ITMI941135A1 - Estratti di piliostigma thonningii, loro uso e formulazioni che li contengono - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "ESTRATTI DI PILIOSTIGMA THONNINGII, LORO OSO E FORMULAZIONI CHE LI CONTENGONO"

Il Piliostigma thonningii Schum, pianta largamente diffusa in tutto il continente Africano, è una leguminosa a basso fusto tipica delle savane; in Tanganyka e in Rodesia la corteccia della radice di questa pianta bollita nel latte è usata per curare la tosse; gli Swahili mangiano le foglie in piccole dosi per curare complicazioni polmonari e gli Ha masticano le foglie fresche come rimedio contro la tosse. Simili usi sono riportati in molti altri paesi africani. Sempre in Africa, parti diverse della pianta sono usate per la cura di gengive infiammate e per la medicazione di ferite e varie ulcerazioni.

Nel corso delle ricerche sperimentali per verificare le proprietà farmacologiche della pianta, si è sorprendentemente trovato che gli estratti preparati secondo l'invenzione sono dotati di attività antivirale su virus patogeni umani di recente isolamento da individui infetti.

Dal punto di vista chimico poco è noto sulla composizione delle radici, dei rami e delle foglie di Piliostigma thonningii. Dalla corteccia dei rami è stato isolato fino al 20% di tannino, senza tuttavia precisarne la composizione, mentre nelle foglie sono stati identificati alcuni flavonoidi e terpeni quali l'acido lambertianico ed il lambertianolo.

Gli estratti oggetto della presente invenzione vengono preparati estraendo tutte le parti della pianta, separatamente o in miscela fra loro, con alcoli o chetoni alifatici a basso peso molecolare puri o diluiti con acqua. Le cortecce della radice e del tronco vengono prevalentemente estratte con acetone acquoso a concentrazione variabile da 9:1 fino a 2:8, preferibilmente 6:4, a temperature comprese fra 25°C e 60°C, preferibilmente a 40°C. Le foglie vengano invece prevalentemente estratte con miscele di alcoli o chetoni, normalmente acetone, in rapporto solvente/acqua 4:6, per evitare l'estrazione di clorofilla e sostanze lipofile indesiderate e risultate non attive nello screening. Gli estratti ottenuti, come verrà illustrato negli esempi seguenti, vengono sottoposti ai seguenti stadi di trattamento:

a) eliminazione del solvente mediante concentrazione a temperatura inferiore a 40°C;

b) filtrazione o centrifugazione per eliminare i residui gommosi di sostanze indesiderate formatesi nell'eliminazione del solvente organico;

c) estrazione dell'estratto acquoso limpido con etile acetato fino al completo esaurimento delle sostanze estraibili, ed eliminazione degli estratti organici;

d) cromatografia della fase acquosa su una colonna di resina di adsorbimento, quale XAD-4, XAD-2, Duolite o altre resine a matrice polistirenica; rieluendo con alcoli o chetoni alifatici a basso peso molecolare diluiti con acqua,preferibilmente con acetone acquoso in diverse percentuali,normalmente con acetone acquoso al 40%;

e) concentrazione parziale dell'eluato della colonna sotto vuoto e a temperature non superiori a 60°C;

f) evaporazione a secco sotto vuoto del concentrato;

g) dissoluzione del residuo in un piccolo volume di metanolo;e h) trattamento della soluzione con una quantità di cloruro di metilene sufficiente per la precipitazione del principio attivo.

Si ottiene un abbondante precipitato rossastro, solubile in acqua e insolubile in tutti i solventi aprotici, dotato di attività anti-virale. Questo prodotto può essere usato come tale o frazionato ulteriormente su colonna,per esempio di Sephadex LH 20 o su matrici equivalenti, secondo il criterio seguente: l'estratto sciolto in etanolo 95% viene fatto assorbire sulla matrice eluendo successivamente con lo stesso solvente le sostanze indesiderate a basso peso molecolare; l'eluizione si continua con miscele di etanolo/acqua, preferibilmente comprese fra il 30 e 60% in solvente organico o meglio con miscele di acetone/acqua sempre comprese fra il 29 e il 70% in solvente organico,preferibilmente fra il 35 e 45%. Gli éluati idroalcolici o idroacetonici che vengalo raccolti in frazioni che, dopo il loro controllo per gel permeation, sono raggruppate in base al peso molecolare simile e vengono concentrate fino ad eliminazione del solvente e liofilizzate. Sono risultate particolarmente attive le frazioni conpesi molecolari compresi fra 1500 e 2500 daltons, preferibilmente con peso molecolare intorno a 2100 daltons.

Alternativamente la soluzione acquosa, dopo estrazione con etile acetato (vedere punto c) precedente)può essre estrata con miscele di nbutanolo/toluene, preferibilmente in rapporto 9:1; gli estratti butanolici possono successivamente essere purificati secondo le modalità più sopra descritte.

L'attività antivirale è stata testata con metodi classici riportati in letteratura o in parte modificati dalla richiedente. A titolo di esempio, cellule di scimmia (African green monkey cells (VERO) Flow Laboratories Ltd. Irvine, Scotland) sono coltivate in mezzo TC-199 contenente 1% di glutammina addizionato di siero di vitello (5% nelle culture non infettate e 2,5% in quelle infettate) contenente o no il virus in esame ed in presenza o meno della sostanza attiva da esaminare.

Per la valutazione degli estratti della presente invenzione sono stati effettuati due diversi tipi di controlli, uno relativo all'attività antivirale vera e propria ed uno sulla citotossicità delle sostanze,in modo da definire il rapporto attività/tossicità.Le Cellule VERO sono state seminate a 2x10<-4 >su piastra; dopo 24 ore di incubazione i monostrati cellulari sono stati infettati con il virus prescelto ed immediatamente dopo trattati con concentrazioni scalari dei derivati di Piliostigma thonningii; dopo 24 ore essi sono stati valutati al microscopio per l'attività specifica.

Per la valutazione della citotossicità le cellule VERO sono seminate ad una concentrazione di 1 x 10<5>; dopo 24 ore le cellule sono liberate del mezzo di coltura, che viene a sua volta sostituito con mezzo di coltura contenente diverse concentrazioni degli estratti da testare.Dopo 48 ore le cellule sono fissate con 1% di aldeide glutarica in soluzione di Hank. Le piastre vengono lavate con acqua deionizzata per 15 minuti ed essiccate all'aria; il colorante (cristalvioletto) assorbito sulle cellule viene estratto con una soluzione allo 0,2% di Triton X-1002 e controllato allo spettrofotometro. Più agevolmente la citotossicità è stata saggiata incubando le cellule come più sopra indicato ad una densità di 2 x 10<4 >per pozzetto; dopo 24 ore il mezzo viene rimosso e le cellule sono trattate con le sostanze in esame; dopo 48 ore di incubazione le cellule sono addizionate di 0,5 nCi/piastra di <3>H-timidina. Le cellule sono ulteriormente incubate per altre 16 ore in atmosfera di CO2, procedendo poi alla quantificazione dell'incorporazione con uno scintillatore. In questo modo si è calcolata la CC50 (concentrazione che riduce l'uptake della timidina del 50% rispetto ai controlli).

Lo screening dei derivati del Piliostigma thonningii ha permesso di identificare sostanze dotate di attività antivirale sui virus erpetici umani (Herpes simplex 1 e 2), sul citomegalovirus e su HSV-1 e HSV-2; gli estratti si sono dimostrati attivi inoltre su differenti ceppi di virus influenzale e sinciziale. A titolo di esempio, sui virus erpetici, impiegando l'estratto non ancora frazionato (Esempio I) a una concentrazione corrispondente a 15,6 ug/ml si è avuta una riduzione del 100% nella formazione delle placche verso i controlli e una citotossicità di 62,5 ug/ml; il rapporto attività/citotossicità è nettamente a favore dell'attività, per cui il prodotto ha un valido indice terapeutico.La EC50 dello stesso prodotto sulla replicazione dei virus HSV-1 e HSV-2 è risultata rispettivamente di 22,4 e 36,2 ug/ml. Le frazioni di questo estratto, quali quelle riportate negli esempi III e IV,presentano un’attività specifica superiore a quella dell'estratto di partenza, incrementando inoltre positivamente il rapporto attività/tossicità. Le EC50 verso i virus erpetici sono state, per esempio, rispettivamente di 5,1 e 6,4 ug/ml con una citotossicità superiore a 100 ug/ml.

Sul virus para-influenzale gli estratti dell'invenzione hanno dimostrato in tutti i test un'attività sorprendentemente elevata, dimostrando così di essere validi per il trattamento delle forme influenzali più diverse.

Per quanto concerne il meccanismo di azione o la sicura identificazione dei principi attivi poco si conosce fino a questo memento. I principi attivi degli estratti della presente invenzione, in parte di natura polifenolica, risulterebbero attivi (virus HIV) nel ridurre l'espressione dell'antigene in coltura e nella riduzione dei sincizi. In questo senso è stato osservato che gli estratti sono particolarmente attivi sui vari modelli cellulari impiegati quando il prodotto viene aggiunto alla coltura in concomitanza del virus e non ad ingresso avvenuto. Questi dati fanno pensare, senza che tale interpretazione invalidi l'invenzione, che l'estratto o le sue frazioni agiscano sulle prime fasi dell'infezione, sebbene non si escluda che la loro attività possa inibire l'azione enzimatica della transcriptasi inversa e/o delle proteasi.

Gli estratti dell’invenzione sono risultati attivi nell'uomo a partire da dosi da 10 mg a 5 g die, a seconda della via di somministrazione e della gravità della patologia da trattare. Per il trattamento dell'herpes, gli estratti e le loro frazioni possono essere somministrati in unguenti o formulazioni per uso topico come si richiede per questo tipo di terapia o per via orale o intravenosa;per tutti gli altri tipi di virus, gli estratti vengono prevalentemente somministrati per via orale, intravenosa o in aerosol semplicemente sciolti in acqua o veicolati dai comuni eccipienti.

Secondo un ulteriore oggetto della presente invenzione, le formulazioni orali degli estratti dell'invenzione sono veicolate in fosfolipidi sia naturali sia sintetici. Di preferenza il rapporto tra fosfolipide ed estratto (o frazioni dell'estratto) varia da una parte in peso fino a tre parti; le miscele di questi estratti con fosfolipidi sono normalmente/preferibilmente somministrate in capsule di gelatina molle in presenza di veicoli quali il migliol ecc. oppure in capsule di gelatina dura o in compresse.

Gli estratti, dell'invenzione possono essere usati per il trattamento di tipo acuto o cranico a seconda della patologia; sia l'estratto sia le sue frazioni non danno luogo ad effetti tossici di particolare rilevanza fino a 5 g/kg nel ratto e nel topo quando somministrati per via orale,mentre sono tollerati fino a 500 mg/kg quando somministrati per via endovenosa.

Gli esempi sotto riportati illustrano l'invenzione senza tuttavia limitarla.

ESEMPIO I - Preparazione dell'estratto totale depurato di corteccia della radice di Piliostigma thonningii.

5 kg di corteccia della radice di Piliostigma thonningii finemente macinata sono estratti a 40°C con 10 volumi di una miscela di acetone/ acqua 60% (p/p); si effettua l'estrazione sotto agitazione e si ripete per tre volte. Si concentrano gli estratti idroacetonici fino alla completa eliminazione dell'acetone; durante la concentrazione si ha precipitazione di materiali insolubili in acqua che vengono accuratamente eliminati per centrifugazione. Dopo estrazione con acetato d'etile, la soluzione acquosa limpida viene fatta passare molto lentamente attraverso una colonna contenente 5 kg di resina di assorbimento XAD4; dopo passaggio dell'estratto si continua l'eluizione della colonna con acqua demineralizzata fino ad acqua incolore o comunque con residuo inferiore allo 0,001%. Successivamente si eluisce la resina con acetone acquoso al 40%. Si continua l'eluizione fino a liquido scolorato. Si concentra l'eluato della colonna fino a 5L ad una temperatura non superiore a 40°C; si filtra il concentrato per l'eliminazione di eventuali residui insolubili e si atomizza. Si ottengono 250 g di estratto secco che possono essere utilizzati come tali o ripurificati secondo l'Esempio II. Questo estratto ha una El% 690 a 260 nm in MeCH. Il prodotto è liberamente solubile in acqua, in alcol, in acetone e insolubile nei solventi clorurati e negli eteri. Esso può essere impiegato per il trattamento di affezioni di natura virale.

ESEMPIO II - Purificazione dell'estratto di Piliostigma thonningii.

200 g dell'estratto di Piliostigma thonningii preparato secondo l'Esempio I vengono sciolti in 1L di acetone anidro e, a solubilizzazione completa, versati sotto forte agitazione in 5 litri di cloruro di metilene; si forma un abbondante precipitato che viene raccolto per centrifugazione, lavato ulteriormente con cloruro di metilene fino ad acque di lavaggio incolori e infine essiccato sotto vuoto a 40°C fino a completa eliminazione del solvente. Si ottengono 170 g di un composto rossastro che può essere utilizzato nel trattamento delle affezioni virali.

La SEC-Chromatography dell'estratto ha il profilo riportato nella Figura allegata.

ESEMPIO III - Frazionamento dell'estratto di corteccia della radice di Piliostigma thonningii.

20 g di estratto preparato secondo gli Esempi I o II vengono sciolti in 500 mi di etanolo 95% e cromatografati su ima colonna contenente 350 g di Sephadex LH20 previamente stabilizzato con lo stesso solvente. Dopo assorbimento della soluzione si eluisce la colonna con etanolo fino all’esaurimento in sostanze eluibili. L'eluato etanolico viene eliminato mentre la colonna è eluita successivamente con acetone acquoso al 40%. Si concentra sotto vuoto la soluzione idroacetonica fino a 200 mi e si liofilizza il concentrato. Si ottengano 6 g di un prodotto rosso-mattone avente peso molecolare medio di 2018 che si può utilizzare senza ulteriori purificazioni come agente antivirale.

ESEMPIO IV - Preparazione di un estratto di Piliostigma thonningii da corteccia del tronco.

5 kg finemente macinati di corteccia del tronco di Piliostigma thonningii vengono estratti secondo le modalità dell'Esempio I; il concentrato acquoso dopo filtrazione dei materiali insolubili viene estratto con 20L di etile acetato; la fase organica viene eliminata mentre quella acquosa viene estratta con una miscela di nbutanolo/toluene 95:5 fino all'esaurimento delle sostanze estraibili con questo solvente. Gli estratti riuniti vengono disidratati su Na2SO4 e concentrati sotto vuoto fino ad 1L. Il concentrato viene versato sotto forte agitazione in 5L di cloruro di metilene. Si raccoglie il precipitato formatosi che dopo accurato lavaggio con cloruro di metilene si essicca sotto vuoto a 40°C. Si ottengono 150 g di prodotto risultato dotato di attività antivirale. Questo prodotto può essere purificato ulteriormente secondo le modalità dell'Esempio III.

ESEMPIO V - Formulazione a base di estratto di Piliostigma thonningii per uso topico.

20 g di estratto purificato di Piliostigma thonningii preparato secondo l'Esempio III vengano mescolati con 40 g di fosfatidilcolina soia ed il tutto solubilizzato in 600 mi di una miscela di cloruro di metilene/metanolo 9:1; a solubilizzazione completa dei due prodotti si elimina il solvente sotto vuoto. Il solido ottenuto viene microdisperso sotto forte agitazione in 1200 mi di acqua deionizzata. Si gelifica la microdispersione acquosa per aggiunta dell'1% di carbossimetilcellulosa. Questo gel acquoso trova applicazione nel trattamento topico di forme erpetiche.

ESEMPIO VI - Preparazione di capsule di gelatina molle contenenti 150 mg di frazione purificata di Piliostigma thonningii.

20 g di estratto purificato di Piliostigma thonningii preparato secondo l'Esempio III vengono mescolati con 40 g di fosfatidilcolina da soia ed il tutto solubilizzato in 600 mi di una miscela di cloruro di metilene metanolo 9:1; a solubilizzazione completa dei due prodotti si elimina il solvente sotto vuoto. Si sospende il solido ottenuto in 180 mi di migliol e si incapsula in capsule di gelatina molle in ragione di 450 mg di miscela estratto/fosfolipide.

Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la preparazione di estratti di Piiiostigma thonningii,che comprende i seguenti stadi: a) eliminazione del solvente mediante concentrazione a te mperatura inferiore a 40°C; b) filtrazione o centrifugazione per eliminare i residui gommosi di sostanze indesiderate formatesi nell'eliminazione del solvente organico; c) estrazione dell'estratto acquoso limpido con etile acetato fino al completo esaurimento delle sostanze estraibili, ed eliminazione degli estratti organici; d) cromatografia della fase acquosa su una colonna di resina di adsorbimento; rieluendo con alcoli o chetoni alitatici a basso peso molecolare diluiti con acqua; e) concentrazione parziale dell'eluato della colonna sotto vuoto e a temperature non superiori a 60°C; f) evaporazione a secco sotto vuoto del concentrato; g) dissoluzione del residuo in un piccolo volume di metanolo;e h) trattamento della soluzione con una quantità di cloruro di metilene sufficiente per la precipitazione del principio attivo.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui l'estrazione dello stadio d) viene effettuata con miscele di n-butanolo/toluene in rapporto 9:1.
3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la rieluizione dello stadio d)viene effettuata con acetone acquoso al 40%.
4. 4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui l'estrazione dello stadio c) viene effettuata con etile acetato.
5. 5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la concentrazione dello stadio e)avviene a temperature non superiori a 60°C.
6. 6. Estratti di Piiiostigma thonningii ottenuti secondo i procedimenti descritti nelle rivendicazioni 1-5.
7. 7. Procedimento per la preparazione di frazioni dell'estratto ottenibile con il procedimento secondo le rivendicazioni 1-5, in cui l'estratto viene frazionato ulteriormente su colonna, secondo i seguenti stadi: i) dissoluzione dell'estratto in etanolo 95%; l) assorbimento sulla matrice; m) eluizione delle sostanze indesiderate a basso peso molecolare con etanolo 95%; n) successiva eluizione con miscele di etanolo/acqua o con miscele di acetone/acqua; o) raggruppamento delle frazioni in base al loro peso molecolare, concentrazione e liofilizzazione.
8. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui la matrice dello stadio 1)è Sephadex LH 20.
9. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui, nello stadio n), le miscele di etanolo/acqua sono utilizzate in concentrazioni fra 30 e 60% in solvente organico e le miscele di acetone/acqua a concentrazioni tra 29 e 70%,preferibilmente fra 35 e 45% in solvente organico.
10. 10. Frazioni di estratti ottenute secondo il procedimento delle rivendicazioni 7-9, aventi pesi molecolari compresi fra 1500 e 2500 daltons.
11. 11. Composizioni farmaceutiche per il trattamento di affezioni erpetiche, di immunodeficienza acquisita legata al virus HIV, di influenza e raffreddore, contenenti cane principio attivo gli estratti secondo la rivendicazione 6.
12. 12. Composiziani farmaceutiche per il trattamento di affezioni erpetiche, immunodeficienza acquisita legata al virus HIV, influenza e raffreddore, contenenti come principio attivo le frazioni di estratti secondo la rivendicazione 10.
13. 13. Composizioni farmaceutiche secondo le rivendicazioni 11 e 12,contenenti come veicoli fosfolipidi sia naturali sia sintetici.
14. 14. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 13, in cui il rapporto tra fosfolipide e principio attivo è da 1 a 3 parti in peso.
15. 15. Uso degli estratti secondo la rivendicazione 6 per la preparazione di medicamenti ad attività antivirale.
16. 16. Uso delle frazioni secondo la rivendicazione 10 per la preparazione di medicamenti ad attività antivirale.