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ITMI940717A1 - PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS WITH ANTI-TOXIC ACTIVITY - Google Patents

PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS WITH ANTI-TOXIC ACTIVITY Download PDF

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ITMI940717A1
ITMI940717A1 IT000717A ITMI940717A ITMI940717A1 IT MI940717 A1 ITMI940717 A1 IT MI940717A1 IT 000717 A IT000717 A IT 000717A IT MI940717 A ITMI940717 A IT MI940717A IT MI940717 A1 ITMI940717 A1 IT MI940717A1
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IT
Italy
Prior art keywords
glutathione
pharmaceutical compositions
transferase
compositions according
glutathicne
Prior art date
Application number
IT000717A
Other languages
Italian (it)
Inventor
Giorgio Federici
Maria Zirulia
Original Assignee
Bioindustria Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE AD ATTIVITA ANTITOSSICA" Description of the industrial invention entitled: PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS WITH ANTI-TOXIC ACTIVITY "

L'oggetto della presente invenzione è costituito da conposizioni farmaceutiche ad attività antitossica, caratterizzate dal fatto che in qualità di principio attivo contengono un'associazione di glutaticne ridotto e di giutatione trasferasi. The object of the present invention consists of pharmaceutical compositions with antitoxic activity, characterized in that as an active principle they contain an association of reduced glutathione and jutathione transferase.

Il glutatione è un fattore inportante nel metabolismo di molte sostanze tossiche sia endogene che esogene. La alchilazione da parte del glutatione di metaboliti o composti esogeni elettrofili, e la riduzione di specie chimiche ossidanti altamente reattive, sono due delle funzioni esercitate dal glutatione nella protezione della cellula o dei tessuti. E' noto l'uso in terapia di preparati a base di glutaticne che agiscono fornendo all'organismo la possibilità di ripristino dei livelli di glutaticne scesi per effetto delle sostanze tossiche al di sotto dei livelli-soglia. In particolare si può prospettare un uso del glutatione ridotto in numerose forme patologiche o’in varie situazioni a rischio: epatopatie croniche di varia eziologia; Glutathione is an important factor in the metabolism of many toxic substances, both endogenous and exogenous. The alkylation by glutathione of metabolites or electrophilic exogenous compounds, and the reduction of highly reactive oxidizing chemical species, are two of the functions exerted by glutathione in protecting the cell or tissues. The use in therapy of glutathicne preparations is known, which act by providing the body with the possibility of restoring the levels of glutathicne which have fallen due to the effect of toxic substances below the threshold levels. In particular, a reduced use of glutathione can be envisaged in numerous pathological forms or in various risk situations: chronic liver diseases of various etiologies;

prevenzione e terapia di danni a livello cerebrale, epatico, renale o sistemico determinati da vari tipi di farmaci; prevention and therapy of brain, liver, kidney or systemic damage caused by various types of drugs;

- prevenzione e terapia di danni ed effetti collaterali a seguito di terapia antiblastica o di terapia radiante. - prevention and therapy of damage and side effects following antiblastic therapy or radiation therapy.

Tuttavia l'efficacia dei detti preparati è in molti casi insoddisfacente. Si è ora sorprendentemente trovato che un'associazione di giutaticne ridotto e di glutaticne trasferasi (in particolare glutaticne trasferasi acida) esercita un’azione protettiva sinergica, tale da rendere le composizioni farmaceutiche secondo l'invenzione sensibilmente più efficaci rispetto a quelle note. However, the effectiveness of said preparations is in many cases unsatisfactory. It has now surprisingly been found that an association of reduced jutathic and glutathic acid transferase (in particular glutathic acid transferase) exerts a synergistic protective action, such as to make the pharmaceutical compositions according to the invention significantly more effective than the known ones.

La cosiddetta "glutatione trasferasi" è rappresentata in realtà da una famiglia di isoenzimi con caratteristiche chimico-fisiche diverse. Seno infatti presenti quattro classi di isoenzimi: alfa, mu, Pi e Teta, che presentano, pur deputate tutte alle reazioni di detossifreazione, caratteristiche molecolari e funzionali diverse tra di loro. In particolare l'isoenzima Pi, con punto isoelettrico acido, è la forma presente nella maggior parte dei tessuti umani ed anche in quelli fetali, tuttavia in concentrazioni plasmatiche molto basse (circa 1-2 ng/ml). Essa è isolabile da placenta umana seguendo uno schema classico di purificazione descritto in letteratura. The so-called "glutathione transferase" is actually represented by a family of isoenzymes with different chemical-physical characteristics. In fact, there are four classes of isoenzymes: alpha, mu, Pi and Theta, which, although all of them are involved in detoxification reactions, have different molecular and functional characteristics. In particular, the isoenzyme Pi, with an acid isoelectric point, is the form present in most human tissues and also in fetal ones, however in very low plasma concentrations (about 1-2 ng / ml). It can be isolated from human placenta following a classical purification scheme described in the literature.

Una placenta a termine, lavata con soluzione fisiologica, ed eventualmente conservata a -20°C anche per molti mesi, viene omogenata in tampone fosfato di potassio pH 6,5 contenente glutatione ridotto (Sigma, St.Louis, USA) 1 mM ed EDTA anch'esso 1 mM. L'omogenato viene centrifugato a 10.000 x g per 30 minuti ed il super atante conservato. Si procede ad un lavaggio del precipitato con lo stesso tampone e dopo ulteriore centrifugazione i due super atanti seno uniti e dializzati contro lo stesso tampone fosfato privo di glutatione. A term placenta, washed with physiological solution, and possibly stored at -20 ° C even for many months, is homogenized in potassium phosphate buffer pH 6.5 containing reduced glutathione (Sigma, St. Louis, USA) 1 mM and EDTA also 1 mM. The homogenate is centrifuged at 10,000 x g for 30 minutes and the super atant is preserved. The precipitate is washed with the same buffer and after further centrifugation the two superatants are united and dialyzed against the same glutathione-free phosphate buffer.

L'omogenato chiarificato (circa 1500 mi) viene passato attraverso una colonna di affinità di epossi-sefarosio attivato con glutatione (dimensioni di 2,5 x 8 cm) ed equilibrata con lo stesso tampone di dialisi. Dopo lavaggio della colonna con il tampone di equilibratura la glutatione trasferasi legata viene eluita con tampone TRIS-HCl 10 nM pH 9,2 contenente glutatione 5 nM. Concentrata per ultrafiltrazione e dializzata la glutatione trasferasi così ottenuta è omogenea in elettroforesi su gel di poliacrilamide e presenta tutte le caratteristiche catalitiche e chimico-fisiche descritte in letteratura. The clarified homogenate (approximately 1500 mL) is passed through a glutathione-activated epoxy-sepharose affinity column (size 2.5 x 8 cm) and equilibrated with the same dialysis buffer. After washing the column with the equilibration buffer, the bound glutathione transferase is eluted with 10 nM pH 9.2 TRIS-HCl buffer containing 5 nM glutathione. Concentrated by ultrafiltration and dialyzed, the glutathione transferase thus obtained is homogeneous in polyacrylamide gel electrophoresis and has all the catalytic and physico-chemical characteristics described in the literature.

La rasa media della preparazione è di circa 10-15 mg di enzima per kg di placenta umana. The average rasa of the preparation is about 10-15 mg of enzyme per kg of human placenta.

Per lo studio dell'effetto protettivo è stato scelto un modello di intossicazione acuta da brcmobenzene, che è noto causare necrosi epatica,e cane marker del danno epatico sono stati misurati i livelli plasmatici di AST (aspartato aminotrasferasi) e di ALT {alanina aminotrasferasi). A model of acute brchmobenzene intoxication, which is known to cause hepatic necrosis, was chosen for the study of the protective effect, and plasma levels of AST (aspartate aminotransferase) and ALT (alanine aminotransferase) were measured. .

Conigli albini, dopo alimentazione ad libitum per una settimana, sono stati mantenuti a digiuno durante la notte e quindi utilizzati per la sperimentazione. Il bromobenzene è stato preparato miscelandolo con tre volumi di olio d'oliva e quindi è stato sonninistrato per via orale ad una concentrazione di 10 mmoli per kg di peso corporeo. Il glutatione ridotto e la glutatione trasferasi seno stati preparati in forma liofila e ripresi con acqua bidistillata apirogena in soluzione contenente, rispettivamente, 10 mg di glutatione ridotto e 10 mg di glutatione ridotto più 10 microgrammi di glutatione trasferasi da placenta umana. Albino rabbits, after ad libitum feeding for one week, were fasted overnight and then used for experimentation. Bromobenzene was prepared by mixing it with three volumes of olive oil and then administered orally at a concentration of 10 mmol per kg of body weight. The reduced glutathione and glutathione transferase were prepared in lyophilic form and taken up with apyrogenic double distilled water in a solution containing, respectively, 10 mg of reduced glutathione and 10 mg of reduced glutathione plus 10 micrograms of glutathione transferase from human placenta.

Tre gruppi di 6 conigli ciascuno sono stati trattati nel modo seguente: Three groups of 6 rabbits each were treated as follows:

1° gruppo: trattato con solo bromobenzene; 1st group: treated with bromobenzene only;

2° gruppo: trattato con bromobenzene e con iniezione di glutatione al tempo zero e dopo sei ore; 2nd group: treated with bromobenzene and with glutathione injection at time zero and after six hours;

3° gruppo: trattato con bromobenzene e con iniezione di glutatione e glutatione trasferasi al tempo zero e dopo sei ore; 3rd group: treated with bromobenzene and with injection of glutathione and glutathione transferase at time zero and after six hours;

Al tenpo zero e dopo 3 ore, 6 ore, 9 ore e 12 ore sono stati eseguiti prelievi di sangue periferico dalla vena del lobo dell’orecchio. La stessa vena è stata utilizzata per la somministrazione del glutatione e del glutatione addizionato di glutatione trasferasi. Il sangue prelevato dopo opportuno sieraggio è stato utilizzato per la determinazione delle attività delle transaminasi con una metodica U.V.NADH dipendente. At zero time and after 3 hours, 6 hours, 9 hours and 12 hours, peripheral blood samples were taken from the earlobe vein. The same vein was used for the administration of glutathione and glutathione added with glutathione transferase. The blood taken after an appropriate serum was used for the determination of the transaminase activities with a U.V.NADH dependent method.

Nella tabella sono riportati i valori ottenuti,espressi cane UI/1. Da questi risultati risulta evidente cane esista una azione protettiva sinergica esercitata dall'associazione glutatione ridotto- glutaticne trasferasi. The table shows the values obtained, expressed as IU / 1. From these results it is evident that there is a synergistic protective action exerted by the reduced glutathione-glutaticne transferase association.

L'associazione sopra descritta è quindi suscettibile di inpiego per una migliore protezione dell'organismo sia in epatopatie di varia eziopatogenesi,che per possibili danni renali, epatici, neurologici ed ematologiei determinati da livelli anche bassi di vari xenobiotici, ed inoltre in qualsiasi situazione fisiopatologica nella quale sia richiesta una protezione esercìtabile mediante reazioni di coniugazione al glutatione. The association described above is therefore susceptible of use for a better protection of the organism both in hepatopathies of various etiopathogenesis, and for possible renal, hepatic, neurological and haematological damage caused by even low levels of various xenobiotics, and also in any pathophysiological situation. in which protection is required which can be exercised through conjugation reactions to glutathione.

Quantunque l'invenzione sia stata esemplificata ccn specifico riferimento all'impiego di glutatione trasferasi Pi, è chiaro che essa può venire attuata anche impiegando altre glutatione trasferasi (e loro miscele), ottenute siaper estrazione sia con procedimenti biotecnologici. Although the invention has been exemplified with specific reference to the use of glutathione transferase Pi, it is clear that it can also be carried out using other glutathione transferases (and their mixtures), obtained both by extraction and by biotechnological processes.

L’associazione glutatione ridotto-glutatione trasferasi può essere utilizzata in conposizioni farmaceutiche per somministrazicne intramuscolare, endovenosa e per aerosol. The reduced glutathione-glutathione transferase association can be used in pharmaceutical compositions for intramuscular, intravenous and aerosol administration.

Nella somministrazione endovenosa il preparato può essere aggiunto a soluzioni perfusionali quelli gluoosale, fisiologiche, elettrolitiche. In intravenous administration, the preparation can be added to perfusional solutions, those gluoosal, physiological, electrolytic.

Si riportano a titolo illustrativo alcuni esempi di formulazioni farmaceutiche secondo l ' invenzione . Some examples of pharmaceutical formulations according to the invention are reported by way of illustration.

Le quantità in peso dei conponenti attivi nelle varie fonte oscillano fra i 100 e i 600 mg per il glutaticne ridotto e fra i 10 e i 100 mcg per la glutatione transferasi. The quantities by weight of the active components in the various sources range between 100 and 600 mg for reduced glutathione and between 10 and 100 mcg for glutathione transferase.

Esempio 1 Example 1

Fiale per uso intramuscolare o endovenoso. Ampoules for intramuscular or intravenous use.

Ogni fiala liofilizzata contiene: Each lyophilized vial contains:

Esempio 2 Example 2

Fiale per uso intramuscolare o endovenoso. Ampoules for intramuscular or intravenous use.

Ogni fiala liofilizzata contiene: Each lyophilized vial contains:

Esempio 3 Example 3

Fiale per uso intramuscolare o endovenoso. Ampoules for intramuscular or intravenous use.

Ogni fiala liofilizzata contiene: Each lyophilized vial contains:

Esempio 4 Example 4

Spray nasale. Nasal spray.

1 mi di soluzione contiene: 1 ml of solution contains:

Claims (6)

RIVENDICAZIONI 1. Composizioni farmaceutiche ad attività antitossica caratterizzate dal fatto che in qualità di principio attivo contengono un’associazione di glutaticne ridotto e di glutaticne trasferasi. CLAIMS 1. Pharmaceutical compositions with antitoxic activity characterized by the fact that as an active ingredient they contain an association of reduced glutathicne and glutathicne transferase. 2. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 1, da inpiegarsi in epatopatie di varia eziopatogenesi, per possibili danni renali, epatici, neurologici ed ematologici determinati da livelli anche bassi di vari xenobiotici, ed inoltre in qualsiasi situazione fisiopatologica nella quale sia richiesta una protezione esercitabile mediante reazioni di coniugazione al glutatione. 2. Pharmaceutical compositions according to claim 1, to be used in hepatopathies of various etiopathogenesis, for possible renal, hepatic, neurological and haematological damage caused by even low levels of various xenobiotics, and furthermore in any physiopathological situation in which a protection that can be exercised by means of conjugation reactions to glutathione. 3. Composizioni farmaceutiche secondo le rivendicazioni 1 e 2,caratterizzate dal fatto che in qualità di glutatione trasferasi contengono glutatione trasferasi Pi. 3. Pharmaceutical compositions according to claims 1 and 2, characterized in that as glutathione transferase they contain glutathione transferase Pi. 4. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 3, caratterizzate dal fatto che la glutaticne trasferasi Pi è ottenuta da placenta umana 4. Pharmaceutical compositions according to claim 3, characterized in that the glutathicne transferase Pi is obtained from human placenta 5. Composizioni farmaceutiche secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, caratterizzate dal fatto che contengano da 100 a 600 mg di glutatione ridotto e da 10 a 100 mcg di glutatione trasferasi per dose unitaria. 5. Pharmaceutical compositions according to any one of the preceding claims, characterized in that they contain from 100 to 600 mg of reduced glutathione and from 10 to 100 mcg of glutathione transferase per unit dose. 6. Composizioni farmaceutiche secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, sotto forma di fiale per uso intramuscolare o endovenoso e di spray nasale. 6. Pharmaceutical compositions according to any one of the preceding claims, in the form of ampoules for intramuscular or intravenous use and of a nasal spray.
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