ITMI940418A1 - Procedimento per la conversione della cefalosporina c in acido glutaril - 7 amminocefalosporanico - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO: ''PROCEDIMENTO PER LA CONVERSIONE DELLA CEFALOSPORI-NA C IN ACIDO GLUTARIL-7-AMMINOCEFALOSPORANICO"
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un migliorato procedimento di ossidazione enzimatica per la conversione della Cefalosporina C in Acido
glutaril-7-aminocefalosporanico (glutaril-7-ACA ) comprendente l’uso di una miscela contenente
D-aminoacido-ossidasi (miscela contenente DAO).
Più precisamente, l’attività esterasica della miscela contenente DAO, usata in questo procedimento, è stata selettivamente ridotta.
Il glutaril-7-ACA è un prodotto intermedio nella preparazione dell’acido 7-aminocefalosporanico (7-ACA ) dalla Cefalosporina C.
La Cefalosporina C reagisce con la D-aminoacidoossidasi (nel seguito DAO) per produrre l’acido α-keto-adipoil-7-ami nocefalosporanico (α-keto adipoil-7-ACA ), il quale è un intermedio termicamente instabile, e perossido di idrogeno, quindi il α-keto-adipoil-7-ACA viene ossidato dal perossido di idrogeno in glutaril-7-ACA.
Allo scopo di ottenere una più alta resa di glutaril -7-ACA, sono stati sviluppati vari procedimenti enzimatici per convertire la Cefalosporina C in glutaril-7-ACA, usando la DAO derivata da Trigonopsis variabilis (nel seguito T.variabilis) .
Per esempio, il Brevetto U.S.A. No. 3,821,209, la Pubblicazione di Brevetto giapponese No.
35119/1980 e No. 15635/1984 descrivono procedimenti di ossidazione enzimatica ottenuti, rispettivamente, in presenza di inibitori della catalasi, come le azidi inorganiche e il perborato, e un eccesso di perossido di idrogeno, per evitare la decomposizione del perossido di idrogeno da parte della catalasi.
Il Brevetto U.S.A. No. 3,801,458 descrive un’ossidazione enzimatica della Cefalosporina C con l’uso di cellule attivate di T. variabilis con un inibitore della catalasi, la sodio azide, al fine di ottenere una buona resa di glutaril-7-ACA. La pubblicazione senza esame di Brevetto Europeo, No.
409,521 descrive un procedimento per l’inattivazione della catalasi, in presenza di DAO, trattando gli enzimi con una soluzione acquosa basica, con pH da circa 11 a 12, prima della ossidazione enzimatica della Cefalosporina C in glutaril-7-ACA.
Comunque, questi procedimenti hanno degli svantaggi quali la riduzione della resa dovuta alla
esterasi di T. variabilis e il deterioramento della qualità dovuto ad impurità, come gli inibitori della catalasi, quando essi sono applicati alla pratica economica su scala industriale. L’esterasi è un enzima che converte la Cefalosporina C, glutaril-7-ACA e α-ketoadipoyl-7-ACA nelle loro forme 3-desacetilate. Tali derivati desacetilati non solo riducono la resa di glutaril-7-ACA , ma deteriorano anche la qualità di glutaril-7-ACA come impurità.
Perciò, allo scopo di migliorare la resa e la qualità di glutaril-7-ACA, è molto importante inattivare o inibire l’attività esterasica.
La pubblicazione senza esame di Brevetto Europeo, No.
409,521: . descrive pure un procedimento per· inattivare l’attività esterasica trattando le cellule di T. variabilis con acetone/acqua al fine di evitare la produzione di Cefalosporina C desacetilata e di glutaril-7-ACA desacetilato.
Comunque,il procedimento descritto richiede una tappa complicata e difficilie per rimuovere
l’acetone .
C’era quindi un grande bisogno di un procedimento semplice e più efficiente per inattivare l’esterasi, applicabile su scala industriale.
La presente invenzione riguarda un migliorato procedimento enzimatico di ossidazione per la conversione della Cefalosporina C in glutaril -7-ACA, comprendente l’uso di una miscela contenente DAO la cui attività esterasica è 5% circa o meno dell’attività della DAO. Nel procedimento della presente invenzione, la miscela contenente DAO, la cui attività esterasica è minore o inibita, è stata ottenuta per contatto della miscela con un composto del rame.
Nel procedimento della presente invenzione, la suddetta miscela contenente DAO è anche ottenuta da un mutante avente un’attività esterasica del 5% o meno, basata sulla attività della propria DAO, il quale è ottenuto trattando un microrganismo, capace di produrre la DAO, con radiazioni ultraviolette, raggi X e un agente mutageno. Secondo il procedimento della presente invenzione, la resa eccellente di glutaril-7-ACA può essere raggiunta con alti livelli di qualità. Inoltre il procedimento della presente invezione prevede tappe semplici e sicure, tali da poter essere applicate su scala industriale. La presente invenzione riguarda un procedimento di ossidazione enzimatica per la conversione della Cefalosporina C in glutaril-7-ACA, comprendente l’uso di una miscela contenente DAO la cui attività esterasica è del 5% o meno dell’attività della DAO.
La Cefalosporina C usata nella presente invenzione è una soluzione acquosa di Cefalosporina C in polvere, o brodi di fermentazione di Cefalosporina C in cui cellule e solidi sono stati rimossi.
La Cefalosporina C è prodotta mediante coltura di cellule di Achremonium chrisogenum nel mezzo di coltura contenente il 2% di saccarosio, 3% di amido di cereali, 5% di melassa di barbabietola, 6% di soia sgrassata, 3% di metiloleato, 0.5% di carbonato di calcio, 1.25% di solfato di calcio e 0.8% di acetato d’ammonio e simili o in un mezzo nutriente di fermentazione.
La miscela contenente DAO usata nella presente invenzione include DAO, per es., DAO parzialmente purificata e DAO grezza, e mostra il 5% o meno di attività esterasica basata sull’attività della DAO. La miscela contenente DAO può essere usata in qualsiasi forma, come cellule intere, cellule parzialmente degradate, cellule permeabilizzate, estratti privi di cellule e enzima immobilizzato. Di questi, le cellule parzialmente distrutte, le cellule permeabilizzate, gli estratti privi di cellule e l’enzima immobilizzato sono quelli preferiti. Essi sono ottenuti con metodi
noti.
Nella presente invenzione si preferisce che la DAO provenga dal T. variabilis. Più preferibilmente, un mutante deficiente di catalasi come il ceppo T. variabilis KC-103 (depositato nell’Istituto Nazionale di Bioscienza e Tecnologia Umana, Agenzia di Scienza e Tecnologia Industriale come Deposito No. FERM BP-4359 ) è usato allo scopo di evitare che rimanga α-keto-adiposi-7-ACA.
Nella presente invenzione, la miscela contenente DAO, la cui attività esterasica è del 5% o meno dell’attività della DAO, è ottenuta per contatto della miscela con un composto del rame. L’attività esterasica della miscela è selettivamente ridotta per contatto della miscela contenente DAO con il composto del rame ad una concentrazione di 10 fino a 2000 ppm, basato sulla quantità totale di soluzione o sospensione acquosadella miscela contenente DAO a una temperatura da 5°a 25°
C per 2 fino a 24 ore.
Al fine di inattivare l’esterasi senza
intaccare l’attività della DAO, si preferisce che la concentrazione del composto del rame vada da 10 a 400 ppm. L’attività esterasica può
essere ridotta di un mezzo o più dal trattamento. Perciò, quando la miscela contenente DAO è ottenuta dal ceppo T. variabilis KC-103 avente un rapporto di attività esterasi/DAO di 9.1%, il rapporto di attività può essere ridotto al 4.5% o meno.
Nella presente invenzione, il composto del rame è messo in contatto con una miscela contenente DAO prima del procedimento di ossidazione enzimatica, cioè prima che sia aggiunta la Cefalosporina C. In alternativa, il composto del rame può essere messo in contatto con la miscela contenente DAO durante il procedimento di ossidazione enzimatica, cioè esso è aggiunto alla miscela di reazione contenente Cefalosporina C e la miscela contenente DAO. In quest’ultimo caso, la concentrazione del composto del rame è di 10 fino a 2000 ppm, basata sulla miscela di reazione. Un esempio rappresentativo del composto di rame usato nella presente invenzione è il CuSO4.
Nella presente invenzione, la miscela contenente DAO, la cui attività esterasica è del 5% o meno della attività della DAO, è anche ottenuta da
un mutante avente il 5% o meno di attività esterasica, basata sulla attività della propria DAO, la quale è ottenuta trattando un microrganismo, capace di produrre DAO, mediante radiazione ultravioletta, raggi X o un mutageno. Un simile mutante è ottenuto nel seguente modo.
Un ceppo genitore, capace di produrre DAO, è trattato con radiazione ultravioletta, raggi X o un mutageno come il N-metil-N’-nitro-N- nitrosoguanidina(NTG ), ed è quindi messo in coltura in un mezzo di fermentazione .
Il ceppo genitore che mostra una
ridotta attività esterasica è selezionato misurando l’attività esterasica.
Nella presente invenzione, si preferisce che come ceppo genitore sia unsato un mutante deficiente di catalasi o negativo, per evitare la formazione di sottoprodotti .
Un esempio rappresentativo del mutante è il ceppo T.variabilis EL-17 (depositato all’Istituto Nazionale di Bioscienza e Tecnologia umana, Agenzia di Scienza e Tecnologia Industriale come Deposito No. FERM BP-4467 ). Esso è ottenuto trattando il ceppo T. variabilis KC-103 con NTG. Π mutante ha il 3% dell’attività esterasica, basata sull’attività della DAO.
L’attività esterasica è misurata nel seguente modo. Un campione di enzima è aggiunto a tampone al fosfato 0.2M (pH 7.5) contenente 2g/l di glutaril-7-ACA, e essi sono fatti reagire a 25°C per
30 minuti. Alcool metilico nella stessa quantità della miscela di reazione è aggiunto per bloccare la reazione. La soluzione di reazione è sottoposta ad HPLC per determinare la quantità del
glutaril-7-ACA desacetilato prodotto.
L’attività della DAO è misurata nel seguente modo. Un campione di enzima è aggiunto a tampone al fosfato 0.1M (pH 7.5) contenente 10g/l di Cefalosporina C, ed essi sono fatti reagire a 25"C per 15 minuti.
Alcool metilico in pari quantità della miscela di reazione è aggiunto per bloccare la reazione. La soluzione di reazione è sottoposta ad HPLC per determinare la quantità di glutaril-7-ACA e di α-keto-adipoil-7-ACA prodotti.
Quando una miscela contenente DAO è messa in contatto con un composto del rame durante il procedimento di ossidazione enzimatica, la quantità totale di Cefalosporina C desacetilata e di glutaril-7-ACA dèsacetilato è misurata prima e dopo il procedimento di ossidazione enzimatica.
L’aumentata quantità dei derivati desacetilati rispetto all'ammontare iniziale di Cefalosporina C è considerata come rapporto di attività esterasi/DAO.
L’ossidazione enzimatica è solitamente effettuata insufflando ossigeno attraverso la soluzione di reazione a 20°fino a 30°C. Il tempo di reazione dipende dalla concentrazione della Cefalosporina C, dalla quantità e dalla attività della miscela contenente DAO e dalla temperatura di reazione.
Quando la quantità di glutaril-7-ACA prodotto ha raggiunto il massimo, il quale può essere determinato con HPLC o TLC o simili, la reazione può essere bloccata. La reazione è generalmente completa tra i 30 minuti e le 4 ore. Allo scopo di ridurre la quantità di α-keto-adipoil-7-ACA rimanente,alla miscela di reazione può essere aggiunto perossido di idrogeno.
Il glutaril-7-ACA è isolato dalla miscela di reazione ottenuta mediante metodi conosciuti.
La presente invenzione sarà illustrata più in particolare con riferimento ai seguenti
esempi non limitanti.
ESEMPIO 1
Il ceppo T. variabilis KC-103 è stato coltivato in un mezzo contenente il 2% di glucosio, 2% di liquido di macerazione di cereali e 0.2% di
DL-metionina a 25°Cper 60 ore. 0.3 ml di
toluene sono stati aggiunti a 60 ml di brodo di fermentazione includente 6g di cellule umide e essi sono stati mescolati a 25°C per 2 ore per permeabilizzare le cellule. 23.6mg di CuSO4.5H2O sono stati aggiunti al brodo di fermentazione ottenuto dalle cellule permeabilizzate e lasciati riposare a temperatura ambiente per 2 ore. Una quantità appropriata di campione di enzima, proveniente dal brodo di fermentazione contenente rame, è stata aggiunta a tampone al fosfato potassico (pH 7.5) contenente 2g/l di glutaril-7-ACA. La reazione è stata effettuata a 25°C per 30 minuti ed è stata bloccata aggiungendo alcool metilico in pari quantità della miscela di reazione, quindi sottoposta ad HPLC. Il glutaril-7-ACA desacetilato prodotto nella reazione non era misurabile, indicando che l’esterasi nel campione di enzima era sufficientemente inattivata.
10g di Cefalosporina C in polvere è stata disciolta in 1000 ml di acqua, e il pH è stato aggiustato a 7.5. La soluzione di Cefalosporina C ottenuta è stata mescolata con il brodo contenente
rame,ottenuto sopra, ed essi sono stati messi a reagire a 20 C per circa 180 minuti con ossigeno insufflato attraverso la miscela di reazione. La resa ottenuta di glutari-7-ACA è stata di 93.2%.
ESEMPIO 2
Un brodo di fermentazione delle cellule impermeabilizzate di ceppo T. variabilis KC-103, la cui attività esterasica era stata inattivata, è stato ottenuto con lo sesso metodo descritto
nell'esempio 1.
Un brodo di fermentazione di A. chrisogenum contenente 8.5g/l di Cefalosporina C è stato aggiustato a pH 2.5, quindi le cellule sono state rimosse dallo stesso. Il pH del brodo è stato aggiustato a 7.5.
1200ml del brodo ottenuto sono stati mescolati a 60 ml del brodo di fermentazione di T. variabilis ottenuto sopra. Mentre ossigeno era insufflato nella miscela di reazione e 23.9 ml di perossido di idrogeno al 3.5% venivano continuamente aggiunti alla miscela di reazione, la reazione è stata condotta a 20°C per circa 240 minuti. La resa in glutaril--7-ACA è stata del 92.8%
ESEMPIO 3
Un brodo di fermentazione di cellule
permeabilizzate di ceppo T. variabilis KC-103 è stato ottenuto con lo stesso metodo descritto nell’esempio 1. 10 g di Cefalosporina C in polvere è stata disciolta in 1000 ml di acqua, e il pH è stato aggiustato a 7.5. La soluzione di Cefalosporina C ottenuta è stata miscelata con 60 mi del brodo di fermentazione di T. variabilis ottenuto precedentemente.
Quindi, 0.5g di CuSO4.5H2O sono stati aggiunti alla miscela risultante.
La reazione è stata condotta a 20°C per circa 180 minuti, mentre ossigeno veniva insufflato nella miscela di reazione. La resa in glutaril-7-ACA è stata del 92.2%. L’aumentata quantità totale di Cefalosporina C desacetilata e di glutaril-7-ACA desacetilato è stata 1% o meno, calcolata sull’ammontare di Cefalosporina C.
ESEMPIO 4
Un brodo di fermentazione delle cellule
permeabilizzate di ceppo T. variabilis KC-103 è stato ottenuto con lo stesso metodo descritto nell’esempio 1. 60 ml del brodo di fermentazione di T. variabilis e 1200ml di brodo di fermentazione di A. chrisogenum contenente Cefalosporina C, ottenuto con lo stesso metodo descritto nell’esempio 2, sono stati mescolati. 0.5g di CuSO4.5H2O sono stati aggiunti alla miscela risultante e sono stati posti a reagire a 20°C per circa 240 minuti
mentre ossigeno vi veniva insufflato atteraverso e 23.9ml di perossido di idrogeno al 3.5% veniva continuamente aggiunto alla miscela di reazione. La resa di glutaril-7-ACA è stata del 92.0%.
L’aumentata quantità totale di Cefalosporina C desacetilata e di glutaril-7-ACA desacetilato è stata dell’1% o meno, calcolata sulla quantità di Cefalosporina C.
ESÈMPIO 5
400 ml di brodo di fermentazione di T. variabilis contenente 40g di cellule umide è stato ottenuto con lo stesso metodo descritto nell’esempio 1, ed è stato trattato con 2ml di toluene con lo stesso metodo descritto nell’esempio 1.
157.3mg di CuSO4.5H2O sono stati
aggiunti al brodo precedentemente ottenuto e la miscela risultante è stata lasciata a temperatura ambiente per 2 ore. L’attività esterasica di un campione di enzima proveniente dal brodo contenente rame ottenuto, è stata misurata con lo stesso metodo descritto nell’esempio 1. L’esterasi nel campione dell’enzima era sufficientemente inattivato. 10g di Cefalosporina C in polvere è stata disciolta in 1000ml di acqua e il pH è stato aggiustato a 7.5.
La soluzione ottenuta è stata mescolata con 400 mi del brodo di fermentazione di T. variabilis sopra ottenuto. La reazione è stata effettuata a 20 C per circa 30 minuti con insufflazione di ossigeno nella miscela di reazione. La resa di glutaril-7-ACA è stata del 99.0%.
ESEMPIO 6
400ml di brodo di fermentazione delle cellule permeabilizzate di ceppo T. variabilis KC-103, ottenuto con lo stesso metodo descritto nell’esempio 1, e 1000ml di soluzione acquosa di Cefalosporina C, ottenuta con lo stesso metodo descritto nell’esempio 1, sono stati mescolati. 0.66 g di CuSO4.5H2O sono stati aggiunti alla miscela di reazione sopra ottenuta e la reazione è stata condotta a 20°C per circa 30 minuti mentre l’ossigeno veniva insufflato nella miscela di reazione.
La resa di glutaril-7-ACA è stata del 98.1%:
L’aumentata quantità totale di Cefalosporina C desacetilata e di glutaril-7-ACA desacetilato è stata del 1% o meno, calcolata sulla quantità d Cefalosporina C.
ESEMPIO 7
Un ceppo T. variabilis è stato coltivato in un mezzo contenente il 2% di glucosio, 2% di liquido di macerazione alcoolica di cereali e 0,2%di
DL-metionina a2ÌC per 60 ore. 0.2ml di toluene sono stati aggiunti a 25ml di brodo di fermentazione avente 2.5g di cellule umide ed essi sono stati mescolati a 25°C per 2 ore per permeabilizzare le cellule.Una adeguata quantità di campione dell’enzima, proveniente dal brodo di fermentazione, è stata aggiunta a tampone al fosfato potassico 0.2M (pH 7.5) contenente 2g/l di glutaril-7-ACA e essi sono stati posti a reagire a 25°C per 30 minuti. La reazione è stata bloccata aggiungendo alcool metilico in pari quantità della miscela di reazione e quindi sottoposta a HPLC. Il rapporto tra l’attività esterasica e l’attività della DAO è statoridotto ad un terzo rispetto a quello del ceppo genitore, cioè 3%.10g di
Cefalosporina C in polvere sono stati
disciolti in 1000ml di acqua e il pH aggiustato a 7.5. La soluzione di Cefalosporina C ottenuta è stata mescolata al brodo di fermentazione delle cellule permeabilizzate ottenuto precedentemente e la miscela è stata fatta reagire a 20°C per circa 180 minuti con ossigeno insufflato nella miscela di reazione. La resa di glutaril-7-ACA è stata del 92.6%.
ESEMPIO 8
Un brodo di fermentazione delle cellule
permeabilizzate di ceppo T. varabilis EL-17 è stato ottenuto con lo stesso metodo descritto
nell’esempio 7.
Un brodo di fermentazione di A. chrisogenum contenente 9 g/1 di Cefalosporina C è stato aggiustato a pH 7.5 e le cellule sono state quindi rimosse dallo stesso.
Il pH è stato aggiustato a 7.5 con NaOH 6N.
6 m<3>del brodo ottenuto sono stati mescolati con 601 del brodo di fermentazione di T. variabilis sopra ottenuto. Mentre l’ossigeno veniva insufflato nella miscela di reazione e 13l di perossido di idrogeno al 35% venivano continuamente aggiunti alla miscela di reazione, la reazione è stata condotta a 20°C per circa 220 minuti.
La resa di glutaril-7-ACA è stata del 92.2% ESEMPIO 9
125 ml di un brodo di fermentazione delle cellule permeabilizzate di ceppo T. variabilis EL-17, ottenuto con lo stesso metodo descritto nell’esempio 7, e 1000 ml di soluzione acquosa di Cefalosporina C ottenuta con lo stesso metodo descritto nell’esempio 1, sono stati mescolati. La miscela è stata poi posta a reagire a 20°C per circa 30 minuti con ossigeno insufflato nella miscela di reazione. La resa di glutaril-7-ACA è stata del 96.2%.
ESEMPIO COMPARATIVO
60 ml di un brodo di fermentazione di cellule permeabilizzate del ceppo T. variabilis KC-103, ottenute con lo tesso metodo dell’esempio 1, e 1000ml di soluzione acquosa di Cefalosporina C ottenuta con lo stesso metodo descritto nell’esempio 1, sono stati mescolati.
La miscela è stata posta a ragire a 20°C per circa 180 minuti con ossigeno insufflato nella miscela di reazione. La resa di glutaril-7-ACA è stata del 83%.
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI: 1. Procedimento di ossidazione enzimatica per convertire la Cefalosporina C in acido glutaril -7-aminocefalosporanico, comprendente l’uso di una miscela contenente D-aminoacido-ossidasi la cui attività esterasica è del 5% o meno dell’attività della D-aminoacido-ossidasi.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la miscela di D-aminoacido-ossidasi è ottenuta da un mutante deficiente in catalasi o negativo capace di produrre D-aminoacido-ossidasi.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui il mutante deriva dalceppo Trignopsis variabilis KC-103 o EL-17·
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la miscela contenente D-aminoacido-ossidasi è ottenuta per contatto della miscela con composti del rame.
- 5. Procdimento secondo la rivendicazione 4, in cui la miscela contenente D-aminoacido-ossidasi è ottenuta per contatto della miscela con un composto del rame a una concentrazione da 10 fino a 2000 ppm.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui il contatto ha luogo prima o durante il processo di ossidazione enzimatica.
- Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la miscela contenente D-aminoacidoossidasi è ottenuta da un mutante avente un’attività esterasica del 5% o meno rispetto alla sua attività DAO, il quale è ottenuto trattando un microrganismo, capace di produrre DAO con radiazione ultravioletta, raggi X o un mutageno.
- 8 Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui la miscela contenente D-aminoacido-ossidasi è costituita da cellule parzialmente degradate , cellule permeabilizzate, estratti privi di cellule ottenuti da esse o enzima immobilizzato.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui il mutante è deficiente in catalasi o negativo.
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui il mutante è il ceppo Trigonopsis variabilisEL-17
- 11. Ceppo di Trigonopsis variabilis EL-17.
- 12. Procedimento per l’inattivazione di esterasi in una miscela di D-aminoacido-ossidasi comprendente il contatto della miscela di D-aminoacido-ossidasi con un composto del rame.
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