HUP0600589A2 - Adjuvant combination formulations - Google Patents

Description

» fob oo5s9 ü·.·:·?::·:·· ···· ·· ···· ·· ····

Kombinációs adjuváns-formák irnrrr rp*>

I Μ i Ml

PÉLDÁNY

A találmány tárgyát képezi aminoalkil-glükózamin-foszfát-vegyület vagy származékának vagy analógjának alkalmazása kombinációban egy citokinnel vagy limfokinnel, különösen 5 granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktorral vagy interleukin-12-vel, adjuváns-formaként antigenikus vagy immunogén készítményben, egy kiválasztott antigénre adott immunválasz fokozására gerinces gazdaszervezetben.

Az immunrendszer különböző mechanizmusokkal támadja meg a kórokozókat. Azonban nem szükségszerűen aktiválódik minden ilyen mechanizmus immunizálást követően. Im10 munizálással indukált, védő hatású immunitás mértéke attól függ, hogy az immunogén készítmény milyen mértékben képes kiváltani megfelelő immunválaszt a patogénnel szemben rezisztencia létrehozása vagy a patogén eliminálása céljából. A patogéntől függően ez sejt-közvetített és/vagy humorális immunválaszt tehet szükségessé.

A jelenlegi nézet helper T-sejtek immunválaszban betöltött szerepéről az, hogy a ΤΙ 5 sejteket alkészletekre lehet osztani az általuk termelt citokinek alapján, és a sejtekben megfigyelt eltérő citokin-profilok határozzák meg fünkciójukat. Ebben a modellben a T-sejtek két fő alkészletre oszthatók: TH-1-sejtek, amelyek interleukin-2-t (IL-2) és gamma-interferont termelnek, és amelyek mind celluláris, mind humorális (ellenanyag) immunválaszokat képesek fokozni; és TH-2-sejtek, amelyek humorális immunválaszokat fokozni képes, interleukin-4-t, 20 interleukin-5-t és interleukin-10-t (IL-4, IL-5 és IL-10) termelnek (lásd 1. hivatkozást).

Gyakran kívánatos az antigén immunogén hatékonyságának fokozása erősebb immunválasz kiváltása céljából az immunizálandó organizmusban, és a gazdaszervezet rezisztenciájának erősítése az antigént hordozó ágenssel szemben. Bizonyos esetekben kívánatos az immunválasz eltolása túlnyomó arányban humorális (TH-2) válaszról kiegyensúlyozottabb, celluláris 25 (TH-1) és humorális (TH-2) válasz felé.

Celluláris válaszban CD8+ CTL-válasz (citotoxikus T-limfocita) alakul ki. Ilyen válasz kívánatos intracelluláris patogénekkel szemben alkalmazott immunogén készítmények kifejlesztése esetén. Különféle patogének elleni védettséghez erős mukozális válaszok, szérumban magas titerek, CTL indukálódása és erőteljes celluláris válaszok szükségesek. Ilyen válaszokat 30 a legtöbb antigenikus készítmény, beleértve hagyományos immunogén alegység-készítmények nem biztosítanak. Egy ilyen patogén például a humán immundeficiencia vírus (HÍV).

-2Tehát szükség van antigenikus készítmény-formák kifejlesztésére, amelyek humorális és celluláris immunválaszokat egyaránt képesek kiváltani gerinces gazdaszervezetben.

Ennek megfelelően, a találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki kombinációs adjuváns-forma alkalmazását antigenikus készítményekben, amely aminoalkilglükózamin-foszfát (AGP) vegyületet vagy származékát vagy analógját tartalmazza, citokinnel vagy limfokinnel, különösen granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktorral (GM-CSF) vagy interleukin-12-vel (IL-12), vagy a citokin vagy limfokin agonistájával vagy antagonistájával kombinációban. Konkrétan, az AGP 2-[(R)-3-tetradekanoil-oxitetradekanoil-amino]-etil-2dezoxi-4-O-foszfono-3-O-[(R)-3-tetradekanoil-oxitetradekanoil]-2-[(R)-3-tetradekanoiloxitetradekanoil-amino]-P-D-glükopiranozid, amely 529-ként is ismert (régebben RC529-ként is).

Adjuváns olyan anyag, amely immunválaszt kepes fokozni, ha együtt adjuk be immunogénnel vagy antigénnel. A találmány szerinti adjuváns-formát egy kiválasztott antigénnel együtt adjuk be egy antigenikus vagy immunogén készítményben. A találmány szerinti antigenikus készítmények immunválaszt képesek fokozni a kiválasztott antigénnel szemben, gerinces gazdaszervezetben. A kiválasztott antigén lehet (1) patogén vírusból, baktériumból, gombából vagy parazitából, (2) vagy ráksejtből vagy tumorsejtből, (3) vagy egy allergénből származó pohpeptid, pepiid vagy fragmens, amely IgE-termelést zavar, és így mérsékli az allergénre adott allergiás választ, vagy származhat (4) amiloid prekurzor fehérjéből, gerinces gazdaszervezetben amiloid lerakódásával járó betegség prevenciója vagy kezelése céljából. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a kiválasztott antigén HIV-ből származik. A kiválasztott HIV-antigén lehet HIV-fehéije, vagy a fehérjéből származó polipeptid, pepiid vagy fragmens. A találmány egy konkrét előnyös megvalósítási módja szerint, a HIV-antigén egy speciális pepiid. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a kiválasztott antigén βamiloid-peptid (Αβ-peptidnek is neveznek), amely az amiloid prekurzor fehérje (APP) belső, 39-43. aminosavaiból álló fragmense, amelynek képződését APP-ből β- és γ-szekretaz enztmek katalizálják.

AGP-t vizes oldatként vagy stabilizált „olaj-vízben” emulzróként (stabrl emulzió, vagy SE-ként rövidítjük) alkalmazunk. A találmány egy előnyös megvalósítást módja szennt, az „olaj-vízben” emulzió szkvalént, glicerint és foszfatidil-kolint tartalmaz. Az SE-formaban az AGP-t citokinnel vagy limfokinnel keverjük, az antigenikus készítmény kialakítása céljából beadás előtt. Nem szükséges, hogy a citokin vagy limfokin az emulzióba kerüljön. A találmány

-3 egy előnyös megvalósítási módja szerint, az AGP SE-formában van. Az antigenikus készítmény tartalmazhat továbbá hígítószert vagy hordozót.

Szintén a találmány tárgyát képezik eljárások (1) patogén vírusból, baktériumból, gombából vagy parazitából kiválasztott antigént tartalmazó, antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, vagy (2) ráksejtből vagy tumorsejtből kiválasztott, rákból származó antigént vagy tumor-asszociált antigént tartalmazó, antigenikus készítmény terápiás vagy profilaktikus, rákellenes hatást kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, vagy (3) allergénből kiválasztott antigént tartalmazó, antigenikus készítmény IgE-termelést zavaró képességének fokozására, ezzel az allergénre adott allergiás válaszokat mérséklő képességének fokozására, vagy (4) egy gazdaszervezet által nem-kívánt módon, mennyiségben vagy helyen termelt molekulából (egy saját molekulából), vagy részletéből kiválasztott antigént tartalmazó, antigenikus készítmény nem-kívánt hatást csökkentő képességének fokozására, amelyben hozzáadunk hatékony adjuváns-hatást kifejteni képes mennyiségben egy citokint vagy limfokint tartalmazó kombinációt, különösen AGP-t GM-CSF-el vagy IL-12-vel, vagy a citokin vagy limfokin agonistájával vagy antagonistájával.

A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások patogén vírusból, baktériumból, gombából vagy parazitából kiválasztott antigént tartalmazó, antigenikus készítmény citotoxikus Tlimfociták termelődését kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, amelyben hozzáadunk hatékony adjuváns-hatást kifejteni képes mennyiségben egy citokint vagy limfokint tartalmazó kombinációt, különösen AGP-t GM-CSF-el vagy IL-12-vel, vagy a citokin vagy limfokin agonistájával vagy antagonistájával.

Az ábrák rövid leírása.

Az 1. ábra bemutatjuk ΑβΙ-42-peptidre specifikus ellenanyagok titereinek mértani középértékét transzgenikus egerekben, amelyeket az alábbiak szerint immunizáltunk. 1. csoport. ΑβΙ-42-peptid plusz PBS (nincs ábrázolva); 2. csoport: ΑβΙ-42-peptid plusz MPL™ SE (négyzetek); 3. csoport: ΑβΙ-42-peptid plusz MPL™ SE és GM-CSF (háromszögek); 4. csoport: ΑβΙ-42-peptid plusz 529 SE és GM-CSF (fordított háromszögek).

A 2 ábrán bemutatjuk az 1. ábránál leírtak szerint, négy, immunizált transzgenikus egércsoport agykérgében mért Αβ-összmennyiségeit.

A 3. ábrán bemutatjuk az 1. ábránál leírtak szerint, négy, immunizált transzgenikus egércsoport agykérgében mért ΑβΙ-42-peptid mennyiségeit.

-4A 4. ábrán bemutatjuk az 1. ábránál leírtak szerint, négy, immunizált transzgenikus egércsoport elülső agykérgében az amiloid-terhelést.

Az 5. ábrán bemutatjuk az 1. ábránál leírtak szerint, négy, immunizált transzgenikus egércsoport elülső agykérgében a neurit-terhelést.

A 6. ábrán bemutatjuk az 1. ábránál leírtak szerint, négy, immunizált transzgenikus egércsoport retrosplenialis agykérgében az asztrocitózis mértékét.

A 7. ábrán bemutatjuk HIV-ből származó C4(E9V)-V3 8₈₉,6p pepiidre specifikus, szérumban mért IgG-ellenanyag-titereinek mértani középértékeit cynomolgus makákó-majmok két csoportjában (4 állat csoportonként). Az 1. csoportban lévő állatokat intranazálisan kizárólag C4(E9V)-V38_g9,₆p-peptiddel immunizáltuk. A 2. csoportban lévő állatokat 529 SE-vel és GMCSF-fel formázott C4(E9V)-V38₈9_;6p-peptiddel intramuszkulárisan immunizáltuk. A nyilak a 0., 4., 8., 18. és 23. heti immunizálást jelölik.

A 8. ábrán bemutatjuk a 7. ábránál leírtak szerint kezelt állatoktól származó, cervikovaginális mosófolyadékból vett mintákban mért ellenanyag-titerek geometriai középértékét.

A 9. ábrán bemutatjuk a 7. ábránál leírtak szerint kezelt állatoktól származó, nazális mosófolyadékból vett mintákban mért ellenanyag-titerek mértani átlagát.

Adjuvánsok, citokinek és limfokinek olyan immunmodulátor anyagok, amelyek képesek különböző, önmagukban gyenge immunogén antigének ellen kifejlődött immunválaszokat fokozni és profiljukat irányítani. Megfelelően kiválasztott adjuvánsok, citokinek és limfokinek jó humorális és celluláris immunválaszokat indukálhatnak, amelyek nem alakulnának ki az adjuváns, citokin, vagy limfokin nélkül. Adjuvánsok, citokinek és limfokinek különösen jelentős hatással lehetnek az immunogén készítményekben lévő alegység- és peptid-antigének ellen kialakult immunválasz fokozásában. Stimuláló aktivitásuk kedvező hatással van fehérjeantigének elleni, antigén-specifikus imunválaszok kifejlődésére is. Sokféle olyan antigén esetén, amelyek nagymértékű mukozális választ, szérumban magas litereket, CTL indukálódást és erőteljes celluláris válaszokat igényelnek, adjuvánst és citokint/limfokint tartalmazó kombinációk olyan stimulusokat biztosítnak, melyet a legtöbb antigénkészítmény nem képes biztosítani.

Számos vizsgálatban elemeztek különböző adjuváns-készítményeket állatmodelleken, azonban emberekre jelenleg az „alum” (aluminium-hidroxid vagy alumínium-foszfát) jelentik az egyetlen, elterjedten alkalmazott, engedélyezett adjuvánst. Egy másik adjuváns a Stimulon QS21 (QS-21) [Antigenics Inc., Framingham, MA (2)]. Egy adjuváns-csoportra, amelyhez különböző „víz-olajban” vagy „olaj-vízben” kombinációkból álló stabil emulziók tartoznak, immunológiai hatékonyságot fokozó képességük miatt különös figyelem irányult. Ezek a formák ál

-5talában metabolizálható vagy inert olajok különböző kombinációiból állnak, amelyek stabihzalószerként és antigén-depóként működnek az injekció helyén. Egy ilyen adjuváns az inkomplett Freund-adjuváns (IFA), amely ásványi olajat, vizet és emulgeálószert tartalmaz. A komplett Freund-adjuvánsban (CFA) IFA plusz hővel elölt Mycobacteriumok vannak. Külön gondot okoz az ilyen típusú adjuvánsok használatánál az injekció helyének irritációja, amely gyakran granulomás elváltozásokat okozó, mononukleáris sejtinfiltráció eredménye. Ezért potenciális adjuvánsként szóba jöhető, más vegyületeket és formákat jelenleg is vizsgálnak.

Egy ilyen vegyületcsoportot alkotnak az aminoalkil-glükózamin-foszfát vegyületek (AGP-k), amelyeket az 6,113,918. számú USA-beli szabadalmi leírásban közöltek, például 2. oszlop 14. sorától a 3. oszlop 38. soráig, amelyet a kitanítás részének tekintünk (3). Az AGP-k egy aminoalkil-csoporttal (aglikonnal) rendelkeznek, amely glikozidos kötéssel kapcsolódik a 2-dezoxi-2-amino-oc-D-glükopiranózhoz (glükózamin), kialakítva az alap szerkezetet. További szubsztituens lehet a glükózamin-gyűrűn a 4. és 6. szénatomok foszforilációja, és három 3alkanoil-oxialkanoil-csoport.

Egy ilyen AGP az 529-jelű vegyület (teljes kémiai neve: 2-[(R)-3-tetradekanoil-oxitetradekanoil-amino]-etil-2-dezoxi-4-O-foszfono-3-O-[(R)-3-tetradekanoil-oxitetradekanoil]2-[(R)-3-tetradekanoil-oxitetradekanoil-amino]-p-D-glükopiranozid, amely a Corixa cég terméke (Hamilton, MT).

A Corixa cégnél előállítottak egy metabolizálható „olaj-vízben” formát is, amelyet 529el kombinálva, 529-SE-jelű, stabilizált emulziót eredményezett. A stabilizált emulziót úgy állították elő, hogy 529-et szkvalén-olajjal, glicerinnel és foszfatidil-kolinnal mikrofluidizáltak. A jelenleg gyártott forma GMP-minőségű mikrofluidizált emulzió. Az 1% olajat (bar más koncentrációkat is lehet alkalmazni) tartalmazó emulziókat a lentebb ismertetett kísérletekben írunk le.

Az 529-SE nem okozott makroszkopikusan észlelhető, szöveti patológiát, ha szubkután beadtuk Balb/c vagy Swiss-Webster egereknek. Ugyanolyan összetételű, de 529-et nem tartalmazó, stabilizált emulziót is előállítottunk, összehasonlítás céljából. Konkrétan, 40 aminosavból álló, TlSP10MN-(A)-jelű HV-peptid cisztein-deletált, 39 aminosavból álló változatával (-Cys)’ [a 40 aminosavból álló peptidböl (+Cys) hiányzik a risztéin a 17. aminosavhelyzetben], vagy az ΑβΙ-42-vel (az APP 42 aminosavból álló belső fragmense) végzett szubkután immunizálás nem okozott észrevehető gyulladást, vörösödést, duzzanatot vagy

-6rendellenes keményedést, a formázás mindkét esetben 529-SE és GM-SCF adjuvánsok kombinációjával történt.

Szintén a találmány által igényelt oltalmi körbe tartoznak az 529 és más AGP-k származékai és analógjai. Ilyen vegyületeket például a 6,113,918. számú USA-beli szabadalmi leírásban közölnek (3).

Citokinek és limfokinek beépítése immunogén készítményekbe ígéretesnek tűnt immunogén készítmények hatékonyságának kiterjesztésére és fokozására (4). Az interleukin-12-jélű citokinről (IL-12) kimutatták, hogy sejt-mediált immunitást képes kiváltani és fokozni úgy, hogy T-helper sejt-alkészlet expanzióját eltolja a Thl citokin-profíl irányába (azaz IgG2alosztály felé, egér modellben) (5-7). Egerekben kimutatták, hogy rekombináns, rágcsáló eredetű IL-12 növelte Thl-domináns immunválasz mértékét (4).

EL-12-t különböző antigénbemutató sejtek termelnek, elsősorban makrofágok és monociták. Ez kritikus eleme a Thl-sejtek naív T-sejtekből való indukciójának. Kimutatták, hogy IL-12 termelése, vagy erre válaszadó képesség döntő fontosságú a védő hatású, Thlszerű válaszok kifejlődésében, például parazita-fertőzések során, legfőképpen Leishmaniasis esetén (8), valamint patogén baktériumból vagy vírusból (9) vagy ráksejtből (10) származó antigénre adott sejt-mediált immunválasz fokozásában. EL-12 hatásait nagyrészt NK-sejtek és Thelper sejtek által termelt gamma-interferon közvetíti. A gamma interferon döntő fontosságú szerepet játszik T-sejtfuggő fehérje-antigének (11) ellen termelődő IgG2a-ellenanyagok, és a T-sejt-fiiggetlen antigénekre (12) adott IgG3-válaszok indukciójában. EL-12, melyet eredetileg természetes killersejt-stimuláló faktornak neveztek, egy heterodimer citokin (13). EL-12-fehérje rekombináns gazdasejtekből való expresszióját és izolálását leírták a WO 90/05147. számú nemzetközi közzétételi iratban.

Egy másik citokin, amely potenciálisan ígéretes adjuvánsnak tűnik, a GM-CSF. GMCSF a kolónia-stimuláló faktorok (CSF) egy adott típusa. CSF-ek a limfokinek egyik családját alkotják, melyek a csontvelőben található őssejtek specifikus, érett vérsejtekké való differenciálódását indukálják. Az 5,078,996. számú USA-beli szabadalmi leírásban közöltek szerint (15), amit a kitanítás részének tekintünk, GM-CSF makrofágokat vagy prekurzor monocitákat képes aktiválni, nem-specifikus tumorölő aktivitás mediálása céljából. A humán GM-CFS-gén nukleotidszekvenciáját leírták (15). GM-CSF-cDNS-t tartalmazó plazmidot E. coliba transzformáltak, és 39900. nyilvántartási számon deponálták az „American Type Culture Collection”-ben (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209). Az 5,229,496. számú USA-beli szabadalmi leírásban közöltek szerint (16), amit a kitanítás részé- 7nek tekintünk, GM-CSF-gént élesztőeredetű expressziós plazmidba is inszertáltak, és 53157. nyilvántartási számon deponálták az ATCC-ben. Továbbá, az 5,073,627. számú USA-beli szabadalmi leírásban közöltek szerint (17), amit a kitanítás részének tekintünk, glikozilációs helyeket nem tartalmazó GM-CSF-t kódoló DNS-szekvenciát 67231. nyilvántartási számon de5 ponáltak az ATCC-ben.

Kimutatták, hogy GM-CSF aktiválással szabályoz antigénbemutató sejtek felszínén lévő, immunválaszokat fokozni képes fehérjemolekulákat (18), és hatást képes kifejteni valamilyen elv szerint tisztított, rágcsáló eredetű B-sejtben Ig-szekréciójára (19). GM-CSF-et immunogén készítményekben alkalmazható adjuvánsként is leírták (20).

Kimutatták, hogy más citokinek vagy limfokinek is rendelkeznek immunmoduláló aktivitással, például 1-alfa, 1-béta, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17- és 18-interleukinek, alfa-, béta- és gamma-interferonok, granulocita kolónia-stimuláló faktor és az alfa- és bétatumornekrózis faktorok.

Bármely citokin vagy limfokin szisztémás beadásával kapcsolatos aggodalmak a 15 citokin- vagy limfokin-aktivitással társult biológiai következmények miatt vannak. Továbbá, antigén-specifikus immunválaszok kifejlődésével kapcsolatos citokin- vagy limfokin-hatások mértékének fokozódniuk kell, ha a citokin vagy limfokin lokális koncentrációját fenntartjuk.

Elemezték a 3-O-dezacilált monofoszforil-lipid-A-t vagy monofoszforil-lipid-A-t és GM-CSF-et vagy IL-12-t tartalmazó kombinációkat; az immunválasz különböző paraméterei20 nek j avulását figyelték meg (21).

A leírásban bemutatjuk, hogy egy antigén, kiválasztott citokin- vagy limfokin-adjuváns és a második adjuváns, egy AGP (előnyösen stabil, metabolizálható emulzióban) kombinációjával az antigénre specifikus immunválaszok mértéke fokozódik.

A találmány szerinti antigenikus készítményekbe kerülő, kiválasztott antigének lehet25 nek fehéijékből származó peptidek és polipeptidek, fehérjék valamint az alábbiak bármelyikéből származó fragmensek: szacharidok, fehéijék, poli- vagy oligonukleotidok vagy más makromolekuláris vegyületek. A leírás szerint egy „pepiid” legalább három, egymáshoz kapcsolódó aminosavból áll, és legalább egy antigén-determinánst vagy epitópot tartalmaz, míg egy „polipeptid” pepiidnél hosszabb molekula, de nem alkot teljes hosszúságú fehéijét. Ilyen 30 peptideket, polipeptideket vagy fehérjéket eltérő szerkezetű fehérjéhez, például tetanusztoxoidhoz vagy diftéría-toxoidhoz lehet konjugálni. A leírás szerint egy „fragmens” egy részletet tartalmaz, de kevesebbet, mint egy teljes szaccharid, fehéije, poli- vagy oligonukleotid

-8 vagy más makromolekuláris vegyület. HÍV esetén a találmány szerinti antigenikus készítmények továbbá teljes hosszúságú HIV-fehérjéket tartalmaznak.

A találmány szerinti megoldást elsőként HIV-ből származó peptid-antigéneket alkalmazó modellrendszerben mutatjuk be. Ezeket a peptideket leírták az 5,013,548. (22) és az 5,019,387. (23) számú USA-beli szabadalmi leírásokban, melyeket a kitanítás részének tekintünk, és most összefoglaljuk. Ezek a peptidek olyan HIV-burokfehérje-régiók aminosavszekvenciáinak felelnek meg, amelyek ellen a semlegesítő ellenanyagok termelődnek, és amely ellen T-sejtes válaszok jönnek létre.

HÍV egy humán retrovirus, amely a szerzett immunhiányos szindróma (AIDS) kórokozó ágense. A HÍV az immunrendszer T-limfocitáit fertőzi meg úgy, hogy külső, burok-glikoproteinjével a T-limfociták felszínén lévő CD4-(T4)-molekulához kapcsolódik, így a CD4(T4)molekulát receptorként felhasználva jut be, és fertőzi meg a T-sejteket. Nagyon kevés sikerrel jártak azok a próbálkozások, amelyek célja HÍV fertőzéssel szemben specifikus, védettséget biztosító immunválasz kialakítása volt immunizáláson keresztül. Jelenleg számos megközelítésben próbálnak hatékony és védettséget biztosító stratégiát kidolgozni immunogén készítmények kifejlesztésére. Ezekben HIV-eredetű antigenikus epitópokat expresszálni képes, gyengített és rekombináns bakteriális vektorokat (24), rekombináns adenovírusokat (25), vagy tehénhimlő-vírusvektorokat (26), DNS-immunizálást (27) vagy HÍV különböző T- és B-sejt epitópjait tartalmazó szintetikus peptideket (28) alkalmaznak.

Kimutatták, hogy a HÍV külső, gpl20-jelű burok-glikoproteinje képes emberben semlegesítő ellenanyagok indukálására. A PB 1-rekombináns fehéijéről (amely megfelel a teljes gpl20-molekula körülbelül egyharmadának) kimutatták, hogy magában foglalja a burokfehérjének azt a részét, amely a semlegesítő ellenanyagok termelődését indukálja. Csimpánzokon végzett vizsgálatokban azonban kimutatták, hogy sem az intakt gpl20, sem a PB1 nem képes magas titerű, semlegesítő ellenanyagok termelődését indukálni.

Hagyományos módszerekkel olyan rövid peptideket szintetizáltunk, amelyek megfelelnek gpl20 antigén-determinánsainak, és ellenanyag-választ idéznek elő gpl20 ellen, ami semlegesíti a vírust, és T-helper és CTL-válaszokat indukál a vírussal szemben.

Egy ilyen peptid a TlSP10MN(A)(+Cys)-jelű, C4/V3 többepitópos HTV-lMN-peptid, és a cisztein-deletált TlSP10MN(A)(-Cys) variáns. Ezek a peptidek Th-, T_Ctl- és B-epitópokat tartalmaznak, de nem indukálnak olyan ellenanyagok termelődését, amelyek CD4-kötődést zavarnak. Már kimutatták, hogy ezek a C4/V3-HIV-peptidek szóba jöhetnek immunválaszok indukálására, ha CFA-val vagy CFA-szerű adjuvánsokkal adják be azokat (29-34). Ezek a

-9peptidek olyan epitópokat tartalmaznak, amelyekről korábban kimutatták, hogy egérben és emberben egyaránt képesek CD4+ Th-sejtes válaszokat kiváltani, és tartalmazzák mindkét alapvető, semlegesítő determinánst, és egy olyan helyet, amely Balb/c-egekben és HLA-(B7+)emberekben egyaránt felismerhető (CD8+)-CTL által. A 39 aminosavból álló peptid immunogenitását és biztonságos alkalmazhatóságát a közelmúltban bizonyították HlV-fertőzött páciensekben (28).

TlSP10MN(A)(+Cys) az alábbi 40 aminosavból álló szekvenciával rendelkezik:

Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Alá Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ue His He Gly Pro Gly Arg Alá Phe Tyr Thr Thr Lys (31) (1. azonosítószámú szekvencia).

TlSP10MN(A)(-Cys)-t a 17. helyen cisztein nélkül szintetizáltuk, és az alábbi 39 aminosavból álló szekvenciával rendelkezik:

Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Alá Phe Tyr Thr Thr Lys (2. azonosítószámú szekvencia).

Ez a cisztein Th-sejtek, CTL- vagy B-sejtek által felismert funkcionális epitópokon kívül helyezkedik el. A vírusgénem különböző régióiból származó egyéb HIV-peptideket az 5,861,243. (35), 5,932,218. (36), 5,939,074. (37), 5,993,819. (38), és az 6,037,135. (39) számú USA-beli szabadalmi leírásokban közöltek szerint, a 671,947. (40) számú európai közzétételi iratban, és a 6,024,965. (41) számú USA-beli szabadalmi leírásban közöltek szerint, amelyeket a kitanítás részének tekintünk.

Egy 28 aminosavból álló, STl/pllC-jelű peptid-konjugátumot is alkalmaztunk. A konjugátum ST-l-jelű, 16 aminosavból álló SIV-env-ből származó T-helper pepiidet tartalmazott a 12 aminosavból álló, pllC-jelű SIV-mac-251-Gag-peptidhez (Gag 179-190. aminosavai) konjugálva (42). Kimutatták, hogy pllC-peptid tertramer-formában CTL-aktivitással rendelkezik SIV-mac-fertőzött Mamu-A*01 Rhesus-majmokban (43). Az STl-pllC-peptidkonjugátum az alábbi aminosav-szekvenciával rendelkezik:

Arg Gin He He Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp He Asn Gin Met Leu (3. azonosítószámú szekvencia);

C4-V3₈9,6P-jelű, 39 aminosavat tartalmazó peptid-konjugátumot (44) is alkalmaztuk.

A peptid-konjugátum C4-régiója (16 aminosav) a HIV-l-burokfehéije (HIV-env) negyedik konstans régiójából származik, és megfelel egy univerzális T-helper epitópnak. A peptid V3része (23 aminosav) a HIV-1-burokfehérje harmadik hipervariábilis régiójából származik, és

- 10megfelel egy fontos semlegesítő faktornak. A C4-V3₈9,6P-konjugátum az alábbi aminosav szekvenciával rendelkezik:

Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (4. azonosítószámú szekvencia).

A HIV-antigén lehet fehérje, a nevezett fehérjéből származó polipeptid, peptid vagy fragmens. A fehérje lehet glikoprotein, például gp41, gpl20 vagy gplóO. Ezzel alternatív módon, a fehérje lehet gag, pol, vif, rév, vpr, tat, nef vagy env gének által kódolt fehérje. Ilyen fehérjékből származó peptidek legalább egy olyan antigéndeterminánst (epitópot) tartalmaznak, amely legalább hat aminosavból áll.

HIV-peptidre adott immunválasz úgy fokozható, hogy a pepiidet kovalensen kapcsoljuk (konjugáljuk) gyógyászatiig elfogadható hordozó molekulához. Alkalmas hordozo molekulák például tetanusz-toxoid, diftéria-toxoid, tengeri tapadókagylóból származó hemocianin, és más, HÍV gpl20-glikoprotein T-sejtes epitópjainak megfelelő peptidek.

Jelenleg úgy tűnik, hogy HÍV elleni immunizálásra alkalmas, sikeres stratégiában HTVre specifikus, mukozális immunitásra és jó CTL-válasz kiváltására van szükség. A közelmúltban rágcsálókon végzett kísérletben, TlSP10MN(A)-jelű többepitópos-peptid és egy mukozális adjuváns, koleratoxin alkalmazásával kimutatták, hogy intranazáhs immunizálás szérumban semlegesítő IgGl-ellenanyagokat indukált (45). Egy következő, szintén HIV-V3-hurok-peptidek alkalmazásával végzett vizsgálatban kimutattak mukozálisan szintetizálódott IgA-ellenanyagok képződését, és erős celluláris választ, például peptid-specifikus CTL indukálódását (46). Magas titerű, szisztémás és semlegesítő ellenanyagok prevencióban vagy HIV-fertőzott egyének állapotának stabilizálásában betöltött funkciója nem ismert, bár feltételezik, hogy vírus-specifikus ellenanyag magas titere a vírusfertőzés teijedésének megelőzéseben fontos.

A találmány egy előnyös megvalósítás módja szerint, stabil, 529-et tartalmazó „olajvízben” emulziót formázunk, amit aztán citokinekkel, IL-12-vel vagy GM-CSF-el keverünk. Az lentebb ismertetett adatok alapján kimutatjuk, hogy 529 és GM-CSF kombinációja szérumban magas titerű HIV-semlegesítő ellenanyagok termelődését eredményezi. 529 SE es GMCSF kombinációja magas titerben indukál antigén-specifikus IgG-ellenanyagokat, beleértve IgGl és az IgG2a alosztályokhoz tartozó ellenanyagokat immunizált, nőstény egerek hüvelyének falában. 529 SE-vel és GM-CSF-fel formázott TlSP10MN(A)(-Cys)-peptiddel immunizált egerekben erős celluláris immunválasz indukálódott, fokozott antigén-specifikus celluláris proliferációval és citokinek tenyészetbe történő szekrécióval, valamint peptid-specifikus CTL

- 11 válaszok indukálódása alapján meghatározva. Hasonló eredményekhez jutottunk, ha az egereket APP-böl származó ΑβΙ-42-peptiddel plusz 529 SE-el és GM-CSf-d immunizáltuk.

Általánosságban, GM-CSF-el vagy IL-12-el és egy kiválasztott fehérjével vagy pepiiddel kombinált, 529-et vagy 529 SE-t tartalmazó antigén/adjuváns-formák magas literben 5 indukálnak antigén-specifikus és virus-semlegesítő ellenanyagokat, jelentősen eltolják az IgGalosztály-arányt úgy, hogy nagyobb részben termelődnek komplement-fixáló IgG-ellenanyagok (egérben az IgG2a kedvező), citokinek termelődését fokozzák és mononukleáris sejtekben tn vitro antigén-stimulációra sejtproliferációt indukálnak. Ezeket a tulajdonságokat 529-et nem tartalmazó, antigén/SE-formáknál nem figyeltük meg, függetlenül GM-CSF vagy 1L-12 jelenít) lététől vagy hiányától. A találmány szerinti fonnák jó celluláris válaszokat is indukálnák, CTL indukálódásával meghatározva.

Az 529 SE előnye, hogy a forma nem idéz elő granulómás felhalmozódást és gyulladást az injekció helyén; ilyen injektálási helyen kialakuló reakciókat tipikusan „víz-olajban” vagy „olaj-vízben” adjuváns-formák indukálnak.

Egy kísérletet végeztünk annak összehasonlítására, hogy a TlSP10MN(A)(-Cys)-jelű

HIV-peptidet csak 529 SE-vel, vagy (529 SE plusz IL-12)-vel vagy (529 SE plusz GM-CSF)el adtuk be.

Ebben a kísérletben (lásd lentebb, az 1. táblázatot) Balb/c-egereket szubkutan immunizáltunk 529 SE-vel formázott, TlSP10MN(A)(-Cys)-jelű HIV-peptiddel, amely csak két in20 jekció után növelte a peptid-specifikus IgG-titert szérumban. Az IgGl- és IgG2a-alosztályok liter-értékei szintén emelkedtek. Egy második adjuváus, akár GM-CSF, akár IL-12 hozzáadása megnövelte a teljes IgG valamint az IgGl-alosztály litereit. IL-12 hozzáadása növelte az IgG2a-alosztály literét; GM-CSF hozzáadása nem növelte az IgG2a-alosztály literei.

Egy másik kísérletben, funkcionális sejt-közvetített immunitás mértékeként meghatá25 roztuk hogy 529 SE-vel, vagy 529 SE plusz IL-12-vel, vagy 529 SE plusz GM-CSF-el immunizált 'egerek lépsejtjei egy készítménybe fonuázva T1SP1OMN(A)(-Cys) többepitópos pepiiddel, milyen mértékben képesek HÍV,.,·.-specifikus CTL-válaszokat létrehozni.

A 2. táblázatban bemutatottak szerint, bármelyik adjuvánssal immunizált egérből származó lépsejtek kismértékű aktivitást fejtettek ki jelöletlen vagy irreleváns, IIIB-CTL-epitóppal 30 pulzus-jelölt célsejtekre. HlVun-specifikus, CTL-mediált célsejt lízis jelentősen fokozódott, ha adjuvánsként 529 SE plusz IL-12-t alkalmaztunk, ahhoz képest, ha 529 SE-t önmagában alkalmaztuk, és még fokozottabb lett, ha 529 SE plusz GM-CSF-et alkalmaztunk (2. táblázat).

_¥ * * * * ’ aL.

- 12Egy további kísérletben Rhesus-majmokat immunizáltunk ST1-pl IC vagy C4-V3_89;6ppeptidekkel, és IFA-t vagy 529 SE plusz GM-CSF-et alkalmaztunk (a csoportokat bemutatjuk a 15. táblázatban). A vizsgálatok eredményeit bemutatjuk a 16-22. táblázatokban, és lentebb összefoglaljuk.

Az STl-pllC-peptidforma önmagában az összes tesztelt állatban jól tolerálhatónak tűnt. Azonban jelentős mellékhatásokat figyeltünk meg az injektálás helyén IFA-adjuváns alkalmazása esetén. Továbbá, valószínűleg az 529 SE/GM-CSF adjuváns-forma kisebb mértékű mellékhatása megfigyelhető meg közvetlenül az utolsó immunizálás után. IFA-t tartalmazó STl-pllC-peptidforma képes volt erőteljes plIC-specifikus celluláris immunválaszt indukálni a vizsgált a két MamuA*01 pozitív Rhesus-majom közül az egyikben. Az 529 SE/GM-CSF-t tartalmazó STl-pllC-peptidforma szintén képes volt erőteljes pllC-specifikus celluláris immunválaszt indukálni a vizsgált két Mamu-A*01 pozitív Rhesus-majom közül az egyikben.

IFA-t tartalmazó C4-V3_89;6p-peptidforma képes volt plazmában maximálisan 1:25.600-1:102.400 tartományban ellenanyag-titert létrehozni, ELISA-val mérve, és SHrV₈₉,6re és SHIV₈9,6P-re specifikus, semlegesítő ellenanyag-titert létrehozni. 529 SE/GM-CSF-et tartalmazó C4-V3₈₉,6p-peptidforma képes volt plazmában maximálisan 1:6.400-1:12.800 tartományban ellenanyag-titert létrehozni, ELISA-val mérve, és kismértékű semlegesítő ellenanyagválaszokat előidézni SHIV₈9,6-re, de SHIV₈9_;6P-re nem.

A csoportokban vizsgált kis számú állat (kettő) miatt nehéz kézzelfogható következtetéseket levonni. Azonban a humorális és celluláris immunválasz mértéke mindkét, 529 SE/GM-CSF-et tartalmazó peptidforma esetén alacsonyabb volt, mint adjuvánsként IFA-val immunizált állatokban mért immunválasz. Folyamatosan utalnunk kell arra, hogy az IFA nem jóváhagyott alkotórésze humán alkalmazásra kerülő, kereskedelmi forgalomban lévő készítményeknek. Továbbá, néhány korlátozott bizonyíték van arra, hogy a reszponzív sejtek funkcionális tulajdonságai és fenotípusa (azaz citokin-profil) különböző lehet az alkalmazott adjuvánsformától függően.

Még egy kísérletben, egy másik főemlős fajból származó állatokat, cynomolgusmakákókat immunizáltunk C4-V3₈₉,_6P-peptiddel, amelyet úgy módosítottunk, hogy a 9. helyen lévő glutaminsavat valinra cseréltük. Az így kapott C4(E9V)-V3₈9,₆p-jelű peptid-konjugátum aminosav-szekvenciája az alábbi:

Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Vai Vai Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (5. azonosítószámú szekvencia).

- 13 C4(E9V)-V3₈₉,_6P-peptiddel immunizáltunk állatokat, adjuváns nélkül vagy (529 SE plusz GM-CSF)-el kombinálva.

Az eredmények azt mutatják, hogy a C4(E9V)-V3₈₉,_6P-peptidet intramuszkuláris injekcióval, 529 SE/GM-CSF-el kombinációban beadva szignifikánsan magasabb peptid-specifíkus IgG-titert idéz elő szérumban, mint azonos mennyiségű, adjuváns nélkül intranazálisan beadott C4(E9V)-V3_89;6P-peptid (7-9. ábrák). A kísérletben kapott eredmények világosan mutatják, hogy egy HIV-peptid immunogét, megfelelő adjuváns-kombinációval beadva, képes szisztémás humorális immunitás kiváltására.

Gerinces gazdaszervezetben amiloid (egy saját molekula) lerakódásával járó betegség prevenciójára vagy kezelésére szolgáló, kívánt immunogén készítmények, amelyek találmány szerinti adjuváns-kombinációkat tartalmaznak, lehetnek olyanok, amelyek béta-amiloid prekurzor fehérje (APP) részleteit tartalmazzák. Erre a betegségre sokféleképpen utalnak, például Alzheimer-kór, amiloidózis vagy amiloidogén betegség. A β-amiloid peptid (Αβpeptidnek is nevezik) az APP egy belső, 39-43. aminosavaiból álló fragmense, amely az APPből β- és γ-szekretáz enzimek működésével alakul ki. Az ΑβΙ-42-peptid aminosavszekvenciája az alábbi:

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Alá Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala He He Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He Alá (6. azonosítószámú szekvencia).

Egyes páciensekben az amiloid lerakódás aggregált Αβ-peptid formájában jelentkezik. Meglepő módon, a közelmúltban azt találták, hogy izolált Αβ-peptid beadása immunválaszt indukál amiloid-lerakódásban található Αβ-peptid-komponens ellen, gerinces gazdaszervezetben (47). Tehát, a találmány szerinti immunogén készítmények találmány szerinti adjuvánskombinációkat, plusz Αβ-peptidet, valamint Αβ-peptid fragmenseit, származékait vagy módosított változatait, és Αβ-peptidre vagy fragmenseire, származékaira vagy módosított változataira specifikus ellenanyagokat tartalmaznak. Az Αβ-peptid egy ilyen, 28 aminosavból álló fragmense a következő szekvenciával rendelkezik (48):

Asp Alá Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Alá Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (7. azonosítószámú szekvencia).

Az Αβ-peptid érdeklődésre számot tartó fragmensei például az 1-10., 1-7., 1-6., 1-5., 3-7., 1-3. és 1-4. aminosavakat tartalmazó ffagmensek, melyeket nem-konjugált formában vagy egy eltérő szerkezetű fehérjéhez kapcsolva lehet beadni.

- 14Vizsgálat-sorozatot végeztünk az ΑβΙ-42-peptiddel és különböző adjuvánsokkal. Most bemutatjuk az eredmények összefoglalását.

Egy első kísérletben Swiss-Webster-egereket immunizáltunk szubkután a farukon, ΑβΙ-42-peptiddel, ami peptid-specifikus IgG, IgGl és IgG2a ellenanyag-titereket eredményezett, ami azt mutatja, hogy az ΑβΙ-42-peptid potenciálisan jól alkalmazható antigén. GM-CSF hozzáadása 529 SE-hez és ΑβΙ-42-peptidhez szérumban az IgG, IgGl és IgG2a ellenanyagtiterek emelkedését eredményezte olyan recipiens szervezetekhez képest, amelyek 529 SE-t és ΑβΙ-42-peptidet kaptak (lásd 3-8. táblázatok). (529 SE plusz GM-CSF)-kombinációval immunizált, egyes egerek szérumában, az ellenanyagok sok esetben nagyobb mértékben és gyorsabban növekedtek, mint azokban az egerekben, amelyek csak 529 SE-t kaptak (adatokat nem mutatjuk). Amikor ezt az első kísérletet idősebb (6-8 hónaposak, a 3 hónaposnál fiatalabbak helyett) Swiss-Webster-egerekkel megismételtük, a 3-8. táblázatokban bemutatott eredményekhez hasonlókat kaptunk (az adatokat nem mutatjuk be).

Egy második kísérletben Swiss-Webster-egereket immunizáltunk szubkután a farukon, ΑβΙ-42-peptiddel és 529-SE-vel, továbbá különböző mennyiségű GM-CSF-el. IgG végponttiterek dózisfuggő módon növekedtek a GM-CSF növekvő mennyiségének függvényében (0,11-től 10 pg-ig) (9. táblázat). 529 SE-t plusz GM-CSF-et tartalmazó, minden kombinációval magasabb IgG-titereket kaptunk, mint egy másik adjuváns, QS21 alkalmazásával immunizált csoportokban, egyedül vagy GM-CSF-el együtt alkalmazva. Különböző összetételű, 529 SE plusz GM-CSF alkalmazásával immunizált csoportokban az IgGl-alosztály titerei szintén magasabbak voltak, ahhoz a csoporthoz képest, amelyben az állatok első dózisként 529 SE plusz GM-CSF-et, második dózisként csak 529 SE-t kaptak (10. táblázat). Különböző 529 SE plusz GM-CSF alkalmazásával immunizált csoportokban az IgG2a-alosztály titerei is emelkedtek, a csak 529 SE-t kapott csoporthoz képest, dózis-függő módon (11. táblázat).

Egy harmadik kísérletben Swiss-Webster-egereket immunizáltunk szubkután a farukon, ΑβΙ-42-peptiddel és 529 SE-vel, GM-CSF eltérő mennyiségeivel, vagy anélkül. A különböző 529 SE plusz GM-CSF (0,5-2-től 5-10 pg-ig) alkalmazásával immunizált csoportokban növekedtek az IgG végpont-titerek, bár nem dózisfuggő módon (12. táblázat). A különböző 529 SE plusz GM-CSF alkalmazásával immunizált csoportokban az IgGl- és IgG2a-alosztályok titerei is növekedtek, a kizárólag 529 SE-t kapott csoporthoz képest, bár nem dózisfüggő módon (13. [IgGl] és 14. táblázat [IgG2a]).

- 15 Egy negyedik kísérletben olyan transzgenikus egereket alkalmaztunk, amelyek a βamiloid prekurzor fehérje (APP) egy olyan variáns formáját expresszálják, amelyben a 717. helyzetben mutáció van, valin helyett fenilalanint tartalmaz (49). Ez a mutáció emberekben az öröklődő Alzheimer-betegséggel asszociált. Ezekben a transzgenikus egerekben (PDAPP5 egerekben) progresszíven kifejlődik Alzheimer-kór több patológiai jegye, például Αβlerakódások, neurit-plakkok és asztrocitózis, így humán Alzheimer-kór állatban működő modelljeként lehet alkalmazni.

Ebben a negyedik kísérletben PDAPP-egereket szubkután immunizáltunk Αβ1-42peptiddel, különböző adjuvánsokkal vagy azok nélkül, az A-táblázatban feltüntetett dózisok10 kai. Konkrétan, az 1. csoport egér pozitív kontrollként ΑβΙ-42-peptidet kapott MPL™-lel (Corixa, Hamilton, MT), stabil emulzió formájában (SE); a 2. csoport egér ΑβΙ-42-peptidet, és MPL™ SE plusz rágcsáló eredetű GM-CSF-et; a 3. csoport egér ΑβΙ-42-peptidet és 529 SE plusz rágcsáló eredetű GM-CSF-et; a 4. csoport egér negatív kontrollként PBS-t kapott. A 2. és 3. csoportokban az οηίΐ-Αβ1-42 ellenanyag-titer értékei gyorsabban növekedtek, és ma15 gasabb maximális értéket ért el, mint az 1. vagy a 4. csoportban. Azonban a 2. és 3. csoportban a titerek 2-3 hónap alatt az L, pozitív kontroll csoportban mért literekkel azonos értékekre csökkentek (A. ábra). Az L, 2. és 3. csoportokban az agyban lévő Αβ-mennyiség szignifikánsán csökkent, ELISA-val meghatározva (B-C-táblázatok és B-C. ábrák), alacsonyabb amiloidterhelés (D-táblázat és D. ábra), és kisebb mértékű neurit-disztrófia (E-táblázat és E. ábra) volt 20 a 4., negatív kontroll csoporthoz képest. A 2. és 3. csoportokban szignifikánsan csökkent az asztrocitózis mértéke az L, pozitív kontroll csoporthoz képest (F. ábra).

Tehát úgy tűnik, hogy 529 SE és GM-CSF vagy IL-12 adjuváns tulajdonságai együtt formázva szinergikusak.

A találmány szerinti antigenikus készítmények immunválaszt képesek modulálni úgy, 25 hogy javítják a gerinces gazdaszervezetben az ellenanyag-választ és sejtközvetített immunitást egy antigenikus készítmény beadása után, amely egy patogén vírusból, baktériumból, gombából vagy parazitából kiválasztott antigént és hatékony adjuváns-hatást kifejtem képes mennyiségben AGP-t, például 529-et tartalmaz (vizes oldatban vagy stabil emulzió formában), citokinnel vagy limfokinnel, különösen GM-CSF-el vagy IL-12-vel kombinálva. Kimutatták, hogy más 30 citokinek vagy limfokinek is rendelkeznek immunmoduláló aktivitással, például 1-alfa, 1-beta, 2- 4- 5- 6- 7- 8-, 10-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- és 18-interleukin, alfa-, béta- és gammainterferonok, granulocita kolónia-stimuláló faktor és alfa- és béta-tumornekrózis faktor.

- 16Bizonyos citokinek vagy limfokinek agonistái vagy antagonistái szintén a találmány által igényelt oltalmi körbe tartoznak. A leírásban „agonista” kifejezésen egy olyan molekulát értünk, amely a citokinek vagy limfokinek aktivitását fokozza, vagy azokkal megegyező módon működik. Ilyen agonista például a citokinek vagy limfokinek mimetikuma. A leírásban „antagonista” kifejezésen egy olyan molekulát értünk, amely gátolja vagy megakadályozza a citokinek vagy limfokinek aktivitását. Ilyen antagonista például a szolubilis IL-4-receptor és a szolubilis TNF-receptor.

A leírásban a „hatásos adjuváns-hatást kifejteni képes mennyiség” kifejezésen a találmány szerinti adjuváns-kombinációk olyan dózisát értjük, amely alkalmas a kiválasztott antigénnel szemben fokozott immunválasz kiváltására gerinces gazdaszervezetben, olyan gazdaszervezethez viszonyítva, amelynek a kiválasztott antigént az adjuváns-kombináció nélkül adtuk be. A konkrét dózis függ részben a gazdaszervezet életkorától, testtömegétől és egészségi állapotától, valamint az antigén beadási módjától. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az adjuváns-kombinációban 529-et 0,1-500 pg/dózistartományban alkalmazunk; a találmány egy előnyösebb megvalósítási módja szerint, a tartomány 1-100 pg/dózis. Alkalmas dózisokat szakember könnyen képes meghatározni. A találmány szerinti antigenikus készítményeket szokásos módon keverni lehet immunológiailag elfogadható hígítószerekkel vagy hordozókkal, injektálható, folyadék-formájú oldatok vagy szuszpenziók előállítása céljából.

A találmány szerinti antigenikus vagy immunogén készítményeket különböző módon adjuk be embernek vagy nem-humán gerinceseknek, például intranzálisan, orálisan, vaginálisan, rektálisan, parenterálisan, intradermálisan, transzdermálisan (lásd például a WO 98/20734. számú nemzetközi közzétételi iratban leírtakat (50), melyet a kitanítás részének tekintünk), intramuszkulárisan, intraperitoneálisan, szubkután, intravénásán vagy intraartériásan. Az antigénkomponens vagy az antigenikus készítmény összetevőinek mennyisége részben függ az antigén minőségétől, valamint a gazdaszervezet életkorától, testtömegétől és egészségi állapotától valamint a beadás módjától. Ismét megemlítjük, hogy alkalmas dózisokat szakember könnyen képes meghatározni. Előnyös, de nem szükséges az antigén és az adjuváns-kombinációk egyidejű beadása. Az antigenikus készítmény dózisainak számát, a beadási rendet szakember könnyen képes meghatározni. Bizonyos esetekben az adjuvánsok-kombinációk adjuváns tulajdonságai csökkenthetik a szükséges dózisok számát vagy kezelés időtartamát.

A találmány szerinti adjuváns-kombinációk alkalmasak antigenikus vagy immunogén készítményekben való alkalmazásra, amelyek széles körből származó, patogén mikroorganizmusokból például embereket és nem-humán gerinceseket fertőzni képes vírusokból, baktériu- 17mokból, gombákból vagy parazita mikroorganizmusokból származó, különféle antigéneket, vagy ráksejtből vagy tumorsejtből származó, különféle antigéneket tartalmaznak. Az antigén tartalmazhat fehérjékből származó peptideket vagy polipeptideket, valamint az alábbiakból származó fragmenseket: szacharidok, fehérjék, poli- vagy oligonukleotidok, rák- vagy 5 tumorsejtek, allergének, saját molekulák (például amiloid prekurzor fehérje), vagy egyéb makromolekuláris vegyületek. Bizonyos esetekben, az antigenikus készítmény egynél több antigént tartalmaz.

A találmány szerinti adjuváns-kombinációkat tartalmazó, kívánt virális immunogén készítmények például humán immundeficiencia vírus, majomban előforduló itnmundeficiencia ví10 rus, respirációs syncytialis vírus, 1-3. típusú parainfluenza-vírus, influenza-vírus, herpesz simplex vírus, humán citomegalovírus, hepatitisz-A vírus, hepatitisz-B vírus, hepatitisz-C vírus, humán papillomavirus, poliovirus, rotavirus, calicivírusok, kanyaró vírusa, mumpsz vírusa, rubeola vírusa, adenovirus, veszettség (rabies) vírusa, kutyában előforduló szopornyica vírusa, keleti marhavész vírusa, humán metapneumovírus, madárban előforduló pneumovírus (koráb15 ban pulykában előforduló rhinotracheitisz vírusa), hendravírus, Nipah-vírus, koronavírus, parvovirus, fertőző rinotracheitisz-vírusok, kutyában előforduló leukémia-vírus, kutyában előforduló, fertőző peritonitisz vírus, madárban előforduló fertőző burzális betegség vírus, Newcastle-betegség vírusa, Marek-féle betegség vírusa, sertés légzőszervi és reproduktív szindróma vírusa, lóban előforduló arteritisz vírus és különböző enkefalitisz-vírusok által oko20 zott betegség prevenciójára és/vagy kezelésére alkalmasak.

A találmány szerinti adjuváns-kombinációkat tartalmazó, kívánt bakteriális immunogén készítmények például Haemophilus influenzae (mind a tipizálható és nem-tipizálható törzsek), Haemophilus somnus, Noraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria 25 meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Alloiococcus otiditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholera, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare complex, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella múltoddá, Actinobacillus pleuropneumoniae és Mycoplasma gallisepticum által okozott betegség prevenciójára és/vagy kezelésére alkalmasak.

- 18 A találmány szerinti adjuváns-kombinációkat tartalmazó, gomba-patogének ellen alkalmazható, kívánt immunogén készítmények például Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus és Histoplasma által okozott betegség prevenciójára és/vagy kezelésére alkalmasak.

A találmány szerinti adjuváns-kombinációkat tartalmazó, paraziták ellen alkalmazható, kívánt immunogén készítmények például Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii és Pneumocystis carinii által okozott betegség prevenciójára és/vagy kezelésére alkalmasak.

A találmány szerinti adjuváns-kombinációkat tartalmazó, gerinces gazdaszervezetben terápiás vagy profílaktikus rákellenes hatást kiváltani képes, kívánt immunogén készítmények rákból származó antigént vagy tumor-asszociált antigént tartalmaznak, ilyenek például prosztata-specifikus antigén, karcinoembrionális antigént, MUC-1, Her2, CA-125 és MAGE-3.

A találmány szerinti adjuváns-kombinációkat tartalmazó, gerinces gazdaszervezetben allergének elleni válaszokat mérsékelni képes, kívánt immunogén készítmények allergént vagy fragmensét tartalmazzák. Ilyen allergénekre példákat találhatunk az 5,830,877. számú USAbeli szabadalmi leírásban (51) és a WO 99/51259. számú nemzetközi közzétételi iratban (52), amelyeket a kitanítás részének tekintünk, és például lehet virágpor, rovarméreg, állati méreg, gombaspóra és gyógyszerek (például penicillin). Az immunogén készítmények zavarják az IgEellenanyagok termelődését, amely allergiás reakciók ismert oka.

A találmány szerinti adjuváns-kombinációkat tartalmazó, gerinces gazdaszervezetben saját molekulák elleni válaszokat mérsékelni képes, kívánt immunogén készítmények egy saját molekulát vagy fragmensét tartalmazzák. Ilyen saját molekulák, a fentebb leírt Αβ1-42peptiden kívül, például cukorbetegségben szerepet játszó inzulin-p-lánc, gyomor- és nyelőcső reflux betegségben szerepet játszó G17-molekula és olyan antigének, melyek autoimmun válaszokat leszabályoznak olyan betegségekben, mint például szklerózis multiplex, lupusz és reumatoid artritisz.

HÍV és SIV esetén az antigenikus készítmények tartalmaznak legalább egy fehérjét, polipeptidet, pepiidet, vagy a fehérjéből származó fragmenst. Bizonyos esetekben több Hívből vagy SIV-ből származó fehérje, polipeptid, peptid és/vagy fragmens van az antigenikus készítményben.

A találmány szerinti kombinációs adjuváns-formák alkalmazhatók adjuvánsként polinukleotid-immunogén készítményekben is (DNS-immunogén készítményként is ismeretesek). Ilyen immunogén készítmények tartalmazhatnak továbbá facilitáló ágenseket, például

- 19bupivicaine-t [lásd 5,593,972. számú USA-beli szabadalmi leírást (53), amit a kitanítás részének tekintünk],

A találmány alaposabb megértése céljából bemutatjuk az alábbi példákat. A példák csupán illusztrációként szolgálnak, amelyekkel nem kívánjuk a találmány által igényelt oltalmi kört 5 korlátozni.

1. példa

Anyagok és módszerek

Az alábbi, 2-7. példákban ismertetett kísérletekben a következő anyagokat és módsze10 reket alkalmaztuk.

Állatok

Nőstény, 7-9 hetes Balb/c-egereket a Taconic Farms, Inc. cégtől (Germantown, NY) szereztünk be. Nőstény, 7-9 hetes Swiss-Webster-egereket szintén a Taconic Farms, Inc. cégtől szereztünk be. Minden egeret az „American Association for Accreditation of Laboratory 15 Animal Care” által jóváhagyott körülmények között helyeztünk el. Az egereket a vizsgálatok megkezdése előtt egy hétig akklimatizáltuk a tartási körülményekhez.

Antigének

Lentebb, a 2-3. példákban leírt HIV-kísérletekben két különböző szintetikus pepiidet alkalmaztunk. A többepitópos T1SP1OMN(A)(-Cys) HIV-l-peptid (MN-10-nek is jelöljük) 20 szekvenciája az alábbi:

Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Alá Phe Tyr Thr Thr Lys (2. azonosítószámú szekvencia). Ezt a pepiidet korábban már leírták (33, 34), és HIV-1 gp 120-ból származó szekvenciákat tartalmaz, amely egérben és emberben egyaránt képes CD4+ Th-sejtes vála25 szokat kiváltani, továbbá egy alapvető semlegesítő determinánst, és Balb/c-egerekben CD8+ CTL által felismert helyet tartalmaz. A pepiidet Dr. R. Scearce (Duke University, Durham, NC) biztosította. CTL-analízishez egy IHB-jelű, eltérő szerkezetű (irreleváns) peptidet alkalmaztunk összehasonlításképpen. Ez a pepiid megfelelt a HIV-1-πιβ V3-loop-jában egy CTLepitópnak (Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr He; 8. azonosítószámú szekvencia), és a 30 Genosys Biotechnologies Inc. cégtől (The Woodlands, TX) szereztük be. Közvetlenül az alkalmazás előtt a peptideket steril vízben feloldottuk, és megfelelő pufferekkel vagy sejttenyészet tápközegével hígítottuk.

-20Az alábbi 4-6. és 8. példákban leírt, amiloiddal kapcsolatos kísérletekben ΑβΙ-42-jelű pepiidet alkalmaztunk. Az Αβ1-42 szekvenciája az alábbi:

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Alá Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala He He Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He Alá (6. 5 azonosítószámú szekvencia).

Ezt a pepiidet korábban már leírták (47), és megfelel az amiloid prekurzor fehérje belső, 42 aminosavból álló fragmensének. Az ΑβΙ-42-t az Elan Pharmaceuticals cégtől (South San Francisco, CA) szereztük be. A pepiidet steril vízben oldottuk, és megfelelő pufferekkel vagy sejttenyészet tápközegével hígítottuk felhasználás előtt.

Adjuvánsok

Minden 529-tartalmú adjuváns-készítményt a Corixa cégtől (Hamilton, MT) szereztünk be. 529 SE-t előzetesen formázott, szkvalén alapú „olaj-vízben” (0,8-2,5% olaj) emulzióként preparáltunk, amelyben az 529 koncentrációja 0-50 pg/ml tartományban volt. Alumíniumfoszfátot házilag állítottunk elő. Komplett Freund-adjuvánst (CFA) és inkomplett adjuvánst 15 (IFA) a Difco Laboratories cégtől (Detroit, MI) szereztünk be. A TlSP10MN(A)-peptideket és Freund-adjuvánsokat 1:1 arányban emulgeáltuk két összekapcsolt fecskendő alkalmazó sával. Rekombinánsan expresszált, rágcsáló eredetű IL-12-t a Genetics Institute (Cambridge, MA) biztosította. Rekombináns, rágcsáló eredetű GM-CSF-t a Biosource International cégtől (Camarillo, CA) szereztünk be hordozómentes, liofílizált por formájában. StimulonTM QS-2120 t Antigenics Inc. cégtől (Framingham, MA) szereztünk be.

Immunizálások

Egereket farukon szubkután immunizáltunk 0,2 ml össztérfogatú oltóanyaggal, melyet a far mindkét oldalán egyenlően elosztottunk. Az immunizálásokat különböző időintervallumonként végeztünk, a lentebb jelöltek szerint. Antigéneket és citokineket az immunizálás előtt 25 16 órán belül, foszfát-pufferolt nátrium-klorid-oldatban hígítottunk megfelelő koncentrációkra, és adjuvánsokkal formáztuk steril körülmények között. Az immunogén készítményeket óvatos rázogatással összekevertük, és 4°C-on tároltuk. A formákat közvetlenül immunizálás előtt vortexszel összekevertük.

Szérum analízise enzimkapcsolt immunoszorbens vizsgálati eljárások alkalmazásával 30 Állatoktól vért vettünk közvetlenül az immunizálás előtt a jelölt időpontokban. A szérum analízisét az egyes titerek geometriai átlagértékeként adtuk meg. HIV-peptid-specifikus ellenanyag és alosztály-eloszlásának analízisére a pepiidet felszuszpendáltuk karbonát

-21 pufferben (15 mM Na₂CO₃, 35 mM NaHCO₃, pH 9,6) vagy PBS-ben 1 pg/ml koncentrációban, és 96 mérőhelyet tartalmazó, mikrotiter-tálcákra (Nunc) szélesztettük 100 μΐ térfogatban. Egy éjszakán át inkubáltuk 37°C-on, majd a tálcákat mostuk, és szobahőmérsékleten, 2-4 óra hosszáig blokkoltuk (0,1% zselatin/PBS). Az ELISA-tálcákat mosó-pufferrel (PBS, 0,1%

Tween™20) mostuk, majd hozzáadtuk a szérumból készült hígítási sort (PBS, 0,1% zselatin, 0,05% Tween™20, 0,02% nátrium-azid). 4 óra hosszáig inkubáltuk, majd a mérőhelyeket mostuk, és hozzáadtunk biotinilált anti-izotípus/alosztály ellenanyagokat megfelelő hígításban, és egy éjszakán át inkubáltuk 4°C-on. A mérőhelyeket mostuk és sztreptavidinnel konjugált, tormából származó peroxidázzal inkubáltuk. Inkubálás után a mérőhelyeket mostuk, és ABTS10 el előhívtuk. A mérőhelyeken az OD-t 405 nm-en olvastuk le. A litereket kontroll szérumok alkalmazásával standardizáltuk.

Ugyanezt az eljárást követtük az ΑβΙ-42-peptid-specifíkus ellenanyag és alosztályeloszlás analízisénél, kivéve, hogy 0,3 pg/ml koncentrációt alkalmaztunk mikrotiter-tálcánként.

Sejt-preparátumok

Proliferációs vizsgálati eljárásokhoz és in vitro citokin-analízishez egerekből kivettünk lépsejteket a megjelölt időpontokban. Egy-sejt szuszpenziókat preparáltunk 3-5 egérből álló csoportokból. A proliferációs és citokin-analízishez a sejteket felszuszpentáltuk U-alakú, 96 mérőhelyet tartalmazó tálcákban, melyeket előzőleg egy éjszakán át burkoltunk HIV-peptidantigénekkel, kontroll fehéijékkel vagy RPMI-10-el egyedül. Hozzáadtunk lépsejteket 5 x 10⁵ sejt/tenyészhely mennyiségben, 2x kiegészítéseket tartalmazó tápközeg alkalmazásával. A sejttenyészet felülúszóit elkülönítettük, 3 párhuzamos tenyésztőhelyről citokin-analízishez, a tenyésztés elindítása után 3 vagy 6 nappal. Közvetlenül a felülúszó elkülönítése után a tenyészeteket 18-24 óra hosszáig pulzáltuk ³H-timidinnel, és elkülönítettük a sejtproliferáció mértékének meghatározására.

2. példa

Reciprok anti-TlSP10MN(A)(-Cvs) végpont-titerek összes IgG-re és alosztályokra

A reciprok végpont-titereket IgG-alosztályokra 5 héttel az első immunizálás után, 2 héttel a második immunizálás után mértük, egyesített szérumokban (n=5 Balb/c). Az egereket a 0. és 3. héten, 25 pg TlSP10MN(A)(-Cys)-val immunizáltuk intramuszkulárisan farba, 0,2 ml össztérfogatban, oldalanként egyenlően elosztva, két 0,1 ml-es injekcióban. 529 SE-t úgy hígítottuk, hogy emulziót készítettünk, amely 1,25% szkvalén-olajat és dózisonként 25 μg

-22 529-t tartalmazott. Az SE „olaj-vízben” emulziós vivőanyag, amely szkvalénből, glicerinből és emulgeáló ágensből áll. Rekombináns, rágcsáló eredetű IL-12-t 40 ng/egér mennyiségben adtunk be. Rekombináns, rágcsáló eredetű GM-CSF-t 25 pg/egér mennyiségben adtunk be. Az eredményeket bemutatjuk az 1. táblázatban, a titereket geometriai átlagértékek formájában, 5 standard hibákkal az egyes csoportokra.

1. táblázat

Reciprok anti-TlSP10MN(A)(-Cys) IgG teljes és alosztályoknak megfelelő végpont-titerek

Adjuvánsok	Pg HIV-peptid	Végpont-titerek
IgG	IgGl	IgG2a
529 (25) SE (1,25% olaj)	25	206.301 +/- 175.149	37.567+/- 31.526	180.671 +/- 277.211
529 (25) SE (1,25% olaj)+ rIL-12 (0,04)	25	460.516+/- 690.712	74.269 +/- 169.868	222.446 +/- 400.716
529 (25) SE (1,25% olaj)+ GM-CSF (25)	25	1.085.658 +/- 1.064.924	238.379 +/- 62.199	117.657+/- 25.301

3. példa

CTL-analízis Balb/c-egerekben

Egereket immunizáltunk a 2. példában leírt eljárás szerint. A második immunizálás utáni 14. napon meghatároztuk az egerekből izolált lépsejtek CTL-aktivitását. 529 SE formázása az alábbiak szerint történt: 25 pg, 1,25% olajat tartalmazó 529 SE, 10 pg GM-CSF-el vagy 40 ng 15 IL-12-vel vagy azok nélkül, plusz 25 pg T1SP1OMN(A)(-Cys).

CTL-analízishez kivettünk lépsejteket immunizált egerekből 14 nappal a második immunizálás után. Lényegében leírt eljárást (39) követtünk. Röviden összefoglalva, csoportonként három egérből származó, eritrocitáktól kimerített lépsejteket összetöltöttünk. Effektor lépsejteket (4 x 10⁶/ml) újra stimuláltunk 24 tenyésztőhelyet tartalmazó tálcákon, 1,5-2 ml 20 térfogatban, 7 napig, 1 pg/ml „MN-10”-peptiddel vagy 10-tagú CTL-epitóp „ΙΙΙΒ’’-peptiddel, vagy HIV-peptid nélkül. Mindkét CTL-epitóp H-2D^d-re korlátozódott. A tenyészeteket a tenyésztés utolsó 5 napjára kiegészítettük 10 U/ml, rekombináns rágcsáló eredetű IL-2-vel • · · · · · .:.. ·..· .u. ·-·.:..

-23 (Biosource). Citotoxikus aktivitás elemzéséhez P815-sejteket megjelöltünk Cr⁵¹-el, és 5 pg/ml pepiiddel (IIIB vagy MN-10) pulzáltunk 4 óra hosszáig, és hozzáadtuk a tenyésztett effektor lépsejtekhez. Ahol nem HIV-peptidet alkalmaztunk, a célsejt-készletet nem pulzáltuk. Az effektor-sejt/célsejt-arányokra („E:T”) harmadoló hígítási sort készítettünk 30:1-től 1,1:1-ig.

Százalékos CTL-aktivitást a króm-felszabadulás százalékos arányaként számítottuk az alábbiak szerint: [(specifikus króm-felszabadulás - spontán króm-felszabadulás)/(maximális krómfelszabadulás - spontán króm-felszabadulás)] x 100. A króm-felszabadulást 6 óra inkubálás után határoztuk meg. Az átlagos spontán króm-felszabadulás mindig kevesebb volt, mint a maximális felszabadulás 15%-a. A 28. napon mért adatokból számított eredményeket bemutatjuk 10 a 2. táblázatban.

2. táblázat

Effektor/cél-arányok

	MN-10-peptid	IIIB-peptid	Pepiid nélkül
529SE+	*	IL-12	GM-CSF	*	IL-12	GM-CSF	*	IL-12	GM-CSF
E:T% spec, felszab.
30:1	31	53	71	8	11	19	4	8	8
10:1	19	41	70	5	8	21	2	5	9
3,3:1	5	11	35	2	1	5	-2	-2	-1
1,1:1 * ?	2	4	14	1	0	2	-3	-2	-3

* Nincs hozzáadott adjuváns

4. példa

Reciprok anti-A01-42 végpont-titerek összes IgG-re és alosztályokra

Kitenyésztett Swiss-Webster-egereket elosztottunk 10 egérből álló csoportokba. Az egyes csoportokban az állatokat 30 pg ΑβΙ-42-peptiddel immunizáltuk, amely az APP egy 20 belső, 42 aminosavból álló régiójának felel meg. Az alábbi adjuvánsokat alkalmaztuk: első csoport: az állatok nem kaptak adjuvánst; második csoport: 50 pg 2,5% olajat tartalmazó 529 SE; harmadik csoport: 50 pg 2,5% olajat tartalmazó 529 SE plusz 10 pg GM-CSF; negyedik csoport: 10 pg GM-CSF; ötödik csoport: 1,25% olajat tartalmazó SE; hatodik csoport: 1,25%

-24olajat tartalmazó 529 SE plusz 10 gg GM-CSF; hetedik csoport: 50 μg QS-21. Az egereket szubkután immunizáltuk farba, 0,2 ml Össztérfogattal, egyenlően elosztva mindkét oldalra a farok/far tövénél. Az immunizálásokat a 0. és 3. héten végeztük.

Az egerektől a 0., 20., 35. és 70. napon vért vettünk. Az egerektől vett szérumokat egyedileg vizsgáltuk. Reciprok anti-Apl-42-peptid, IgG-osztályra és alosztályra vonatkozó végpont-titereket egyedi szérumokból (n=10 Swiss-Webster) az 5. és 10. héten mértünk. Az IgG végpont-titerek eredményeit bemutatjuk a 3. (5. hét) és 4. (10. hét) táblázatban. Az IgGlalosztályra kapott eredményeket bemutatjuk az 5. (5. hét; adjuvánst nem kapott vagy QS-21-et kapott csoportokban nem mértünk) és 6. (10. hét) táblázatban. Az IgG2a-alosztályra kapott eredményeket bemutatjuk a 7. (5. hét; adjuvánst nem kapott vagy QS-21-et kapott csoportokban nem mértünk) és 8. (10. hét) táblázatban.

-25 3. táblázat

Αηΐί-ΑβΙ-42 IgG végpont-titerek az 5. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
Nincs	12.976	+/- 14.386
529 SE (50)	16.204	+/-225.221
529 SE (50) + GM-CSF (10)	608.474	+/- 623.575
GM-CSF (10)	214.497	+/- 609.067
SE (1%)	33.342	+/- 15.493
SE (1%) + GM-CSF (10)	453.367	+/- 162.750
QS-21 (50)	4076	+/- 9036

4. táblázat

Αηίΐ-Αβ1-42 IgG végpont-titerek a 10. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
Nincs	21.426	+/- 24.959
529 SE (50)	86.847	+/- 187.792
529 SE (50) +GM-CSF (10)	943.075	+/- 989.177
GM-CSF (10)	1.049.414	+/- 390.525
SE (1%)	255.631	+/- 114.025
SE (1%) + GM-CSF (10)	1.005.899	+/-407.108
QS-21 (50)	47.222	+/- 159.775

5. táblázat

Αηίϊ-Αβ1-42 IgGl végpont-titerek az 5. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
529 SE (50)	461	+/- 627
529 SE (50) + GM-CSF (10)	1936	+/- 12.680
GM-CSF (10)	8654	+/- 10.100
SE (1%)	4515	+/- 6273
SE (1%) + GM-CSF (10)	24.422	+/- 19.764

-266. táblázat Αηίΐ-Αβ1-42 IgGl végpont-titerek a 10. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
Nincs	2086	+/- 2448
529 SE (50)	969	+/- 521
529 SE (50) + GM-CSF (10)	2076	+/- 4901
GM-CSF (10)	8483	+/- 10.998
SE (1%)	3623	+/- 3456
SE (1%) + GM-CSF (10)	12.472	+/- 11.502
QS-21 (50)	988	+/- 895

7. táblázat

Αηίϊ-Αβ1-42 IgG2a végpont-titerek az 5. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
529 SE (50)	2224	+/- 10.099
529 SE (50) + GM-CSF (10)	94.764	+/- 849.173
GM-CSF (10)	25.554	+/- 13.191
SE (1%)	1484	+/- 2271
SE (1%) + GM-CSF (10)	8405	+/-31.303

8. táblázat

Αηΐί-Αβ1-42 IgG2a végpont-titerek a 10. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
Nincs	5910	+/- 39.626
529 SE (50)	5944	+/- 9100
529 SE (50) + GM-CSF (10)	47.694	+/- 88.053
GM-CSF (10)	64.910	+/- 54.824
SE (1%)	2350	+/- 2326
SE (1%) + GM-CSF (10)	7421	+/-31.153
QS-21 (50)	3544	+/- 26.332

• »· ·

5. példa

Reciprok anti-A01-42 végpont-titerek összes IgG-re és alosztályokra, különböző mennyiségű GM-CSF alkalmazásával

Kitenyésztett Swiss-Webster-egereket elosztottunk 10 egérből álló csoportokba. Mind5 két csoportban az állatokat kétszer immunizáltuk 30 pg ΑβΙ-42-peptiddel a 0. és a 3. héten.

Az alábbi anyagokkal immunizáltunk: első csoport: 25 pg 529 SE plusz 10 pg GM-CSF; második csoport: 25 pg 529 SE plusz 1 pg GM-CSF; harmadik csoport: 25 pg 529 SE plusz 0,1 pg GM-CSF; negyedik csoport: első dózis 25 pg 529 SE plusz 10 pg GM-CSF, majd második dózis csak 25 pg 529 SE; ötödik csoport: 25 pg QS-21; hatodik csoport: 25 pg QS-21 plusz 10 10 pg GM-CSF. Az egereket szubkután immunizáltuk farba, 0,2 ml össztérfogattal, egyenlően elosztva mindkét oldalra a farok/far tövénél.

Az egerektől a 0., 21. és 42. napon vért vettünk. Reciprok anti-A01-42, IgG-osztályra és alosztályra vonatkozó végpont-titereket egyedi szérumokból (n=10) a 6. héten mértünk. Az IgG végpont-titerek eredményeit bemutatjuk a 9. táblázatban. Az IgGl-alosztályra kapott 15 eredményeket bemutatjuk a 10. táblázatban. Az IgG2a-alosztályra kapott eredményeket bemutatjuk all. táblázatban.

9. táblázat

Αηίΐ-Αβ1-42 IgG végpont-titerek a 6. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
529 SE (25) + GM-CSF (10)	353.660	+/- 148.940
529 SE (25) + GM-CSF (1)	150.935	+/-218.332
529 SE (25) + GM-CSF (0,1)	86.145	+/-91.724
529 SE (25) *	25.365	+/- 54.083
QS-21 (25)	1866	+/- 18.430
QS-21 (25) + GM-CSF (10)	48.970	+/- 116.106

*Első dózis: 529 SE (25) + GM-CSF (10); második dózis: csak 529 SE (25)

-2810. táblázat

Αηίί-Αβ1-42 IgGl végpont-titerek a 6. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
529 SE (25) + GM-CSF (10)	10.867	+/- 18.333
529 SE (25) + GM-CSF (1)	24.909	+/- 18.625
529 SE (25) + GM-CSF (0,1)	6608	+/- 17.736
529 SE (25) *	4511	+/-8154
QS-21 (25)	581	+/- 126
QS-21 (25) +GM-CSF (10)	7618	+/-29.145

Első dózis. 529 SE (25) + GM-CSF (10); második dózis: csak 529 SE (25)

11. táblázat

Αηίϊ-Αβ1-42 IgG2a végpont-titerek a 6‘ héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
529 SE (25) + GM-CSF (10)	243.758	+/- 354.383
529 SE (25) + GM-CSF (1)	116.222	+/- 143.140
529 SE (25) + GM-CSF (0,1)	98.018	+/-391.797
529 SE (25) *	16.018	+/- 165.298
QS-21 (25)	nem végeztük el	+/- nem végeztük el
QS-21 (25) + GM-CSF (10) •4Ί—'1 tt 1 ' ·	30.133	+/- 134.774

Első dózis: 529 SE (25) + GM-CSF (10); második dózis: csak 529 SE (25)

6. példa ¹⁰ Reciprok anti-APl-42 végpont-titerek összes IgG-re és alosztályokra, különböző mennyiségű GM-CSF alkalmazásával

Kitenyésztett Swiss-Webster-egereket elosztottunk 10 egérből álló csoportokba. Mindkét csoportban az állatokat alkalmanként 30 pg ΑβΙ-42-peptiddel immunizáltuk a 0. és a 3. héten. A 0. héten az alábbi anyagokkal immunizáltunk: első csoport: 50 pg 529 SE; második 15 csoport: 50 pg 529 SE plusz 10 pg GM-CSF; harmadik csoport: 25 pg 529 SE plusz 5 pg GM-CSF; negyedik csoport: 50 pg 529 SE plusz 2 pg GM-CSF, ötödik csoport: 50 pg 529 SE plusz 0,5 pg GM-CSF; hatodik csoport: 1% SE. A 3. heti immunizáláskor az 1-5. csoportokban lévő állatok ugyanazt a dózist kapták, mint a 0. heti immunizálásnál, kivéve azt, hogy

-29az 529 SE mennyiségét 50 pg-ról 25 pg-ra csökkentettük. A 6. csoportnak adott SEmennyiséget a 0. heti immunizáláskor adott 1%-ról a 3. héten 1,2%-ra növeltük. Az egereket szubkután immunizáltuk farba, 0,2 ml össztérfogattal, egyenlően elosztva mindkét oldalra a farok/far tövénél.

Az egerektől a 2., 20. és 35. napon vért vettünk. Reciprok anti-Αβ 1-42, IgG-osztályra és alosztályra vonatkozó végpont-titereket egyedi szérumokból (n=10) az 5. héten mértünk. Az IgG végpont-titerek eredményeit bemutatjuk a 12. táblázatban. Az IgGl-alosztályra kapott eredményeket bemutatjuk a 13. táblázatban. Az IgG2a-alosztályra kapott eredményeket bemutatjuk a 14. táblázatban.

12. táblázat

Αηίΐ-Αβ1-42 IgG végpont-titerek az 5. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
529 SE (50)	6.119	+/-3103
529 SE (50) + GM-CSF (10)	52.312	+/- 78.421
529 SE (50) + GM-CSF (5)	16.392	+/- 17.706
529 SE (50) + GM-CSF (2)	321.524	+/- 224.875
529 SE (50) + GM-CSF (0,5)	36.934	+/- 29.449
SE (1%)	7784	+/- 9041

13. táblázat

Αηΐϊ-Αβ1-42 IgGl végpont-titerek az 5. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
529 SE (50)	499	+/- 676
529 SE (50) + GM-CSF (10)	1424	+/- 2468
529 SE (50) + GM-CSF (5)	3407	+/- 5653
529 SE (50) + GM-CSF (2)	18.328	Γ +/- 8067
529 SE (50) + GM-CSF (0,5)	3526	+/- 17.606
SE (1%)	2556 ---	+/- 5615

-3014. táblázat

Αηίΐ-Αβ1-42 IgG2a végpont-titerek az 5. héten

Adjuvánsok	Geometriai középérték	Standard hiba
529 SE (50)	1386	+/-5173
529 SE (50) + GM-CSF (10)	48.519	+/- 148.981
529 SE (50) + GM-CSF (5)	11.659	+/-23.132
529 SE (50) + GM-CSF (2)	124.815	+/- 167.340
529 SE (50) + GM-CSF (0,5)	26.190	+/- 40.254
SE (1%)	694	+/- 1325

7. példa

Rhesus-maimok immunizálása Th-CTL- és C4-V3-peptiddel

Az alábbi kísérletet célja az volt, hogy számos, pepiidből és adjuvánsból álló kombinációs formákat főemlős fajban (Rhesus-majmokban) közvetlenül összehasonlítsunk olyan potenciális peptid/adjuváns-kombinációk azonosítása céljából, amelyeket humán klinikai vizsgálatokra lehet továbbvinni. Konkrétan, humán GM-CSF-t tartalmazó 529 SE adjuváns-formát elemeztünk inkomplett Freund-adjuváns-formához (IFA) viszonyítva, kombinációban (1) SIVenv-ből származó T-helper/SIV-gag CTL-peptid-konjugátummal (STl-pllC), amelynek szekvenciája az alábbi:

Arg Gin He He Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp He Asn Gin Met Leu (3. azonosítószámú szekvencia);

vagy (2) egy HÍV-1-ből származó C4-V3-peptid-konjugátummal (C4-V3_89>6p), amelynek szekvenciája az alábbi:

Lys Gin He lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (4. azonosítószámú szekvencia).

Vizsgálati terv: Összesen 8 állatot alkalmaztunk a kísérletben, 4 db Mamu-A*01+ és 4 db Mamu-A*01- állatot, a 15. táblázatban leírtak szerint.

.··. .·*. ··♦« .·%

15. táblázat

529 SE & GM-CSF IFA-val szemben

Csoport sz.	Állatok sz.	Állat	Immunogén készítmény	Adjuváns
1	2 Mamu-A01+	95X009 93X021	STl-pllC	IFA
2	2 Mamu-A01+	98N002 98N008	STl-pllC	529 SE/GM-CSF
3	2 Mamu-A01-	98N007 98N013	C4-V389,6p	IFA
4	2 Mamu-A01-	95X011 96X004	C4-V389,6p	529 SE/GM-CSF

Az 1. csoportban lévő állatok 0,5 ml STl-pllC Th-CTL-peptidet (1,0 mg/ml) kaptak „víz-olaj”-emulzióban, 0,5 ml IFA-val, 1,0 ml össztérfogatban. A 2. csoportban lévő állatok 0,5 ml STl-pl lC-t (1,0 mg/ml) kaptak, 250 pg humán GM-CSF-fel, 50 pg 529 SE-vel kombinálva, 1 ml össztérfogatban, az olaj végkoncentrációja 1% volt. A 3. csoportban lévő állatok 0,5 ml C4-V3₈9,6P-peptidet (2,0 mg/ml) kaptak „víz-olaj”-emulzióban, 0,5 ml IFA-val 1,0 ml össztérfogatban. Végül, a 4. csoportban lévő állatok 0,5 ml C4-V3₈9,6p-peptidet (2,0 mg/ml) kaptak, 250 pg humán GM-CSF-el, 50 pg 529 SE-vel kombinálva, 1 ml össztérfogatban, az olaj végkoncentrációja 1% volt.

Minden állatot intramuszkuláris injekcióval immunizáltunk, a terv szerint, a 0., 4. és 8. héten. Perifériás vérből mintákat vettünk közvetlenül minden egyes immunizálás előtt, és 1 vagy 2 héttel a egyes immunizálások után, hogy kövessük CTL indukálódását tetramer festéssel, pllC-specifikus (Cys Thr Pro Tyr Asp He Asn Gin Met; 3. azonosítószámú szekvencia, 19-27. aminosavak) ELISPOT-válaszokat és nagyobb mennyiségű tenyészetben vizsgált (1. és 2. csoport) CTL-válaszokat, valamint peptid-specifikus ellenanyag-válaszokat (1-4. csoportok).

Biztonság és tolerálhatóság

STl-pl IC + IFA: Az (STl-pl IC + IFA)-forma, amelyet az 1. csoportban lévő állatoknak egy helyre, három alkalommal, intramuszkuláris injekcióban adtunk be, jelentős mértékű injekcióhely-reaktivitással társult. Egy állatnál (93x021) az injekció helyén 1,5 cm nagyságú tályog fejlődött ki két héttel a második immunizálás után. A másik állatnál (95x009) szintén

-32kifejlődött egy 2,0 cm nagyságú tályog az injekció helyén, két héttel a harmadik immunizálás után, amely áttört a bőrön és kötözést igényelt.

STl-pllC + 529 SE/GM-CSF: Az (STl-pllC + 529 SE/GM-CSF)-forma, amelyet a 2. csoportban lévő állatoknak egy helyre, három alkalommal, intramuszkuláris injekcióban adtunk be, kisebb jelentőségű mellékhatásokkal társult. A 2. csoportban mindkét állat hányt röviddel a 3. immunizálást követően, a 8. héten. Más mellékhatást nem figyeltünk meg.

C4-^V3g9^p_±. IFA: A (C4-V3₈₉,6p + IFA)-forma, amelyet a 3. csoportban lévő állatoknak egy helyre, három alkalommal, intramuszkuláris injekcióban adtunk be, jelentős mértékű injekcióhely-reaktivitással társult. Egy állatban (98n013) az injekció helyén 1,0 cm nagyságú tályog alakult ki egy héttel a második immunizálás után. A másik állatnál (98n007) szintén kialakult egy 1,5 cm nagyságú tályog az injekció helyén, egy héttel a második immunizálás után. Ebben az állatban a tályog négy héttel később drenálást és kötözést igényelt.

C4-V3.89.6P + 529 SE/GM-CSF: A (C4-V38₉,6p + 529 SE/GM-CSF)-forma, amelyet a 4. csoportban lévő állatoknak egy helyre, három alkalommal, intramuszkuláris injekcióban adtunk be, kisebb jelentőségű mellékhatásokkal társult. A 4. csoportban lévő egyik állat (95x011) hányt nem sokkal a 3. immunizálást követően, a 8. héten. Más mellékhatást nem figyeltünk meg.

Az 1. és 3. csoportban lévő összes állaton, ahol az állatok adjuvánsként IFA-t kaptak, jelentős mértékű injekcióhely-reaktivitásokat figyeltünk meg. Az eredmények azt mutatják, hogy 0,5 ml-es IFA-adagok rosszul tolerálhatóak, ha intramuszkuláris injekcióban ugyanarra a helyre adjuk. Szintén érdemes megjegyezni, hogy abból a 4 állatból, amelyek adjuvánsként 529 SE/GM-CSF-t kaptak a 8. héten, 3 az immunizálást követően hamarosan hányt. Bár ismeretes, hogy az alkalmazott anesztetikum (ketamin) mellékhatása hányás, a vizsgálat alatt más esetekben nem jegyeztük fel, hogy az állatok hánytak. Jelenleg nincs elegendő bizonyíték arra, hogy az állatok hányását bármilyen, 529 SE/GM-CSF-fel összefüggő mellékhatásnak tulajdonítsuk.

Eredmények: Celluláris immunválaszok indukálása (1, és 2, csoport)

Friss-vérben pl IC-tetramer festése: Az immunizálást megelőzően, és 1 és 2 héttel az immunizálás után minden Mamu-A*01 pozitív állatból (1. és 2. csoport) frissen vett perifériás vért szkríneltünk pl IC-specifikus CD3⁺CD8⁺-T-limfociták jelenlétére, szolubilis, 1. osztályú MHC-tetramer festéssel. A 16. táblázatban bemutatottak szerint, csak egy állatban (93x021), amely STl-pl IC-peptidet IFA-val kombinációban kapott, tapasztaltunk immunizálással indukált celluláris immunválaszt nem stimulált perifériás vérben.

16. táblázat pl IC-tetramer festődés (%) és pl IC-specifíkus ELISPOT-válaszok frissen izolált perifériás vérben

Állat/ (csoport)	Forma	0. hét immunizálás előtt	5. hét; 1 héttel a 2. immunizálás után	6. hét; 2 héttel a 2. immunizálás után
Friss vér tetramer festődésa	ELISPOT # SFC 106 sejtre	Friss vér tetramer festődésa	ELISPOT # SFC 106 sejtre	Friss vér tetramer festődésa	ELISPOT # SFC 106 sejtre
95x009/ (1)	STl-pllC + IFA	0,02	0,0	0,00	0,0	0,0	3,8
93x021/ (1)	STl-pllC + IFA	0,02	Ndb	0,15	56,3	0,12	21,9
98n002/ (2)	STl-pllC + 529SE/ GM-CSF	0,00	0,6	0,05	0,0	0,01	6,3
98n008/ (2)	STl-pllC + 529SE/ GM-CSF	0,05	o,o	0,04	15,0	0,01	9,4

Állat/ (csoport)	Forma	8. hét; 4 héttel a 2. immunizálás után	9. hét; 1 héttel a 3. immunizálás után	10. hét; 2 héttel a 3. immunizálás után
Friss vér	ELISPOT	Friss vér	ELISPOT	Friss vér	ELISPOT
95x009/ (1)	STl-pllC + IFA	0,00	Nd	0,01	2,5	0,02	1,9
93x021/ (1)	STl-pllC + IFA	0,02	Nd	0,14	Nd	0,02	Nd
98n002/ (2)	STl-pllC + 529SE/ GM-CSF	0,06	Nd	0,00	Nd	0,00	3,8
98n008/ (2)	STl-pllC + 529SE/ GM-CSF	0,02	Nd	0,02	Nd	0,00	0,0 _

^a Friss vérben lévő CD3⁺CD8⁺-limfociták pozitív festődése (%) p 11 C-tetramerrel;

^b Nd = nincs adat (ebben és a további táblázatokban).

PllC-specifikus ELISPOT-válaszok: Az állatok 1. és 2. csoportjaiban, celluláris immunválaszok indukálódásának további elemzése céljából, perifériás vérből frissen izolált limfocitákat szkríneltünk pl IC-specifikus CD3⁺CD8⁺-T-limfociták jelenlétére, ELISPOTanalízissel. A 16. táblázatban bemutatottak szerint, csak a 93x021-jelű állatban detektáltunk pl 1 C-specifikus CD8 -T-limfocitákat, ugyanabban az állatban, amelyre a friss véren végzett tetramer analízissel kimutattunk detektálható mennyiségű pl 1 C-specifikus CD8⁺-T-limfocitákat. A pl lC-tetramer analízisben kapott pozitív választ minden esetben megerősítettük pozitív pl 1 C-specifikus ELISPOT-válasszal.

pllC-specifikus, celluláris immunválaszok pllC-peptiddel való in vitro stimuláció után: Abból a célból, hogy analízis előtt növeljük a pl 1 C-specifikus sejtek számát, perifériás vérből frissen izolált limfocitákat stimuláltunk in vitro pl IC-peptiddel és rhTT -9-vel Az eredményül kapott effektor sejteket 14 nap múlva pllC-tetramer-kötésre, valamint funkcionális pllC-specifikus, lítikus aktivitásra szkríneltük standard, króm-felszabadulást alkalmazó, CTL vizsgálati eljárásban. A pl IC-tetramer analízis és a funkcionális CTL-vizsgálat eredményeit bemutatjuk a 17. táblázatban. A 93x021 jelű állatban, amelynek frissen izolált limfocitáiban következetesen pllC-specifikus immunválaszt találtunk, magas tetramer-kötési és funkcionális CTL-aktivitás alakult ki egy héttel a második immunizálás Oután. Ez egy nagyon hatékony pllC-specifikus, celluláris immunválasz indukálódásra utal. A frissen izolált limfociták esetén kapott eredményekkel szemben, a 2. csoportban egy állatban (98n008-jelű, STl-pllC + 529 SE/GM-CSF) pllC-specifikus, celluláris immunválaszra utaló jeleket kezdett mutatni két héttel a második immunizálás után. Azonban ebben a 2. csoporthoz tartozó állatban a pllCspecifikus immunválasz jelentősen kisebb mértékű volt, mint amit az 1. csoportban lévő, reagáló állatnál tapasztaltunk.

-3517. táblázat pllC-tetramer festődés (%) és funkcionális pl IC-specifíkus CTL-válaszok pl IC-peptiddel való in vitro stimulálás után

Állat/ (csoport)	Forma	0. hét immunizálás előtt	5. hét; 1 héttel a 2. immunizálás után	6. hét; 2 héttel a 2. immunizálás után
Tetramer festődés’	CTL 20:1 E:Tb	Tetramer festődés	CTL 20:1 E:T	Tetramer festődés	CTL 20:1 E:T
95x009/ (1)	STl-pllC + IFA	0,03	0,6	0,23	Nd	0,27	0,0
93x021/ (1)	STl-pllC + IFA	0,03	0,0	34,31	66,3	15,15	4,69
98n002/ (2)	STl-pllC + 529SE/ GM-CSF	0,21	o,o	Nd	Nd	0,73	Nd
98n008/ (2)	STl-pllC + 529SE/ GM-CSF	0,16	o,o	Nd	Nd	5,84	Nd

Állat/ (csoport)	Forma	8. hét; 4 héttel a 2. immunizálás után	9. hét; 1 héttel a 3. immunizálás után	10. hét; 2 héttel a 3. immunizálás után
Tetramer festődés	CTL 20:1 E:T	Tetramer festődés	CTL 20:1 E:T	Tetramer festődés	CTL 20:1 E:T
95x009/ (1)	STl-pllC + IFA	Nd	Nd	0,76	3,0	0,72	0,0
93x021/ (1)	STl-pllC + IFA	Nd	Nd	4,90	7,3	Nd	Nd
98n002/ (2)	STl-pllC + 529SE/ GM-CSF	Nd	Nd	0,07	5,7	0,39	ο,ο
98n008/ (2)	STl-pllC + 529SE/ GM-CSF	Nd	Nd	2,24	H,4	5,00	ο,ο

·*··· · · · ·»·· ·· ···· ·· »···

-36^a CD3⁺CD8⁺ tenyésztett sejtek pozitív festődése (%) p 11 C-tetramerrel;

^b pl IC-specifikus lízis (%) (mínusz háttér), ha az effektor/cél-arány (E:T) 20:1.

Intracelluláris citokin-analízis: Immunogén-indukált, pl IC-peptidre specifikus limfociták funkcionális és fenotipikus tulajdonságainak további jellemzése céljából, Thl-típusú citokinek, azaz INF-γ, TNF-α, IL-2 és Th2-típusú, IL-4-citokin intracelluláris expresszióját követtük. Intracelluláris citokin-expressziót perifériás vérből vett limfocitákban követtük egy kezdeti in vitro stimuláció után, 10 μΜ pllC-peptid és rhIL-2 jelenlétében. A tenyészeteket ezután 14 napig tartottuk fenn 40 U/ml IL-2-vel. Két hét után a tenyésztett sejteket tápközeggel önmagában vagy 10 μΜ pl IC-peptiddel + anti-humán CD28-al és anti-humán CD49d-vel, 1 óra hosszáig stimuláltuk. Egy óra után a sejteket Brefeldin-A-val kezeltük további öt óra hosszáig, hogy lehetővé tegyük az intracelluláris citokinek endoplazmatikus retikulumban való koncentrálódását. Ezután az intracelluláris citokin-expresszió mértékét áramlási citometriával mértük (18. és 19. táblázat).

A 18. táblázatban bemutatottak szerint, két héttel pllC-peptiddel való in vitro stimuláció után az 1. csoportban, a 93x021-jelű állatból (STl-pllC + IFA) vett, perifériás vérből származó, CD3⁺-limfocitákban Thl-típusú, kismértékű citokin-expressziót tapasztaltunk, és az összes sejt 1,5%-ánál kisebb része szekretált aktívan INF-y-t, TNF-a-t vagy IL-2-t. Az összes CD3⁺-limfocita körülbelül 8%-a szekretált aktívan Th2-típusú IL-4-citokint, ami az IL4-et szekretáló sejtek esetén azt találtuk, hogy a CD3⁺CD4⁺-limfocita alkészletre korlátozódtak. A pl IC-peptiddel való rövid újra-expozíció után a pllC-tetramer⁺ és CD3⁺CD8⁺-limfocita alkészletek aktívan szekretáltak Thl-típusú citokineket, INF-y-t és TNF-a-t, de nem lehetett indukálni szignifikánsan nagyobb mértékű IL-2-szekréciót. A pl IC-peptiddel való újraexpozíciót követően a Th2-típusú IL-4-citokin szekréciója változatlan mértékű maradt.

-3718. táblázat

Intracelluláris citokin-analízis, 1. csoportban lévő 93x021-jelű állatra, két héttel a második immunizálás után

Limfocita-alkészlet	Tápközeg	INF-ypllC	aS.I.	Tápközeg	TNFapllC	S.I.
bpl lC-tetramer+	977	27.612	28,3	90	20.342	226,0
hBulk CD3+	7628	65.567	8,6	12.256	51.361	4,2
bCD3+CD4+	2488	5545	2,2	6.252	2827	0,4
bCD3+CD8+	5273	60.573	H,5	6865	48.439	7,1

Limfocita-alkészlet	Tápközeg	IL-2pllC	aS.I.	Tápközeg	IL-4pllC	S.I.
bpl lC-tetramer+	751	2004	2,7	Nd	Nd	Nd
Bulk CD3+	2879	6463	2,2	78.069	90.563	1,2
bCD3+CD4+	1377	1683	1,2	71.275	81.437	1,1
bCD3+CD8+	1502	4783	3,2	6794	9216	1,3

19. táblázat

Intracelluláris citokin-analízis, a 2. csoportban lévő 98n008-jelű állatra, egy héttel a harmadik immunizálás után

Limfocita-alkészlet	Tápközeg	INF-γ pl IC	aS.I.	Tápközeg	TNFapllC	S.I.
bpl lC-tetramer+	545	560	1,0	748	454	0,0
bBulk CD3+	6829	10.489	1,5	3402	13.443	4,0
bCD3+CD4+	3310	3789	1,1	1428	2567	1,8
bCD3+CD8+	3189	6825	2,1	2587	11.324	4,4

Limfocita-alkészlet	Tápközeg	IL-2pllC	aS.I.	Tápközeg	IL-4pllC	S.I.
bpl lC-tetramer+	77	456	5,9	Nd	Nd	Nd
bBulk CD3+	385	2868	7,4	219.789	202.122	0,9
bCD3+CD4+	1379	1761	1,3	170.804	158.175	0,9
bCD3+CD8+	36	2095	58,2	49.053	44.083	0,9 .....

^a S.I. jelentése: stimulációs index ^b Pozitívan festődött, adott sejtek száma ajelölt citokin/10⁶ CD3⁺-sejtre, mínusz háttér (izotípus kontroll) festődése.

-38 A 19. táblázatban bemutatottak szerint, két héttel pl IC-peptiddel való in vitro stimuláció után a 2. csoportban, a 98n008-jelű állatból (STl-pl IC + 529 SE/GM-CSF) vett, perifériás vérből származó, CD3⁺-limfocitákban Thl-típusú, kismértékű citokin-expressziót tapasztaltunk, és az összes sejt 1,0%-ánál kisebb része szekretált aktívan INF-y-t, TNF-oi-t vagy IL-2-t.

Érdekes módon az összes CD3⁺-limfocita körülbelül 20%-a szekretált aktívan Th2-típusú IL4-citokint, ami az IL4-et termelő sejtek számában 2,5-szeres növekedés az 1. csoportban lévő állathoz viszonyítva. Az 1. csoporthoz tartozó állatban azt találtuk, hogy az IL4-t szekretáló sejtek a CD3⁺CD4⁺-limfocita alkészletre korlátozódtak. A pl IC-peptiddel való rövid újraexpozíció után a 2. csoportban lévő állatban, pllC-tetramer⁺ és CD3⁺CD8⁺-limfocita alkészle10 teket stimulálni lehetett TNF-a-szekrécióra, de INF-y-szekrécióra nem. Az 1. csoportban lévő állatokkal szemben, a peptid újra-expozíciója után a CD3⁺CD8⁺-sejtek IL-2-expressziója fokozódott. Az 1. csoportban lévő állat esetére leírtak szerint, pllC-peptiddel való újra-expozíciót követően a Th2-típusú IL-4-citokin szekréciója változatlan mértékű maradt.

Eredmények: Immunogén-indukált humorális immunválaszok (1. és 2, csoport):

Immunogén-specifikus humorális ellenanyag-válaszok elemzése céljából, ELISA-ban anti-STl-pllC ellenanyag-titereket mértünk az 1. és 2. csoportban lévő állatok plazmáiban közvetlenül az immunizálás előtt, és 1 és 2 héttel a második és a harmadik immunizálás után. Az eredményeket összefoglaljuk a 20. táblázatban.

-3920. táblázat

ELISA végpont-titerek STl-pllC-vel immunizált rhesus-majmok szérumában (1. és 2. csoport)

Állat	Csoport	Forma	Hét	ST 1 -p 11C ellenanyagtitera
95x009	1	STl-pllC + IFA	5	12.800
			6	12.800
			9	6400
			10	12.800
93x021	1	STl-pllC + IFA	5	51.200
			6	102.400
			9	51.200
			10	51.200
98x002	2	ST 1-pl IC + 529SE/GM-CSF	5	<50
			6	<50
			9	1600
			10	<50
98n008	2	STl-pl IC + 529SE/GM-CSF	5	200
			6	200
			9	12.800
			10	6400

Ellenanyag végpont kötési titereket úgy határoztuk meg, mint a plazma legnagyobb hígításának reciprokát, ahol a leolvasott kísérlet/kontroll (E/C) OD >3,0 volt. Immunogén-índukált humorális immunválaszok (3, és 4, csoport) Immunogén-specifikus és adjuváns-specifikus humorális ellenanyag-válaszok elemzése céljából, ELISA-ban anti-C4-V3_89j6P és anti-GM-CSF ellenanyag-titereket mértünk a 3. és 4. csoportban lévő állatok plazmáiban közvetlenül az immunizálás előtt, és egy és két héttel a má10 sodik és a harmadik immunizálás után. Az eredményeket összefoglaljuk a 21. táblázatban. Az eredmények azt mutatják, hogy a plazmában mért, C4-V3_89j6P-ra specifikus ellenanyag-titerek minden vizsgált állatban egy héttel a második immunizálás után voltak maximálisak. A 3. csoportban lévő állatokban (C4-V3_89j6p + IFA) a plazmában mért ellenanyag-titerek több nagyságrenddel nagyobbak voltak, mint a 4. csoporthoz tartozó állatok (C4-V3_89j6P + 529 SE/GM-40CSF) plazmáiban mért ellenanyag-titerek. A 4. csoportban lévő állatokban alacsony, de detektálható anti-GM-CSF ellenanyag-titer volt, amelynek maximuma egy héttel a harmadik immunizálás után volt.

21. táblázat

ELISA végpont-titerek C4-V3_89;6P-vel immunizált Rhesus-majmok plazmájában (3. és 4. csoport)

Állat/ csoport	Forma	Hét	C4-V3 ellenanyag-titer’	Anti-humán GM-CSF ellenanyag-titer
98n007	C4-V389,6P + IFA	5	102.400	<10
(3)		6	25.600	<10
		9	25.600	<10
		10	25.600	<10
98n013	C4-V389,6P + IFA	5	12.800	<10
(3)		6	6400	<10
		9	12.800	10
		10	12.800	<10
96x004	C4-V389j6P +	5	6400	320
(4)	529SE/GM-CSF	6	1600	160
		9	3200	2560
		10	1600	1280
95x011	C4-V389j6P +	5	1600	160
(4)	529SE/GM-CSF	6	800	80
		9	1600	1280
		10	1600	1280

^a Ellenanyag végpont kötési titereket úgy határoztuk meg, mint a plazma legnagyobb hígításának reciprokát, ahol a leolvasott kísérlet/kontroll (E/C) OD >3,0 volt.

Semlegesítő ellenanyagok indukálódását a 3. és 4. csoporthoz tartozó állatokban is követtük; az eredményeket összefoglaljuk a 22. táblázatban. Az eredmények azt mutatják, hogy a 3. csoportban és a 4. csoportban lévő állatokban egyaránt termelődtek olyan semlegesítő ellenanyagok, amelyek képesek voltak SHIV₈₉,6-vírus in vitro semlegesítésére. SHIV₈₉,₆semlegesítő ellenanyag-titerek a 3. csoportban lévő állatokban általában magasabbak voltak,

-41 mint a 4. csoportban lévő állatokban. Továbbá, az utolsó immunizálás után a 3. csoportban lévő állatoktól vett szérumokban kismértékű semlegesítő aktivitást találtunk SHIV_89s6vírustörzzsel szemben, amely nehezen semlegesíthető.

22. táblázat

Semlegesítő ellenanyag-titerek C4-V3_89>6p-vel immunizált Rhesus-majmok szérumában (3. és 4. csoport)

Állat/ csoport	Forma	Hét	Semlegesítő ellenanyagok3
shiv89,6	SHIV89j6p
98n007	C4-V389,6p + IFA	0	<10	<10
(3)		5	22	<10
		6	46	<10
		9	113	46
		10	74	71
98n013	C4-V389;6p + IFA	0	<10	<10
(3)		5	12	<10
		6	19	<10
		9	36	18
		10	22	<10
96x004	C4-V389,6p +	0	<10	<10
(4)	529SE/GM-CSF	5	<10	<10
		6	<10	<10
		9	26	<10
		10	<10	<10
95x011	C4-V389;6p +	0	<10	<10
(4)	529SE/GM-CSF	5	11	<10
		6	<10	<10
		9	19	<10
		10	<10	<10

³ Semlegesítő ellenanyag-titereket úgy határoztuk meg, mint a szérum olyan hígításának reciprokát, ahol a sejtek 50%-a védett volt vírussal indukált pusztulással szemben, neutrálvörös 10 felvételével mérve.

-428. példa

Terápiás hatékonyság vizsgálata ΑβΙ-42-vel és adiuváns(ok)kal kezelt, PDAPP transzgenikus egereken

Az alábbi kísérletet terveztük többféle, kombinációs adjuváns-forma összehasonlítására PDAPP transzgenikus egerekben, az ΑβΙ-42-peptid terápiás hatékonyságának tesztelésére.

Vizsgálati terv: 40 darab, 10,5-12 hónapos, PDAPP transzgenikus egeret (hímek és nőstények) négy csoportba osztottunk úgy, hogy az egyes csoportokban a lehető legjobban egyezzen életkor, nem és a transzgenikus szülő. A csoportokat a 23. táblázatban ismertetjük:

23. táblázat

Transzgenikus egerek kezelt csoportjai

Csoport	Adjuváns	Dózis	Αβ1-42 dózis	N startnál	N végén
1	MPL SE	25 pg	75/60 pg	40	35
2	MPL SE + GM-CSF	25 pg/10 pg	64/60 pg	41	34
3	529 + GM-CSF	25 pg/10 pg	64/60 pg	40	31
4	PBS	na	na	40	37

ΑβΙ-42-peptidet az Elan Pharmaceuticals cégtől, 529 SE-t és MPL™ SE-t a Corixa cégtől, rágcsáló eredetű GM-CSF-t a Biosource cégtől szereztünk be. Valamennyi egér a 0., 2., 4., 8., 12., 16., 20. és 24. héten kapott injekciót. A második injekciótól kezdve, az egyes injekciók utáni 5-7. napon vért vettünk az egerektől. Az 1., 2. és 3. csoportban lévő állatokat 200 μΐ térfogatú oltóanyaggal, szubkután injektáltuk, míg a 4. csoportban lévő állatok 250 plben, szubkután kapták a dózist. A vizsgálat 25. hetében az állatokat elpusztítottuk. A litereket olyan hígításban határoztuk meg, amelyben a leolvasott OD a maximum 50%-a volt.

Eredmények

Immunogenitás és ellenanyag-válasz: ΑβΙ-42-peptid ellen termelődött ellenanyagtiterek geometriai középértéke (GMT) mindegyik csoportban a második (RC529 + GM-CSF) vagy a harmadik (MPL™ SE, MPL™ SE + GM-CSF) vérvételnél érte el maximumát (lásd 1. ábra). A maximális GMT (MPL SE + GM-CSF) alkalmazásával 16.400 volt, míg (529 SE + GM-CSF) alkalmazásával 13.400, vagy körülbelül másfélszerese a (MPL™ SE)-kontroll esetén mért értéknek (9700). Azonban a két, GM-CSF-t tartalmazó forma (2. és 3. csoport) alkalmazása esetén a titerek körülbelül a (MPL™ SE)-kontrollnak megfelelő értékre csökkentek,

-43 ahol az utolsó GMT: MPL™ SE alkalmazásával 4600, MPL SE + GM-CSF alkalmazásával 5350, és 529 SE + GM-CSF alkalmazásával 4650.

Annak meghatározása céljából, hogy vajon a GM-CSF-tartalmú, két forma alkalmazásával elért titerek csökkenése a kísérlet végére anti-GM-CSF ellenanyag-válasznak tulajdonít5 ható-e, ELISA-val meghatároztuk, hogy termelődtek-e anti-GM-CSF-ellenanyagok az immunizálás alatt. GM-CSF alkalmazásával immunizált minden állat szérumában meghatároztuk a kísérletben alkalmazott, rágcsáló eredetű GM-CSF ellen termelődött titert. Egyik kezelt állatban sem találtunk anti-GM-CSF-re specifikus ellenanyagokat (az adatokat nem mutatjuk be).

Αβ-mennyiségek az agyban: Mindhárom kezelt csoportban szignifikánsan csökkent az 10 összes Αβ-peptid (2. táblázat: egyedi eredmények; 24. táblázat: összesített eredmények) és az Αβ1-42 (3. táblázat: egyedi eredmények; 25. táblázat: összesített eredmények) felhalmozódása PDAPP-egerek agykérgében. Αβ (összmennyiség és 1-42-formák) mérésére szolgáló ELISAkat korábban leírt eljárás (54) szerint végeztünk guanidin-szolubilizált agy-homogenizátumokkal. A statisztikai összehasonlításokat Mann-Whitney-féle szignifikanciateszt alkalmazásával 15 végeztük.

24. táblázat

Αβ összmennyiségei az agykéregben

	PBS	MPL SE	MPL SE + GM-CSF	529 SE + GM-CSF
Átlag (ng/g)	6478	1707	925	1313
Tartomány	64-17.208	33 -8501	67 - 5293	79-5271
% csökkenés	-	74	86	80
P-érték (M-W)	-	< 0,0001	< 0,0001	<0,0001
N	37	35	34	31

25. táblázat

Αβ 1 -42 mennyiségei az agykéregben

	PBS	MPL SE	MPL SE + GM-CSF	529 SE + GM-CSF
Átlag (ng/g)	5609	1799	779	1127
Tartomány	284 - 14.004	10-6715	43 - 4824	29 - 4442
% csökkenés	-	68	86	80
P-érték (M-W)	-	< 0,0001	<0,0001	<0,0001
N	36	35	34	31

-44 Amiloid-terhelés: Az amiloidózis kiterjedését az elülső agykéregben előzőleg leírt (55), immunohisztokémiai módszerek alkalmazásával határoztuk. Mindhárom kezelt csoportban szignifikánsan csökkent az amiloid-terhelés mértéke (4. táblázat: egyedi eredmények; 26. táblázat: összesített eredmények).

26. táblázat

Amiloid-terhelés az elülső agykéregben

	PBS	MPL SE	MPL SE + GM-CSF	529 SE + GM-CSF
Átlag (%AB)	7,98	0,49	0,00	0,04
Tartomány	0,00 - 27,37	0,00 - 9,63	0,00 - 0,83	0,00 - 5,53
% csökkenés	-	94	100	99,5
P-érték (M-W)	-	< 0,0001	< 0,0001	<0,0001
N	29	33	29	30

Neurit-terhelés: A kezelés hatását neurit-disztrófia elülső agykéregben való kifejlődéséit) re gyakorolt hatását korábban leírt eljárás szerint, immunohisztokémiailag határoztuk meg (55). Mindhárom kezelt csoportban szignifikánsan csökkent a neurit-terhelés kiterjedése a kontroll, PBS-el kezelt esetekhez viszonyítva (5. ábra: egyedi eredmények; 27. táblázat: összesített eredmények).

27. táblázat

Neurit-terhelés az elülső agykéregben

	PBS	MPL SE	MPL SE + GM-CSF	529 SE + GM-CSF
Átlag (%NB)	0,35	0,14	0,04	0,02
Tartomány	0,00-1,21	0,00 - 0,82	0,00 - 0,60	0,00-0,91
% csökkenés	-	60	88	95
P-érték (M-W)	-	<0,0001	< 0,0001	<0,0001
N	29	33	29	30

Asztrocitózis: A retrospleniális agykéregben az asztrocitózis kiterjedését korábban leírtak szerint határoztuk meg (55). GM-CSF-et tartalmazó immunogénnel kezelt csoportokban 20 szignifikánsan csökkent az asztrocitózis mértéke (6. ábra).

-45 9. példa

Cvnomolgus-makákók immunizálása C4ÍE9V)-V3s₉.6p-peptiddel

A kísérlet célja az, hogy HIV-1-eredetű env-burokfehéijéből származó peptid-konjugátum, C4(E9V)-V3₈9,6P-peptid immunogenitását elemezzük a találmány szerinti kombinációs adjuváns-formákkal vagy azok nélkül, egy másik főemlős fajban, cynomolgus-majmokban (Macaca fascicularis). A 7. példában leírt C4(E9V)-V3_89j6p-peptidet úgy módosítottuk, hogy a 9. aminosav-helyzetben lévő glutaminsavat valinra cseréltük. Az eredményül kapott, C4(E9V)V3_89;6p-jelű peptid-konjugátumot alkalmaztuk, amelynek aminosav-szekvenciája az alábbi:

Lys Gin He Ue Asn Met Trp Gin Vai Vai Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (5. azonosítószámú szekvencia).

A peptid C4-régiójában glutaminsav valinnal való szubsztitúciója (E9V) megnöveli a pepiid immunogenitását a módosítatlan szekvenciával rendelkező peptid immunogenitásához viszonyítva az egér-modellben.

Ez a HIV-1-eredetű, Env-burokfehéijéből származó peptid egérben humorális immunválaszok kiváltására képes. Azonban az egérben kapott eredmények emberre való extrapolálásának nehézsége miatt, a 1. fázisú, humán klinikai vizsgálatok előtt a szóba jöhető, HIV1-eredetű, immunogén készítményeket nem-ember főemlősökön szükséges tesztelni. Ebben a kísérletben az intramuszkuláris (IM) és az intranazális (IN) beadási módokat egyaránt elemeztük. Az állatokat ötször immunizáltuk a 0. ,4., 8., 18. és 23. héten. 25 héten át, hetente vérmintákat, és cervikovaginális és nyálkahártya mosófolyadék-mintákat vettünk és analizáltunk az immunogén készítményre specifikus ellenanyagok jelenlétének kimutatására.

Kísérleti terv: Csoportonként négy, összesen nyolc cynomolgus-majmot alkalmaztunk a kísérletben (28. táblázat). Az 1. csoport nem kapott adjuvánst; a 2. csoport 529 SE plusz GM-CSF adjuváns-formát kapott. Az állatokat egy állatházban tartottuk és vizsgáltuk.

28. táblázat

529 SE plusz GM-CSF alkalmazása adjuváns nélkül végzett immunizáláshoz viszonyítva

Csoport száma	Immunogén	Adjuváns	Beadás módja
1	C4(E9V)-V389,6p-peptid	nincs	IN
2	C4(E9V)-V389j6p-peptid	529 SE/GM-CSF	IM

-46Immunizálások: Valamennyi intranazális immunizálás egy 100 pl-t adagolni képes orrspray-készülékkel történt. Minden intramuszkuláris injekciót a kvadricepsz izomba adtunk, tűvel és fecskendővel. Minden állatot terv szerint, a 0., 4., 8., 18. és 23. héten immunizáltunk.

Formák:

1. csoport: 1000 pg C4(E9V)-V3₈9,6P-peptid steril normál nátrium-klorid-oldatban, 200 pl végtérfogatban (100 pl mindegyik orrcimpába).

2. csoport: 1000 pg C4(E9V)-V3₈9,6P-peptid, 50 pg 529 SE, és 250 pg human GMCSF, az olaj végkoncentrációja 1%, végtérfogat 1,0 ml (500 pl kvadricepszenként, IMinjekcióval).

Vizsgálati eljárások immunogén-indukált immunválaszok követésére:

Közvetlenül immunizálás előtt és után minden állatot gondosan követtünk immunogén-indukált humorális immunválaszokra az alábbi vizsgálati eljárások alkalmazásával:

(1) Szérumban anti-C4(E9V)-V3₈9_j6p-peptid-re specifikus IgG ellenanyag-titereket ELISA-val.

(2) Mukozális (cervikovaginális, nazális) anti-C4(E9V)-V3₈9,₆p-peptidre specifikus IgG ellenanyag-titereket ELISA-val.

Eredmények:

Immunogén biztonság és tolerálhatóság:

Önmagában vagy 529 SE/GM-CSF adjuvánsokkal együtt beadott C4(E9V)-V3_89;6ppeptid rendkívül jól tolerálható volt. Tűvel és fecskendővel, intramuszkulárisan immunizált állatokban nem figyeltünk meg az injektálás helyén mellékhatásokat. Minden állatban gondosan követtük a testhőmérséklet változását az egyes immunogének beadása után közvetlenül kezdve, 24 óra hosszáig. A vizsgálat ideje alatt egyetlen állatban sem tapasztaltunk abnormálisán megnövekedett testhőmérséklet-értékeket (az adatokat nem mutatjuk be).

Immunogén-specifikus ellenanyag-válaszok szérumban:

Minden állatból szérum-mintákat vettünk közvetlenül az egyes immunizálások előtt, és egy és két héttel az egyes immunizálások után (25 héten keresztül). Két héttel az utolsó immunizálás után minden szérum-mintát anti-C4(E9V)-V3₈₉,₆p-peptidre specifikus IgG-ellenanyagok jelenlétére analizáltuk. Intranazálisan immunizált, 1. csoportban lévő állatokban [C4(E9V)V3_89j6p-peptid önmagában] nem találtunk az immunizálás előttieknél magasabb anti-C4(E9V)V3₈9_;6p-peptidre specifikus IgG ellenanyag-titereket a szérumban (7. ábra). Ezzel ellentétben, a 2. csoportban lévő állatok szérumában [C4(E9V)-V3₈9,ep + 529 SE/GM-CSF, IM beadás] ·*· ·· · ♦ 1 ·*·· ·· ♦ «·· ** *···

-47C4(E9V)-V3-ra specifikus IgG-ellenanyagok jelentős mennyiségben termelődtek (7. ábra). A bemutatott végpont-titerek mértani középértékeit úgy számítottuk, hogy az egyes állatokban azt a legalacsonyabb titert használtuk fel, amely legalább háromszorosa az egyesített naív szérumra leolvasott értéknek ugyanilyen hígításnál.

Az 1. csoportban lévő (adjuváns nélkül immunizált) állatoktól vett cervikovaginális mosófolyadék-mintákban anti-C4(E9V)-V3₈₉,6p-re specifikus IgG ellenanyag-titerek csak a negyedik immunizálást követően voltak az immunizálás előttinél magasabbak, de azután csökkentek (8. ábra). Ezzel szemben a 2. csoportban lévő állatoktól vett (adjuvánssal) cervikovaginális mosófolyadék-mintákban anti-C4(E9V)-V3_89;6P-re specifikus IgG ellenanyag10 titerek az első immunizálást követően magasabbak voltak az immunizálás előttieknél, és minden azt követő immunizálásnál tovább növekedtek (bár később mindegyik esetben történt némi csökkenés) (8. ábra).

Az 1. csoportban lévő (adjuváns nélkül immunizált) állatoktól vett nazális mosófolyadék-mintákban anti-C4(E9V)-V3_89;6p-re specifikus IgG ellenanyag-titerek nem voltak az im15 munizálás előtti értékeknél nagyobbak (9. ábra). Ezzel ellentétben, a 2. csoportban lévő állatoktól (adjuvánssal) vett nazális mosófolyadék-mintákban jelentős mennyiségben (literrel) termelődtek anti-C4(E9V)-V3_89j6p-re specifikus IgG-ellenanyagok (9. ábra).

-48 HIVATKOZÁSOK JEGYZÉKE

1. Mosmann, T.R., et al., J. Immunoi», 136, 2348-2357 (1986).

2. U.S. Patent Number 5,057,540

3. U.S. Patent Number 6,113,918.

4. Ahlers, J.D., et al., J. Trnmunoi», 158, 3947-3958 (1997).

5. Scharton-Kersten, T., et al., j. Immunol. 154, 5320-5330 (1995).

6. Ghalib, H.W., et al., J. Immunol., 154, 4623-4629 (1995).

7. Murray, H.W., and Hariprashad, J.,, j. Exp. Med., 181, 387-391 (1995).

8. U.S. Patent Number 5,571,515.

9. U.S. Patent Number 5,723,127.

10. U.S. Patent Number 5,976,539.

11. Finkelman, F.D., and Holmes, J., Ann. Rev. Immunol., 8, 303-333 (1990).

12. Snapper, C.M., et al., J. Exp. Med., 175, 1367-1371 (1992).

13. Kobayashi, M., et al., j. Exp. Med., 170, 827-845 (1989).

14. Published International Patent Application Number WO 90/05147.

15. U.S. Patent Number 5,078,996.

16. U.S. Patent Number 5,229,496.

17. U.S. Patent Number 5,073,627.

18. Alderson, M.R., et al., J. Exp. Med., 178, 669-674 (1993).

19. Snapper, C.M., et al., J. Immunol», 154, 5842-5850 (1995).

20. U.S. Patent Number 5,679,356.

21. Published International Patent Application Number WO 00/69456.

22. U.S. Patent Number 5,013,548.

23. U.S. Patent Number 5,019,387.

24. Charbit, A., et al., Vaccine, 11, 12211228 (1993).

25. Natuk, R.J., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 9, 395-404 (1993).

26. Johnson, R.P., et al., J. Virol., 68, 3145-3153 (1994).

27. Fuller, D.H., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 10, 1433-1441 (1994).

28. Berzofsky, J.A., et al., J. Clin. Invest♦, 88, 876-884 (1991).

29. Palker, T.J., et al., J. Immunol·, 142, 3612-3619 (1989).

30. Hart, M.K., et al., J. Immunol,, 145, 2677-2685 (1990).

31. Haynes, B.F., et al., J. Immunol., 151, 1646-1653 (1993).

32. Hart, M.K., et al.. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 9448-9452 (1991).

33. Bartlett, J.A., et al., AIDS, 12, 12911300 (1998).

34. Haynes, B.F., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 11, 211-221 (1998).

35. U.S. Patent Number 5,861,243.

36. U.S. Patent Number 5,932,218.

37. U.S. Patent Number 5,939,074.

38. U.S. Patent Number 5,993,819.

39. U.S. Patent Number 6,037,135.

40. Published European Patent Application Number 671,947.

41. U.S. Patent Number 6,024,965.

42. Miller, M.D., et al., J. Immunol., 147, 320-329 (1991).

43. Kuroda, M.J., et al., J. Exp. Med., 187, 1373-1381 (1998).

-50.·% .··. .··. **·< .· .+ . ’*’··~· .1

44. Liao, Η-Χ, et al., J. Virol., 74, 254263 (2000).

45. Staats, H.F., et al., J. Immunol., 157, 462-472 (1996).

46. Porgador, A., et al., J. Immunol., 158, 834-841 (1997).

47. Published International Patent Application Number WO 99/27944.

48. U.S. Patent Number 4,666,829.

49. Games, D., et al., Nature, 373, 523-527 (1995).

50. Published International Patent Application Number WO 98/20734.

51. U.S. Patent Number 5,830,877.

52. Published International Patent Application Number WO 99/51259.

53. U.S. Patent Number 5,593,972.

54. Johnson-Wood, D., et al.. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94, 1550-1555 (1997).

55. Schenk, D., et al.. Nature, 400, 173-177 (1999)

Claims (67)

1. * .:,. ·..·.:.. .1..

   -51 SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Antigenikus készítmény, amely egy patogén vírusból, baktériumból, gombából vagy parazitából, vagy ráksejtből vagy tumorsejtből, vagy egy allergénből, vagy egy saját molekulából kiválasztott antigént, és hatékony adjuváns-hatást kifejteni képes mennyiségben alábbi kombinációt tartalmaz: (1) aminoalkil-glükózamin-foszfát (AGP) vegyületet vagy származékát vagy analógját, és (2) egy citokint vagy limfokint, vagy a citokin vagy limfokin agonistáját, amelyben az adjuváns-kombináció immunválaszt képes fokozni az antigén ellen gerinces gazdaszervezetben.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely antigénként egy fehérjéből származó polipeptidet, peptidet vagy fragmenst tartalmaz.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amelyben az AGP stabil „olaj-víz” emulzió-formában van alkalmazva.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely citokinként vagy limfokinként granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktort vagy interleukin-12-t tartalmaz.
5. 5. A 4. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely citokinként vagy limfokinként granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktort tartalmaz.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amelyben az AGP stabil „olaj-víz” emulzió-formában van alkalmazva.
7. 7. A 4. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely citokinként vagy limfokinként interleukin-12-t tartalmaz.
8. 8. A 7. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amelyben az AGP stabil „olaj-víz” emulzió-formában van alkalmazva.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely továbbá hígítószert vagy hordozót tartalmaz.
10. 10. A 9. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amelyben az AGP stabil „olaj-víz” emulzió-formában van alkalmazva.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amelyben az AGP: 2-[(R)-3tetradekanoil-oxitetradekanoil-amino]-etil-2-dezoxi-4-O-foszfono-3-O-[(R)-3-tetradekanoiloxitetradekanoil]-2-[(R)-3-tetradekanoil-oxitetradekanoil-amino]-P-D-glükopiranozid (529).
12. 12. Az 1. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely humán immundeficiencia vírusból (HÍV) kiválasztott antigént tartalmaz.

    ·» · · · .4». ·-52-
13. 13. A 12. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely kiválasztott HlV-antigénként egy HIV-fehérjét, polipeptidet vagy a fehérjéből származó fragmenst tartalmaz.
14. 14. A 13. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely kiválasztott antigénként HIV-peptid(ek)et tartalmaz az alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező peptidek közül:

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (1. azonosítószámú szekvencia);

    Lys Gin He lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Alá Phe Tyr Thr Thr Lys (2. azonosítószámú szekvencia);

    Arg Gin He He Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp He Asn Gin Met Leu (3. azonosítószámú szekvencia);

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (4. azonosítószámú szekvencia); és

    Lys Gin lie He Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (5. azonosítószámú szekvencia).
15. 15. A 14. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely HIV-peptidként alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező pepiidet tartalmaz:

    Lys Gin lie He Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (1. azonosító számú szekvencia).
16. 16. A 14. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely HIV-peptidként alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező pepiidet tartalmaz:

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Alá Phe Tyr Thr Thr Lys (2. azonosítószámú szekvencia).
17. 17. A 14. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely HIV-peptidként alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező pepiidet tartalmaz:

    Arg Gin He He Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu (3. azonosítószámú szekvencia).

    «· «**# .99 · S · ·»»» ·♦* »Jr·· *«·» ·$·<
18. 18. A 14. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely HIV-peptidként alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező peptidet tartalmaz:

    Lys Gin He Ue Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (4. azonosítószámú szekvencia).
19. 19. A 14. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely HIV-peptidként alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező peptidet tartalmaz:

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (5. azonosítószámú szekvencia).
20. 20. A 12. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amelyben az AGP stabil „olaj-víz” emulzió-formában van alkalmazva.
21. 21. A 12. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely citokinként vagy limfokinként granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktort vagy interleukin-12-t tartalmaz.
22. 22. A 21. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely citokinként vagy limfokinként granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktort tartalmaz.
23. 23. A 22. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amelyben az AGP stabil „olajvíz” emulzió-formában van alkalmazva.
24. 24. A 21. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely citokinként vagy limfokinként interleukin-12-t tartalmaz.
25. 25. A 24. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amelyben az AGP stabil „olajvíz” emulzió-formában van alkalmazva.
26. 26. A 12. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely továbbá hígítószert vagy hordozót tartalmaz.
27. 27. A 26. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amelyben az AGP stabil „olaj-víz” emulzió-formában van alkalmazva.
28. 28. A 12. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely AGP-ként 529-et tartalmaz.
29. 29. Eljárás patogén vírusból, baktériumból, gombából vagy parazitából kiválasztott antigént tartalmazó, antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy beadunk a gazdaszervezetnek 1. igénypont szerinti antigenikus készítményt.
30. 30. Eljárás patogén vírusból, baktériumból, gombából vagy parazitából kiválasztott antigént tartalmazó, antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességének fokozására ge- • f »< #5» * v · e « <* · 9 t>

    »!♦. ’#»* »<»· **·* *.l«% rinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy beadunk a gazdaszervezetnek 9. igénypont szerinti antigenikus készítményt.
31. 31. Eljárás HIV-antigént tartalmazó, antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy beadunk a gazdaszervezetnek 12. igénypont szerinti antigenikus készítményt.
32. 32. Eljárás HIV-antigént tartalmazó, antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy beadunk a gazdaszervezetnek 26. igénypont szerinti antigenikus készítményt.
33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiválasztott antigénként az alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező peptidek közül kiválasztott HIV-peptid(ek)et tartalmazó antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességét fokozzuk:

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Alá Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (1. azonosítószámú szekvencia);

    Lys Gin Ue He Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Alá Phe Tyr Thr Thr Lys (2. azonosítószámú szekvencia);

    Arg Gin He Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp He Asn Gin Met Leu (3. azonosítószámú szekvencia);

    Lys Gin lie He Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (4. azonosítószámú szekvencia); és

    Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (5. azonosítószámú szekvencia).
34. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező HIV-peptidet tartalmazó antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességét fokozzuk:

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (1. azonosító számú szekvencia).

    **?*? Λ· rh. *·*»* ·$»· *«·* «1»«.
35. 35. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező HIV-peptidet tartalmazó antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességét fokozzuk:

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Alá Phe Tyr Thr Thr Lys (2. azonosítószámú szekvencia).
36. 36. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező HIV-peptidet tartalmazó antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességét fokozzuk:

    Arg Gin He He Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp He Asn Gin Met Leu (3. azonosítószámú szekvencia)
37. 37. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező HIV-peptidet tartalmazó antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességét fokozzuk:

    Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (4. azonosítószámú szekvencia).
38. 38. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező HIV-peptidet tartalmazó antigenikus készítmény immunválaszt kiváltó képességét fokozzuk:

    Lys Gin He lie Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (5. azonosítószámú szekvencia).
39. 39. Eljárás patogén vírusból, baktériumból, gombából vagy parazitából kiválasztott antigént tartalmazó antigenikus készítmény citotoxikus T-limfociták termelődését kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy beadunk a gazdaszervezetnek 1. igénypont szerinti antigenikus készítményt.
40. 40. Eljárás patogén vírusból, baktériumból, gombából vagy parazitából kiválasztott antigént tartalmazó antigenikus készítmény citotoxikus T-limfociták termelődését kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy beadunk a gazdaszervezetnek 9. igénypont szerinti antigenikus készítményt.

    .·*.

    r» ·!*·· *·* vlb*
41. 41. Eljárás HIV-antigént tartalmazó antigenikus készítmény citotoxikus T-limfociták termelődését kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy beadunk a gazdaszervezetnek 12. igénypont szerinti antigenikus készítményt.
42. 42. Eljárás HIV-antigént tartalmazó antigenikus készítmény citotoxikus T-limfociták termelődését kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy beadunk a gazdaszervezetnek 26. igénypont szerinti antigenikus készítményt.
43. 43. A 42. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiválasztott antigénként az alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező peptidek közül kiválasztott HTV-peptid(ek)et tartalmazó antigenikus készítmény citotoxikus T-limfociták termelődését kiváltó képességét fokozzuk:

    Lys Gin He Ue Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Alá Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (1. azonosítószámú szekvencia);

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Alá Phe Tyr Thr Thr Lys (2. azonosítószámú szekvencia);

    Arg Gin lie He Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu (3. azonosítószámú szekvencia);

    Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (4. azonosítószámú szekvencia); és

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (5. azonosító számú szekvencia).
44. 44. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező HIV-peptidet tartalmazó antigenikus készítmény citotoxikus Tlimfociták termelődését kiváltó képességét fokozzuk:

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (1. azonosítószámú szekvencia).
45. 45. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező HIV-peptidet tartalmazó antigenikus készítmény citotoxikus Tlimfociták termelődését kiváltó képességét fokozzuk:

    ν·*. ·*·.

    ·*** »!♦· **·'*

    -57Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (2. azonosítószámú szekvencia).
46. 46. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező HIV-peptidet tartalmazó antigenikus készítmény citotoxikus Tlimfociták termelődését kiváltó képességét fokozzuk:

    Arg Gin He He Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp He Asn Gin Met Leu (3. azonosítószámú szekvencia)
47. 47. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező HIV-peptidet tartalmazó antigenikus készítmény citotoxikus Tlimfociták termelődését kiváltó képességét fokozzuk:

    Lys Gin He He Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (4. azonosítószámú szekvencia).
48. 48. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy az alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező HIV-peptidet tartalmazó antigenikus készítmény citotoxikus T-limfociták termelődését kiváltó képességét fokozzuk:

    Lys Gin He lie Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Alá Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Alá Arg Arg (5. azonosítószámú szekvencia).
49. 49. Eljárás ráksejtből vagy tumorsejtből kiválasztott, rákból származó antigént vagy tumor-asszociált antigént tartalmazó antigenikus készítmény terápiás vagy profilaktikus, rákellenes hatást kiváltó képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezetnek beadunk antigenikus készítményt, amely a ráksejtből vagy tumorsejtből kiválasztott, rákból származó antigént vagy tumor-asszociált antigént, és hatékony adjuváns-hatást kifejteni képes mennyiségben alábbi kombinációt tartalmaz: (1) AGP-t vagy származékát vagy analógját, és (2) egy citokint vagy limfokint, vagy a citokin vagy limfokin agonistáját.
50. 50. Eljárás egy kiválasztott allergént tartalmazó antigenikus készítmény allergiás választ mérséklő képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezetnek beadunk antigenikus készítményt, amely allergént, és hatékony adjuváns-hatást kifejteni képes mennyiségben alábbi kombinációt tartalmaz: (1) AGP-t vagy származékát vagy analógját, és (2) egy citokint vagy limfokint, vagy a citokin vagy limfokin agonistáját.

    3**» ·**« ·**· ··*! *^e,>« **>* ?·· *·** frtto»
51. 51. Antigenikus készítmény, amely egy gazdaszervezet által nem-kívánt módon, mennyiségben vagy helyen termelt molekulából, vagy részletéből kiválasztott antigént, és a nem-kívánt hatás csökkentésére hatékony adjuváns-hatást kifejteni képes mennyiségben alábbi kombinációt tartalmaz: (1) AGP-t vagy származékát vagy analógját, és (2) egy citokint vagy limfokint, vagy a citokin vagy limfokin agonistáját.
52. 52. Az 51. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely kiválasztott antigénként amiloid prekurzor fehéijéből származó polipepidet, pepiidet vagy fragmenst, vagy ezek bármelyikére specifikus ellenanyagot tartalmaz.
53. 53. Az 52. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely kiválasztott antigénként Αβ-peptidet tartalmaz, amely amiloid prekurzor fehéije belső, 39-43. aminosavából álló fragmense, vagy az Αβ-peptid fragmensét tartalmazza.
54. 54. Az 53. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely kiválasztott antigénként az alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező Αβ-peptidet tartalmazza:

    Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Alá Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala He He Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He Alá (6. azonosítószámú szekvencia).
55. 55. Az 54. igénypont szerinti antigenikus készítmény, amely AGP-ként 529-et tartalmaz.
56. 56. Eljárás egy gazdaszervezet által nem-kívánt módon, mennyiségben vagy helyen termelt molekulából, vagy részletéből kiválasztott antigént tartalmazó antigenikus készítmény nem-kívánt hatást csökkentő képességének fokozására, azzal jellemezve, hogy hozzáadunk hatékony adjuváns-hatást kifejteni képes mennyiségben alábbi kombinációt: (1) AGP-t vagy származékát vagy analógját, és (2) egy citokint vagy limfokint, vagy a citokin vagy limfokin agonistáját.
57. 57. Eljárás antigenikus készítmény amiloid lerakódásával járó betegséget megelőző vagy kezelő képességének fokozására gerinces gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezetnek beadunk amiloid prekurzor fehéijéből származó polipepidet, pepiidet vagy fragmenst, vagy ezek bármelyikére specifikus ellenanyagot, és hatékony adjuváns-hatást kifejteni képes mennyiségben alábbi kombinációt: (1) AGP-t vagy származékát vagy analógját, és (2) egy citokint vagy limfokint, vagy a citokin vagy limfokin agonistáját.

    -»**· ·**· ·**· *·*! ·**·
58. 58. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiválasztott antigénként beadunk Αβ-peptidet, amely amiloid prekurzor fehérje belső, 39-43. aminosavából álló fragmense, vagy beadjuk az Αβ-peptid fragmensét.
59. 59. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiválasztott antigénként beadjuk az alábbi aminosav-szekvenciával rendelkező Αβ-peptidet:

    Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Alá Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala He He Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He Alá (6. azonosítószámú szekvencia).
60. 60. Az 59. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy AGP-ként 529-et alkalmazunk.
61. 61. Adjuváns-forma, amely alábbi kombinációt tartalmaz: (1) aminoalkil-glükózaminfoszfát (AGP) vegyületet vagy származékát vagy analógját, és (2) egy citokint vagy limfokint, vagy a citokin vagy limfokin agonistáját.
62. 62. A 61. igénypont szerinti adjuváns-forma, amelyben az AGP stabil „olaj-víz” emulzió-formában van alkalmazva.
63. 63. A 61. igénypont szerinti adjuváns-forma, amely citokinként vagy limfokinként granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktort vagy interleukin-12-t tartalmaz.
64. 64. A 61. igénypont szerinti adjuváns-forma, amely továbbá hígítószert vagy hordozót tartalmaz.
65. 65. A 61. igénypont szerinti adjuváns-forma, amely citokinként vagy limfokinként granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktort tartalmaz.
66. 66. A 61. igénypont szerinti adjuváns-forma, amely citokinként vagy limfokinként interleukin-12-t tartalmaz.
67. 67. A 61. igénypont szerinti adjuváns-forma, amely AGP-ként 529-et tartalmaz.

    A meghatalmazott:

    DANUBIA