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BESCHREIBUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Enzymen der Allenoxidsynthase-Familie
bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung einer Ischämie-Reperfusions-Schädigung des
Herzmuskels, die mit Herzinfarkt, Thrombolyse, Angioplastie und
Koronararterien-Bypass-Operation verbunden ist. Die Erfindung beschreibt
die Verabreichung von Allenoxidsynthasen, die in der Lage sind,
Lipidwasserstoffperoxiden zu eliminieren, als leistungsfähiges Mittel
für den
Schutz des Herzens. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass
eine Verabreichung von Allenoxidsynthase nach einer schweren, umfassenden
Ischämie
die Erholung (Heilung) des Herzens stimuliert.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Ischämie, der
klinische Begriff für
Sauerstoffmangel, ist weltweit die Haupttodesursache. Die gängigsten
zum Tode führenden
Ischämieformen
werden durch Unterbrechungen des Blutflusses verursacht. Herzerkrankung,
Schlaganfall und schwerer Blutverlust durch traumatische Schädigungen
sind Beispiele für
Ischämie,
die für über 50%
aller Todesfälle
verantwortlich sind.
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In
klinischen Situationen von Ischämie
ist es das unmittelbare Ziel, den Blutfluss im Patienten schnellstmöglich wieder
herzustellen. Wird der Blutfluss innerhalb eines geeigneten Zeitraums
wieder hergestellt, kann eine Schädigung des Gewebes verhindert
werden. Allerdings führt
eine erhebliche Verzögerung beim
Wiederherstellen des Blutflusses zu einem als Ischämie-Reperfusions-Schädigung bekannten
Sekundärzustand.
Eine Reperfusions-Schädigung
beginnt, wenn nach dem ischämischen
Vorfall reaktive Sauerstoffspezies gebildet werden. Reaktive Sauerstoffspezies
entstammen komplexen, spontanen radikalischen reaktionen, die Lipide,
Proteine und DNA schädigen
und letztendlich Zellen abtöten
können.
Lipide in Zellmembranen sind die primären, anfänglichen Ziele für den Angriff
von Sauerstoff im Blut, was zur Bildung von äußerst zytotoxischen Lipidperoxiden
führt (Kilgore,
K.S. und Lucchesi, B.R., 1993, Clin. Biochem. 26:359–70; Kloner,
R.A., 1993, J. Am. Coll. Cardiol. 21:357–45; Huynh, T.T. et al., J.
Surg. Res. 84:223–32;
Kesavulu, M.M. et al., Diabetes Res. Clin. Pract. 53:33–9).
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Eine
Ischämie-Reperfusions-Schädigung kann
sich nach einem ischämischen
Vorfall allmählich
entwickeln und eine irreversible Gewebeschädigung verursachen. Klinische
Beispiele schließen
eine Dysfunktion der Herzmuskelkontraktion, Arrhythmien und eine
irreversible Myozytenschädigung
(Herzzelltod) ein, wonach ein Herzinfarkt (Herzanfall) erfolgt.
Wenngleich derzeit keine Arzneistoffe zum Behandeln einer Ischämie-Reperfusions-Schädigung verfügbar sind,
ist die durch Ischämie-Reperfusions-Schädigung verursachte
Schädigung
vermeidbar und reversibel, wenn bestimmte Behandlungen in einer
zeitlich gesteuerten Weise verabreicht werden. Die klinisch relevantesten
Behandlungen beinhalten die Verabreichung von Antioxidantien. Endogene
Antioxidantien wie Glutathionperoxidase (GPX), Superoxiddismutase
(SOD) und Catalase fungieren als primärer Abwehrmechanismus. Zudem
kann Vitamin E aus der Nahrung eine sekundäre Rolle beim Vermindern einer
Ischämie-Reperfusions-Schädigung spielen.
Die Verabreichung von exogenen antioxidierenden Narrungsmittelergänzungen
vor oder nach einer Reperfusion zeigte eine gewisse Nutzbarkeit
in Versuchssystemen (Abunasra, H.J. et al., 2001, Eur. J. Cardiothorac.
Surg. 20:153–8;
Cuzzocrea, S. et al., 2001, Pharmacol. Rev. Mar. 53:135–59; Dhalla,
N.S. et al., 2000, Cardiovasc. Res. 47:446–56; Galang, N. et al., 2000,
Toxicology 148:111–8;
Hangaishi, M. et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 285:1220–5; Kanamasa,
K. et al., 2001, Acta Cardiol. 56:181–6; Laurindo, F.R. et al.,
1991, Circulation 83:1705–15;
Li, Q., 2001, Circulation 103:1893–8 ; Prasad, K. et al., 1996,
Can. J. Cardiol. 12:1083–91
; Rowland, R.T. et al., 1995, Surgery 118:446–52 ; Van Remmen, H. et al.,
2001, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281:H1422–32). Allerdings misslang
es, dass eine SOD-Behandlung eine vorteilhafte Wirkung in klinischen
Versuchen am Menschen zeigen konnte (Flaherty, J.T., 1994, Circulation
89:1982–91).
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Allenoxidsynthase
dient durch rasches Eliminieren von Lipidwasserstoffperoxiden aus
dem System als Antioxidans (
US-Patent
Nr. 6,132,711 ; Pan, Z. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:18139–18145).
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur Verringerung
einer Ischämie-Reperfusions-Schädigung auf
der Basis der Verabreichung von Allenoxidsynthase bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Enzymen der Allenoxidsynthase-Familie
bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung einer Ischämie-Reperfusions-Schädigung des
Herzmuskels, die mit Herzinfarkt, Thrombolyse, Angioplastie und
Koronararterien-Bypass-Operation verbunden ist. Die Erfindung beschreibt
die Verabreichung von Allenoxidsynthasen als leistungsfähiges Mittel
zum Schutz des Herzens vor Ischämie-Reperfusions-Schädigung.
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass eine Verabreichung
von Allenoxidsynthase in der Lage ist, nach einer schweren, umfassenden
Ischämie
die Erholung des Herzens zu stimulieren.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt Enzyme der Allenoxidsynthase-Familie
umfassende Zusammensetzungen und die Verwendung derartiger Zusammensetzungen
zur Vorbeugung und/oder Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung.
Derartige kardiovaskuläre
Erkrankungen schließen
z.B. Herzinfarkt, Angina pectoris, Thrombolyse, Angioplastie, Koronararterien-Bypass-Operation,
Gefäß- oder Herzmuskelischämie und
damit verbundene, wie dem Fachmann bekannte Zustände, einschließlich der
Dysfunktion oder Schädigung
des Herzens oder des Gefäßsystems
und insbesondere der mit der Anhäufung
von zytotoxischen Lipidwasserstoffperoxiden verbundenen Schädigung des
Gewebes ein.
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Zudem
können
die durch die vorliegende Erfindung beschriebenen Zusammensetzungen
zum Behandeln von anderen mit der Anhäufung von zytotoxischen Wasserstoffperoxiden
in angegriffenen Geweben verbundenen Ischämiearten verwendet werden.
Derartige Ischämien
schließen
Mesentarialischämie,
Gehirnischämie
(Schlaganfall), Ischämie
der Extremitäten,
optische Ischämie
und hepatische Ischämie
ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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Viele
Allenoxidsynthasen sind bekannt und können folglich durch bekannte
Verfahren aus bekannten Ausgangsmaterialien oder durch zum Herstellen
von Allenoxidsynthasen wie in der Literatur beschrieben verwendeten
Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann Allenoxidsynthase
wie in
US-Patent Nr. 6,132,711 beschrieben
rekombinant exprimiert werden. Alternativ dazu kann die Allenoxidsynthase
im Handel erhalten werden. Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann jeder beliebige Vertreter
der Allenoxidsynthase-Familie verwendet werden, mit der Maßgabe, dass
das ausgewählte
Enzym in der Lage ist, den Gehalt an zytotoxischen Lipidwasserstoffperoxiden
zu verringern.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt Arzneimittel, die eine Allenoxidsynthase
in einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfassen. Derartige Träger
schließen
jede beliebige physiologische Lösung
oder jedes beliebige Dispersionsmittel oder dergleichen, wie Kochsalzlösung oder
gepufferte Kochsalzlösung
ein. Träger
können
z.B. auch jedes beliebige Verdünnungsmittel,
jeden beliebigen Exzipienten, jedes beliebige Suspensionsmittel,
jedes beliebige Schmiermittel, jeden beliebigen Hilfsstoff, jedes
beliebige Vehikulum, jedes beliebige Abgabesystem, jeden beliebigen
Emulgator, jedes beliebige Absorptionsmittel, jedes beliebige Konservierungsmittel,
jedes beliebige oberflächenaktive
Mittel, jedes beliebige Farbmittel, jeden beliebigen Geschmackstoff
oder Süßstoff,
beliebige antibakterielle Mittel und Mittel gegen Pilze, beliebige
isotonische und die Absorption verzögernde Mittel und dergleichen
einschließen.
Insofern jegliches herkömmliche
Medium, jeglicher herkömmlicher
Träger
oder jegliches herkömmliche
Mittel mit dem Wirkstoff nicht unverträglich ist, wird dessen Verwendung
in den Zusammensetzungen erwogen.
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Die
vorliegende Erfirndung beschreibt ferner Verfahren zur Vorbeugung
und/oder Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung. Die Erfindung
findet besondere Nützlichkeit
in Verbindung mit chirurgischen Maßnahmen wie Koronararterien-Bypass. In derartigen
Fällen
würde die
Allenoxidsynthase vor oder gegebenenfalls nach der Maßnahme normal
verabreicht werden. Die Allenoxidsynthase kann auch vor oder während einer
Ischämie-Reperfusion
nach einem spontanen ischämischen
Vorfall verwendet werden. Derartige spontane Vorfälle schließen Patienten
mit Koronararterienverschluss ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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Das
durch die Erfindung beschriebene Verfahren umfasst die Schritte
des Verabreichens einer Menge an Allenoxidsynthase die in der Lage
ist, den Gehalt an Lipidwasserstoffperoxiden zu verringern, vor
und/oder zum Zeitpunkt einer Ischämie-Reperfusions-Schädigung einem
Patienten und wirksames Inkontaktkommenlassen der Allenoxidsynthase
mit dem Gewebe zur Verringerung der Ischämie-Reperfusions-Schädigung.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können unter Verwendung einer
Vielfalt von unterschiedlichen Verfahren, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf orale, pulmonale, parenterale (intramuskuläre, intraartikuläre, intraperitoneale,
intravenöse
(IV) oder subkutane Injektion), Inhalations-, (über eine Feinpulverformulierung
oder einen feinen Nebel), transdermale, nasale, vaginale, rektale
oder sublinguale Verabreichungswege verabreicht und in für jeden
Verabreichungsweg geeignete Dosierungsformen formuliert werden.
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In
bevorzugten durch die Erfindung beschriebenen Ausführungsformen
wird die Allenoxidsynthase typischerweise durch Infusion von Allenoxidsynthase
in den Blutstrom vor einer Ischämie-Reperfusions-Schädigung verabreicht.
Alternativ dazu wird die Allenoxidsynthase während einer Ischämie-Reperfusions- Schädigung und
vor der Beendigung einer aus einer Ischämie-Reperfusions-Schädigung resultierenden
Gewebeschädigung
verabreicht. In Fällen,
in welchen die Allenoxidsynthase nach Beginn einer Ischämie-Reperfusions-Schädigung verabreicht
wird, sollte die Verabreichung innerhalb von fünf Tagen nach einem derartigen
Beginn, stärker
bevorzugt innerhalb von vierundzwanzig Stunden nach Beginn und besonders
bevorzugt innerhalb einer Stunde nach Beginn der Schädigung erfolgen.
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Die
zu verabreichende Dosierung der durch die vorliegende Erfindung
beschriebenen Zusammensetzungen wird mit Bezug auf verschiedene
Parameter, einschließlich
der Patientenspezies, des Alters, Gewichts und Erkrankungsstatus
und insbesondere der physiologischen Zustände, die eine phänotypische
Veränderung erfordern,
bestimmt. Die Dosierung wird vorzugsweise derart ausgewählt, dass
die Verabreichung ein wie durch Molekularassays oder phänotypische
Veränderung
gemessenes, wirksames Ergebnis bewirkt. Derartige Assays schließen z.B.
die Messung der Herzfunktion, d.h. des systolischen und diastolischen
Drucks, des Kontraktionsvermögens
und des Herzvolumens, ein.
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6. BEISPIEL: ALLENOXIDSYNTHASE STIMULIERT
DIE ERHOLUNG DER MECHANISCHEN FUNKTION VON HERZEN NACH EINER ISCHÄMIE
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6.1. MATERIAL UND VERFAHREN
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Tiere
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Männliche
Wistar-Ratten (300–350
g) wurden von Charles River Laboratories erhalten. Jeweils zwei Tiere
wurden in Käfigen
untergebracht und hatten freien Zugang zu Futter (standardmäßiges Rattenfutter)
und Wasser. Die in dieser Studie verwendeten Tiere wurden gemäß den Empfehlungen
in The Guide fort he Care and Use of Laboratory Animals, National
Institute of Health, Publ. Nr. 85-23, überarbeitet 1986, betreut.
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Ischämie-Protokoll
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Die
Herzen von vorher mit CO, vergasten und enthaupteten Ratten wurden
als Arbeitsherzen perfundiert und kanüliert. Kurz gesagt, wurden
die Herzen schnell heraus seziert, in eiskalten Puffer gegeben und sofort über die
Aorta mit Krebs-Henseleit-Puffer,
enthaltend in (mM) 118 NaCl, 4,7 KCL, 1,2 KH2PO4, 1,2 MgSO4, 2,5
CaCl2, 0,5 EDTA, 25 NaHCO3,
11 Glucose, 1,75 Ca2+ (pH 7,4, begast mit
95% O2–5%
CO3) retrograd perfundiert. Während dieser
Perfusion wurden die Herzen von überschüssigem Gewebe
befreit und die Öffnungen
der linken Arterien kanüliert.
Die Herzen wurden dann in den Arbeitsmodus geschalten und mit einem
linksarteriellen Fülldruck
von 11,5 mmHg und einem mittleren Aortendruck von 80mmHg in einem
Pufferumlaufsystem, enthaltend 11 mM Glucose und 1,2 mM an 3% Rinderserumalbumin
vorgebundenes Palmitat, perfundiert. Die Herzen wurden mit dieser
Fettsäurekonzentration
perfundiert, da sie diejenige nachahmt, die im klinischen Milieu
der mit einer Herzoperation verbundenen Ischämie und Reperfursion beobachtet
wurde. Nach 15 Minuten aerober Perfusion wurden die Herzen durch
Abklemmen sowohl der linksarteriellen Füllung als aus der mittleren
Aortendruckleitung für
eine Dauer von 30 Minuten einer umfassenden Ischämie unterzogen. Nach der Ischämie wurden
der linksarterielle Fluss und der Aortenfluss wieder hergestellt
und die Herzen für
eine Dauer von 30 Minuten reperfundiert. Allenoxidsynthase wurde,
falls verwendet, mit einer Konzentration von 250 μg 15 Minuten
vor der Reperfusionsperiode direkt dem Perfusat zugesetzt. Am Ende
der Reperfusion wurden die Herzen von der Kanüle entfernt und in flüssigem N2 eingefroren. Die Herzfunktion wurde unter
Verwendung von Transomic-in-line-Fließsonden (Model T206) und einem
Leistungsanalysator des Typs Dig Med (Modell HPA-tau) aufgezeichnet.
Während
des gesamten Perfusionsprotokolls hielten mit Wasser ummantelte Kammern
die Perfusattemperatur bei 37°C.
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Statistische Analyse
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Für den statistischen
Vergleich von Gruppendurchschnittswerten wurde der Student-t-Test
verwendet. Ein Wert von p < 0,05
wurde als signifikant betrachtet. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben.
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6.2 ERGEBNISSE
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Tabelle
1 zeigt die Wirkungen von ADS auf die Erholung der Reperfusion von
Herzen nach einer schweren umfassenden Ischämie. Unter aeroben Bedingungen ähnelte sich
die mechanische Funktion zwischen Herzen von Kontrollgruppen und
mit Allenoxidsynthase behandelten Gruppen. Allerdings war nach 30 Minuten
einer schweren nicht-fließenden
Ischämie
Allenoxidsynthase für
die Wiederaufnahme der mechanischen Funktion von Vorteil. Tatsächlich war
so früh
wie 5 Minuten in der Reperfusion die Wiederaufnahme des systolischen
Drucks, des diastolischen Endrucks, des Kontraktionsvermögens und
des CO in mit Allenoxidsynthase behandelten verglichen mit nicht
behandelten Herzen signifikant verbessert. Während der gesamten übrigen Reperfusionsperiode
wurden die vorteilhaften Wirkungen von Allenoxidsynthase auf den
systolischen Druck, das Kontraktionsvermögen und das Herzvolumen beobachtet.
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Ein
Ausbruch von sauerstofffreien Radikalen, der typischerweise während der
Reperfusion von hohen Gehalten von Plamitat ausgesetzten ischämischen
Herzen beobachtet wird, kann zu einer Herzdysfunktion führen. Es
ist klar, dass vor Beginn der Reperfusion zugesetzte Allenoxidsynthase
von Vorteil ist. Tabelle 1. Wirkungen von AOS auf die Wiederaufnahme
der Reperfusion nach einer Ischämie
| Gruppe | HR
(Schläge/Min.) | PSP (mmHg) | EDP (mmHg) | +dP/dt mmHg/Sek.) | –dP/dt mmHg/Sek.) | CO
(ml/Mm.) |
| Aerobe
Perfusion Kontrolle + AOS | 231±11
223+6 | 104±3
116±4 | 47±2
44±2 | 1898±160
2089±124 | 1243±100
1372±152 | 41±5
46±2 |
| 5
Mm. Regerfusion Kontrolle + AOS | 174±24
221±11 | 56±18
112±3† | 35±5
48:±1† | 743±429
2152+15† | 455±193
1232±159† | 12±9
40±2† |
| 10
Mm. Regerfusion Kontrolle + AOS | 164±3
210±16 | 75±12
117±7† | 41±2
42±4 | 795±494
2149±119↕ | 831±108
1340±177 | 10±5
42±4† |
| 20
Min. Regerfusion Kontrolle + AOS | 172±19
221±7 | 82±11
119±4† | 44±3
43±1 | 1093±359
2472±101↕ | 831±132
1482±140† | 17±9
50±4† |
| 30
Min. Regerfusion Kontrolle + AOS | 190±18
234±4† | 85±8
118+4↕ | 50±3
42±1 | 1174±241
2603±155 | 727±169
1650±124↕ | 16±9
56+3↕ |
-
Die
Werte sind als Mittelwert ± SEM
für 4 Tiere
für jede
Gruppe angegeben. HR, Herzrate; PSP, systolischer Spitzendruck;
EDP, diastolischer Enddruck; +dP/dt, Kontraktionsrate; –dP/dt,
Entspannungsrate; CO, Herzvolumen.
- †
- signifikant, verglichen
mit der Kontrollgruppe, p < 0,05.
- ↕
- signifikant, verglichen
mit der Kontrollgruppe, p < 0,01.