composizioni dovrebbero essere farmaceuticamente puri e non tossici ai dosaggi impiegati.

Per la preparazione di composizioni farmaceutiche per via di somministrazione parenterale, il principio attivo può essere incoiporato in soluzioni o sospensioni, che possono includere in aggiunta i seguenti componenti: un diluente sterile come acqua per iniezioni, soluzione salina, oli, glicoli polietilenici, glicerina, glicole propilenico o altri solventi sintetici; agenti antibatterici quale alcool benzilico; antiossidanti quali acido ascorbico o sodio bisolfito; agenti chelanti quale acido etilendiamminotetraacetico; tamponi quali acetati, citrati o fosfati e agenti per aggiustare la tonicità della soluzione quali sodio cloruro o destrosio.

La preparazione parenterale può essere inclusa in ampolle, siringhe mono-uso o fiale in vetro o plastica.

Claims

RIVENDICAZIONI: 1. Uso dei composti di fomula (I): ( i ) R R in cui: R è scelto nel gruppo comprendente idrogeno, (Ci-Cs)alchile lineare o ramificato, fenile (eventualmente sostituito da un gruppo (Ci-Cj)alcossi), -(CH2)B-COOH, dove n è un intero da 1 a 3; Ri è idrogeno o un gruppo -COOR4, dove R4 è idrogeno o (Ci-Cs)alchile; R2 è idrogeno o un gruppo -COOR4 come sopra definito; R3 è scelto nel gruppo comprendente idrogeno, alogeno (cloro, bromo, fluoro o iodio), (C r C4)alcossi, benzilossi, di loro enantiomeri, racemati, diastereoisomeri e di loro sali con acidi e basi farmaceuticamente accettabili, per la preparazione di una composizione farmaceutica avente attività antimetastatica o di inibizione dell’invasione tumorale.
2. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui detti composti sono: 6-metossi- 1,2, 3, 4-tetraidronoiharmano; acido l,2,3,4-tetraidronorharmano-3-carbossilico; acido 6-metossi- 1,2,3, 4-tetraidronorharman- 1-carbossilico; acido l-(4-metossifenil)-l,2,3,4-tetraidronorharman-3-carbossiIico; acido 1-metil- l,2,3,4-tetraidronorharman-3-carbossilico; acido 1-metil- 1,2,3,4-tetraidronorharman- 1 ,3-dicarbossilico; acido l-(dietilmetil)- 1 ,2,3,4-tetraidronorharman-3-carbossilico; acido (6-bromo- 1,2,3,4-tetraidronorharman- l-il)-3-propionico; acido 1-isobutil- 1,2,3, 4-tetraidronorharman-3-carbossilico; acido 1-fenil- 1,2,3, 4-tetraidronorharman-3-carbossilico; acido 1-propil- 1,2,3, 4-tetraidronorharman-3-carbossilico; 1-metil- l-metossicarbonil-6-benzilossi- 1,2,3, 4-tetraidronorharmano; 1-metil- l-metossicarbonil-6-metossi- 1,2,3, 4-tetraidronorhannano; / 1-metil- l-metossicarbonil-6-idrossi- 1,2, 3, 4-tetraidronorharmano; 1-metil- l-metossicarbonil-6-cloro- 1,2, 3, 4-tetraidronorharmano; 1-metil- l-metossicarbonil-6-bromo- 1,2, 3, 4-tetraidronorharmano; 1-metil- 1-metossicarbonil- 1 ,2, 3, 4-tetraidronorharmano.
3. Uso secondo la rivendicazione 2, in cui i principi attivi sono: 6-metossi- 1 ,2, 3 , 4-tetraidronorharmano ; acido l,2,3,4-tetraidronorharmano-3-carbossilico; acido 6-metossi- 1,2,3,4-tetraidronorharman- 1-carbossilico.
4. Uso dei composti di fonatila (I): (i) R è scelto nel gruppo comprendente idrogeno, (Ci-C5)alchile lineare o ramificato, fenile (eventualmente sostituito da un gruppo (CrC5)alcossi), -(CH2)n-COOH, dove n è un intero da 1 a 3 ; Ri è idrogeno o un gruppo -COOR4, dove R4 è idrogeno o (Ci-Cs)alchile; R2 è idrogeno o un gruppo -COOR4 come sopra definito; R3 è scelto nel gruppo comprendente idrogeno, alogeno (cloro, bromo, fluoro o iodio), (Ci-C4)alcossi, benzilossi, di loro enantiomeri, racemati, diastereoisomeri e di loro sali con acidi e basi farmaceuticamente accettabili, per la preparazione di una composizione farmaceutica per la prevenzione o la cura delle condizioni associate. all’azione delle matrice-metallo proteinasi.
5. Uso secondo la rivendicazione 4, in cui detti composti sono: 6-meto ssi- 1 ,2 ,3 ,4-tetraidronorharmano ; acido l,2,3,4-tetraidronorhannano-3-carbossilico; acido 6-metossi- 1 ,2,3,4-tetraidronorharman- 1-carbossilico; acido l-(4-metossifenil)- 1,2,3, 4-tetraidronorharman-3-carbossilico; acido l-metil-l,2,3,4-tetraidronorbarman-3-carbossilico; acido 1-metil- 1 ,2,3,4-tetraidronorharman- 1,3-dicarbossilico; acido l-(dietilmetil)- 1,2,3, 4-tetraidronorharman- 3 -carb ossifico; acido (6-bromo- 1,2, 3, 4-tetraidronorharman- l-il)-3-propionico; acido 1-isobutil- 1,2,3, 4-tetraidronorharman-3-carbossilico; acido 1-fenil- 1 ,2,3,4-tetraidronorharman-3-carbossilico; acido 1-propil- 1 ,2,3,4-tetraidronorharman-3-carbossilico; 1-metil- l-metossicarbonil-6-benzilossi- 1,2,3, 4-tetraidronoiharmano; 1-metil- l-metossicarbonil-6-metossi- 1,2,3, 4-tetraidronoiharmano; l-metil- l-metossicarbonil-6-idrossi- 1,2,3, 4-tetraidronorharmano; l-metil- l-metossicarbonil-6-cloro- 1,2,3, 4-tetraidronorharmano; l-metil- l-metossicarbonil-6-bromo- 1,2, 3, 4-tetraidronorharmano; 1 -metil- 1 -meto ssicarb onil- 1 ,2,3 ,4-tetr aidronorhannano .
6. Uso secondo la rivendicazione 5, in cui i principi attivi sono: 6-metossi- 1 ,2,3,4-tetraidronorharmano; acido 1 , 2, 3,4-tetraidronorharmano- 3 - carb ossilico ; acido 6-metossi- 1,2,3, 4-tetraidronorharman- 1-carbossilico.
7. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6, in cui la condizione da trattare è selezionata nel gruppo consistente in: artrite reumatoide, osteoartrite, artrite settica, ulcerazioni della cornea, epidermiche o gastriche, trombosi coronarica, proteinuria, conseguenze patologiche di traumi.
8. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6, per la prevenzione dell’ovulazione o dell’impianto dell’ovulo nell’utero.