IT201900007446A1 - Composizione comprendente citrato e carnitina in grado di attivare la produzione della proteina klotho - Google Patents

Description

Descrizione della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: composizione comprendente citrato e carnitina in grado di attivare la produzione della proteina Klotho

Sfondo dell’invenzione

La presente invenzione riguarda il settore della farmaceutica e più in particolare una composizione comprendente citrato e carnitina che è in grado di attivare la produzione della proteina Klotho da parte delle cellule renali e quindi è in grado di ridurre i danni da stress ossidativo per cause esogene ed endogene che possono interessare i reni. La formulazione può essere impiegata per ridurre la nefrotossicità indotta da mezzi di contrasto iodati, antibiotici o FANS e da agenti che inducano lo stress ossidativo. Nell’ambito del settore del trapianto d’organo, la composizione può essere efficacemente impiegata per la conservazione, perfusione e la riperfusione di organi per il trapianto.

Stato dell’arte

La proteina Klotho esiste in tre differenti isoforme: α, β e γ. Klotho α nell'uomo è codificata dal gene KL e codifica per un enzima appartenente alla famiglia delle beta-glucosidasi espressa principalmente nel tubulo distale del rene ma anche a livello dei plessi coroidei dell'encefalo, nelle ghiandole paratiroidi, nella vescica, nel muscolo scheletrico, nella placenta, nella ghiandola tiroidea e, nelle cellule endoteliali dell’aorta e dell’arteria renale. (Donate-Correa J, Expression of FGF23/KLOTHO system in human vascular tissue. Int J Cardiol.

2013; Lim K, Vascular Klotho deficiency potentiates the development of human artery calcification and mediates resistance to fibroblast growth factor 23. Circulation. 2012, Lim K, α-Klotho Expression in Human Tissues. J Clin Endocrinol Metab. 2015).

Klotho α, nota semplicemente come Klotho, è una proteina che contrasta l’invecchiamento e l’infiammazione; la sua forma solubile rilasciata principalmente dal rene è secreta nel sangue ed esplica una funzione protettiva in tutto l’organismo, in particolare a livello cardiovascolare e del sistema nervoso centrale. In particolare, la forma solubile α Klotho riduce le calcificazioni nelle arterie, protegge il cuore dall’ipertrofia (Xie J, Cardioprotection by Klotho through downregulation of TRPC6 channels in the mouse heart. Nat Commun.2012) attraverso l’inibizione della disfunzione endoteliale e dello stress ossidativo sulle cellule muscolari lisce (Mencke R, Hillebrands JL; The role of the anti-ageing protein Klotho in vascular physiology and pathophysiology. Ageing Res Rev. 2017)(Donate-Correa J, Klotho in cardiovascular disease: Current and future perspectives. World J Biol Chem. 2015).

A livello del sistema nervoso centrale, α Klotho svolge un ruolo essenziale nel promuovere le capacità cognitive e nel contrastare disturbi neurologici e psichiatrici (Vo HT,. Klotho, the Key to Healthy Brain Aging? Brain Plast. 2018). In modelli animali, l’aumentata espressione di questa proteina ha mostrato un miglioramento cognitivo e una maggiore resistenza alla neurodegenerazione correlata all’Alzheimer. Inoltre, in sistemi in vitro di colture cellulari, si è osservato che la proteina Klotho induce una maggiore resistenza allo stress ossidativo ed una significativa protezione dalla citotossicità indotta dalle proteine A13 e dal glutammato associati al morbo di Alzheimer. (Cararo-Lopes MM, The relevance of α-KLOTHO to the central nervous system: Some key questions. Ageing Res Rev. 2017)

La forma trans-membrana di α Klotho che agisce da co-recettore del FGF23 (Fibroblast Growth Factor-23), è costituita da 130 kDa, mentre le forme secrete rilevabili nel siero, nelle urine e nel liquido cerebro¬spinale possono formarsi sia per clivaggio della proteina transmembrana che per splicing alternativo (formando l’isoforma di 70 kDa). Nel tubulo renale, la proteina Klotho di membrana regola il riassorbimento del fosfato e controlla il metabolismo della vitamina D, coinvolta nell’omeostasi del calcio. Le forme secrete, invece, agiscono indipendentemente dal recettore FGF23 e diffondono con azione ormonale lungo il torrente circolatorio, regolando la trasduzione del segnale dell’insulina (Schmid C,. Growth hormone and Klotho. J Endocrinol. 2013) e la via di trasduzione di Wnt con effetto anti-ossidante ed anti-invecchiamento.

Topi transgenici privi di Klotho sviluppano una sindrome assimilabile a un accelerato invecchiamento, con morte prematura, osteoporosi, cecità, arteriosclerosi e calcificazioni vascolari, in particolare, mostrano un difetto nella vasodilatazione endotelio-dipendente e nell'angiogenesi. La protezione da parte della proteina Klotho del sistema cardiovascolare avviene mediante il controllo del rilascio dell’ossido nitrico, nota molecola anti-ossidante che contrasta la vasocostrizione e la disfunzione endoteliale. Diversamente dai topi knock-out, i topi che iper-esprimono Klotho vivono più a lungo dei topi normali.

Per quanto riguarda β Klotho è noto che controlla il metabolismo dei lipidi, l’omeostasi del glucosio ed il rilascio della bile (Xu Y. Molecular basis of Klotho: from gene to function in aging. Endocr Rev. 2015; Yamamoto M, et al. Regulation of oxidative stress by the anti-aging hormone klotho. J Biol Chem 2005; Ito S,. Impaired negative feedback suppression of bile acid synthesis in mice lacking beta Klotho. J Clin Invest 2005;. Razzaque MS. The role of Klotho in energy metabolism. Nat Rev Endocrinol 2012). La deregolazione di β è connessa con alterazioni a carico del tessuto adiposo (Nies VJ, Fibroblast Growth Factor Signaling in Metabolic Regulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2016)come l’obesità. E’ stata rilevata l’esistenza di interazione (cross-talk) tra tessuto adiposo bruno, fegato e microbiota intestinale regolato da β Klotho (E.Somm et al., β-Klotho deficiency protects against obesity through a crosstalk between liver, microbiota, and brown adipose tissue, JCI Insight. 2017). Le funzioni di γKlotho sono molto poco note ed altamente dibattute. (Kim JH,. Biological role of anti-aging protein Klotho. J Lifestyle Med 2015). E’ noto che in un individuo sano i valori sierici medi di Klotho si aggirano intorno a 472 pg/ml (Pedersen L,Soluble serum Klotho levels in healthy subjects. Clin Biochem. 2013), mentre i valori si abbassano drasticamente con l’avanzare dell’età, nei pazienti con malattia renale cronica, nei soggetti affetti da patologie cardiovascolari o dal diabete. In particolare, è stato osservato che i livelli di Klotho solubile sono inversamente correlati alla creatinina sierica. Risulta invece ancora dibattuta l’influenza del genere femminile/maschile sui livelli normali di Klotho plasmatico (Yamazaki Y, Establishment of sandwich ELISA for soluble alpha-Klotho measurement: Age-dependent change of soluble alpha-Klotho levels in healthy subjects. Biochem Biophys Res Commun. 2010).

Diversi studi hanno testato i fattori in grado di aumentare il rilascio di Klotho ed hanno portato all’identificazione di farmaci, composti naturali o stili di vita da adottare. Tra questi per esempio citiamo gli ACE inibitori (ramipril) (Zanchi C, Renal expression of FGF23 in progressive renal disease of diabetes and the effect of ACE inhibitor. PLoS One. 2013) somministrati via endovena in un modello animale di diabete o nefropatia diabetica (Eltablawy N, Vitamin D protection from rat diabetic nephropathy is partly mediated through Klotho expression and renin-angiotensin inhibition. Arch Physiol Biochem. 2018) i fattori probiotici come il Lactobacillus acidophilus o il Bifidobacterium bifidum valutati in supplementazione alla dieta in un modello di aging murino (Kaushal D, Probiotic Dahi containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum alleviates age-inflicted oxidative stress and improves expression of biomarkers of ageing in mice. Mol Biol Rep. 2012), l’insulina (Chen CD, Insulin stimulates the cleavage and release of the extracellular domain of Klotho by ADAM10 and ADAM17. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007) il cui effetto è stato analizzato in vitro su cellule renali di scimmia.

Altri composti, quali il carbone attivo in grado di agire sequestrando le tossine uremiche, come per esempio l’indoxil solfato, che riducono il rilascio di klotho hanno dimostrato efficacia in diversi studi (Lekawanvijit S, Chronic kidney disease-induced cardiac fibrosis is ameliorated by reducing circulating levels of a non-dialysable uremic toxin, indoxyl sulfate. PLoS One. 2012).

Infine, risultati contrastanti sono stati ottenuti dalla supplementazione dietetica della vitamina D, soprattutto nei pazienti dializzati (Prié D, Reciprocal control of 1,25-dihydroxyvitamin D and FGF23 formation involving the FGF23/Klotho system. Clin J Am Soc Nephrol. 2010; Seibert E, Influence of cholecalciferol supplementation in hemodialysis patients on monocyte subsets: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. Nephron Clin Pract. 2013).

L’esercizio fisico si è rivelato essere uno dei principali fattori in grado di aumentare stabilmente i livelli di Klotho circolante. (Avin KG, Skeletal muscle as a regulator of the longevity protein, Klotho. Front Physiol. 2014 ).

La domanda di brevetto internazionale n. WO2018098375 descrive proteine klotho ricombinanti.

La domanda di brevetto Coreana n. KR20170111384 descrive composizioni comprendenti klotho per ridurre la tossicità a livello renale indotta dal farmaco tacrolimus.

La domanda di brevetto Cinese n. CN107438423 descrive composizioni contenti klotho per attivare il gene della longevità.

La domanda di brevetto Canadese N. CA3025461 descrive vari applicazioni terapeutiche della proteina klotho.

La domanda di brevetto statunitense n. US2018289306 descrive l’uso di klotho come biomarcatore per il danno renale.

La domanda di brevetto statunitense n. US2018037868 descrive cellule mesenchimali staminali modificate geneticamente per esprimere klotho.

La domanda di brevetto cinese n. CN105838661 descrive l’uso di modifiche genetiche del gene di per etero trapianti del rene.

La domanda di brevetto israeliana n. IL201880 e le domande di brevetto statunitense n. US2012172314 e US2012232024 descrivono preparazioni farmaceutiche contenenti klotho per il trattamento del cancro.

La domanda di brevetto giapponese n. JP2001072607 descrive una composizione farmaceutica comprendente il vettore contenente il gene KL che codifica per la proteina αklotho che è in grado di proteggere l’endotelio da ipertensione e aterosclerosi.

Il brevetto cinese n. CN104826164 descrive un vaso sanguigno artificiale che contiene la proteina Klotho o GDNF.

Le domande di brevetto cinese n. CN102961739, CN107148215, CN107148215, CN106342787, CN106035316 le domande di brevetto statunitense n. US2018070582, US2017265456, US2017265456, US2016302406, US2018070582; US2017265456; le domande di brevetto di Singapore n. SG10201709595 e SG10201709595, le domande di brevetto giapponese JP2017186295, JP2017061531, JP2017057184; JP2017186295 la domanda di brevetto internazionale n. WO2015152429 descrivono soluzioni per la conservazione di organi per il trapianto.

Problema tecnico

La cellula tubulare renale costituisce la fonte principale per il rilascio di Klotho, che esercita innumerevoli azioni benefiche anti-senescenza, anti-fibrotiche, anti-infiammatorie su diversi distretti corporei.

In condizione di danno o di invecchiamento cellulare, il tubulo renale riduce significativamente la produzione di Klotho che non può più esercitare le sue essenziali funzioni di antiinvecchiamento.

A causa della sua funzione di filtro del sangue, il rene costituisce l’organo deputato alla depurazione dell’organismo e di conseguenza si trova esposto ai potenziali danni dovuti alle sostanze che lo attraversano. Tra le sostanze esogene più dannose per la fisiologia renale si annoverano alcuni farmaci e/o loro metaboliti, mezzi di contrasto usati in radiologia e antibiotici.

Gli inventori della presente invenzione hanno identificato e testato delle sostanze in grado di proteggere la produzione nelle cellule epiteliali del rene della proteina Klotho, impedendone la soppressione della sintesi e rilascio; questa protezione si esplica nei confronti di diverse sostanze tubulo tossiche quali farmaci nefrotossici, agenti che inducono stress ossidativo, mezzi di contrasto iodati.

Altre condizioni quali la sepsi o interventi chirurgici come il trapianto renale possono ridurre in maniera drastica e improvvisa la funzionalità renale portando ad una grave condizione patologica correlata ad alti tassi di mortalità, definita danno renale acuto.

La sepsi rappresenta una sindrome clinica caratterizzata da un’infiammazione sistemica dovuta ad un’aberrante risposta immunitaria dell’organismo che può evolvere in danno renale acuto. È stato dimostrato che una drastica deregolazione di Klotho in corso di sepsi determina l’aumento dell’incidenza di disfuzioni multiorgano e mortalità (Jorge LB, Klotho deficiency aggravates sepsis-related multiple organ dysfunction. Am J Physiol Renal Physiol. 2019 ; Jou-Valencia D, Renal Klotho is Reduced in Septic Patients and Pretreatment With Recombinant Klotho Attenuates Organ Injury in Lipopolysaccharide-Challenged Mice. Crit Care Med. 2018).

Al giorno d’oggi, il trapianto renale rappresenta la strategia terapeutica d’elezione per i pazienti affetti da malattia renale terminale offrendo una migliore qualità di vita rispetto alla dialisi. Tuttavia, sono ancora numerosi i casi di fallimento tardivo del trapianto principalmente a causa di eventi inevitabili durante la procedura di donazione e trapianto come il danno da ischemia/riperfusione ed a causa della scarsa qualità degli organi utilizzati.

La carenza di donazioni da vivente, infatti, costringe la comunità dei trapiantologi a considerare come potenziali candidati al trapianto donatori in morte cerebrale, donatori in morte cardiaca e più recentemente ad estendere i criteri di arruolamento considerando anche donatori marginali (Expandend Criteria Donors): anziani, ipertesi, con complicazioni cardiovascolari o con creatinina sierica superiore a 1,5 mg/ml).

A fronte di queste condizioni, caratterizzate da fisiopatologie complesse che comprendono alterazioni emodinamiche, risposte pro-infiammatorie e lo stress-ossidativo, la presente invenzione fornisce composti in grado di incrementare la produzione renale di Klotho che apportano un miglioramento dei parametri di funzionalità renale o della qualità dell’organo da trapiantare.

Il suddetto problema tecnico è risolto fornendo una composizione costituita da sostanze naturali, prodotte in maniera endogena dall’organismo e che sono coinvolte nel normale metabolismo cellulare.

Nella composizione oggetto della presente invenzione i componenti in combinazione mostrano un effetto maggiore e sinergico rispetto all’effetto additivo esercitato dai singoli componenti.

Oggetto dell’invenzione

Il suddetto problema tecnico è risolto fornendo una composizione farmaceutica comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili.

Costituisce ulteriormente oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente in combinazione come principi attivi citrato, carnitina e opzionalmente e ulteriormente almeno un poliolo e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili.

Costituisce ulteriormente oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica in forma liquida comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opzionalmente e ulteriormente almeno un poliolo addizionata ad una soluzione per soluzione di preservazione e/o conservazione per organi per il trapianto o una soluzione di perfusione e/o riperfusione per organi per il trapianto.

Costituiscono oggetto della presente invenzione le suddette composizioni per uso per la riduzione del danno renale indotto da sostanze nefrotossiche.

Costituiscono le suddette composizioni e in forma liquida per uso come soluzione di preservazione e/o conservazione per organi per il trapianto e per uso come soluzione di perfusione e/o riperfusione per organi per il trapianto.

Costituisce ulteriormente oggetto della presente invenzione una forma solida delle suddette composizioni a costituire un prodotto dietetico/nutraceutico per la prevenzione e/o la riduzione del danno renale indotto da sostanze nefrotossiche.

Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno chiare dalla descrizione dettagliata che segue con riferimento alle figure allegate e ai dati sperimentali forniti.

Breve descrizione delle figure

La figura 1 mostra la schematizzazione del modello di coltura in vitro e delle condizioni usate per testare i composti e le concentrazioni di citrato e di carnitina in grado di incrementare i livelli di Klotho nei surnatanti delle RPTEC (cellule tubulari renali) sia in condizioni basali fisiologiche che in seguito ad un insulto nefrotossico.

La figura 2 mostra i risultati relativi al rilascio di αKlotho nel surnatante di colture di cellule tubulari primarie dopo 12 ore di pre-trattamento con citrato e/o carnitina e seguita da 6 ore di esposizione a stress ossidativo mediante stimolazione con H2O2.

La figura 3 mostra i risultati relativi al rilascio di αKlotho nel surnatante di colture cellule tubulari primarie dopo 12 ore di pre-trattamento con citrato e/o carnitina e seguita da 6 ore di esposizione a Iodixanolo (nome commerciale Visipaque, mezzo di contrasto iodato).

La figura 4 mostra i risultati relativi al rilascio di αKlotho nel surnatante di colture cellule tubulari primarie dopo 12 h di pre-trattamento con citrato e/o carnitina e seguita da 6h di esposizione a danno tubulare indotto dalla gentamicina solfato (Antibiotico).

La figura 5 mostra i risultati relativi alla Real time PCR eseguita su colture di cellule endoteliali primarie derivanti da cordone ombelicale (HUVEC) per il trascritto del gene KL (proteina αKlotho).

Descrizione dettagliata dell’invenzione

La presente invenzione riguarda composizione farmaceutica comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili.

In alternativa la composizione farmaceutica comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili può ulteriormente comprendere almeno un poliolo.

Preferibilmente il poliolo è scelto nel gruppo consistente di Eritritolo, Sorbitolo, Mannitolo, Maltitolo, Isomalto, Lattitolo, poliglicitolo, xilitolo.

La composizione farmaceutica può essere formulata in forma liquida, o solida in base alle applicazioni.

La forma solida può essere, compresse, pillole, capsule rigide, polveri, granulati, supposte.

La presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili in grado di stimolare la produzione della proteina klotho da parte delle cellule renali.

Preferibilmente le cellule renali sono cellule endoteliali renali e/o cellule tubulari renali.

La presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili, per la riduzione del danno renale indotto da sostanze nefrotossiche.

Costituisce ulteriormente oggetto della presente invenzione una composizione in forma liquida comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili per uso come soluzione di preservazione e/o conservazione per organi per il trapianto.

Costituisce ulteriormente oggetto della presente invenzione una composizione in forma liquida comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili per uso come soluzione di perfusione e/o riperfusione per organi per il trapianto.

Costituisce ulteriormente oggetto della presente invenzione una forma solida della composizione comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili a costituire un prodotto dietetico/nutraceutico per la prevenzione e/o la riduzione del danno renale indotto da sostanze nefrotossiche.

Le sostanze nefrotossiche son scelte nel gruppo consistente di mezzi di contrasto iodati, antibiotici nefrotossici, antiinfiammatori FANS ed agenti che inducono stress ossidativo.

Preferibilmente la forma solida può essere, compresse, pillole, capsule rigide, polveri, granulati, supposte.

Gli agenti che inducono stress ossidativo sono scelti nel gruppo consistente di: radicali Liberi dell’ossigeno, perossido di ossigeno (H2O2), specie reattive dell’azoto.

Per radicali Liberi dell’Ossigeno (Reactive Oxygen Species, ROS) si intendono tutti gli intermedi molecolari che con successive riduzioni monoelettroniche causano la trasformazione dell’ossigeno molecolare in acqua. Per esempio, la formazione dell’anione superossido (O2•-) porta al rilascio del H2O2; per esempio il radicale idrossile (HO-) è una molecola altamente reattiva, si forma a partire dall’ H2O2 con forti capacità ossidanti e costituisce l’agente principalmente responsabile della fase iniziale dei processi perossidativi nei tessuti.

Preferibilmente i radicali liberi dell’ossigeno sono scelti nel gruppo consistente di: anione superossido, radicale ossidrile.

Le specie reattive dell’azoto (Reactive Nitrogen Species, le specie reattive dell’azoto RNS) si formano quando elevati livelli endocellulari di anione superossido e H2O reagiscono con l‘ossido nitrico.

Preferibilmente le specie reattive dell’azoto sono scelte nel gruppo consistente di: ossido nitrico, perossinitrito, diossido di azoto, triossido di azoto.

Per esempio il prodotto dietetico/nutraceutico può essere somministrato prima di indagini radiologiche, come per esempio TAC, che prevedono l’uso di mezzi di contrasto iodati, notoriamente nefrotossici per ridurne gli effetti di tossicità renale.

Per esempio il prodotto dietetico/nutraceutico può essere somministrato in combinazione con antibiotici nefrotossici o anti-infiammatori FANS per ridurne gli effetti nefrotossici.

La forma liquida della composizione può essere impiegata come soluzione di preservazione e/ o conservazione per organi per il trapianto.

La forma liquida della composizione può essere impiegata come soluzione di perfusione e/o riperfusione per organi per il trapianto.

La forma liquida della composizione può essere usata anche in fase pre-prelievo d’organo in infusione endovenosa o arteriosa.

Le composizioni in forma liquida oggetto della presente invenzione possono essere impiegate come soluzioni per la perfusione di organi per il trapianto all’interno di macchine di perfusione.

Il citrato di sodio è preferibilmente usato nella forma di sale di sodio disodio citrato, monosodio citrato e trisodio citrato.

Il citrato è preferibilmente in una concentrazione compresa tra 0,25 e 10 mM.

Più preferibilmente il citrato è in una concentrazione pari a 2,5 mM oppure 5 mM.

La L-Carnitina è preferibilmente in una concentrazione compresa tra 0.1-20 mM.

Più preferibilmente la L-Carnitina è in una concentrazione pari a 2,5 mM oppure 5 mM.

Più preferibilmente la carnitina è in una concentrazione pari a 5 mM.

Ancora più preferibilmente la composizione farmaceutica comprendente citrato in una concentrazione pari 5 mM e carnitina in una concentrazione pari 5 mM.

Le composizioni secondo la presente invenzione contengono, insieme ai principi attivi almeno un opportuno veicolo o eccipiente farmaceuticamente accettabile, che possono essere coadiuvanti in base alla formulazione e forma che si vuole ottenere, che possono essere selezionati dalla persona esperta del settore in base alle sue conoscenze medie.

La forma liquida della composizione può essere addizionata alle soluzioni di preservazione e/o conservazione e perfusione e/o riperfusione per organi per il trapianto note nell’arte, che possono adeguatamente essere selezionate dalla persona esperta nel settore in base all’organo da preservare, conservare, perfondere, riperfondere.

Esempi di dette soluzioni sono descritti in Guibert EE et al., 2011, Organ Preservation: Current Concepts and New Strategies for the Next Decade, Transfus Med Hemother, 38(2): 125–142 e in O'Callaghan J, Leuvenink H, Friend P, Ploeg R. Kidney Preservation, Chapter 9 in: Kidney Transplantation, Principles and Practice 7th Edition. Saunders. Eds Peter J Morris and Stuart J Knechtle. p130-141.

Per esempio, la soluzione fisiologica salina contenente Albumina da siero umano e Dextran 40, nota con il nome commerciale STEEN SOLUTION ® (XVIVO Perfusion AB, Svezia), generalmente usata per il polmone.

Oppure per esempio, la soluzione contenente sodio bicarbonato, potassio fosfato monobasico, potassio fosfato bibasico triidrato, potassio cloruro, nota come Soluzione di Eurocollins.

Oppure per esempio, la soluzione contenente lattobionato di potassio, KH2PO4, MgSO4, raffinosio, adenosina, glutatione, allopurinolo, amido idrossietilico, nota come University of Wisconsin solution o soluzione UW, Viaspan ®, generalmente usata per rene, fegato, pancreas e piccolo intestino.

Oppure per esempio, la soluzione contenente sodio, potassio, magnesio, calcio, chetoglutarato/acido glutammico, istidina, mannitolo e triptofano, nota come soluzione HTK istidinatriptofano-chetoglutarato.

Oppure per esempio, la soluzione contenente potassio, sodio, magnesio, citrato o HEPES, nota come soluzione Marshall o soluzione HOC.

Oppure per esempio, la soluzione contenente glutatione, mannitolo, acido lattobionico, acido glutammico, idrossido di sodio, cloruro di calcio diidrato, cloruro di potassio, cloruro di magnesio esaidrato, istidina nota come soluzione Celsior.

Oppure per esempio, la soluzione contenente ione potassio, ione sodio, ione magnesio, ione solfato, difosfato, raffinosio, acido lattobionico, polietilene glicole, glutatione, allopurinolo, adenosina, nota come Institute Georges Lopez Solution o soluzione IGL.

Esempi

In un modello in vitro, cellule renali epiteliali tubulari (RPTEC) primarie sono state poste in coltura e sottoposte all’esposizione di diverse soluzioni contenenti sale del sodio citrato (Trisodio citrato) e L-Carnitina. Gli intervalli di concentrazione testati sono stati: 0.1 -50 mM per il sodio citrato e 0.1-20 mM per la L-Carnitina.

Il modello in vitro che ha permesso di testare i composti e le concentrazioni di citrato e di carnitina in grado di incrementare i livelli di Klotho nei surnatanti delle RPTEC sia in condizioni basali fisiologiche che in seguito ad un insulto nefrotossico è mostrato schematicamente nella figura 1.

I risultati dimostrano un incremento del rilascio di αKlotho nel surnatante di colture di cellule tubulari primarie dopo 12 ore di esposizione alle concentrazioni di 5 mM di Sodio Citrato ed L-Carnitina, come mostrato in figura 2.

È stato poi verificato se questo incremento fosse conservato anche in seguito a differenti insulti nefrotossici come lo stress ossidativo indotto dall’H2O2, come mostrato in figura 2, l’esposizione a mezzi di contrasto iodati, come mostrato in figura 3, ad antibiotici nefrotossici, come la gentamicina solfato, come mostrato in figura 4.

La figura 2 mostra in grafico l’incremento del rilascio di αKlotho nel surnatante di colture cellule tubulari primarie dopo 12 ore di pre-trattamento con citrato e/o carnitina e seguita da 6 ore di esposizione a stress ossidativo mediante stimolazione con H2O2 ad una concentrazione di 0.1 mM cioè la concentrazione più bassa in grado di indurre una riduzione statisticamente significativa di Klotho. Sono state anche testate concentrazioni di H2O2 pari a 0.1, 0.2, 0.5 fino a 1 mM.

Il P-value di 5 esperimenti indipendenti è stato calcolato mediante t-test (unpaired) ed i valori di P value<0.05 e **P value<0.01 sono stati calcolati rispetto alla condizione con H2O2, come è indicato in figura dalla linea tratteggiata. L’analisi di aKlotho solubile è stata condotta mediante test commerciale ELISA Ibl codice 277789 seguendo le indicazioni della casa produttrice.

I valori di Klotho (pg/ml) per le relative condizioni indicate sono indicati nella tabella 1 che segue:

Tabella 1

L’esposizione simultanea al citrato ed alla carnitina conferisce un effetto sinergico, ovvero l’effetto combinato delle due sostanze è maggiore della somma degli incrementi del citrato o della carnitina presi in considerazione singolarmente, come si evidenzia dai valori numerici in tabella 1.

La figura 3 mostra i risultati relativi al rilascio di αKlotho nel surnatante di colture cellule tubulari primarie dopo 12 ore di pre-trattamento con citrato e/o carnitina e seguita da 6 ore di esposizione al mezzo di contrasto iodato Iodixanolo (nome commerciale Visipaque).

Le concentrazioni del mezzo di contrasto utilizzate sono state 50 e 100 mg/ml, sono mostrati in figura i dati relativi alle concentrazioni più elevate di 100 mg/ml. *P value<0.05; **P value<0.01 comparato alla condizione con solo mezzo di contrasto Iodixanolo come indicato dalla linea tratteggiata. Lo iodixanolo induce una drastica riduzione di Klotho comparato alla condizione basale.

I valori di Klotho (pg/ml) per le relative condizioni sono indicati nella tabella 2 che segue:

Tabella 2

L’esposizione simultanea al citrato ed alla carnitina conferisce un effetto sinergico, ovvero l’effetto combinato delle due sostanze è maggiore della somma degli incrementi del citrato o della carnitina presi in considerazione singolarmente, in presenza dello Iodixanolo, come mostrato dai valori numerici della tabella 2.

La figura 4 mostra i risultati relativi al rilascio di αKlotho nel surnatante di colture di cellule tubulari primarie dopo 12 ore di pre-trattamento con citrato e/o carnitina e seguita da 6 ore di esposizione ad antibiotico nefrotossico Gentamicina solfato.

Concentrazioni testate da 0,1-1-10 mM, sul grafico è indicata la concentrazione di 10 mM. *P value<0.05; **P value<0.01 comparato alla condizione con sola Gentamicina solfato, come indicato dalla linea tratteggiata. L’incremento dei livelli di Klotho ottenuto dalla co-incubazione di citrato e carnitina è sinergico, come evidente dai valori numerici della tabella 3 che segue.

Tabella 3

L’analisi di aKlotho solubile è stata condotta mediante test ELISA Ibl.

Il rene è uno degli organi più vascolarizzati nel corpo umano; per questo si è testato l’effetto del composto su cellule endoteliali umane. La figura 5 mostra in grafico l’incremento dei livelli di espressione genica di KL (codificante la proteina αKlotho) da parte di colture di cellule endoteliali primarie (HUVEC, Human umbilical vein endothelial cells) dopo 24 ore di esposizione alla formulazione contenente citrato e/o carnitina. Il composto quindi non ha effetti tossici su cellule endoteliali e mostra la stessa capacità di indurre la trascrizione del gene di Klotho così come avviene nelle cellule tubulari.

Il P-value di 3 esperimenti indipendenti è stato calcolato mediante t-test (unpaired) ed il valore di P value (*p<0.05) è stato calcolato rispetto alla condizione basale. L’analisi della espressione genica del trascritto di aKlotho è stata condotta mediante Real time PCR, nello specifico saggio Syber green (con la SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix) e la quantizzazione è stata eseguita mediante software Light Cycler 96 (Roche) con il metodo 2<-DDCT >assegnando alla condizione basale valore 1.

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione farmaceutica comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili.
2. 2. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1 ulteriormente comprendente almeno un poliolo.
3. 3. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 2 in cui il poliolo è scelto nel gruppo consistente di Eritritolo, Sorbitolo, Xilitolo, Mannitolo, Maltitolo, Isomalto, Lattitolo, poliglicitolo.
4. 4. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1 in cui il citrato di sodio è nella forma di sale di sodio disodio citrato, monosodio citrato e trisodio citrato.
5. 5. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1-4 formulata in forma liquida o solida.
6. 6. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1 in cui la forma solida è scelta nel gruppo consistente di compresse, pillole, capsule rigide, polveri, granulati, supposte.
7. 7. Composizione farmaceutica in forma liquida secondo la rivendicazione 5 addizionata ad una soluzione di preservazione e/o conservazione e/o perfusione e/o riperfusione per organi per il trapianto.
8. 8. Composizione farmaceutica in forma liquida secondo la rivendicazione 7 in cui la soluzione di preservazione e/o conservazione e/o perfusione e/o riperfusione per organi per il trapianto è scelta nel gruppo consistente di Steen Solution, soluzione di Eurocollins, soluzione di University of Wisconsin, soluzione istidina-triptofanochetoglutarato, soluzione Marshall, soluzione Celsior, soluzione Institute Georges Lopez.
9. 9. Composizione in forma liquida comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili secondo le rivendicazioni 5,7 e 8 per uso come soluzione di preservazione e/o conservazione per organi per il trapianto.
10. 10. Composizione in forma liquida comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili secondo le rivendicazioni 5,7 e 8 per uso come soluzione di perfusione e/o riperfusione per organi per il trapianto.
11. 11. Composizione farmaceutica comprendente in combinazione come principi attivi citrato e carnitina e opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8 per uso per la riduzione del danno renale indotto da sostanze nefrotossiche.
12. 12. Composizione per uso secondo la rivendicazione 11 in cui la sostanza nefrotossica è scelta nel gruppo consistente di mezzi di contrasto iodati, antibiotici nefrotossici, anti-infiammatori FANS ed agenti che inducono stress ossidativo.
13. 13. Composizione per uso secondo la rivendicazione 11 in cui l’agente che induce stress ossidativo è scelto nel gruppo consistente di: radicali Liberi dell’ossigeno, perossido di ossigeno, specie reattive dell’azoto.
14. 14. Composizioni in forma liquida oggetto secondo le rivendicazioni 7-10 per uso come soluzioni per la perfusione di organi per il trapianto all’interno di macchine di perfusione.