ITMI951565A1 - Caledotricine - Google Patents
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-
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
DESCRIZIDNE dell'invenzione industriale
La presente invenzione riguarda nuove sostanze fisiologicamente attive, ossia caledotricine A, B, C, D, E, F,· G, H e I, e loro sali.
La presente invenzione inoltre riguarda l'impiego di sostanze fisiologicamente attive costituite da caledotricine A, B, C, D, E, F, G, H e I oppure di loro sali nella produzione di farmaci per il trattamento di malattie micotiche; riguarda composizioni farmaceutiche contenenti caledotricine A, B, C, D, E, F, G, H oppure I; riguarda microorganismi capaci di produrre caledotricine; e riguarda un procedimento per produrre caledotricine.
Una micosi profonda provocata da funghi opportunistici in pazienti immunocompromessi ha avuto un incremento a causa di svariati fattori predisponenti, per esempio AIDS, terapia anti-cancro, trapianto di organi, aumento della popolazione anziar.a e un aumentato impiego di antibiotici. In questi, pazienti immunocompromessi, numerosi funghi che non sono patogeni per l'uomo sano si comportano come patogeni virulenti. Come risultato, sussiste una necessità medica rapidamente crescente per avere a disposizione prodotti antifunghi ben tollerat:.. Tuttavia, fino ad ora, i prodotti antifunghi non sono stati completamente sviluppati. Soltanto pochi prodotti antifunghi per micosi sistemiche sono sul mercato. Inoltre, le proprietà di questo prodotti antifunghi non soddisfano i requisiti pratici in misura completa. Questa situazione ha spinto gli inventori a cercare nuovi prodotti antifunghi che abbiano ampi spettri di azione. Come risultato, si è trovato che alcuni microorganismi specifici producono nuovi prodotti anti funghi aventi ampi spettri di attività contro i funghi, come descritto qui di seguito più dettagliatamente.
Le proprietà chimico-fisiche di sostanze fisiologicamente attive ossia caledotricine A, B, C, D, E, F, G, H e I ottenute secondo la presente invenzione sono le seguenti:
Caledotricina A:
1) Aspetto: prodotto solido bianco
2) Rotazione specifica: [a]2’D-50,8° ± 6,4° (c = 0,10 in piridina)
3) Peso molecolare (metodo FAB-MS)
Tipo dello ione positivo: m/z 1401 (M+H) *, 1423 (M+Na)<*>
Tipo dello ione negativo: m/z 1399 (M-H)<'>, 1417 (M+H20-H)<'>
4) Formula molecolare: C65H100N;:022
5) Spettroscopia di massa ad elevata separazione (per M+H) :
Trovato: 1407.7117
Cale, per C65H101N12O22: 1401.7143
6) Spettro UV: in metanolo (vedi figura 1)
lraiI 203±5 (84300), 224±5 (82900 sh), 275±5 (8280 sh) (in metanolo)
lmax 203±5 (ε 3500), 220±5 (ε 2900 sh), 275±5 (ε 315 sh) (in N/10HCl-metanolo)
lraax 204±5 (e 7200), 225±5 (ε 2600 sh), 245±5 (ε 1600 sh), 295±5 (e 200 sh) (in N/10NaOH-metanolo)
7) Spettro IR: in compressa di KBr (vedi figura 2) Nume::i d'onda di assorbimento medio (cm<-1>) sono i seguenti: 3298, 2925, 2854, 1745, 1657, 1517, 1262, 1100-1000,
8) Spettro <l>H-NMR: 400 MHz, in miscela con dimetilsolfoss:.do-d6 e con acido trifluoroacetico (25:1) (vedi figura 3)
9) Spettro <13>C-NMR: 100 MHz, in miscela con dimetilsolfoss Ldo-de e con acido trifluoroacetico (25:1) (vedi figura 4).
10) Solubilità:
Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubili: acqua, dimetil solfossido, metanolo
11) Reazione cromatica
Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori eli iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di broraocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dinitrofenilidrazina-acido solforico, reagente di Sakaguchi e nitrato di argento.
12) Cron.atografia su strato sottile (TLC)
Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254<+1 >diclorometano:metanolo:acqua 0,13 (60:35:5)
n-butanolo:acido acetico:acqua 0,25 (3:1:1)
*1: E. Merck AG., Germania.
13) Crcmatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC):
Veicolo: YMC-Pack A303, prodotto dalla Yamamura Chemical. Laboratories
Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) = 45:55
Velocità di flusso: 1 ml/min. Rt = 16,3±0,5 minuti 14) Class.ificazione della sostanza: sostanza anfotera 15) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina A a 120°C in HCl 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina.
Caledotricina B:
1) Aspetto: solido bianco
3) Peso molecolare (metodo FAB-MS)
Tipo (iello ione positivo: m/z 1223 (M+H)<+>
Tipo dello ione negativo: m/z 1221 (M-H)<'>
3) Formula molecolare: C59H90N12O16
4) Spettro IR: in compressa di KBr (vedi figura 5) I numer:. d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3304, 2926, 2854, 1741, 1657, 1518, 1261, 1130-1060,
5) Spettro <l>H -NMR: 400 MHz, in miscela con dimetilsolfossido-d6 e con acido trifluoroacetico (25:1) (vedi figura 6)
6) Solubilità:
Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo
7) Reazione cromatica
Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido raolibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dinitrofenilidrazin acido solforico, reagente di Sakaguchi, nitrato di argento.
8) Cromatografia su strato sottile (TLC)
Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf
Gel di silice F254<+l >n-butanolo-acido acetico:acqua 0,49
(3 : 1 : 1)
*1: E. Merck AG., Germania.
9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC):
Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei co.
Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 22,4+0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina B a 120°C in HC1 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina.
Caledot.cicina C:
1) Aspetto: prodotto solido bianco
2) Peso nolecolare (metodo FAB-MS)
Tipo con ione positivo: m/z 1239 (M+H)<+>
Tipo con ione negativo: m/z 1237 (M-H)-3) Formula molecolare: C59H90N12O17
4) Spett.ro IR: in compressa di KBr (vedi figura 7) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<1>) sono i seguenti: 3368, 2926, 2855, 167l) 1671, 1518, 1204, 1138
5) Spettro <l>H-NMR: 400 MHz, in miscela con dimetilsolfossido-de e con acido trifluoroacetico (25:1) (vedi figura 8)
6) Solubilità:
Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo
7) Reazione cromatica
Positiva.: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-din:.trofenilidrazin acido solforico, reagente di Sakaguchi e nitrato di argento.
8) Cromatografia su strato sottile (TLC) Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di si],ice F254<+1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,46
(3:1:1)
*1: E. Merck AG., Germania.
9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC):
Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co. Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocitc.di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 22,2±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina C a 120°C in HC1 6N per 24 ore, e quindi si è effettuata una analisi di amminoacidi per rivelarci tirosina, treonina X2, glutammina, glicina, istidina.
Caledotricina D:
1) Aspetto: prodotto solido bianco
3) Peso molecolare (metodo FAB-MS)
Tipo dello ione positivo: m/z 1355 (M+H)<+>
Tipo dello ione negativo: m/z 1353 (M-H)-3) Formula molecolare: C59H98N12O20
4) Spettro IR: compressa di KBr (vedi figura 9) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<_1>) sono i seguenti: 3342, 2910, 2830, 1740, 1655, 1527, 1204, 1140
5) Spettro <l>H-NMR: 400 MHz, in miscela con dimetilsolfossido-ds e con acido trifluoroacetico (25:1) (vedi figura 10)
6) Solubilità:
Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo
7) Reazione cromatica
Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dinitrofenilidrazin acido solforico, reagente di Sakaguchi e nitrato di argento.
8) Cromatografia su strato sottile (TLC)
Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di siLice F254<+1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,43
(3:1:1)
*1: E. Merck AG., Germania.
9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC):
Veicolo·: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co.
Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 18,2±0,5 minuti 10) Classiliica2ione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina D a 120°C in HCl 6N per 24 ore, e quindi La si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina.
Caledotricina E:
1) Aspetto: prodotto solido bianco
2) Peso molecolare (metodo FAB-MS)
Tipo dello ione positivo: m/z 1371 (M+H)<+>
Tipo dello ione negativo: m/z 1369 (M-H)-3) Formula molecolare: C64H98N12021
4) Spettro IR: compressa di KBr (vedi figura 11) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3354, 2920, 2850, 1740, 1678, 1530, 1262, 1150-1050,
5) Spettro <1>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossido-de e acido trifluoroacetico (25:1), (vedi figura 12)
6) Solubilità:
Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo
7) Reazione cromatica:
Positiva : anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith
Negativa.: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dini.trofenilidrazin acido solforico, reagente di Sakaguchi e nitrato di argento.
8) Croméitografia su strato sottile (TLC)
Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254<41 >η-butanolo:acido aceticoracqua 0,39 (3:1:1)
*1: E. Merck AG., Germania.
9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC):
Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co .
Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 17,6+0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina E a 120°C in HCl 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glicina, istidina.
Caledotr.icina F:
1) Aspetto: prodotto solido bianco
2) Peso molecolare {metodo FAB-MS)
Tipo dello ione positivo: m/z 1517 (M+H)'
Tipo dello ione negativo: m/z 1515 (M-H)<">
3) Formula molecolare: C70H108N12025
4) Spettro IR: compressa di KBr (vedi figura 13)
Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-l>) sono i seguenti: 3356, 2926, 2855, 1740, 1657, 1518, 1260, 1100-1000,
5) Spettro <l>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossido-d6 e acido trifluoroacetico (25:1), (vedi figura 14)
6) Solubilità:
Solubile: piridina, acido trifluoroacetico,
Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo
7) Reazione cromatica:
Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith
Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-din:Ltrofenilidrazin acido solforico, reagente di Sakaguchi, nitrato di argento.
8) Cromatografia su strato sottile (TLC) Sostanza-vsicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254<+1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,18
(3:1:1)
*1: E. Merck AG., Germania.
9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC):
Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co.
Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 16,3±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina F a 120°C in HC1 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina.
Caledotricina G:
1) Aspetto: prodotto solido bianco
2) Peso molecolare (metodo FAB-MS)
Tipo dello ione positivo: m/z 1373 (M+H)<+>
3) Formula molecolare: C63H96N12O22
4) Spett.ro IR: compressa di KBr (vedi figura 15) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3350, 2926, 2855, 1739, 1659, 1518, 1265, 1120-1030,
5) Spettro <1>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossido-de e acido trifluoroacetico (25:1), (vedi figura 15)
6) Solubilità:
Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, d'imetil solfossido, metanolo
7) Reazione cromatica:
Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori eli iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dinitrofenilidrazin acido solforico, reagente di Sakaguch.i, nitrato di argento.
8) Croma.tografia su strato sottile (TLC)
Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254<+1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,24 (3:1:1)
*1: E. Merck AG., Germania.
9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC):
Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co.
Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM {pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 15,6±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina G a 120°C in HCl 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tiros'ina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina.
Caledotricina H:
1) Aspetto: prodotto solido bianco
2) Peso molecolare (metodo FAB-MS)
Tipo dello ione positivo: m/z 1343 (M+H)<+>
Tipo dello ione negativo: m/z 1341 (M-H)-3) Formula molecolare: 062Η94Ν12021
4) Spettro IR: compressa di KBr (vedi figura 17) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti : 3386, 2925, 2850, 1745, 1670, 1520, 1210, 1140,
5) Spettro <1>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossido-d6 e acido trifluoroacetico (25:1), (vedi figura 18)
6) Solubilità:
Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo
7) Reazione cromatica:
Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith
Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dini1:rofenilidrazin acido solforico, reagente di Sakaguch:. e nitrato di argento.
8) Cromatografia su strato sottile (TLC)
Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254*<1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,22 (3:1:1)
*1: E. Merck AG., Germania.
9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC):
Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co .
Fase motile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 12,3±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina H a 120°C in HCl 6N per 24 ore, quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina .
Caledotricina I:
1) Aspetto: prodotto solido bianco
2) Peso molecolare (metodo FAB-MS)
Tipo dello ione positivo: m/z 1327 (M+H)<*>
Tipo dello ione negativo: m/z 1325 (M-H)-3) Formula molecolare: C62H94N12020
4) Spettro IR: compressa di KBr (vedi figura 19)
Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3347, 2920, 2850, 1679, 1540, 1205, 1140, 5) Spettro “H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossido-d6 e acido trifluoroacetico (25:1), (vedi figura 20)
6) Solubilità:
Solubile: piridina, acido trifluoroacetico,
Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo
7) Reazione cromatica:
Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith
Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dinitrofenilidrazin acido solforico, reagente di Sakaguchi, nitrato di argento.
8) Cromatografia su strato sottile (TLC) Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254<+1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,43
(3:1:1)
*1: E. Merck AG., Germania.
9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC):
Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co.
Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 12,6±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina I a 120°C in HC1 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina.
Le caledotricine A, B, C, D, E, F, G, H e I hanno presentato spettri <l>H-NMR quasi simili come indicato nelle figure 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20 e hanno presentato spettri IR come indicato nelle figure 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19, rispettivamente, indicando che le caledotricine sono omologhi di depsipeptidi . Una analisi di amminoacidi di caledotricine ha messo in evidenza che esse hanno i medesimi residui di amminoacidi, che sono treonina, glieina, glutammina, istidina e tirosina. La presenza di unità di acidi grassi è stata indicata, sulla base di loro spettri <l>H-NMR (un segnale a 0,95 ppm attribuibile ad un gruppo metile e segnali a 1,2 ppm-1,4 ppm, attribuibili a gruppi metilenici).
Secondo il procedimento messo a disposizione dalla presente invenzione, si preparano caledotricine A, B, C, D, E, F, G, H e I sottoponendo a coltura un microorganismo che appartiene al genere Pseudomonas in condizioni aerobiche, in un mezzo di coltura acquoso a isolandole.
I microrganismi usati nella presente invenzione comprendono tutti i ceppi appartenenti al genere Pseudomonas, equivalenti funzionali, sottoculture, mutanti e varianti di detto microorganismo che sono in grado di produrre le sostanze fisiologicamente attive caledotricine A, B, C, D, E, F, G, H e I.
Ceppi preferiti sono Pseudomonas spp. BA 7399 e BA 8429 che sono stati isolati da un campione di terreno. I ceppi indicati Pseudomonas spp. BA 7399 e BA 8429 sono stati depositati il 2 agosto 1994 presso il National Institute of Bioscience and Human-Technology, Giappone, sotto il trattato di Budapest con i nùmeri di deposito:
Pseudomonas sp. BA7399 FERM BP-4766 Pseudomonas sp.BA8429 FERM BP-4767
Le caratteristiche morfologiche e fisiologiche di Pseudomonas spp. BA 7399 e BA 8429 sono le seguenti :
Caratteristiche morfologiche e fisiologiche
Il ceppo BA 7399 e il ceppo BA 8429 erano Gramnegativi, non sporulanti, a forma di bacchetta, aerobici e dotati di motilità con parecchi (più di 6) flagelli polari. Il colore delle colonie era giallo pallido. La produzione di ossidasi e la produzione di catalasi erano positive. La prova OF del ceppo BA 7399 era ossidante, ma il ceppo BA 8429 era negativo. I fattori di crescita non erano richiesti. Queste caratteristiche hanno indicato chiaramente che due ceppi, ossia BA 7399 e BA 8429, appartenevano al genere Pseudomonas Migula. Pertanto, questi ceppi sono stati identificati come Pseudomonas spp. BA 7399 e BA 8429.
La coltura secondo il procedimento messo a disposizione dalla presente invenzione può venire effettuata in un mezzo di coltura che contiene usualmente sostanze nutritive impiegabili dal microorganismo che viene coltivato. Come sorgente di carbonio si possono citare, per esempio, glucosio, levulosio, galattosio, mannosio, sorbosio, arabinos.lo, xilosio, saccarosio, amido, glicerolo, melasse, destrina e loro miscele. Le sorgenti di azoto sono, per esempio, farina di semi di soia, farina di semi di cotone, farina di mais, estratto di carne, peptone, lievito essiccato, estratto di lievito, liquido di macerazione del mais, solfato di ammonio, nitrato di sodio e loro miscele. Inoltre, si possono aggiungere al mezzo di coltura altre sostanze organiche oppure inorganiche per favorire la crescita del microorganismo e per fare aumentare la produzione di caledotricine, esempi di tali sostanze essendo sali inorganici, per esempio, carboidrato di calcio, cloruro di sodio, tiosolfato di sodio, fosfati e simi1i.
Si effettua la coltura in condizioni aerobiche in un mezzo acquoso, preferibilmente mediante fermentc.zione sommersa. La coltura viene effettuata opportunamente ad una temperatura di 20°C-35°C, la temperatura ottimale essendo 27°C.
Preferibilmente, si effettua la coltura ad un pH di 3-9. Il tempo di coltura dipende dalle condizioni nelle qjali si effettua la coltura. In generale, è sufficiente effettuare la coltura a 24°C per 200 ore.
Pei: raccogliere le caledotricine oggetto della presente invenzione dalle colture, si possono adottare opportunamente metodi che vengono usualmente impiegati per isolare metaboliti prodotti da microbi, da loro colture. Per esempio, la caìedotricina A, che è una sostanza anfotera estraibile con n-butanolo, è contenuta principalmente in un panello di micelio e viene isolata vantaggiosamente adottando i seguenti procedimenti. Ossia, tutto il brodo di coltura viene sottoposto a filtrazione oppure a centrifugazione per raccogliere le cellule e il panello di micelio ottenuto viene estratto con un opportuno solvente per isolare i prodotti desiderati. Tra i solventi che possono venire usati per l'estrazione sono compresi solventi organici solubili in acqua oppure soluzioni acquose di solventi organici solubili in acqua, per esempio metanolo, etanolo, acetone, acetone acquoso e alcoli a.cquosi.
Sali, sostanze solubili in acqua, ecc., possono venire vantaggiosamente allontanati dall'estratto che si ottiene mediante ripartizione tra acqua e solventi organici non miscibili con acqua, come n-butanolo, metil etilchetone, ecc. Per rimuovere sostanze colorant.i, sostanze solubili in grassi o simili dall'est.ratto, si può usare gel di silice (Wako Chemicals Co. Ltd, Giappone), resine tipo setacci molecolari come per esempio Sephadex (Pharmacia, Svezia) e Toyopearl (Tokyo Soda Manufacturing Co., Giappone), ecc.
Per una completa purificazione dei composti, vantaggiosamente si effettua una cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC). Tra le sostanze-veicolo che possono venire usate in tale HPLC sono comprese una resina tipo fase inversa come gel YMC (Yamamura Chemical Laboratories, Giappone) oppure Capcel pak gel (Shiseido, Co. Ltd., Giappone). Come fase mobile, si impiega vantaggiosamente un sistema di solventi costituito da una miscela di soluzione-tampone acquosa e di un opportuno solvente organico solubile in acqua come metanolo, acetonitrile, ecc.
La frazione di eluato così purificata e frazionata come indicato sopra può venire sottoposta a concentrazione, liofilizzazione oppure cristallizzazione per polverizzare o cristallizzare le caledotricine .
Per preparare sali farmacologicamente accettabili (per esempio sale di potassio, sale di calcio = sale cloridrato ecc.) dalle caledotricine (forma libera) si possono adottare metodi tradizionali .
Attività antifunghi in vitro
Le concentrazioni di inibizione minima (valori MIC) delle caledotricine A, B, C, D, E, F, G, H e I contro i funghi patogeni rappresentativi sono indicate nella tabella 1. Il valore MIC viene definito come la concentrazione minima del composto in esame in corrispondenza della quale non si mette in evidenza alcuna crescita visibile. I mezzi di coltura impiegati per misurare i valori MIC erano base di azoto di lievito (Difco) integrato con 1% di glucosio, 0,2% di agarosio basso-fondente e 0,25% di K2HPO4 (pH 7,0). Non si è usato agarosio bassofondente quando si è misurata l'attività antifunghi contro Candida albicans e contro Cryptococcus neoformans. I mezzi di coltura sono stati inoculati con cellule di funghi in corrispondenza della concentrazione finale di 10.000 cfu/ml. La lastra è stata sottoposta all'incubazione per 1-12 giorni a 27°C. Tutti i valori MIC riportati nella tabella 1 sono espressi come μg/ml dei composti in esame.
TABELLA 1
Attività antifunghi di caledotriciuo A-I
; fluconazolo NT; non sperimentato
Non si è osservata tossicità acuta per le caledotricine A fino a I.
Per l'impiego terapeutico le caledotricine possono venire preparate sotto forma di composizioni medicinali di forme diverse secondo tecniche di formulazione note.
Per l'impiego delle caledotricine nella terapia della candidiasi, per esempio si può somministrare la caledotricina A per via endovenosa, sottocutanea oppure intramuscolare, sotto forma di una soluzione in salina fisiologica, usualmente in una dose compresa tra 0,1 e 50 mg/kg/giorno, preferibilmente di 0,5 fino a 20 mg/kg/giorno. Per una somministrazione orale, la caledotricina A preferibilmente viene formulata sotto forma di capsule oppure di compresse rivestite con zucchero mediante procedimenti convenzionali e viene somministrata in una dose di solito compresa tra 0,1 e 100 mg/kg/giorno, preferibilmente compresa tra 1 e 50 mg/kg/giorno.
Le caledotricine ottenute mediante la presente invenzione possono anche venire usate come disinfettante per uso topico. Per esempio, la caledotricina A può venire usata per sterilizzare e disinfettare la pelle oppure le mucose dell'uomo e di animali applicandola sotto forma di una composizione liquida preparata sciogliendo la caledotricina A per esempio in acqua distillata in una concentrazione di solito ,compresa tra 0,1 e 10% (peso/volume), preferibilmente compresa tra 0,5 e 5% {peso/volume) oppure sotto forma di un unguento impiegando vaselina oppure lanolina come base, tale Unguento contenendo di solito 0,2 fino a 100 mg, preferibilmente 1 fino a 20 mg di. caledotricina A per grammo.
Gli esempi che seguono illustrano ulteriormente la presente invenzione. Le percentuali riportate sono in peso/volume.
ESEMPIO 1
La, sospensione di cellule ottenuta da una coltura su agar inclinato di Pseudomonas sp. BA 7399 è stata inoculata in un pallone di Erlenmeyer da 500 mi contenente 100 mi del mezzo costituito da destrina 3%, Ajipron E3 (Ajinomoto) 1,5%, polipeptone (Wako) 0,2%, farina di glutine di mais (Shouwasangyou) 1,5%, Na2S203 0,1% e una goccia di antischiuma/pallone (nissan). Il pallone è stato sottoposto a sbattimento a 220 glri/minuto per 1 giorno a 27°C. 0,2 mi della coltura ottenuta sono stati trasferiti rispettivamente in cinquanta palloni da 500 mi contenenti il medesime' mezzo di cui sopra. Si è effettuata la fermentazione su un dispositivo di sbattimento ruotante a 220 giri/minuto a 27°C. Dopo coltura per 2 giorni, il brodo di coltura è stato sottoposto al procedimento di isolamento descritto di seguito.
Il brodo di coltura (51) così ottenuto è stato sottoposto ad una centrifugazione continua in modo da ottenere il sedimento del micelio. Il sedimento del micelio è stato aggiunto ad etanolo (1,3 1) e la miscela è stata sottoposta ad agitazione. La miscela è stata filtrata e l'estratto in etanolo (1,4 1) è stato concentrato fino a secco a pressione ridotta. Il residuo (6,4 g) è stato sciolto in acqua (2 1) e la sospensione così ottenuta è stata regolata a pH 2. Si è aggiunto n-butanolo (2 1) e si è sottoposta ad agitazione la miscela dopo di che si è separato lo strato acquoso. Allo strato organico così ottenuto si è aggiunta acqua (2 1) e si è regolata la miscela a pH 9. La miscela è stata sottoposta ad agitazione e quindi s;i è allontanato lo strato acquoso. Lo strato organico cosi ottenuto è stato concentrato fino a secco a pressione ridotta e il residuo (4,5 g) è stato quindi sottoposto ad una cromatografia in colonna su gel di silice (1 1). La colonna è stata dapprima eluita con una miscela di diclorometano e metanolo (1:1). Successivamente, gli antibiotici sono stati fluiti con una miscela di diclorometano e metanolo (1:1) e quindi con metanolo. Le frazioni contenenti gli antibiotici sono state combinate e sono siate concentrate fino a secco a pressione ridotta. Il residuo (1,4 g) così ottenuto è stato sottoposto a cromatografia in colonna su Sephadex LH20 (1/5 1). Si è effettuata la eluizione con metanolo. Le frazioni contenenti gli antibiotici sono state combinate (205 mi) e quindi sono state concentrate fino a secco a pressione ridotta. Gli antibiotici grezzi sciolti in piridina sono stati sottoposti a cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC) su una colonna di YMC pak C18 (20 mm x 250 mm) , eluendo con un sistema solvente costituito da acetonitrile : tampone di bisolfato di sodio 10 mM (pH 3,4) (45 : 55) per il frazionamento. Le frazioni contenenti le singole caledotricine da A fino a I sono state combinate e quindi sono state concentrate. Al concentrato (30 mi) si è aggiunto nbutanolo (30 mi), si è sottoposto ad agitazione per 5 minuti e quindi si è allontanato lo strato acquoso. Lo strato organico così ottenuto è stato lavato con acqua (15 mi x 2)ed è stato concentrato fino a secco a pressione ridotta. Il residuo è stato sciolto in piridina ed è stato di nuovo concentrato fino a secco a pressione ridotta ottenendo la caledotricina A (30 mg), B (7,8 mg), C (3,7 mg), D (2,1 mg), E (1,0 mg), F (1,4 mg), G (1,1 mg), H (1,6 mg) e I (3,0 mg) sotto forma di polvere bianca.
Esempio 2
In modo analogo a quello descritto nell'esempio 1, tranne che al posto di Pseudominas sp. BA 7399 si è usato Pseudomonas sp. BA 8429, si sono ottenute sotto forma di polvere bianca, le caledotricine A (12,5 mg), B (2,6 mg), C (tracce), D (tracce), E (tracce), F (0,3 mg), G (5,6 mg), H (tracce) e I (3,2 mg) .
Esempio 3
Si sono preparate soluzioni iniettabili contenenti ciascuna i seguenti ingredienti, in modo di per s;é convenzionale:
Claims (16)
- RIVENDICAZIONI 1. Una sostanza fisiologicamente attiva, caledotricina A avente le seguenti proprietà fisicochimiche : 1) Aspetto: prodotto solido bianco 2) Rotazione specifica: [a]<24>D-50,8° ± 6,4° (c = 0,10 in piridina) 3) Peso molecolare (metodo FAB-MS) Tipo dello ione positivo: m/z 1401 (M+H)<+>, 1423 (M+Na)<+> Tipo dello ione negativo: m/z 1399 (M-H)-, 1417 (M+H2O-H)· 4) Formula molecolare: C65H100N12O22 5) Spettroscopia di massa ad elevata separazione (per M+H) : Trovato: 1407.7117 Cale, per C65H100N12O22: 1401.7143 6) Spettro UV: in metanolo (vedi figura 1) 1MX 203:t5 (ε4300), 224±5 (ε 2900 sh), 275±5 (ε 280 sh) (in metanolo) 1MX 203±5 (ε 3500), 220+5 (ε 2900 sh), 275±5 (ε 315 sh) (in N/10HCl-metanolo) lmax 204±5 (ε 7200), 225±5 (ε 2600 sh), 245±5 (ε 1600 sh) , 295±5 (ε 200 sh) (in N/10NaOH-metanolo) 7) Spettro IR: in compressa di KBr (vedi figura 2) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3298, 2925, 2854, 1745, 1657, 1517, 1262, 1100-1000, 8) Spettro 'H-NMR: 400 MHz, in miscela con dimetilsolfossido-de e con acido trifluoroacetico (25:1) (vedi figura 3) 9) Spettro <13>C-NMR: 100 MHz, in Aìscela di dimetilsolfossido-d6 e acido trifluoroacetico (25:1) (vedi figura 4). 10) Solubilità: Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo 11) Reazione cromatica Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dinitrofenilidrazina-acido solforico, reagente di Sakaguchi, nitrato di argento. 12) Cromatografia su strato sottile (TLC) Sostanzavveicolo Sistema di solventi Rf Gel di si.lice F254<*1 >diclorometano:metanolo:acqua 0,13 (60:35:5) n-butanolo:acido acetico:acqua 0,25 (3:1:1) *1: E. Merck AG., Germania. 13) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC): Veicolo: YMC-Pack A303, prodotto dalla Yamamura Chemical Laboratories Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato di sodio li) mM (pH 3,4) = 45:55 Velocità di flusso: 1 ml/min. Rt = 16,3±0,5 minuti 14) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 15) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina A a 120°C in HC1 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina, e un suo sale fisiologicamente accettabile.
- 2. Sostanza fisiologicamente attiva caledotricina B avente le seguenti proprietà fisicochimiche:: 1) Aspetto: solido bianco 3) Peso molecolare (metodo FAB-MS) Tipo dello ione positivo: m/z 1223 (M+H)<+> Tipo dello ione negativo: m/z 1221 (M-H)-3) Formula molecolare: C59H90N12O16 4) Spettro IR: in compressa di KBr (vedi figura 5) I numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3304, 2926, 2854, 1741, 1657, 1518, 1261, 11.30-1060, 5) Spettro <l>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossido-d6 e acido trifluoroacetico (25:1) (vedi figura 6) 6) Solubilità: Solubile : piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo 7) Reazione cromatica Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dinitrofenilidrazina acido solforico, reagente di Sakaguchi, nitrato di argento. 8) Cromatografia su strato sottile (TLC) Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254<+l >n-butanolo-acido acetico:acqua 0,49 (3:1:1) *1: E. Merck AG., Germania. 9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC): Veicolo; MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei co . Fase mobile: acetonitrile : tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente 3⁄4i solvente Veloci te;di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 22,4±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina B a 120°C in HC1 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina, e un sue sale fisiologicamente accettabile.
- 3. Sostanza fisiologicamente attiva caledotricina C avente le seguenti proprietà fisicochimiche : 1) Aspetto: prodotto solido bianco 2) Peso molecolare (metodo FAB-MS) Tipo con ione positivo: m/z 1239 (M+H)<*> Tipo con ione negativo: m/z 1237 (M-H) <"> 3) Formula molecolare: C59H90N12O17 4) Spettro IR: in compressa di KBr (vedi figura 7) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3368, 2926, 2855, 1740, 1671, 1518, 1204, 1138 5) Spettro <l>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossi.do-de e acido trifluoroacetico (25:1) (vedi figura 8) 6) Solubilità: Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo 7) Reazione cromatica Positive.: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2, 4-dinitrofenilidrazina acido solforico, reagente di Sakaguchi e nitrato di argento. 8) Cromatografia su strato sottile (TLC) Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254*<1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,46 (3:1:1) *1: E. Merck AG., Germania. 9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC): Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co. Fase mobile: acetonitrile : tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di sovente Velocità di flusso: 1,2 ml/rain. Rt = 22,2±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina C a 120°C in HCl 6N per 24 ore, e quindi si è effettuata una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, cfrutammina, glieina, istidina e un suo sale fisiologicamente accettabile.
- 4. Sostanza fisiologicamente attiva caledotxicina D avente le seguenti proprietà fisicochimiche: 1) Aspetto: prodotto solido bianco 3) Peso molecolare (metodo FAB-MS) Tipo dello ione positivo: m/z 1355 (M+H)<+> Tipo dello ione negativo: m/z 1353 (M-H)-3) Formula molecolare: C64H9BN1202O 4) Spettro IR: in compressa di KBr (vedi figura 9) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3342, 2910, 2830, 1740, 1655, 1527, 1204, 1140 5) Spettro <1>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossido-ds e acido trifluoroacetico (25:1) (vedi figura 3.0) 6) Solubilità: Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo 7) Reazione cromatica Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-din:.trofenilidrazina acido solforico, reagente di Sakaguchi e nitrato di argento. 8) Croméitografia su strato sottile (TLC) Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254*<1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,43 (3:1:1) *1: E. Merck AG., Germania. 9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC) : Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co. Fase mobile: acetonitrile : tampone di fosfato acido di sodic 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 18,2±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina D a 120°C in HC1 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di airaninoc.cidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina e un suo sali fisiologicamente accettabile.
- 5. Sostanza fisiologicamente attiva caledotricina E avente le seguenti proprietà fisicochimiche: 1) Aspetto: prodotto solido bianco 2) Peso molecolare (metodo FAB-MS) Tipo dello ione positivo: m/z 1371 (M+H)<+> Tipo dello ione negativo: m/z 1369 (M-H)-3) Formula molecolare: C64H90N12O21 4) Spettro IR: compressa di KBr (vedi figura 11) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3354, 2920, 2850, 1740, 1678, 1530, 1262, 1150-1050, 5} Spettro <1>H-NMR: 400 MHz, in miscela di etilsolfoss.Ldo-de e acido trifluoroacetico (25:1), (vedi figura 12) 6) Solubilità: Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile acqua, dimetil solfossido, metanolo 7) Reazione cromatica: Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dinitrofenilidrazinaacido solforico, reagente di Sakaguchi e nitrato di argento. 8) Cromatografia su strato sottile (TLC) Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di salice F254<+1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,39 (3:1:1) *1: E. Merck AG., Germania. 9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC): Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co. Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velociti di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 17,6±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledot:ricina E a 120°C in HCl 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina e un suo sali fisiologicamente accettabile.
- 6. Sostanza fisiologicamente attiva caledot ricina F avente le seguenti proprietà fisicochimiche : 1) Aspetto: prodotto solido bianco 2) Peso molecolare (metodo FAB-MS) Tipo dello ione positivo: m/z 1517 (M+H)<+> Tipo dello ione negativo: m/z 1515 (M-H)-3) Formula molecolare: CToHioaN^Oas *<'> 4) Spettro IR: compressa di KBr (vedi figura 13) Numeri d'onda di assorbimento principale (cnf<1>) sono i seguenti: 3356, 2926, 2855, 1740, 1657, 1518, 1260, 1100-1000, 5) Spettro <l>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossido-d6 e acido trifluoroacetico (25:1), (vedi figura 14) 6) Solubilità: Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubili: acqua, dimetil solfossido, metanolo 7) Reazione cromatica: Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-din:.trofenilidrazina acido solforico, reagente di Sakaguchi, nitrato di argento. 8) Cromatografia su strato sottile (TLC) Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254<+l >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,18 (3:1:1) *1: E. Merck AG., Germania. 9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC): Veicolc: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co. Fase mobile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 16,3±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina F a 120°C in HC1 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina e un suo sale fisiologicamente accettabile.
- 7. Sostanza fisiologicamente attiva caledotricina G avente le seguenti proprietà fisicochimiche: 1) Aspetto: prodotto solido bianco 2) Peso molecolare (metodo FAB-MS) Tipo dello ione positivo: m/z 1373 (M+H)* 3) Formila molecolare: C63H95N12O22 4) Spettro IR: in compressa di KBr (vedi figura 15) Numeri d'onda di assorbimento principale (cnf<!>) sono i seguenti : 3350, 2926, 2855, 1739/ 1659, 1518, 1265, 1120-1030, 5) Spettro <1>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfoss;i.do-d6 e acido trifluoroacè<'>tico (25:1), (vedi figura 16) 6) Solubilità: Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo 7) Reazione cromatica: Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dinltrofenilidrazina acido solforico, reagente di Sakaguchi, nitrato di argento. 8) Crome.tografia su strato sottile (TLC) Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254*<1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,24 ( 3 : 1 : 1 ) *1: E. Merck AG., Germania. 9) Crome.tografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC): Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co . Fase mobile: acetonitrile : tampone di fosfato acido di sodio 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocita di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 15,6±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina G a 120°C in HC1 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina e un suo sale fisiologicamente accettabile. 8. Sostanza fisiologicamente attiva caledotricina H avente le seguenti proprietà fisicochimiche;: 1) Aspetto: prodotto solido bianco 2) Peso molecolare (metodo FAB-MS) Tipo dello ione positivo: m/z 1343 (M+H)<+> Tipo dello ione negativo: m/z 1341 (M-H)-3) Formula molecolare: 4) Spettro IR: in compressa di KBr (vedi figura 17) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3386, 2925, 2850, 1745, 1670, 1520, 1210, 1140, 5) Spettro <l>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossido-d6 e acido trifluoroacetico (25:1), (vedi figura L8) 6) Solubilità: Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubile: acqua, dimetil solfossido, metanolo 7) Reazione cromatica: Positivia: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2, 4-din.Ltrofenilidrazina acido solforico, reagente di Sakaguchi, nitrato di argento.
- 8) Cromatografia su strato sottile (TLC) Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254<+1 >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,22 (3:1:1) *1: E. Merck AG., Germania. 9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC):. Veicolo; MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co . Fase mobile: acetonitrile : tampone di fosfato acido di sodio 10 raM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 12,3±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledotricina H a 120°C in HC1 6N per 24 ore, quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelans tirosina, treonina X2, glutammina, glicina, istidina, e un suo sale fisiologicamente accettabile. 9. Sostanza fisiologicamente attiva caledotricina I avente le seguenti proprietà fisicochimiche: 1) Aspetto: prodotto solido bianco 2) Peso molecolare (metodo FAB-MS) Tipo dello ione positivo: m/z 1327 (M+H)<+> Tipo dello ione negativo: m/z 1325 (M-H)-3) Formula molecolare: C62H94N12O20 4) Spettro IR: compressa di KBr (vedi figura 19) Numeri d'onda di assorbimento principale (cm<-1>) sono i seguenti: 3347, 2920, 2850, 1679, 1540, 1205, 1140, 5) Spettro <l>H-NMR: 400 MHz, in miscela di dimetilsolfossi-do-de e acido trifluoroacetico (25:1), (vedi figura 20) 6) Solubilità: Solubile: piridina, acido trifluoroacetico, Scarsamente solubili: acqua, dimetil solfossido, metanolo 7) Reazione cromatica: Positiva: anisaldeide-acido solforico, HBr-ninidrina, vapori di iodio, acido molibdofosforico, vanillinaacido solforico, reagente di Rydon-Smith Negativa: verde di bromocresolo, cloruro ferrico, 2,4-dinitrofenilidrazina acido soiforico, reagente di Sakaguchi, nitrato di argento, 8} Cromatografia su strato sottile (TLC) Sostanza-veicolo Sistema di solventi Rf Gel di silice F254<+l >n-butanolo:acido acetico:acqua 0,43 (3:1:1) *1: E. Merck AG., Germania.
- 9) Cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC): Veicolo: MCIgel ODS, prodotto dalla Mitsubishi Kasei Co. Fase mcbile: acetonitrile: tampone di fosfato acido di sodiD 10 mM (pH 3,4) gradiente di solvente Velocità di flusso: 1,2 ml/min. Rt = 12,6±0,5 minuti 10) Classificazione della sostanza: sostanza anfotera 11) Analisi di amminoacidi: si è riscaldata la caledot.vicina I a 120°C in HC1 6N per 24 ore, e quindi la si è sottoposta ad una analisi di amminoacidi per rivelare tirosina, treonina X2, glutammina, glieina, istidina e u suo sale fisiologicamente accettabile.
- 10 . Sostanze fisiologicamente attive caledotricine A, B, C, D, E, F, G, H e I oppure loro sali come definite nelle rivendicazioni da 1 a 9 per l'impiego come farmaco.
- 11., Impiego di sostanze fisiblogicamente attive caledotricine A, B, C, D, E, F, G, H e I oppure loro sali, come definite nelle rivendicazioni da 1 a 9, come ingrediente attivo nella produzione di farmaci per il trattamento di malattie micotiche.
- 12. Composizione farmaceutica contenente la caledotiricina A, B, C, D, E, F, G, H oppure I oppure un loro'sale come definite nelle rivendicazioni da 1 a 9 e sostanze ausiliarie farmaceutiche usuali.
- 13. Pseudomonas sp. BA 7399 (FERM BP 4766).
- 14. Pseudomonas sp. BA 8429 (FERM BP 4767).
- 15. Procedimento per preparare le sostanze attive caledotricine A, B, C, D, E, F, G, H e I che consiste nel sottoporre a coltura un microrganismo appartenente al genere Pseudomonas in condizicni aerobiche, in un mezzo di coltura acquosa e isolaile.
- 16. Procedimento secondo la rivendicazione 15, in cui il microrganismo è Pseudomonas sp. BA 7399 (FERM ΕΙΡ 4766) oppure Pseudomonas Sp. BA 8429 (FERM BP 4767 ) .
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| 0001 | Granted |