CZ20031225A3 - Adjuvantní kombinované prostředky - Google Patents

Description

Adjuvantní kombinované prostředky

Oblast techniky

Vynález se týká použití aminoalkyl glukosamin fosfátové sloučeniny, nebo jejích derivátů nebo analogů v kombinaci s cytokinem nebo lymfokinem, konkrétně faktorem stimulujícím kolonie granulocytů-makrofágů nebo interleukinem-12, jako adjuvantního prostředku v antigenní nebo imunogenní kompozici pro zesílení imunitní reakce u obratlovce na vybraný antigen.

Dosavadní stav techniky

Imunitní systém používá různé typy mechanismů proti napadajícím patogenům. Nicméně, ne všechny tyto mechanismy jsou nezbytně aktivovány po imunizaci. Protektivní imunita indukovaná imunizací je závislá na kapacitě imunogenní kompozice pro vyvolání vhodné imunitní reakce k ochraně před pa.togenem nebo k jeho eliminaci.

Současné paradigma o úloze pomocných T buněk v imunitní odpovědi předpokládá, že T buňky mohou být rozděleny na podtřídy podle cytokinů, které produkují, a že různý cytokinový profil pozorovaný u těchto buněk určuje jejich funkci. Tento model T buněk obsahuje dvě hlavní podtřídy: TH-1 buňky, které produkují interleukin-2 (IL-2) a interferon γ, které zvyšují jak buněčné, tak humorální (protilátkové) imunitní reakce; a TH-2 buňky, které produkují interleukin-4, interleukin-5 a interleukin-10(IL4, IL-5 a IL-10 v příslušném pořadí), které zvyšují humorální imunitní reakce (1).

Často je žádoucí zvýšit imunogenní účinnost antigenu pro dosažení silnější imunitní odpovědi v imunizovaném • · • ·

organismu a pro zesílení jeho odolnosti vůči agens nesoucím antigen. V některých situacích je žádoucí posunout imunitní odpověď z predominantně humorální odpovědi (TH-2) na více vyváženou buněčnou (TH-1) a humorální (TH-2) odpověď.

Buněčná odpověď zahrnuje tvorbu reakce CD8+ CTL (cytotoxických T-lymfocytů). Takováto reakce je žádoucí pro vývoj imunogenních kompozic proti vnitrobuněčným patogenům. Ochrana proti různým patogenům vyžaduje silné slizniční reakce, vysoké sérové titry, indukci CTL a aktivní buněčnou odpověď. Těchto odpovědí nebylo dosaženo s použitím většiny antigenních kompozic, včetně běžných podjednotkových kompozic. Mezi takové patogeny patří virus lidské imunodeficience (HIV).

Proto existuje potřeba vývoje antigenních kompozic, které jsou schopné vyvolat u obratlovce jak humorální, tak buněčné imunitní reakce.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití adjuvantních kombinovaných prostředků v antigenních kompozicích, které obsahují aminoalkyl glukosamin fosfátovou sloučeninu (AGP), nebo její deriváty nebo analogy v kombinaci s cytokinem nebo lymfokinem, konkrétně faktorem stimulujícím kolonie granulocytů-makrofágů (GM-CSF) nebo interleukinem-12 (IL12), nebo agonistou nebo antagonistou uvedeného cytokinu či lymfokinu. Konkrétně AGP je 2-[(R)-3tetradekanoyloxytetradekanoylamino] ethyl 2-deoxy-4-0fosfono-3-0-[ (R) -3-tetradekanoyoxytetradekanoyl]-2-[ (R) -3tetradekanoyoxytetradekanoylamino]-p~D-glukopyranosid, který je rovněž znám jako 529 (dříve známý jako RC529).

Adjuvans je substance, která zesiluje imunitní reakci, když je podána společně s imunogenem nebo antigenem.

• · · · • · · ·· ·· ·· • · · · · · · · · • · · · · · · · · · · · • ······· · · ··· · · ·· · ···· ···· ·· · ·· ·· ·· ··

Adjuvantní prostředek podle vynálezu je podán společně s vybraným antigenem v antigenní nebo imunogenní kompozici. Antigenní kompozice podle vynálezu zesiluje u obratlovce imunitní odpověď na vybraný antigen. Vybraným antigenem může být polypeptid, peptid nebo fragment získaný (1) z patogenního viru, baktérie, houby nebo parazita; nebo (2) z rakovinné nebo nádorové buňky; nebo (3) z alergenu tak, aby interferoval s produkcí IgE, a tak, aby došlo ke zmírnění alergických reakcí na alergen; nebo (4) z amyloidového prekursorového proteinu tak, aby se zabránila nebo aby se léčila onemocnění charakterizovaná ukládáním amyloidu u obratlovců. V jednom provedení podle předkládaného vynálezu je vybraný antigen získán z HIV. Vybraným HIV antigenem může být HIV protein, polypeptid, peptid nebo fragment odvozený od uvedeného proteinu.

V konkrétním provedení podle předkládaného vynálezu je HIV antigenem specifický peptid. V jiném provedení vynálezu je vybraným antigenem β-amyloidový peptid (rovněž známý jako peptid Αβ), jenž je vnitřním fragmentem amyloidového prekursorového proteinu (APP) v rozsahu aminokyselin 39-43, který je produkován zpracováním APP pomocí β a γ sekretázových enzymů.

AGP může být použit ve formé vodného roztoku nebo ve formě stabilizované emulze olej-ve-vodě (stabilní emulze nebo SE).V preferovaném provedení vynálezu obsahuje emulze olej-ve-vodě skvalen, glycerol a fosfatidylcholin. V SE prostředku je ACG smísen s cytokinem nebo lymfokinem za tvorby antigenní kompozice před podáním. Cytokin nebo lymfokin nemusí vstupovat do emulze. Ve výhodném provedení vynálezu je AGP v SE formě. Antigenní kompozice může dále obsahovat ředidlo nebo nosič.

Vynález je také zaměřen na způsoby zvýšení schopnosti antigenní kompozice obsahující antigen vybraný z (1) • · · · patogenního viru, baktérie, houby nebo parazita; nebo (2) nádorového antigenu nebo antigenu asociovaného s nádorem z rakovinných nebo nádorových buněk schopný vyvolat terapeutický nebo profylaktický protinádorový účinek u obratlovce; nebo(3) alergenu, který interferuje s produkcí IgE tak, aby došlo ke zmírnění alergických reakcí na alergen; (4)molekuly nebo její části, která je produkována obratlovcem (vlastní molekula) nežádoucím způsobem, v nežádoucím množství nebo místě, tak, aby byl snížen takový nežádoucí účinek, s tím, že uvedená antigenní kompozice obsahuje účinné adjuvantní množství kombinace cytokinu nebo lymfokinu, konkrétně AGP s GM-CSF nebo IL-12, nebo agonistů nebo antagonistu uvedeného cytokinu nebo lymfokinu.

Vynález je dále zaměřen na způsoby pro zesílení schopnosti antigenní kompozice obsahující antigen ,vybraný z patogenního viru, baktérie, houby nebo parazita ,vyvolat tvorbu cytotoxických T lymfocytů u obratlovce tím, že kompozice obsahuje účinné adjuvantní množství kombinace cytokinu nebo lymfokinu, konkrétně AGP s CSF nebo IL-12, nebo agonistů nebo antagonistu uvedeného cytokinu nebo lymfokinu.

Popis obrázků

Obr.l ukazuje geometrické průměry titrů (GMT) protilátek-proti peptidu Αβ1-42 v transgenní myši imunizované následovně: Skupina 1 - peptid Αβ1-42 plus PBS (neznázorněno); Skupina 2 - peptid Αβ1-42 plus MPL™ SE (čtverečky); Skupina 3 - peptid Αβ1-42 plus MPL™ SE a GMCSF (trojúhelníčky); Skupina 4 - peptid Αβ1-42 plus 529 SE a GM-CSF (převrácené trojúhelníčky).

• ·· ·

Obr.2 ukazuje celkové kortikální hladiny Αβ v transgenní myši imunizované čtyřmi skupinami látek popsanými u obr.l.

Obr.3 ukazuje kortikální hladiny peptidu Αβ1-42 v transgenní myši imunizované čtyřmi skupinami látek popsanými u obr.l.

Obr.4 ukazuje amyloidovou zátěž frontálního kortexu v transgenní myši imunizované čtyřmi skupinami látek popsanými u obr.l.

Obr.5 ukazuje neuritickou zátěž frontálního kortexu v transgenní myši imunizované čtyřmi skupinami látek popsanými u obr.l.

Obr.6 ukazuje hladiny astrocytosis v retrospleniálním kortexu v transgenní myši imunizované čtyřmi skupinami látek popsanými u obr.l.

Obr.7 ukazuje geometrické průměry titrů specifických protilátek IgG proti HIV C4 (E9V)-V3₈9.6p-peptidu v séru dvou skupin opic makaka cynomolgus (4 zvířata na skupinu). Skupina zvířat 1 byla imunizována intranasálně pomocí samotného peptidu 04 (E9V)-V3₈9.6p. Skupina zvířat 2 byla imunizována intramuskulárně pomocí peptidu C4 (E9V)-V3₈g.6P upraveného 529 SE a GM-CSF. Šipky označují imunizaci v týdnu 0, 4, 8, 18 a 23.

Obr.8 ukazuje geometrické průměry titrů protilátek v cervikovaginálních lavážích zvířat shodných se zvířaty popsanými u obr.7.

Obr.9 ukazuje geometrické průměry titrů protilátek ve vzorcích z nasálního výplašku zvířat shodných se zvířaty popsanými u obr.7.

• · · ·

» · · • · • · · · • · • · * · ·

Podrobný popis vynálezu

Adjuvans, cytokiny a lymfokiny jsou imunomodulační sloučeniny, které mají schopnost zvyšovat a udržovat vývoj a profil imunitní odpovědi proti různým antigenům, které jsou samy o sobě slabě imunogenní. Vhodný výběr adjuvans, cytokinů a lymfokinů může indukovat dobré humorální a buněčné imunitní reakce, které by nevznikly za absence adjuvans, cytokinů nebo lymfokinů. Konkrétně, adjuvans, cytokiny a lymfokiny mají významné účinky v zesílení imunitní reakce na podjednotkové a peptidové antigeny v imunogenních kompozicích. Jejich stimulační aktivita je rovněž přínosná pro vývoj antigenně specifických imunitních reakcí namířených proti antigenům. Pro různé druhy antigenů, které vyžadují silné slizniční reakce, vysoké sérové titry, indukci CTL a silné buněčné reakce, poskytují kombinace adjuvans a cytokin/lymfokin stimuly, které nejsou poskytnuty většinou antigenních přípravků.

Četné studie hodnotily různé adjuvantní prostředky na zvířecích modelech, ale kamenec (hydroxid hlinitý nebo fosforečnan hlinitý) je v současnosti jediným adjuvans povoleným pro všeobecné použití u člověka. Jiným adjuvans je Stimulon™QS-21 (QS-21) (Antigenics' lne., Framingham, MA (2). Jedné ze skupin adjuvans, stabilním emulzím skládajícím se z kombinací voda-v-oleji nebo olej-ve-vodě, se dostalo značné pozornosti pro její imunopotenciační schopnost. Tyto prostředky se obvykle skládají z různých kombinací metabolizovatelných nebo inertních olejů, které stabilizují a deponují antigen v místě injekce. Jedním takovým adjuvans je nekompletní Freundovo adjuvans (IFA), které obsahuje minerální oleje, vodu a emulgační činidlo. Kompletní Freundovo adjuvans (CFA) je IFA plus tepelně usmrcené mykobaktérie. Při použití těchto typů adjuvans je • ·· · důležité to, že v místě vpichu injekce dochází často k podráždění, jako důsledek infiltrace mononukleárních buněk které může způsobit granulomatózní léze. Proto jsou jako potenciální adjuvans hledány jiné sloučeniny a prostředky.

Jednou skupinou takových sloučenin jsou aminoalkyl glukosamin fosfátové sloučeniny (AGP), které jsou popsány v US patentu 6 113 918, například ve sloupci 2, řádek 14 a: sloupec 3, řádek 38, který je zde zahrnut jako odkaz (3). AGP mají aminoalkylovou (aglykonovou) skupinu, která je glykosidicky spojena s 2-deoxy-2-amino-a-D-glukopyranózou (glukosaminem) za vzniku základní struktury. Další substituenty zahrnují fosforylaci uhlíku 4 a 6 na glukosaminovém kruhu a tři 3-alkanoyloxyalkanoylové zbytky.

Jednou z takových AGP sloučenin je sloučenina označovaná jako 529 (jejíž plný chemický název je 2-[(R)-3tetradekanoyloxytetradekanoylamino] ethyl 2-deoxy-4-0fosfono-3-0-[ (R) -3-tetradekanoyoxytetradekanoyl]-2-[ (R) -3tetradekanoyoxytetradekanoylamino]-p-D-glukopyranosid) , která je vyráběna Corixa (Hamilton, MT) .

Corixa rovněž připravila metabolizovatelný prostředek typu olej-ve-vodě, který, když je kombinován s 529 rezultuje v tvorbu stabilizované emulze označené jako 529 SE. Stabilizovaná emulze je vytvořena mikrofluidizací 529 se skvalenovým olejem, glycerolem a fosfatidylcholinem. Současný prostředek je mikrofluidizovaná emulze GMP kvality. Emulze obsahující 1 % oleje (i když i jiné koncentrace mohou být použity) jsou popsány v příkladech níže.

529 SE nevede ke vzniku žádné rozeznatelné nežádoucí tkáňové patologie, jestliže je aplikována subkutánně Balb/c nebo Swiss-Webster myším. Stabilizovaná emulze obsahující stejné složky, ale bez 529, byla rovněž připravena pro srovnávací účely. Konkrétně, subkutánní imunizace s 39 • ·

4 4 · « • 44444 4 4 •44 4

•4 4444 aminokyselinovou verzí s deletovaným cysteinem (-Cys) HIV peptidu o 40 aminokyselinách, T1SP10MN(A) (který postrádá cysteinový zbytek v aminokyselinové pozici 17 v peptidu tvořeném 40 aminokyselinami (+Cys)), nebo s Αβ1-42 (interní fragment APP o 42 aminokyselinách),jako antigeny, z nichž každý byl připraven v kombinaci s adjuvans 529 SE a GM-CSF, nevedla k žádnému rozeznatelnému zánětu, zarudnutí, otoku nebo zatvrdnutí tkáně.

Do rozsahu předkládaného vynálezu spadají deriváty a analogy 529 a jiné AGP. Takové sloučeniny zahrnují, ale bez omezení, sloučeniny popsané v US patentu 6 113 918(3).

Přidání cytokinů a lymfokinů do imunogenních kompozic se ukázalo jako slibné pro zlepšení a zesílení potenciálu imunogenních kompozic (4). Bylo prokázáno, že cytokin interleukin-12 (IL-12) vyvolává a zesiluje buněčnou imunitu, prostřednictvím posunu v expanzi podskupiny T pomocných buněk směrem k Th-1 cytokinovému profilu (tj. na myším modelu k IgG2 podtřídě) (5-7). U myší bylo prokázáno, že rekombinantní myší IL-12 zesiluje Thl dominující profil imunitní reakce (4).

IL-12 je produkován různými buňkami prezentujícími antigen, zejména makrofágy a monocyty. Je zásadním prvkem v indukci Thl buněk z naivních T buněk. Produkce IL-12 nebo schopnost na něj reagovat byla prokázána jako zásadní pro vývoj protektivních Thl reakcí, například během parazitárních infekcí, zejména při Leishmanióze (8), stejně jako zesílení buňkami zprostředkované imunitní reakce na antigen z patogenní baktérie nebo viru (9), nebo z rakovinné buňky (10). Účinky IL-12 jsou z valné části zprostředkovány interferonem gamma produkovaným NK buňkami a pomocnými T buňkami. Interferon gamma je kritický pro indukci IgG2a protilátek proti T dependentním proteinovým antigenům (12) . IL-12, původně označovaný jako faktor

• ·· · • · · • · · · • · ···* • · · ·· ·

stimulující přirozené zabiječské buňky, je heterodimérním cytokinem(13). Exprese a izolace proteinu IL-12 v rekombinantních hostitelských buňkách je popsána v publikované Mezinárodní patentové přihlášce WO 90/05147 (14) .

Jiným cytokinem, který má slibný potenciál jako adjuvans, je GM-CSF. GM-CSF je specifickým typem faktoru stimulujícího kolonie (CSF). CSF jsou rodinou cytokinů, které indukují progenitorové buňky nalézající se v kostní dřeni k diferenciaci na specifické typy zralých krevních buněk. Jak je popsáno v US patentu č. 5 078 996 (15), který je zde uveden jako odkaz, GM-CSF aktivuje makrofágy nebo prekursorové monocyty k nespecifické protinádorové aktivitě. Byla popsána nukleotidová sekvence kódující lidský gen GM-CSF (15). Plasmid obsahující GM-CSF cDNA byl transformován do E.coli a byl uložen v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, pod přírůstkovým číslem 39900. Jak je popsáno v US patentu č. 5 229 496 (16), který je zde uveden jako odkaz, byl gen pro GM-CSF rovněž inzerován do kvasinkového expresního plasmidu a uložen v ATCC pod přírůstkovým číslem 53157. Dále, jak je popsáno v US patentu č. 5 073 627 (17), který je zde uveden jako odkaz, byla sekvence DNA kódující GM-CSF s odstraněnými místy glykosylace uložena v ATCC pod přírůstkovým číslem 67231.

Bylo prokázáno, že GM-CSF zvyšuje expresi proteinových molekul na buňkách prezentujících antigen, známých tím, že zesilují imunitní reakce (18) á působí na sekreci Ig v tříděných a purifikovaných myších B buňkách (19). GM-CSF byl rovněž popsán jako adjuvans pro imunogenní kompozice (20) .

Bylo prokázáno, že i jiné cytokiny nebo lymfokiny mají imunomodulační aktivitu, včetně například (avšak bez ·· ··· · • · · • · · · • · · · · · • · · ·· · omezení) interleukinů 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 a 18, interferonů α, β a γ, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a faktorů nekrózy nádorů a a β.

Problémy, které souvisejí se systémovým podáním jakéhokoliv cytokinu nebo lymfokinu, spočívají v biologických následcích spojených s aktivitou cytokinu nebo lymfokinu. Dále, účinky cytokinu nebo lymfokinu související s vývojem specifických imunitních reakcí na antigen, by měly být zvýšeny, jestliže budou udrženy lokální koncentrace cytokinu nebo lymfokinu.

Byly vyhodnoceny kombinace 3-0-deacylovaného monofosforyl lipidu A nebo monofosforyl lipidu A s GM-CSF nebo IL-12; bylo pozorováno zvýšení různých parametrů imunitní reakce (21) .

Předkládaný vynález popisuje, že kombinací antigenu, vybraného cytokinu nebo lymfokinu jako adjuvans a druhého adjuvans AGP (výhodně ve stabilní metabolizovatelné emulzi), je zesílena imunitní reakce specifická pro antigen.

Antigeny vybrané pro použití v antigenních kompozicích podle předloženého vynálezu jsou peptidy nebo polypeptidy získané z proteinů, proteiny, stejně jako jakékoliv fragmenty kterékoliv z následujících sloučenin: sacharidy, proteiny, póly- nebo oligonukleotidy, nebo jiné makromolekulární složky. Termín „peptid, jak je zde použit, označuje řadu alespoň tří aminokyselin a obsahuje alespoň jednu antigenní determinantu nebo epitop, zatímco „polypeptid je molekula delší než peptid, avšak nevytváří protein o plné délce. Takové peptidy, polypeptidy nebo proteiny mohou být konjugovány s nepříbuzným proteinem, jako je například tetanický nebo difterický toxoid. Termín „fragment, jak je zde použit, označuje část, avšak méně ·· *·· · ·· · ·· ·· ·· ·· než celek, sacharidu, proteinu, póly- nebo oligonukleotidu, nebo jiné makromolekulám! složky. Pro případ HIV obsahují antigenní kompozice podle předkládaného vynálezu dále kompletní proteiny HIV.

Předkládaný vynález je nejdříve doložen na modelovém systému využívajícím peptidové antigeny odvozené z. HIV.

Tyto peptidy jsou popsány nebo odvozeny z US patentů č.

013 548 (22) a č. 5 019 387 (23), které jsou zde uvedeny jako odkaz, a jsou nyní sumarizovány. Tyto peptidy obsahují aminokyselinové sekvence, které odpovídají regionu HIV obalového proteinu, proti kterému vznikají neutralizační protilátky a T buňky.

HIV je lidský retrovirus, který je příčinným agens syndromu získané imunodeficience (AIDS). HIV infikuje T buňky imunitního systému tím, že se svým glykoproteinem zevního obalu připojuje k CD4 (T4) molekule na povrchu T lymfocytů, takže využívá CD4 (T4) molekuly jako receptoru pro průnik do a infikování T buněk. Pokusy o indukci protektivní imunitní reakce specifické pro HIV infekci pomocí imunizace se setkaly s velmi omezeným úspěchem.

V současnosti se provádí mnoho postupů ve snaze stanovit účinnou a protektivní strategii pro vývoj imunogenních kompozic. Mezi tyto postupy patří použití atenuovaných a rekombinantních bakteriálních vektorů, které exprimují antigenní epitopy z HIV (24), použití rekombinantního adenoviru (25), nebo použití vektorů viru vakcinie (26), použití DNA imunizace (27) a použití syntetických peptidů, které obsahují různé T a B buněčné epitopy HIV (28).

Bylo prokázáno, že glykoprotein gpl20 zevního obalu HIV je schopen indukovat neutralizační protilátky u člověka. Bylo prokázáno, že rekombinantní protein PB1, který kóduje přibližně jednu třetinu celé molekuly gpl20 , obsahuje část obalového proteinu, který indukuje tvorbu · · ·· 9

9 9 • 9 9 9

9 9994 • · 9 ·

4

4 • 4 4 4 • 9 4

44

9« 9999

9 9 • 4 9

9 4 4 • 4 4 4

94 neutralizačních protilátek. Nicméně, studie na šimpanzech prokázaly, že ani intaktní gpl20, ani PB1 nejsou schopny vyvolat produkci vysokých titrů neutralizačních protilátek.

Běžnými metodami byly syntetizovány krátké peptidy, které odpovídají antigenním determinantám gpl20 a které generují protilátkou odpověď proti gpl20, jež neutralizuje virus a indukuje T-pomocnou a CTL odpověď proti viru.

Jedním takovým peptidem je HIV-1_MN peptid obsahující C4/V3 multiepitop, označený jako T1SP10MN(A)(+Cys), a jeho varianta s deletovaným cysteinem T1SP10MN(A)(-Cys). Tyto peptidy obsahují Th, Tctl 3 B epitopy, ale neidukují protilátky, které interferují s vazbou na CD4. Dříve bylo prokázáno, že tyto peptidy C4/V3 HIV jsou slibnými kandidáty pro indukci imunitních odpovědí, když jsou podány s CFA nebo s adjuvans podobnými CFA (29-34). Tyto peptidy obsahují epitopy, u nichž bylo dříve prokázáno, že vyvolávají CD4+Th buněčné odpovědi jak u myší, tak i u lidí, a obsahují jak základní neutralizační determinantu, tak místo které je rozpoznáváno CD8+ CTL jak u Balb/c myší, tak u lidí, kteří jsou HLA B7+. U 39 aminokyselinového peptidu bylo nedávno prokázáno, že je imunogenní a bezpečný u pacientů infikovaných HIV (28).

TlSPlOMN(A)(+Cys) má následující sekvenci 40 aminokyselin:

Lys

Gin

Ile

Ile

Asn

Met

Trp

Gin

Glu

Val

Gly

Lys

Ala

Met

Tyr

Ala

Cys

Thr

Arg

Pro

Asn

Tyr

Asn

Lys

Arg

Lys

Arg

Ile

His

Ile

Gly

Pro

Gly

Arg

Ala

Phe

Tyr

Thr

Thr

Lys

(31)

(SEQ

' ID

NO:

1) .

TS1SP10MN(A) (-Cys) byl syntetizován bez cysteinu v pozici 17 a má následující sekvenci 39 aminokyselin:

Lys

Gin

Ile

Ile

Asn

Met

Trp

Gin

Glu

Val

Gly

Lys

Ala Met

Tyr

Ala

Thr

Arg

Pro

Asn

Tyr

Asn

Lys

Arg

Lys

Arg

Ile

His

Ile

Gly

Pro

Gly

Arg

Ala

Phe

Tyr

Thr

Thr

Lys

·♦ ♦ 4· 49 • · 4 4 4 4 • · · * 4 4444 « #444 4 4 4 4 4 ⁴ · · 4 4 4 4 • 4 ϊ «Λ 4 4

4444 (SEQ ID N0:2).

Tento cysteinový zbytek je lokalizován mimo funkční epitopy rozpoznávané Th buňkami, CTL nebo B buňkami. Jiné HIV peptidy z různých regionů virového genomu jsou popsány v US patentu č. 5 861 243 (35), US patentu č. 5 932 218 (36), US patentu č. 5 993 819 (38), US patentu č. 6 037 135 (39), Publikované Evropské přihlášce č. 671 947 (40) a US patentu č. 6 024 965 (41), které jsou zde rovněž uvedeny jako odkazy.

Rovněž je použit peptidový konjugát označený jako STl/pllC o 28 aminokyselinách. Konjugát sestává ze SIV envodvozeného T-pomocného peptidu o 16 aminokyselinách, označeného jako ST-1, konjugovaného s peptidem SIV mac 251 Gag (aminokyseliny 179-190 z Gag) o 12 aminokyselinách, který je označován jako pllC (42). Peptid pllC v tetramerní formě vykazoval CTL aktivitu u SIV mac-infikovaných MamuA*01 opic makaka rhesus(43). Peptidový konjugát STl-pllC má následující aminokyselinovou sekvenci:

Arg	Gin	Ile	Ile	Asn	Thr	Trp His	Lys Val	Gly
Lys	Asn	Val	Tyr	Leu	Glu	Gly Cay	Thr Pro	Tyr
Asp	Ile	Asn	Gin	Met	Leu	(SEQ ID	NO:3).

Rovněž je použit peptidový konjugát označený jako C4V3s9.6p o 39 aminokyselinách (44) . Oblast C4 tohoto peptidového konjugátu (16 aminokyselin) je odvozena ze čtvrté konstatní oblasti HIV-1 obalového proteinu a představuje univerzální T-pomocný epitop. V3 podíl peptidu (23 aminokyselin) je odvozen ze třetí hypervariabilní oblasti HIV-1 obalového proteinu a představuje rozhodující neutralizační determinantu. Konjugát C4-V3g9-6P má následující aminokyselinovou sekvenci:

Lys	Gin	Ile	Ile	Asn	Met	Trp	Gin	Glu	Glu	Val Gly
Lys	Ala	Met	Tyr	Ale	Thr	Arg	Pro	Asn	Asn	Asn
Thr	Arg	Glu	Arg	Leu	Ser	Ile	Gly	Pro	Gly	Arg

•4 ···· • · · • 9 • · ·

9 · 9 ♦ 9 »··· 4

9 9 *· ♦

Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO:4).

HIV antigen může být protein, polypeptid, peptid nebo fragment uvedeného proteinu. Protein může být glykoprotein, jako je gp 41, gpl20 nebo gp!60. Alternativně, protein může být protein kódovaný takovými geny, jako jsou gag, pol, vif, rev, vpr, tat, nef nebo env. Peptidy získané z takových proteinů budou obsahovat alespoň jednu antigenní determinantu (epitop) o délce alespoň šest aminokyselin.

Imunitní odpověď na HIV peptid může být zesílena kovalentním navázáním (konjugací) peptidu na farmaceuticky přijatelný nosič. Příklady vhodných nosičů jsou tetanický toxoid, difterický toxoid, přílipkový (keyhole limpet) hernokyanin a jiné peptidy odpovídající T-buněčným epitopům glykoproteinu HIV gpl20.

V současnosti se předpokládá, že úspěšná strategie imunizace proti HIV vyžaduje vyvolání slizniční imunity vůči HIV, stejně jako dobré CTL odpovědi. V nedávné studii na myších s použitím multiepitopového peptidu TISPIOMN(A) a slizničního adjuvans, cholerového toxinu, bylo prokázáno, že intranasální imunizace indukovala neutralizační sérové protilátky IgGl (45). Následující studie, také využívající peptidy HIV-V3 smyčky, prokázala indukci slizniční protilátky IgA a silné buňkami zprostředkované reakce, včetně CTL specifické pro peptid (46). Funkční úloha vysokých titrů systémových a neutralizačních protilátek v prevenci nebo stabilizaci jedinců infikovaných HIV je neznámá, ačkoliv se předpokládá, že vysoké titry protilátky specifické pro virus jsou významné pro prevenci šíření viru.

V preferovaném provedení předkládaného vynálezu je připravena stabilní emulze olej-ve-vodě, která obsahuje 529, jež je potom smísena s cytokiny IL-12 nebo GM-CSF.

Údaje uvedené dále ukazují, že kombinace 529 plus GM-CSF • · · · • · · · · · · • · • · · vede k vysokým titrům sérových HIV-neutralizačních protilátek. Kombinace 529 SE a GM-CSF indukuje vysoké titry protilátek IgG specifických pro antigen, včetně jak IgGl, tak IgG2a podtříd, ve vagíně imunizovaných myších samic. Imunizace myší pomocí peptidu T1SP10MN(A)(-Cys) připraveném společně s 529 SE a GM-CSF indukuje silnou buněčnou imunitní reakci, jak je určeno zvýšením antigenněspecifické buněčné proliferace a sekrece cytokinů do kultury, stejně jako indukcí CTL reakcí specifických pro peptid. Podobné výsledky byly pozorovány, když byly myši imunizovány pomocí peptidu Αβ1-42 z APP společně s 529 SE a GM-CSF.

Obecně, prostředky antigen/adjuvans obsahující 529 nebo 529 SE v kombinaci s GM-CSF nebo IL-12 a proteinem nebo peptidem podle výběru indukují vysoké titry antigenněspecifických a virus-neutralizujících protilátek, významný posun v poměru podtříd IgG směrem k vyšší produkci komplement-fixačních protilátek IgG (ve prospěch IgG2a u myší), a vyšší produkci cytokinů a buněčnou proliferaci z mononukleárních buněk jako reakci na stimulaci antigenem in vitro. Tyto vlastnosti nebyly pozorovány u prostředků s obsahem antigenu a SE za nepřítomnosti 529, buďto s nebo bez GM-CSF nebo IL-12. Prostředky podle předkládaného vynálezu také indukují dobré buněčné reakce, jak je stanoveno indukcí CTL.

Přínos 529 SE spočívá v tom, že prostředek neindukuje granulomatózní akumulaci a zánět v místě injekce; takové reakce v místě injekce jsou typicky indukovány adjuvantními prostředky typu voda-v-oleji nebo olej-ve-vodě.

Byl proveden pokus pro srovnání podání peptidu HIV

T1SP10MN(A)(-Cys) se samotným 529 SE nebo s 529 SE plus IL12, nebo 529 SE plus GM-CSF.

• · • · · · • · · · · · · • · ♦ ·· ·

V tomto pokusu (Tabulka 1 níže), kde byly myši Balb/c subkutánně imunizovány peptidem HIV TISPIOMN(A)(-Cys)a 529 SE, byly peptid-specifické sérové titry IgG vyvolány pouze po dvou injekcích. Byly také vyvolány titry podtříd IgGl a IgG2a. Zařazení druhého adjuvans, buďto GM-CSF nebo IL-12, pozvedlo celkové titry IgG, stejně jako titry IgGl podtřídy. Přidání IL-12 pozvedlo titry podtřídy IgG2a; přidání GM-CSF nezvýšilo titry podtřídy IgG2a.

V jiném pokuse, jako míra funkčními buňkami zprostředkované imunity, byla stanovena schopnost buněk sleziny z myší imunizovaných 529 SE, nebo 529 SE plus IL12, nebo 529 SE plus GM-CSF, formulovaných společně s multiepitopovým peptidem TISPIOMN(A)(-Cys), generovat HIV_MN-specifické CTL odpovědi.

Jak je ukázáno v Tabulce 2, vykazovaly buňky sleziny z myší imunizovaných kterýmkoliv z adjuvans nízkou aktivitu vůči cílovým buňkám, které byly buďto neznačené, nebo pulsně značené irelevantním epitopem IIIB CTL. HIV_MNspecifická CTL zprostředkovaná lyže cílových buněk byla výrazně zvýšena, jestliže byl podán 529 SE plus IL-12 ve srovnání s 529 samotným, a ještě více, když byl podán 529 SE plus GM-CSF (Tabulka 2).

V dalším pokusu byly opice makaka rhesus imunizovány pomocí peptidů STl-pllC nebo C4-V389.6P a IFA nebo 529 SE plus GM-CSF (skupiny jsou uvedeny v Tabulce 15). Výsledky analýz jsou uvedeny v Tabulce 16 až 22 a jsou nyní shrnuty.

Zdá se, že STl-pllC přípravek sám o sobě je dobře tolerován u všech testovaných zvířat. Nicméně, byly zjištěny signifikantní reaktivity v místě injekce u adjuvans IFA. Kromě toho byly po konečné imunizaci, pozorovány možné minoritní nepříznivé účinky adjuvantního 529/GM-CSF prostředku. Prostředek obsahující peptid STlpllC a IFA byl schopen indukovat silnou specifickou • · · • · · · · • · • · buněčnou imunitní reakci u jednoho ze dvou testovaných Mamu-A*01 pozitivních makaků. STl-pllC peptidový prostředek obsahující 529 SE/GM-CSF byl také schopen indukovat pllCspecifickou buněčnou odpověď u jednoho ze dvou testovaných Mamu-A*01 pozitivních makaků.

Prostředek obsahující peptid C4-V3₈₉.6_P a IFA byl schopen vytvoření píku plazmatických ELISA titrů protilátek v rozmezí 1:25,600 - 1:102,400 a titrů sérových neutralizačních protilátek proti SHIV₈9.6 a SHIV₈₉.₆p. Prostředek obsahující peptid C4-V3₈₉,6_P a 529 SE/GM-CSF byl schopen vytvoření píku plazmatických ELISA titrů protilátek v rozmezí 1:6,400 - 1:12,800 a nízké úrovně odpovědi neutralizačními protilátkami proti SHIV₈₉.₆, avšak nikoliv proti SHIV₈₉._6p.

Vzhledem k malému počtu zvířat na skupinu (dvě) je obtížné navrhnout konkrétní závěry. Nicméně, úroveň imunitní reakce, jak humorální tak buněčné, generované oběma peptidovými prostředky obsahujícími 529 SE/GM-CSF byla kvantitativně nižší, než imunitní odpověď pozorovaná u zvířat, u nichž bylo použito IFA jako adjuvans. Vždy je třeba poukázat na to, že IFA není schválenou složkou kompozic pro komerční účely u lidí. Mimo to, existují určité omezené důkazy o tom, že funkční vlastnosti a fenotyp (t.j. cytokinové profily) odpovídajících buněk mohou být odlišné v závislosti na použitém adjuvantním. prostředku.

V dalším pokuse byla zvířata druhého druhu primátů, opic makaka cynomolgus, , imunizována peptidem C4-V3₈₉.6_P, který byl modifikován záměnou glutamové kyseliny v poloze aminokyselinového zbytku 9 za valin. Výsledný peptidový konjugát, označený jako C4 (E9V) -V3₈₉._6P, má následující sekvenci:

Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Val Val Gly

Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn

Thr Arg Glu Arg le Ser Ile Gly Pro Gly Arg

Ale Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO:5).

Zvířata byla immunizována peptidem C4 (E9V)-V3₈9.6p buďto bez adjuvans, nebo v kombinaci s 529 SE plus GM-CSF.

Výsledky naznačují, že peptid C4 (E9V)-V3₈9.6_P, když je podán intramuskulární injekcí v kombinaci s 529 SE/GM-CSF, vyvolává signifikantně vyšší peptid-specifické titry v séru, než stejné množství peptidu C4 (E9V)-V3₈₉.₆p podaného intranasálně bez adjuvans (Obrázky 7-9). Výsledky z tohoto pokusu jasně prokazují, že když je HIV peptidový imunogen podáván v kombinaci s vhodnou kombinací adjuvans, je schopen vyvolat systémovou humorální imunitu.

Vhodné imunogenní kompozice pro prevenci nebo ošetřování nemocí charakterizovaných ukládáním amyloidu (vlastní molekuly) u obratlovců, které obsahují adjuvantní kombinace podle předloženého vynálezu, zahrnují ty, které obsahují části beta amyloidového prekursorového proteinu (APP). Toto onemocnění je nazýváno různě, jako Alzheimerova choroba, amyloidosis nebo amyloidogenní nemoc, β-amyloidový peptid (také nazývaný jako peptid Αβ) je vnitřní fragment APP o aminokyselinách 39-43, který vzniká štěpením APP β a γ sekretázovými enzymy. Peptid Αβ-42 má následující sekvenci:

Asp

Ala

Glu

Phe

Arg

His

Asp

Ser

Gly

Tyr

Glu

Val

His

His

Gin

Lys

Leu

Val

Phe

Phe

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly

Ala

Ile

Ile

Gly

Leu

Met

Val

Gly

Gly

Val

Val

Ile

Ala

(SEC

> ID

NO:

6) .

U některých pacientů má ukládání amyloidu formu agregovaného peptidu Αβ. Překvapivě bylo nyní zjištěno, že podání izolovaného peptidu Αβ indukuje imunitní reakci proti peptidové Αβ komponentě amyloidového depozitu u obratlovce(47). Proto imunogenní kompozice podle • · ···· • · · ·· · · předkládaného vynálezu zahrnují adjuvantní kombinace podle vynálezu plus peptid Αβ, stejně jako fragmenty, deriváty nebo modifikace peptidu Αβ a protilátky proti peptidu Αβ nebo jeho fragmentům, derivátům nebo modifikacím. Jedním takovým fragmentem peptidu Αβ je peptid o 28 aminokyselinách mající následující sekvenci (48):

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Le Val Phe Phe Ale Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEQ ID NO:7).

Další fragmenty peptidu Αβ, které jsou předmětem zájmu, zahrnují, ale bez omezení, aminokyseliny 1-10, 1-7, 1-6, 1-5, 3-7, 1-3 a 1-4, které mohou být podávány v nekonjugované formě, nebo konjugované s nepříbuzným proteinem.

Byla provedena řada studií s peptidem Αβ1-42 a různými adjuvans. Souhrn výsledků bude nyní uveden.

V prvém pokusu myši Swiss-Webster imunizované subkutánně v oblasti hýždě peptidem Αβ1-42 vytvářely titry peptid-specifických protilátek IgG, IgGl a IgG2a, což prokazuje, že peptid Αβ1-42 je realizovatelný kandidátský antigen. Přidání GM-CSF k 529 SE a peptidu Αβ1-42 vedlo ke zvýšení titrů sérových protilátek IgG, IgGl a IgG2a ve srovnání s příjemci 529 SE a peptidu Αβ1-42 (viz Tabulky 38) .

Sérové protilátky z jednotlivých myší, které obdržely kombinaci 529 SE plus GM-CSF, byly zvýšeny mnohem rychleji, než z myší, které obdržely samostatně 529 SE (data nejsou uvedena). Když byl první pokus opakován se staršími myšmi Swiss-Webster (ve stáří6-8 měsíců místo méně než 3 měsíce), byly pozorovány výsledky podobné těm, které uvádí Tabulky 3-8 (data nejsou uvedena).

Ve druhém pokusu Swiss-Webster myši byly imunizovány subkutánně v oblasti hýždě peptidem Αβ1-42 a 529 SE s proměnlivým množstvím GM-CSF. Konečné titry IgG se zvyšovaly v závislosti na dávce tak, jak se zvyšovalo množství GM-CSF (0,1 , 1 a 10 pg). Titry IgG pro všechny kombinace 529 SE plus GM-CSF byly vyšší než pro skupiny, které obdržely jiné adjuvans, QS-21, samotné nebo s GM-CSF. Titry podtříd IgGl byly také zvýšeny pro různé 529 SE plus GM-CSF skupiny ve srovnání se skupinou, která obdržela 529 SE plus GM-CSF v prvé dávce a 529 SE samotné ve druhé dávce (Tabulka 10). Titry podtřídy IgG2a byly rovněž v závislosti na dávce zvýšeny pro různé 529 SE plus GM-CSF skupiny ve srovnání se skupinou, která obdržela 529 SE samotnou (Tabulka 11).

Ve třetím pokusu byly Swiss-Webster myši imunizovány subkutánně v oblasti hýždě peptidem Αβ1-42 a 529 SE, společně nebo bez proměnlivého množství GM-CSF. Konečné titry IgG byly zvýšeny pro různé 529 SE plus GM-CSF skupiny (0,5, 2, 5, 10 pg), nikoliv však v závislosti na dávce (Tabulka 12). Jak titry podtřídy IgGl, tak titry podtřídy IgG2 byly také zvýšeny pro různé 529 SE plus GM-CSF skupiny ve srovnání se skupinou 529 SE samotné, nikoliv však v závislosti na dávce (Tabulky 13 [IgGl] a 14 [IgG2a]) .

Ve čtvrtém pokusu byly použity transgenní myši, které exprimují různé formy β-amyloidového prekursorového proteinu (APP), majícího mutaci ve zbytku 717 - záměnu valinu za fenylalanin (49). Tato mutace je spojena s familiární Alzheimerovou chorobou u lidí. Tyto transgenní myši (označované jako myši PDAPP) progresivně vyvíjejí mnoho patologických charakteristických znaků Alzeheimerovy choroby, včetně ukládání Αβ, neuritických plaků a astrocytosis, a proto slouží jako zvířecí model pro lidskou Alzheimerovu chorobu.

V tomto čtvrtém pokusu myši PDAPP byly imunizovány subkutánně peptidem Αβ1-42 s nebo bez různých adjuvans a • · · ♦ · · . , .

• ... · « · a · , , _ • ···.··· ,. ··· . , .· · · ·· · · ·· · ·· · ·· ·· ....

v dávkách uvedených v Tabulce A. Konkrétně, skupina myší 1 obdržela peptid Αβ1-42 s MPL™ (Corixa, Hamilton, Mt) ve stabilní emulzní formě (SE)jako pozitivní kontrolu; skupina myší 2 obdržela peptid Αβ1-42 s MPL™ SE plus myší GM-CSF; skupina myší 3 obdržela Αβ1-42 peptid s 529 SE plus myší GM-CSF; skupina myší 4 obdržela PBS jako negativní kontrolu. Skupiny 2 a 3 vykazovaly mnohem rychlejší zvýšení hodnot titru protilátky βηίί-Αβ1-42, stejně jako vyšší pík titru než skupina 1 nebo 4. Nicméně, titry ve skupinách 2 a 3 ustoupily na ekvivalentní titr skupiny 1 pozitivních kontrol během 2-3 měsíců (Obrázek A). Skupiny 1, 2 a 3 vykazovaly signifikantní snížení hladin mozkového Αβ, jak bylo měřeno pomocí ELISA (Tabulky B-C a Obrázky B-C),nižší amyloidovou zátěž (Tabulka D a Obrázek D) a menší neuritickou dystrofii (Tabulka E a Obrázek E), když byly srovnány se skupinou 4 negativních kontrol. Skupiny 2 a 3 měly signifikantní snížení astrocytosis ve srovnání se skupinou 1 pozitivních kontrol (Obrázek F).

Proto se zdá, že adjuvantní vlastnosti 529 SE a GM-CSF nebo IL-12 jsou synergické, jsou-li tyto formulovány společně.

Antigenní kompozice podle předloženého vynálezu modulují imunitní reakci zvýšením protilátkové odpovědi obratlovce a buňkami zprostředkované imunity po podání antigenní kompozice obsahující antigen vybraný z patogenního viru, baktérie, houby nebo parazita, a účinné adjuvantní množství AGP, jako je 529 (ve vodné nebo stabilní emulzní formě) kombinované s cytokinem nebo lymfokinem, zejména GM-CSF nebo IL-12. Bylo prokázáno, že jiné cytokiny nebo lymfokiny mají imunomodulační aktivitu včetně,avšak bez omezení, interleukinů 1-alfa, 1-beta, 2,

4, 5,.6, 7, 8, 10, 13 , 14, 15, 16, 17 a 18, interferonů···· • * alfa, beta a gamma, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a faktorů nádorové nekrózy alfa a beta.

Agonisté nebo antagonisté uvedených cytokinu nebo lymfokinu spadají rovněž do rozsahu tohoto vynálezu. Termín „agonista, jak je zde uveden, označuje molekulu, která zesiluje aktivitu nebo funkci stejným způsobem, jako výše uvedené cytokiny nebo lymfokiny. Příkladem takového agonisty je sloučenina napodobující uvedené cytokiny nebo lymfokiny. Termín „antagonista, jak je zde uveden, označuje molekulu, která inhibuje nebo brání aktivitě uvedených cytokinů nebo lymfokinů. Příklady takových antagonistů jsou solubilní receptor pro IL-4 a solubilní receptor pro TNF.

Termín „účinné adjuvantní množství, jak je zde použit, označuje dávku kombinace adjuvans popsaných výše, která je vhodná pro vyvolání zesílené imunitní reakce na vybraný antigen u obratlovce ve srovnání s příjemcem, který dostává vybraný antigen za absence adjuvantní kombinace. Konkrétní dávka závisí částečně na věku, váze a zdravotním stavu příjemce, stejně jako na způsobu podání antigenu. Ve výhodných provedeních se využívá kombinace adjuvans 529 v rozmezí 0,1-500 gg/na dávku. V ještě výhodnějším provedení je rozmezí 1-100 gg/na dávku. Vhodné dávky jsou snadno určeny odborníky v oboru. Antigenní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být také smíseny s imunologicky přijatelnými ředidly nebo nosiči běžným způsobem pro přípravu injekčních kapalných roztoků nebo suspenzí.

Antigenní nebo imunogenní kompozice podle vynálezu jsou podávány lidem nebo jiným obratlovcům různými cestami, včetně, ale bez omezení, intranasálního, orálního, vaginálního, rektálního, parenterálního, intradermálního, transdermálního (viz např. Mezinárodní přihláška WO •444 ·

4 i · · • ···· • * • 444 4 4 • · 4 , *♦ 44

98/20734 (50), která je zde uvedena jako odkaz), intramuskulárního, intraperitoneálního, subkutánního, intravenózního a intraarteriálního podání. Množství antigenní složky nebo složek v antigenní kompozici se bude lišit podle typu antigenů, stejně jako podle věku, váhy a zdravotního stavu příjemce, stejně jako podle způsobu podání. Opět jsou vhodné dávky snadno určeny odborníkem v oboru. Je výhodné, ačkoliv ne nutné, aby antigen a kombinace adjuvans byly podány ve stejnou dobu. Počet dávek a dávkovači protokol pro antigenní kompozici jsou také snadno stanoveny odborníky v oboru. V některých případech mohou adjuvantní vlastnosti kombinace adjuvans snižovat počet požadovaných dávek nebo dobu dávkovacího protokolu.

Kombinace adjuvans podle předkládaného vynálezu jsou vhodné pro použití v antigenních nebo imunogenních kompozicích obsahujících širokou paletu antigenů z různých patogenních mikroorganismů, včetně, avšak bez omezení, virů, baktérií, hub nebo parazitických mikroorganismů, které infikují člověka a jiné obratlovce, nebo z rakovinných nebo nádorových buněk. Antigen může obsahovat peptidy nebo polypeptidy odvozené od proteinů, stejně jako fragmenty následujících sloučenin: sacharidů, proteinů, póly- nebo oligonukleotidů, rakovinných nebo nádorových buněk, alergenů, vlastních molekul (jako je amyloidový prekursorový protein), nebo jiných makromolekulárních složek. V některých případech obsahuje antigenní kompozice více než jeden antigen.

Požadované virové imunogenní kompozice obsahující adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu zahrnují ty, které jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených virem lidské imunodeficience, virem opičí imunodeficience, respiračně syncytiálním virem,

Parainfluenzovými viry typu 1-3, virem chřipky, virem • · • 9 99

9 4 • · « ·

• ♦ · • 9 9 9

99999 · · ·

hepatitidy A, virem hepatitidy B, virem hepatitidy C, lidským papillomavirem, poliovirem, rotavirem, caliciviry, virem spalniček, virem příušnic, virem zarděnek, adenovirem, virem vztekliny, virem psinky, virem dobytčího moru, lidským metapneumovirem, ptačím pneumovirem (dříve krůtí virus rhinotracheitis), virem Hendra, virem Nipah, koronavirem, parvovirem, infekčními viry rhinotracheitidy, virem kočičí leukemie, virem kočičí infekční peritonitidy, virem ptačí infekční bursitidy, virem Newcastle nemoci, virem Marekovy nemoci, virem prasečího respiračního a reprodukčního syndromu, virem koňské arteritidy a různými viry encefalitidy.

Požadované bakteriální imunogenní kompozice obsahující adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu zahrnují ty, které jsou určeny pro prevenci a/nebo léčení onemocnění způsobených, bez omezení, Haemophilus influenzae (jak typizovatelným, tak netypizovatelným), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae,

Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae,

Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Alloiococcus otiditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, , Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae,

Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium - komplexem Mycobacterium intracellulare, Próteus mirabilis, Próteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae a Mycoplasma gallisepticum.

• Φ · φ φ φ ♦ · φ · • φφφφφ φφφ φφ · φφφ • Φ φφφφ

Požadované imunogenní kompozice proti houbovým patogenům obsahující adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu zahrnují ty, které jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených, bez omezení, Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes,

Cryptococcus a Histoplasma.

Požadované imunogenní kompozice proti parazitům obsahující adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu zahrnují ty, které jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených, bez omezení, Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii a Pneumocystis carinii.

Požadované imunogenní kompozice pro vyvolání terapeutického nebo profylaktického protinádorového účinku u obratlovace zahrnují ty, které používají nádorový antigen nebo s nádorem asociovaný antigen včetně, bez omezení, prostatového specifického antigenů, karcinoembryonálního antigenů, MUC-1, Her-2, CA-125 a MAGE-3.

Požadované imunogenní. kompozice pro zmírnění reakce na alergeny u obratlovce obsahující adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu zahrnují ty, které obsahují alergen nebo jeho fragment. Příklady takových alergenů jsou popsány v US patentu č. 5 830 877 (51) a ve zveřejněné Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 99/51259 (52), které jsou zde uvedeny jako odkazy, a zahrnují pyl, hmyzí jedy, zvířecí epitélie (dander), spory hub a léčiva (jako je penicilín) . Imunogenní kompozice interferují s produkcí protilátek IgE, které jsou známou příčinou alergických reakcí.

Požadované imunogenní kompozice pro zmírnění reakce na vlastní molekuly u obratlovců, které obsahují adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu, zahrnují ty, které obsahují vlastní molekulu nebo její fragment. Příklady ·· 4444 • 4 4

4 4 ♦ 4 4# « 44444 • 4 4 ·

takových vlastních molekul vedle peptidu Αβ1-42 popsaného výše, zahrnují β-řetězec inzulínu zúčastněného v diabetes, molekulu G17, zúčastněnou v gastroezofageálním refluxu, a antigeny, které snižují autoimunitní reakce u onemocnění, jako je roztroušená skleróza, lupus a artritida.

V případě HIV a SIV obsahuje antigenní kompozice alespoň jeden protein, polypeptid, peptid nebo fragment odvozený od uvedeného proteinu. V některých případech obsahuje antigenní kompozice více HIV nebo SIV proteinů, polypeptidů, peptidů a/nebo fragmentů.

Adjuvantní kombinované- prostředky podle předkládaného vynálezu jsou také vhodné pro použití jako adjuvans v polynukleotidových imunogenních kompozicích (též známých jako DNA imunogenní kompozice). Takové imunogenní kompozice mohou dále obsahovat facilitační činidla, jako je bupivicain (viz US patent č. 5 593 972 (53), který je zde uveden jako odkaz).

Pro lepší pochopení předkládaného vynálezu jsou uvedeny následující příklady. Tyto příklady jsou určeny pouze pro ilustraci a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Materiál a metody

Následující materiály a metody byly použity v pokusech uvedených jako Příklady 2-7 níže.

Zvířata * 9« • 9 • 999

9 1

9 « » ·9

9999 • 9

9999 ·

9 9 • 9 9

Samice myší Balb/c ve věku 7-9 týdnů byly zakoupeny od Taconic Farms, lne. (Germantown, NY). Samice myší SwissWebster ve věku 7-9 týdnů byly také získány od Taconic Farms, lne. Všechny myši byly chovány v zařízeních schválených American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Myši se nechaly aklimatizovat v zařízeních po dobu jednoho týdne před zahájením pokusů.

Antigeny

V HIV pokusech podle Příkladů 2-3 níže byly použity dva odlišné syntetické peptidy. Sekvence multiepitopového HIV-1-mn T1SP10MN(A)(-Cys) (zde rovněž označovaná jako MN10) je následující:

Lys	Gin I.le Ile Asn Met Trp	Gin Glu Val	Gly Lys Ala Met
Tyr	Ala Thr Arg Pro Asn Tyr	Asn Lys Arg	Lys Arg Ile His
Ue	Gly Pro Gly Arg Ala Phe	Tyr Thr Thr	Lys (SEQ ID NO:2).
	Tento peptid byl popsán	dříve (33,	34) a obsahuje

sekvence z HIV-1 gpl20Mu, které vyvolávají reakci buněk CD4⁺ Th u myší i u člověka, základní neutralizační determinantu a místo rozpoznávané CD8⁺ CTL u myší Balb/c. Peptid byl získán od Dr. R. Scearce (Duke University, Durham, NC). Pro CTL analýzu byl pro srovnávací účely použit irelevantní peptid označený IIIB. Tento peptid odpovídal CTL epitopu ve V3 smyčce HlV-l-me (Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ule (SEQ ID NO:8)) a byl získán od Genosys Biotechnologies lne. (The Woodlands, TX) . Peptidy byly solubilizovány ve sterilní vodě a před použitím naředěny ve vhodných pufrech nebo buněčných kultivačních médiích.

V amyloidových pokusech podle příkladů 4-6 a 8 níže byl použit peptid označený Αβ1-42. Sekvence Αβ1-42 je následuj ící:

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His »· • · 9 · • 9 999

9999 9 9

9 9 ·· ····

Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (SEQ ID NO:6).

Peptid byl dříve popsán (47) a odpovídá vnitřnímu fragmentu amyloidového prekursorového proteinu o 42 aminokyselinách. Αβ1-42 byl získán od Elán Pharmaceuticals (South San Francisco, CA). Peptid byl solubilizován ve sterilní vodě a před použitím naředěn ve vhodných pufrech nebo buněčných kultivačních médiích.

Adj uvans

Všechny adjuvantní přípravky obsahující 529 byly získány od Corixa (Hamilton, MT). 529 SE byla připravena jako předem upravená emulze olej-ve-vodš na bázi skvalenu (0,8-2,5 % oleje), s koncentrací 529 v rozsahu 0-50 μg/ml. Fosforečnan hlinitý se připravil v laboratoři. Freundovo kompletní adjuvans (CFA) a nekompletní adjuvans (IFA) byly zakoupeny od Difco laboratories, Detroit, MI. Peptidy TISPIOMN(A) a Freundova adjuvans se emulsifikovaly v poměru 1:1 s použitím dvou spojených injekčních stříkaček. Rekombinantně exprimovaný myší IL-12 byl zakoupen od Genetics Institute (Cambridge, MA). Rekombinantní myší GMCSF byl zakoupen od Biosource International (Camarillo,

CA), jako lyofilizovaný prášek bez nosiče. Stimulon™ QS-21 byl získán od Antigenics lne. (Framingham, MA).

Imunizace

Myši byly imunizovány subkutánně v oblasti hýždě , přičemž celkový objem 0,2 ml byl rozdělen stejným dílem ke každé straně ocasu. Imunizace byly prováděny v různých časových intervalech, jak je uvedeno níže. Antigen a ·· 44 ·· 44 • 4 4.

• «444 • · 4 4 « • 4 4 4 ·· 44 • · · 4 • 4 4444 • · 4

4 cytokiny byly ředěny ve fosfátovém pufrovaném salinickém roztoku na vhodné koncentrace a upraveny s adjuvans méně než 16 hodin před imunizací za sterilních podmínek. Imunogenní kompozice byly promíseny jemným třepáním a skladovány při 4 °C. Přípravky se promísily bezprostředně před imunizací.

Analýza sér s použitím enzymové imunoanalýzy (ELISA)

Zvířatům se odebírala krev před první imunizací a v uvedených dobách. Analýza séra byla geometrickým průměrem titrů jednotlivých zvířat. Pro analýzu protilátek specifických proti HlV-peptidu a jejich distribuce v podtřídách byl peptid suspendován buďto v karbonátovém pufru (15mM Na2CC>3, 35mM NaHCC>3, pH 9,6), nebo v PBS, v koncentraci lgg/ml a vnesl se do 96-jamkových mikrotitračních ploten (Nunc) v objemu 100:1. Po inkubaci přes noc při 37 °C byly plotny promyty a blokovaly se (0,1% želatina/PBS) při teplotě místnosti po dobu 2-4 hodin. Po čtyřhodinové inkubaci se jamky promyly a přidala se vhodná ředění biotinylovaných antiizotypových/podtřídových protilátek pro inkubaci při 4 °C přes noc. Jamky se promyly a inkubovaly s křenovou peroxidázou konjugovanou se streptavidinem. Po inkubaci se jamky promyly a vyvíjely se s ABTS. Jamky byly odečítány při 405 nm. Titry byly standardizovány za použití kontrolního séra.

Shodný protokol byl použit pro analýzu specifických protilátek proti peptidu Αβ1-42 a jejich distribuce v podtřídách, s tou výjimkou, že bylo použito koncentrace 0,3 gg/ml na mikrotitrační plotnu.

*· ·«··

Buněčné přípravky

Pro proliferační testy a in vitro analýzu cytokinů byly buňky sleziny získány od myší v uvedených časech. Jednobuněčné suspenze byly připraveny od skupin 3-5 myší. Pro analýzu proliferace a cytokinů byly buňky suspendovány v 96-jamkových kultivačních plotnách s oblým dnem předem potažených přes noc HIV peptidovými antigeny, kontrolními proteiny nebo pouze RPMI-10. Buňky sleziny byl přidány v množství 5xl0⁵ buněk/jamku za použití kultivačního média obsahujícího 2x doplňky. Získaly se supernatanty buněčné kultury ze třech jamek pro analýzu cytokinů tři nebo šest dnů po iniciaci kultury. Ihned po odběru supernatantů byly kultury pulsně značeny ³H-thymidinem po dobu 18-24 hodin a odebrány pro kvantifikaci buněčné proliferace.

Příklad 2

Reciproční anti-TISPlOMN(A)(-Cys) IgG konečné titry a titry podle podtříd

Reciproční konečné IgG podtřídové titry byly měřeny ze souboru sér (n=5 Balb/c) pět týdnů po primární imunizaci a dva týdny po sekundární imunizaci. Myši byly imunizovány subkutánně v oblasti kořene ocasu 25 μς T1SP10MN(A)(-Cys) v celkovém objemu 0,2 ml, který byl stejným dílem rozdělen na dvě injekce ke každé straně ocasu, v týdnu 0 a týdnu 3. 529 SE byla naředěna za vzniku emulze obsahující 1,25 % skvalenového oleje a 25 μg 529 na dávku. SE je vehikulum typu emulze olej-ve-vodě obsahující skvalen, glycerol a emulsifikační činidlo. Rekombinantní myší IL-12 byl aplikován v dávce 40 ng/myš. Rekombinantní myší GM-CSF byl aplikován v dávce 25 μς/πψέ. Výsledky jsou uvedeny

4· >

• · · • 9 9 9

9 9999

9 9

9 *· 99

9 9

9 99 9 • · · • 9 9

99 *· ····

9 ·

9 9 • 9 9 v Tabulce 1 jako geometrický průměr titrů plus standardní odchylka pro každou skupinu.

Tabulka 1

Reciproční anti-TlSPUOMN(A) (-Cys)konečné IgG titry a titry podle podtříd

Konečné titry

Adjuvans	μ9 HIV peptidů	xg<3	IgGl	lgG2a
529 (25) SE (1,25% olej)	25	206,301 + /- 175,149	37,567 +/- 31,526	180,671 +/- 277,211
529 (25) SE (1,25% olej) + rIL-12 (.04)	25	460,516 +/- 690,712	74,269 + /- 169,868	222,446 +/- 400,716
529 (25) SE (1,25% olej) +	25	1,085,658 + /- 1,064,924	238,379 + /- 62,199	117,657 + /- 25,301

Příklad 3

CTL analýza u myší Balb/c.

Pro imunizaci myší se postupovalo podle protokolu uvedeného pro Příklad 2. Byla stanovena CTL aktivita buněk sleziny izolovaných z myší 14 dnů po sekundární imunizaci. 529 SE byla připravena jako 25 μg 529 SE obsahující 1,25 % oleje s nebo bez 10 μg GM-CSF nebo 40 ng IL-12 plus 25 μg T1SP10MN(A) )(-Cys).

Pro CTL analýzu byly buňky sleziny odebrány 14 dnů po sekundární imunizaci. V podstatě se postupovalo podle dříve popsaného protokolu (39). Stručně, buňky sleziny zbavené erytrocytů od tří myší na skupinu se smísily. Efektorové buňky sleziny (4xl0⁶/ml) se restimulovaly ve 24-jamkových kultivačních plotnách v objemu 1,5-2,0 ml po dobu sedmi dnů ·· ·· • 4 4 » · 444 • 4 4 1 • 444 4 ► 4 4 «

4« ,ΙΙΙΒ 10·· 4 • 4 4 • « 4 4 • «4444 • · ·

4 pomocí 1 μς/ml buďto „MN-10 peptidu, nebo měrového peptidu obsahujícího CTL epitop, nebo žádným HIV peptidem. Oba CTL epitopy byly omezeny na H-2D^d. Kultury byly doplněny 10 U/ml rekombinantního IL-12 (Biosource) po dobu posledních pěti dnů kultivace. Pro analýzu cytotoxické aktivity byly buňky P815 značeny Cr⁵¹ a pulsovány s 5 pg/ml peptidu (IIIB nebo MN-10) po dobu čtyř hodin, a přidaly se ke kultivovaným efektorovým buňkám sleziny. Když nebyl použit žádný HIV peptid, soubor cílových buněk nebyl pulsován. Použila se 3-násobná ředění poměrů efektorových a cílových buněk („E:T), v poměru od 30:1 do 1,1:1. Procento CTL aktivity se vypočetlo jako procento uvolňování chrómu za použití vzorce ((specifické uvolňování chrómu spontánní uvolňování chrómu) / (maximální uvolňování chrómu - spontánní uvolňování chrómu)) x 100. Uvolňování chrómu se hodnotilo po šestihodinové inkubaci. Průměrné spontánní uvolňování chrómu bylo vždy menší než 15 % maximálního uvolňování. Výsledky získané ze dne 28 jsou uvedeny v Tabulce 2.

Tabulka 2

Poměry efektořové/cílové buňky

529 6E+i	Peptid IL-12	MN-10 GM-CSF	Peptid	IIIB GM-CSF	Žádný peptid
*	IL-12	*	IL-12 GM-CSF
E:T% specifické uvolňováni	4-
30:1	31	53	71	8	11	19	4	8	8
10:1	19	41	70	S	8	21	2	5	9
3.3:1	5	11	35	2	1	S	-2	-2	-1
1.1:1	2	4	14	1	0	2	-3	-2	-3

* Žádné další adjuvans »· · ·· ΛΛ ··

·* ···· • · • · · · ·· ·«

Příklad 4

Reciproční konečné anti-Afil-42 titry celkem a podle podtříd

Outbrední myši Swiss-Webster byly rozděleny do skupin, každá po 10 myších. Každá skupina dostala 30 gg peptidu Αβ1-42, který odpovídá vnitřní oblasti APP dlouhé 42 aminokyselin. První skupina nedostala adjuvans; druhá skupina dostala 50 gg 529 SE obsahující 2,5 % oleje; třetí skupina dostala 50 gg 529 SE obsahující 2,5 % oleje plus 10 μς GM-CSF; čtvrtá skupina dostala 10 μg GM-CSF; pátá skupina dostala SE obsahující 1,25 % oleje; šestá skupina dostala SE obsahující 1,25 % oleje plus 10 μς GM-CSF; sedmá skupina dostala 50 μg QS-21. Myši byly imunizovány subkutánně v oblasti hýždě celkovým objemem 0,2 ml, který byl rovnoměrně rozdělen na každou ze dvou stran kořene ocasu. Imunizace byly provedeny v týdnu 0 a týdnu 3.

Myším byla odebírána krev ve dnech 0, 20, 35 a 70. Analyzované sérum bylo od jednotlivých myší. Reciproční konečné titry IgG proti peptidu Αβ1-42 ve třídě celkem a v podtřídách byly měřeny z individuálních sér (n=10 SwissWebster) v týdnu 5 a týdnu 10. Konečné výsledky IgG jsou uvedeny v Tabulce 3 (týden 5) a Tabulce 4 (týden 10). Výsledky pro podtřídu IgGl jsou uvedeny v Tabulce 5 (týden 5; skupiny, které obdržely QS-21 nebo žádné adjuvans nebyly měřeny ) a v Tabulce 6 (týden 10). Výsledky pro podtřídu IgG2a jsou uvedeny v Tabulce 7 (týden 5; skupiny, které obdržely QS-21 nebo žádné adjuvans nebyly měřeny) a v Tabulce 8 (týden 10).

• · * · · • ····

Tabulka 3

Konečné titry anti-A/Jl-42 IgG - týden 5

Adjuvans	Geometrický průměr	Standardní odchylka
Žádné	12,976	+/- 14,386
529 SE (50>	16,204	+ /- 225,221
529 SE (50) + GM- 608,474	+/- 623,575
CSF (10)
GM-CSF (10)	214,497	+/- 609,067
SE (1%)	33,342	+/- 15,493
SE (1¾) + GM-CSF	453,367	+/- 162,750
(10)
QS-21 (50)	4,076	+/- 9,036
Konečné	Tabulka 4 titry anti-A/Jl-42 IgG	- týden 10
Adjuvans	Geometrický průměr	Standardní odchylka
Žádné	21,426	+ /- 24,955
529 SE (50)	86,847	+/- 187,792
529 SE (50) + GM	943,075	+/- 989,177
CSF (10)
GM-CSF (10)	1,049,414	+/- 390,525
SE (1¾)	255,631	+/- 114,025
SE (1¾) + GM-CSF	1,005,899	+/- 407,108
(10)
QS-21 (50)	47,222	+/- 159,775

• · · • ···· ·· ·· • · · * · · · · • · · · « • · · · ·· ··

Tabulka 5

Konečné titry anti-A/Jl-42 IgGl - týden 5

Adjuvans Geometrický průměr Standardní odchylka

529 SE (50)	461	+/- 627
529 SE (50) + GM-	1,936	+/- 12,680
CSF (10)
GM-CSF (10)	8,654	+/- 10,100
SE (1¾)	4,515	+/- 6,273
SE (1%) + GM-CSF	24,422	+/- 19,764

(10)

Tabulka 6

Konečné titry anti-A/Jl-42 IgGl - týden 10 .Adjuvans Geometrický průměr Standardní odchylka

(Žádné	2,086	+/- 2,448
529 SE (50)	969	+/- 521
529 SE (50) + GM-	2,076	+/- 4,901
CSF (10)
GM-CSF (10)	8,483	+/- 10,998
SE (1%)	3,623	+/- 3,456
SE (1¾) + GM-CSF	12,472	+/- 11,502
(10)
QS-21 (50)	988	+/- 895

895 • ·

Příklad 5

Reciproční konečné anti-Api-42 titry celkem a podle podtříd s proměnlivým množstvím GM-CSF

Outbrední myši Swiss-Webster byly rozděleny do skupin, každá po 10 myších. Každá skupina dostala 30 pg peptidu Αβ1-42 v týdnu 0 a 3. První skupina dostala 25 pg 529 SE plus 10 pg GM-CSF; druhá skupina dostala 25 pg 529 SE plus 1 pg GM-CSF; třetí skupina dostala 25 pg 529 SE plus 0,1 pg GM-CSF; čtvrtá skupina dostala 25 pg 529 SE plus 10 pg GMCSF v primární dávce, kterou následovalo podání pouze 529 SE ve druhé dávce; pátá skupina dostala 25 pg QS-21; šestá skupina dostala 25 pg QS-21 plus 10 pg GM-CSF. Myši byly imunizovány subkutánně v oblasti hýždě celkovým objemem 0,2 ml, který byl rovnoměrně rozdělen na každou ze dvou stran kořene ocasu.

Myším byla odebírána krev ve dnech 0, 21 a 42. Reciproční konečné titry IgG proti Αβ1-42 peptidu ve třídě celkem a v podtřídách byly měřeny z individuálních sér (n=10 Swiss-Webster) v týdnu 6. Konečné výsledky IgG jsou uvedeny v Tabulce 10. Výsledky pro podtřídu IgGl jsou uvedeny v Tabulce 10. Výsledky pro podtřídu IgG2a jsou uvedeny v Tabulce 11.

• · •···· « ,

Tabulka 7

Konečné titry anti-Aftl-42 IgG2a - týden 5

Adjuvans

Geometrický průměr Standardní odchylka

529 SE (50)	2,224	+/-	10,099
529 SE (50) + GM-	94,764	+/-	849,173
CSF (10)
GM-CSF (10)	25,554	+ /-	13,191
SE (1¾)	1,484	+ /-	2,271
SE (1¾) + GM-CSF	8,405	+ /-	31,303

(10)

Tabulka 8

Konečné titry anti-A/ll-42 ZgG2a - týden 10

Adjuvans	Geometrický průměr	Standardní odchylka
Žádné	5, 910	+/- 39,626
529 SE (50)	5,944	+/- 9,100
529 SE (50) 4 GM-	47,694	+/- 88,053
CSF (10)
GM-CSF (10)	64,910	+/- 54,824
SE (1¾)	2,350	+/- 2,326
SE (1%) + GM-CSF	7,421	+/- 31,153
(10)
QS-21 (50)	3,544	+/- 26,332

Tabulka 9

Konečné titry anti-A ^1-42 IgG - týden 6 Adjuvans Geometrický průměr Standardní odchylka

529	SE (25) + GM-	353,660	+ /-	148,940
CSF	(10)
529	SE (25) +	GM-	150,935	+/-	218,332
CSF	(1)
529	SE (25) t	GM-	86,145	+/-	91,724
CSF	(0-1)
529	SE (25)*		25,365	+/-	54,083
QS-21 (25)		1,866	+/-	18,430
QS-21 (25) +		48,970	+/-	116,106

GM-CSF (10) * První dávka 529 SE (25) + GM-CSF (10); druhá dávka 529 SE (25)samotný

Tabulka 10

Konečné titry anti-A 1-42 IgGl - týden 6

Adjuvans	Geometrický průměr	Standardní odchylk.
529 SE (25) -« GM-	10,867	+/- 18,333
CSF (10)
529 SE (25) + GM-	24,909	+/- 18,625
CSF (1)
529 SE (25) + GM-	6,608	+/- 17,736
CSF (0.1)
529 SE (25)*	4,511	+/- 8,154
QS-21 (25)	581	+/- 126
QS-21 (25) +	7,618	+/- 29,145

GM-CSF (10) * První dávka 529 SE (25) + GM-CSF (10); druhá dávka 529 SE (25) s amos t at ně ·· ·

Tabulka 11

Konečné titry anti-A^l-42 IgG2a - týden 6

Adjuvans	Geometrický průměr	Standardní odchylka
529 SE (25) + GM-	243,758	+/- 354,383
CSF (10)
529 SE (25) + GM-	116,222	+/- 143,140
CSF (1)
529 SE (25) + GM-	98,018	+/- 391,797
CSF (0,1)
529 SE (25)*	16,018	+/- 165,298
QS-21 (25)	neprov áděno	+ / - neprováděno
QS-21 (25) +	30,133	+ /- 134,774
GM-CSF (10)
* První dávka 529 SE	(25) + GM-CSF (10);	druhá dávka 529 SE (25)

samotný

Příklad 6

Reciproční konečné anti-Apl-42 titry celkem a podle podtříd s proměnlivým množstvím GM-CSF

Outbrední myši Swiss-Webster byly rozděleny do skupin, každá po 10 myších. Každá skupina byla imunizována v týdnu 0 a týdnu 3 pomocí 30 gg peptidu Αβ1-42 v každém z uvedených časů. V týdnu imunizace 0 první skupina dostala 50 μς 529 SE; druhá skupina dostala 50 gg 529 SE plus 10 gg GM-CSF; třetí skupina dostala 50 gg 529 SE plus 5 gg GMCSF; čtvrtá skupina dostala 50 gg 529 SE plus 2 μg GM-CSF; pátá skupina dostala 50 gg 529 SE plus 0,5 gg GM-CSF; šestá skupina dostala 1% SE. V týdnu imunizace 3 prvních pět skupin dostalo stejné dávky jako při imunizaci v týdnu 0, s tou výjimkou, že množství 529 SE bylo sníženo z 50 na 25 μς. Množství SE, které dostala šestá skupina, bylo zvýšeno z 1% v týdnu imunizace 0 na 1,2 % v týdnu imunizace 3. Myši byly imunizovány subkutánnš v oblasti hýždě celkovým objemem 0,2 ml, který byl rovnoměrně rozdělen na každou ze dvou stran kořene ocasu.

Myším byla odebírána krev ve dnech 2, 20 a 35. Reciproční konečné titry IgG proti peptidu Αβ1-42 ve třídě celkem a v podtřídách byly měřeny z individuálních sér (n=10) v týdnu 5. Výsledky podtřídy IgGl jsou uvedeny v Tabulce 13. Výsledky podtřídy IgG2a jsou uvedeny v Tabulce 14.

·· ··

Tabulka 12

Konečné titry anti-Aftl-42 IgG - týden 5

Adjuvans Geometrický průměr Standardní odchylka

529 SE	(50)	6,119	+ /-	3,103
529 SE	(50) + GM-	52,312	+ /-	78,421
CSF (10)
529 SE	(50) + GM-	16,392	+ /-	17,706
CSF (5)
529 SE	(50) + GH-	321,524	+/-	224,875
CSF (2)
529 SE	(50) + GH-	36,934	+/-	29,449
CSF (0,	5)
SE (1¾)		7,784	+/-	9,041

Tabulka 13

Konečné titry anti-A P,l-42 IgGl - týden 5

Adjuvans Geometrický průměr Standardní odchylka

529	SE	(50)	499	+ /-	676
529	SE	(50) + GM-	1,424	+/-	2,468
CSF	(10)
529	SE	(50) + GM-	3,407	+/-	5,653
CSF	(5)
529	SE	(50) + GM-	18,328	+/-	8,067
CSF	(2)
529	SE	(50) + GM-	3,526	+/-	17,606
CSF	(0,	5)
SE	(1¾)		2,556	+/-	5,615

• 9

Tabulka 14

Konečné titry anti-A/Jl-42 IgG2a - týden 5

Adjuvans Geometrický průměr Standardní odchylka

529	SE (50)			1,366	+/- 5,173
529	SE (50)		GM-	46,519	+/- 148,981
CSF	(10)
529	SE (50)	+	GM-	11,659	+/- 23,132
CSF	(5)
529	SE (50)	+	GM-	124,615	+/- 167,340
CSF	(2)
529	SE (50)	+	GM-	26,190	+/- 40,254
CSF	(0,5)
SE	(1¾)			694	+/- 1,325

Přiklad 7

Imunizace makaka rhesus peptidem Th-CTL a C4-V3

Následující pokus byl navržen pro přímé srovnání řady kombinace peptid a adjuvans v prostředku u druhu primátů (opice makak rhesus) tak, aby byly identifikovány účinné peptid/adjuvantní kombinace k nahrazení lidských klinických zkoušek. Konkrétně, adjuvantní prostředek 529 SE s lidským GM-CSF byl hodnocen ve srovnání s nekompletním Freundovým adjuvans (IFA) v kombinaci s (1) SIV env-odvozený Tpomocný/SIV gag CTL peptidovým konjugátem (STl-pllC), který má následující sekvenci:

Arg	Gin	Ile	Ile	Asn	Thr	Trp	His	Lys Val	Gly
Lys	Asn	Val	Tyr	Leu	Glu	Gly	Cys	Thr Pro	Tyr
Asp	Ile	Asn	Gin	Met	Leu	(SEQ	ID	NO:3);

·· ·· nebo (2) HIV-1 odvozený C4-V3 peptidovým konjugátem (C4V3₈9.6p) , který má následující sekvenci:

Lys	Gin	Ile	Ile	Asn	Met	Trp	Gin	Glu	Val	Gly
Lys	Ala	Met	Tyr	Ala	Thr	Arg	Pro	Asn	Asn	Asn
Thr	Arg	Glu	Arg	Leu	Ser	Ile	Gly	Pro	Gly	Arg
Ala	Phe	Tyr	Ala	Arg	Arg	(SEQ	' ID	NO:	4) .

Projekt studie

Pro studii bylo použito celkem 8 zvířat, 4 Mamu-A*01+ a 4 Mamu-A*01~, jak jsou popsány v Tabulce 15

Tabulka 15

529 SE & GM-CSF vs. IFA

Skupina # Zvířata Zvíře Imunogenní Adjuvans kompozice

1	2	Mamu-A01+	95X009 93X021	STl-pllC	TFA
2	2	Mtomu-AOl*	9SN002 98N008	STÍ-pllC	529	SE/GM-CSF
3	2	Mamu-AOl-	98N007 93N013	C4_V3gj,5p	IFA
4	2	Mamu-A01-	95X011 96X004	C4“V3 93.53	529	SE/GM-CSF

Skupina zvířat 1 dostala 0,5 ml Th-CTL peptidu STlpllC (1,0 mg/ml) v emulzi voda-v-oleji s 0,5 ml IFA v celkovém objemu 1,0 ml. Skupina zvířat 2 dostala 0,5 ml STl-pllC (1,0 mg/ml) kombinovaného s 250 pg lidského GMCSF, 50 μg 529 SE s konečnou koncentrací oleje 1 % v celkovém objemu 1,0 ml. Skupina zvířat 3 dostala 0,5 ml ·· ·· ♦ · · · • ·»·· · · • · ·

peptidu C4-V3₈9.6p (2,0 mg/ml) v emulzi voda-v-oleji s 0,5 ml IFA v konečném objemu 1,0 ml. Konečně skupina zvířat 4 dostala 0,5 ml peptidu C4-V3s9.6p (2,0 mg/ml kombinovaného s 250 pg lidského GM-CSF, 50 pg 529 SE s konečnou koncentrací oleje 1 % v celkovém objemu 1,0 ml.

Všechna zvířata byla imunizována intramuskulární injekcí podle plánu v týdnech 0, 4 a 8. Vzorky periferní krve byly odebrány bezprostředně před a 1 nebo 2 týdny po každé imunizaci pro monitorování CTL indukce pomocí tetramerního barvení, pllC (Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin Met; SEQ ID NO:3, aminokyseliny 19-27) - specifické ELISPOT odpovědi a objemu CTL odpovědí kultury (bulk culture CTL responses) (Skupiny 1 a 2), stejně jako protilátkových odpovědí specifických pro peptid.

Bezpečnost a přijatelnost

STl-pllC + IFA:

Prostředek obsahující STl-pllC + IFA, který byl podán skupině zvířat 1 třikrát intramuskulární injekcí do jednoho místa, byl spojen se signifikantní reaktivitou v místě injekce. U jednoho ze zvířat (93x021) se vyvinul v místě injekce absces o velikosti 1,5 cm dva týdny po druhé imunizaci. U dalšího zvířete (95y009) se také vyvinul absces o velikosti 2,0 cm v místě injekce dva týdny po třetí imunizaci, který se otevřel a vyžadoval obvázání.

STl-pllC + 529 SE/GM-CSF:

Prostředek obsahující STl-pllC + 529 SE/GM-CSF, který byl podán skupině zvířat 2 třikrát intramuskulární injekcí do jednoho místa, byl spojen s nepatrnými nežádoucími účinky. Obě zvířata ze skupiny 2 zvracela krátce po třetí *φ · ♦ · · • · · · • ·φφφφ • φ φ ·· φ imunizaci v týdnu 8. Žádné další nežádoucí účinky nebyly pozorovány.

φφ ·· ; · ♦ • φ Φ ·· ΦΦ

C4-V3₈9.₆p + IFA:

Prostředek obsahující C4-V3₈9.6p + IFA, který byl podán skupině zvířat 3 třikrát intramuskulární injekcí do jednoho místa, byl spojen se signifikantní reaktivitou v místě injekce. U jednoho ze zvířat (98n013) se vyvinul v místě vpichu injekce absces o velikosti 1,0 cm jeden týden po druhé imunizaci. U dalšího zvířete (98n007) se také vyvinul absces o velikosti 1,5 cm v místě injekce jeden týden po druhé imunizaci. Abscesy zvířat vyžadovaly odsávání a obvazování následně čtyři týdny.

C4-V3₈₉.6p + 529 SE/GM-CSF:

Prostředek obsahující C4-V3₈g.6P + 529 SE/GM-CSF, který byl podán skupině zvířat 4 třikrát intramuskulární injekcí do jednoho místa, byl spojen s jedním nepatrným nežádoucím účinkem. Jedno ze zvířat ze skupiny 4 (95x011) zvracelo krátce po třetí imunizaci v týdnu 8. Žádné další nežádoucí účinky nebyly zaznamenány.

U všech zvířat ze skupiny 1 a 3, ve kterých zvířata dostala IFA jako adjuvans, byly pozorovány signifikantní reaktivity v místě injekce. Tyto výsledky naznačují, že IFA v množství 0,5 ml je špatně tolerováno, když je podáno intramuskulární injekcí do jednoho místa vpichu. Rovněž stojí za povšimnutí, že 3 ze 4 zvířat, která dostala 529 SE/GM-CSF jako adjuvans, v týdnu 8 zvracela krátce po imunizaci. Přestože je známé, že použité anestetikum (ketamin) je spojeno se zvracením, žádné další případy zvracejících zvířat nebyly v průběhu studie zaznamenány.

V současností neexistuje dostatečný důkaz pro to, aby ♦· 44 • ♦ >444 • · 4 • · 4 • 4 44 • · • 4 • · · • · 4

4 zvracení zvířat bylo připisováno k jakýmkoliv nežádoucím účinkům spojeným s 529 SE/GM-CSF.

Výsledky: Indukce buněčných imunitních reakcí (Skupiny 1 a

Barvení pllC-tetramerem v čerstvé krvi

Před imunizaci a jeden a dva týdny po imunizaci byla čerstvě odebraná krev ze všech Mamu-A*01 pozitivních zvířat (Skupiny 1 a 2) vyšetřena na přítomnost pllC-specifických CD3+CD8+ T lymfocytů pomocí tetramerního barvení rozpustné MHC třídy I. Jak je ukázáno v Tabulce 16, pouze jedno zvíře (93x021), které dostalo peptid STl-pllC v kombinaci s IFA, vykazovalo důkaz o imunizací indukované buněčné imunitní odpovědi v nestimulované periferní krvi.

♦ · ·· ··♦»

Tabulka 16

Procento barvení pllC-tetramerem a pllC-specifických ELISPOT reakcí v čerstvě izolované periferní krvi

Zvíře/ (skupina)	Prostředek	Týden 0 P r e imuni z ac e	Týden 5 1 týden po 2.imunizaci	Týden 6 2 týdny po 2.imunizaci
Čerstvá krev Tetiamec. barveni8	ELISPOT * SPC6 Per 10 buněk	Čerstvá krev Tetraoner. barvení	ELISPOT # SFC Per 106 buněk	Čerstvá krev Tetraoner. barvení	ELISPOT tt SFC Per 106 buněk
95x009(1)	ETl-pllC + IFA	0,02	0,0	0,00	0,0	0,00	3,8
93x021(1)	STÍ-pllC + IFA	0,02	Elď’	0,lS	55,3	0,12	21,9
9Bn002(2)	STÍ-plic + 529SE/ GM-CSF	0,00	0,5	0,05	0,0	0,01	5,3
9BnOOB(2)	STÍ-plic ť 529SE/ OM-csr	0,05	0,0	0,04	15,0	0,01	9,4
		Týden 8	Týden 9		Týden 10
		4 týdny po 2. imunizaci	1 týden po 3. imunizaci		2 týdny po 3. imunizaci
Zvíře	Prostředek	Čerstvá krev ELISPOT	Čerstvá krev	ELISPOT	Čerstvá krev	ELISPOT

95x009(1)	STl-pllC 0,00 4- IFA	Hd	0,01	2,5	0,02 1,9
93x021(1)	STl-pllC 0,02 + IFA	NÚ	0,14	Hd	0,02 Nd
98«002{2)	STl-pllC 0,06 + S298E/ OH-CSF	Nd	0,00	Hd	0,00 3,8
9&n0Q0(2)	STl-pllC 0,02 4- 529SE/ CM-CSF	Křd	0,02	Hd	0,00 0,0
a Uvedeno jako procento CD3+CD8+ lymfocytů pllC-tetramerem; HB - neprováděno b HB = žádné údaje (v této a následujících	v čerstvé krvi, tabulkách).	které	se pozitivně barví

PllC-specifické ELISPOT odpovědi:

Pro další vyhodnocení indukce buněčných imunitních reakcí ve skupinách zvířat 1 a 2, byly čerstvě izolované ** · * » · ♦ • · ·· ♦ « · · • · ♦ lymfocyty periferní krve vyšetřeny na přítomnost pllCspecifických CD3⁺CD8⁺ T lymfocytů pomocí analýzy.ELISPOT. Jak je ukázáno v Tabulce 16, pouze zvíře 93x021, které vykazovalo detekovatelné hladiny pllC-specifických CD8⁺ lymfocytů v tetramerové analýze čerstvé krve, mělo pllCspecifické CD8⁺ T lymfocyty detekovatelné ELISPOT analýzou. V každém případě pozitivní reakce v pllC-tetramerové analýze bylo potvrzena pozitivní pllC-specifickou reakcí ELISPOT.

P-ll-C-speclfické buněčné imunitní reakce po stimulaci peptidem plic in vitro

Za účelem zvýšení počtu pllC-specifických buněk před analýzou, byly čerstvě izolované lymfocyty periferní krve stimulovány in vitro peptidem plic a rhIL-2. Po 14 dnech, byly výsledné efektorové buňky vyšetřeny na vázání pllCtetrameru, stejně jako na funkční pllC-specifickou lytickou aktivitu stanovenou ve standardním CTL testu uvolňování chrómu. Výsledky pllC-tetramerové analýzy a zkoušky funkční CTL jsou uvedeny v Tabulce 17. Zvíře 93x021, které trvale vykazovalo pllC-specifickou imunitní reakci v čerstvě izolovaných lymfocytech, vykazovalo velmi vysokou úroveň tetramerového vázání a funkční CTL aktivity jeden týden po druhé imunizaci. Toto indikuje indukci velmi silné pllCspecif ické buněčné imunitní odpovědi. V porovnání s výsledky pozorovanými u čerstvě izolovaných lymfocytů jedno zvíře ze skupiny 2 (98n008, STl-pllC + 529 SE/GM-CSF) začalo vykazovat důkazy o pllC-specifických buněčných imunitních reakcích dva týdny po druhé imunizaci. Nicméně, pllC-specifická imunitní reakce pozorovaná ve skupině 2 byla signifikantně nižšího stupně, než reakce pozorovaná u odpovídajících zvířat ze skupiny 1.

«* ♦ * * 4

A ♦ · · ·>· * ·· ·· ·· «

Tabulka 17

Procento barvení pllC-tetramerem a funkčních plic-specifických CTL reakcí po stimulaci pllC peptidem in vitro

Týden 0 Preimunizace

Týden 5 1 týden po 2. imunizaci

Týden 6 2 týdny po 2. imunizaci

Zvíře/ Skupina	Prostředek	Tetramer. CTL barvení* 20:1 E:/*	Teramer. barvení	CTL 20:1 E:T	Tetramer. barvení	CTL 20:1 E:T
95x009(1)	STÍ-p110 + IP*	0,03	0,6	0,23	Hd	0,27	0,0
93x021(1)	STÍ-plic « IPX	0,03	0,0	34,31	66,3	15,15	4,69
901X002(2)	STl-pllC + 529&E/ GH-CSP	0,21	0,0	Hd	tu	0,73	tu
98n008(2)	STÍ-plic * 5295E/ GH-CSP	0,16	0,0	nd	Hd	0,04	Hd
		Týden 8 4 týdny po 2.imunizaci	Týden 9 1 týden po 3. imunizaci	Týden 10 2 týdny po 3. imunizaci
Zvíře/ Skupina	Prostředek	Tetramer, barvení	CTL 20:1 E:T	Tetramer. CTL barvení 20:1 E:T	Tetramer. barvení	CTL 20:1 E:T
95x009(1)	βτι-piic + IFA	Hd	Md	0,76	3,0	0,72	0,0
93x021(1)	STÍ—plic * IFA	Nd	ud	4,90	7,3	Hd	Hd
9&n002{2)	BTi-piie -¼ 529SE/ GM-CSF	Nd	Hd	0,07		0,39	0,0
9821003(3)	STl-pllC + S23EE/	Kd	Kd	2,24	11,4	5,00	0,0

GW-CSF a Uvedeno jako procento CD3+CD8+ kultivovaných buněk, které se pozitivně barví pllC-tetramerem b Uvedeno jako procento pllC-specifické lyže (minus pozadí) při poměru efektor/cíl (E:T) 20:1

Intracelulární analýza cytokinů:

Pro další charakteristiku funkčních a fenotypových vlastností imunogenem indukovaných lymfocytů specifických ·· • · • · · •···· · • 9 .··.·· : : • »· ·· ·« pro peptid pllC peptidů byla monitorována intracelulární exprese cytokinů typu Thl, t.j. cytokinů INFy, TNFa, IL-2, a cytokinů IL-4 jako cytokinů typu Th2. Intracelulární exprese cytokinů byla monitorována u lymfocytů z periferní krve po počáteční in vitro stimulaci v přítomnosti 10 μΜ peptidů pllC a rhIL-2. Kultury byly pak udržovány po dobu 14 dnů se 40 U/ml IL-2. Po dvou týdnech byly kultivované buňky stimulovány buďto se samotným médiem, nebo s 10 μΜ peptidů pllC + protilátkou proti lidskému CD28 (anti-human CD28) a protilátkou proti lidskému CD49d (anti-human CD49d) po jednu hodinu. Po jedné hodině byly buňky ošetřeny Bredelfinem A po dobu dalších pět hodin tak, aby bylo umožněno intracelulárním cytokinům koncentrovat se v endoplazmatickém retikulu. Intracelulární exprese cytokinů byla pak kvantifikována průtokovou cytometrií (Tabulky 18 a 19).

Jak je uvedeno v Tabulce 18, dva týdny po stimulaci peptidem pllC in vitro vykazovaly CD3⁺ lymfocyty periferní krve zvířete 93x021 ze skupiny 1 (STl-pllC + IFA) nízkou úroveň exprese cytokinů typu Thl, s méně než 1,5 % všech buněk aktivně vylučujících INF-γ, TNFa nebo IL-2. Přibližně 8 % ze všech CD3⁺ lymfocytů po stimulaci peptidem pllC in vitro aktivně vylučovalo cytokin typu Th2 cytokin IL-4, přičemž bylo zjištěno, že buňky vylučující IL-4 byly omezeny na podtřídu lymfocytů CD3⁺CD4⁺. Po krátké opakované expozici vůči peptidů pllC, pllC-tetramer⁺ a podtřídy lymfocytů CD3⁺CD8⁺ aktivně vylučovaly cytokiny typu Thl, t.j. INF-γ a TNFa, ale nemohly být indukovány k sekreci signifikantně zvýšených hladin IL-2. Po opakované expozici vůči peptidů pllC nebyla sekrece cytokinů typu Th2 cytokinů IL-4 ovlivněna.

• · • · • · · · • · · · · • ····· · · • · · ·

Tabulka 18

Intracelulární analýza cytokinů, skupina 1, zvíře 93x021 dva týdny po druhé imunizaci

Poďtřida

lymfocytů	Media	IMF-γ plic	s.i.	Media	TfcTFct pllC	S.I.
DP11C-
tetramar*	977	27,512	28.3	90	20,342	226.0
^ulk CD3*	7,628	65,567	8.6	12,256	51,361	4.2
bCT>3‘CP4*	2,488	5,545	2,2	6,252	2,827	0.4
bCD3+CD8*	5,273	60,573	11.5	6,865	48,439	7.1

	Media	11,-2 pllC	S.I.	Media	IL-4 plic	S.I.
P11C-
tetramer*	751	2,004	2.7	Nd	Nd	Nd
^Bulk £B3*	2,879	6,463	2.2	78,069	90,563	1.2
bCD3*CD4*	1,377	1,683	1.2	71,275	81,437	1.1
bCD3*CP8*	1,502	4,783	3.2	6,794	9,126	1.3

» · ·· ·· • · · · · ··· · · · · · ······· · · «

Tabulka 19

Intracelulární analýza cytokinů, skupina 2 zvíře 98n008, jeden týden po třetí imunizací

Podtřida lymfocytů ItJF-y TNFa

	Media	pllC	”5.1.	Madla	pllC	S.I.
bPllC-
tetramar*	54.5	560	1.0	748	454	0.0
^Bulk CD3*	6 , 829	10,489	1,5	3,402	13,443	4.0
bCD3+CD4*	3,310	3,789	1.1	1,428	2,567	1.8
bCD3*CD8*	3,189	6,825	2.1	2,587	11,324	4.4

	Media	IL-2 pllC	S.I.	Media	11,-4 pllC	S.I.
bPllC-
tetramer*	77	456	5.9	ad	ad	ad
^Bulk C»3*	385	2,868	7.4	219,789	202,122	0.9
bCD3*CD4*	1,379	1,751	1.3	170,804	158,175	0.9
bCD3*CD8*	35 ·	2,095	58.2	49,053	44,083	0.9

^a S . I. , stimulační index ^fa uvedeno jako počet odečtených buněk barvících se pozitivně pro indikovaný c cytokin per 10 CD3+ buněk, minus barveni pozadí (izotypova kontrola)

Jak je uvedeno v Tabulce 19 dva týdny po stimulaci peptidem pllC in vitro vykazovaly CD3⁺ lymfocyty periferní krve zvířete 98n008 ze skupiny 2 nízkou úroveň exprese cytokinů typu Thl s méně než 1 % všech buněk aktivně vylučujících INF-γ, TNFa nebo IL-2. Je zajímavé, že přibližně 20 % všech CD3⁺ lymfocytů aktivně vylučovalo cytokin typu Th2 cytokin IL-4, t.j. bylo dosaženo zvýšení počtu buněk produkujících IL-4 2,5x ve srovnání se skupinou zvířat 1. Jako v případě skupiny zvířat 1, bylo zjištěno, že IL-4 vylučující buňky byly omezeny na podtřídu lymfocytů CD3⁺CD4⁺. Po krátké opakované expozici vůči peptidu pllC, pllC-tetramer⁺ a podtřídy lymfocytů CD3⁺CD8⁺ ze skupiny zvířat 2 mohly být stimulovány k sekreci TNFa, nikoliv však INF-γ. Na rozdíl od skupiny zvířat 1 bylo po peptidové opakované expozici prokázáno signifikantní zvýšení exprese • · ··· · · · ·· · • · · · · · ··· · · · • · ···· · · · · · · · · · • · · ···· · · · · •· · ·· ·· ·· · ·

IL-2 buňkami CD3⁺CD8 ⁺ . Tak jako v případě zvířat skupiny 1 byla sekrece cytokinu typu Th2 cytokinu IL-4 po opakované expozici vůči peptidu pllC nezměněna.

Výsledky: Humorální imunitní odpovědi indukované imunogenem (Skupiny 1 a 2).

K vyhodnocení indukce humorálních protilátkových odpovědí specifických pro antigen byly měřeny ELISA titry protilátek anti-STl-pllC v séru skupiny zvířat 1 a 2 bezprostředně před imunizací a 1 a 2 týdny po druhé a třetí imunizaci. Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 20.

• · • ·· · «· 4 • · · · • · · · · • · · · · · · 4

Tabulka 20

ELISA konečné titry v séru makaků rhesus imunizovaných STl-pllC (skupiny 1 a 2)

Zvíře Skupina Přípravek Týden STl-pllC titr protilátek^a

95x009

STl-pllC + ISA

12,800

12,800

5,800

12,800

93x021

STl-pllC + IFA

51,200

102,400

51,200

51,200

98x002

STl-pllC t 529SE/GM-CSF 5 € 9 <50 <50

1,600 <50

98n008 a Konečné nejvyššího > 3,0.

STl-pllC + 529SR/GM-CSP 5

9 10 protilátkové vazebné titry byly stanoveny jako reciproční z ředěni plazmy, poskytujícího OD hodnoty pokus/kontrola (E/C)

200

200

12,800

6,400

Humorální imunitní odpovědi indukované imunogenem (Skupiny a 4)

K vyhodnocení indukce humorálních protilátkových odpovědí specifických pro antigenu a adjuvans byly měřeny ELISA titry protilátek anti-C4-V3s9.6P a anti-GM-CSF v plazmě skupiny zvířat 3 a 4 bezprostředně před imunizací a jeden a dva týdny po druhé a třetí imunizaci. Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 21. Výsledky naznačují, že pík titrů plazmatických C4-V3s9.6p protilátek byl vytvářen jeden týden po druhé imunizaci u všech testovaných zvířat. Pík titrů plazmatických protilátek ve skupině zvířat 3 (C4-V3₈9.sp + IFA) byl několikařádově vyšší než pík titrů plazmatických • · · · • ······· ·· ··· · ·· · ···· · ♦ · • · · ·· ·· ·· ·· protilátek zjištěný u skupiny 4 (C4-V3₈₉.₆p + 529 SE/GMCSF). Skupina zvířat 4 vykazovala nízké ale detekovatelné hladiny titru protilátek anti-GM-CSF, které dosahovaly vrcholu jeden týden po třetí imnunizaci.

Tabulka 21

ELISA konečné titry v plasmě makaků rhesus imunizovaných C4-V3_{83 ev} (skupiny 3 a 4)

Zvíře/ Skupina	Prostředek	Týden	Titr C4-V3 protilátek	Titr protilátek proti lidskému GM-CSF
98n0D7(3>	C4-V3„.w + IFA	5	102,400	<10
		6	25/600	<10
		9	25,600	<10
		10	25,600	<10
98n013(3)	C4-V3es.«» + IFA	5	12,800	<10
		6	6,400	<10
		9 ‘	12,B00	10
		10	12,800	<10
96x004(4}	C4-V3ís.6j *	5	6,400	320
	529SE/GM-CSF	6	1,600	160
		9	3,200	2,560
		10	1,600	1,280
95x011(4}	C4_V3feí.Ép +	5	1,600	160
	529SE/GM-CSF	6	800	80
		9	1,600	1,280
		10	1,600	1,280

a Konečné protilátkové vazebné titry byly stanoveny jako reciproční z nejvyššího ředění plazmy poskytujícího OD hodnoty pokus/kontrola (E/C)

Také byla monitorována indukce neutralizačních protilátek u skupiny zvířat 3 a 4; výsledky jsou shrnuty v Tabulce 22. Výsledky naznačují, že jak skupina zvířat 3 ·· · • ·· · tak skupina zvířat 4 produkovala neutralizační protilátky, které byly schopné in vitro neutralizovat virus SHIV₈₉.6· Titry neutralizačních SHIV₈₉.₆ protilátek pozorované u skupiny zvířat 3 byly celkově vyšší než tyto pozorované u skupiny zvířat 4. Mimo to sérum ze skupiny tří zvířat vykazovalo po konečné, imunizaci nízkou úroveň neutralizační aktivity proti kmenu viru SHIV₈₉._6p, který je obtížné neutralizovat.

•4 4 44 ·· ·· • 44 444 · ·

4 4 4 4 4 4·· 4 4 4 4 4444 44 44 444 4 44 4 4444 44

4 44 44 44

Tabulka 22

Konečné sérové titry neutralizačních protilátek z makaků rhesus imunizovaných C4-V3_{#J w} (skupiny 3 a 4) a

Zvíře/ Prostředek Týden Neutralizační protilátka k

Skupina ^SHIV89 ,_e ^SHIV8S.6P

98n007{3)	C4-V3»,» + 3FA	0	<10	<10
		5	22	<10
		6	46	<10
		9	113	46
		10	74	71
98x013(3)	C4-V3e>.ťř + IFA	0	<10	<10
		5	12	<10
		6	19	<10
		9	36	16
		io	22	<10
96x004(4)	C4-V3,s.6í +	0	<10	<10
	529SE/GM-CSF	5	<10	<10
		6	<10	<10
		9	26	<10
		10	<10	<10
95x0X1(4)	C4-V3b9.íp +	0	<10	<10
	529SK/GM-CSF	5	11	<10
		6	<10	<10
		9	19	<10
		10	<10	<10

a Titry neutralizační protilátky odpovídají recipročnímu ředění séra, při kterém 50 % buněk bylo chráněno před virem indukovaným zabitím, jak bylo měřeno příjmem neutrální červeně.

• · · · * · • · · • · · · • 9 9··· • 9 ·

Příklad 8

Studie terapeutické účinnosti na PDAPP transgenních myších ošetřených Αβ1-42 a adjuvans.

Následující pokus byl navržen pro srovnání řady adjuvantních kombinovaných prostředků u transgenních myší PDAPP pro otestování terapeutické účinnosti peptidů Αβ1-42

Projekt studie:

Transgenní myši PDAPP staré deset a půl až dvanáct a půl měsíce (samci a samice) byly rozděleny do čtyř skupin po 40 myších, tříděných tak, že v každé skupině se myši co nejvíce shodovaly z hlediska věku, pohlaví a transgenního rodiče. Popis skupin je uveden v Tabulce 23.

Tabulka 23

Ošetření skupin trangenních myší

Skupina	Adjuvans	Dávka	A 1-42	dávka	H při startu	H na konci
i	MPL SE	25 pg	75/60	íxg	40	35
2	MPL· SE+GM-CSF	25 pg/10 μ<3	64/60	μσ	41	34
3	529+GM-CSF	25 /xg/10 μ<3	64/60		40	31
4	PBS	na	na		40	37

Peptid Αβ1-42 byl od Elán Pharmaceuticals, 529 SE a MPL™ byly od Corixa, a myší GM-CSF byl od Biosource. Všechny myši dostaly injekce v týdnech 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20 a 24. Myším byla odebrána krev 5-7 dnů po injekci, ·»·4

4

4»

4 4 4 4 4 *

444 4 4 4 4* 4

4 4444 4 4 4 4 4 4 4

4* počínaje po druhé injekci. Skupiny 1, 2 a 3 dostaly injekci subkutánně v objemu 200 μΐ, zatímco skupina 4 dostala subkutánní dávku 250 μΐ. Zvířata byla usmrcena ve 25. týdnu pokusu. Byly získány titry za použití ředění, které poskytuje hodnotu 50 % maximální hodnoty optické hustoty.

Výsledky

Imunogenicita a protilátková odpověď:

Všechny skupiny dosáhly píku geometrického průměru titru (geometrie mean titer, GMT) protilátek proti Αβ1-42 peptidu buďto při druhém (RC529 + GM-CSF), nebo při třetím (MPL™ SE, MPL™ SE + GM-CSF) odběru (viz Obrázek 1) . Pík GMT pro MPL™ SE + GM-CSF byl 16, 400, zatímco pro 529 SE + GM-CSF byl 13,400, nebo přibližně 1,5 x kontrola MPL™ SE o hodnotě 9,700. Nicméně, titry dvou prostředků obsahujících GM-CSF (skupiny 2 a 3) ustoupily na přibližnou úroveň kontroly MPL™ SE s konečnými titry (GMT) pro MPL™ SE = 4600, pro MPL™ SE + GM-CSF = 5350 a pro 529 SE + GM-CSF = 4650.

Pro stanovení, zda konečný pokles titru dvou prostředků obsahujících GM-CSF je způsoben protilátkovou odpovědí anti-GM-CSF, byla použita ELISA ke stanovení, zda se vytvářely protilátky anti-GM-CSF v průběhu imunizace. Séra ze všech zvířat, která dostala GM-CSF, byla titrována proti myšímu GM-CSF použitému v průběhu tohoto pokusu.

Nebyl nalezen žádný důkaz o protilátkách proti GM-CSF u žádného z ošetřených zvířat (údaje nejsou uvedeny).

Hladiny Αβ v mozku:

o ·*·» >♦ « *«» w * * » * * * · · • · · · · · ··· · * · • »···* * · ·· · · · · t • · · · * * · · ♦ · · ·· · ·· «· «* ··

Všechny tři ošetřené skupiny signifikantně redukovaly akumulaci jak celkového peptidu Αβ (Obrázek 2 individuální výsledky; Tabulka 24 - skupinové výsledky), tak Αβ1-42 (Obrázek 3 - individuální výslekdy; Tabulka 25 skupinové výsledky) v kortikální oblasti mozku myší PDAPP. Zkoušky ELISA na Αβ (úplný a formu l-42)byly prováděny tak, jak bylo dříve popsáno (54) s použitím guanidinsolubilizovaných homogenátů mozku. Ke statistickému vyhodnocení byl použit test významnosti podle Mann-Whitney.

Tabulka 24

Celkové hladiny kortikálniho A

	PBS	MPL SE	MPL SE + GM-CSF	529 SE + GM-CSF
Střed	6,478	1,707	025	1,313
(ng/g) Rozmezí	64 -	33 -	67 -	79 -
	17,208	8,501	5,293	5,271
Redukce		74	86	80
F Hodnota	—	<0,0001	<0,0001	<0,0001
N	37	35	34	31

• · · · · • ··· · · · • · · · · · · • · · · · · · ·· ·· ·*

Tabulka 25

Hladiny kortikálního A 1-42

	PBS	MPL SE	MPL SE + GM-CSF	529 SE + GM-CSF
Střed	5,609	1,799	779	1,127
(ng/g)
Rozmezí	284 -	10 -	43 -	29 -
	14,004	6,715	4, 824	4,442
Redukce	— -	68	86	80
P Hodnota	—	<0,0001	<0,0001	<0,0001
(M-WJ
N	36	35	34	31

Amyloidová zátěž:

Rozsah amyloidosis byl kvantifikován ve frontálním kortexu s použitím imunohistochemických metod tak, jak byly dříve popsány (55) . Všechny tři ošetřené skupiny vykazovaly signifikantní redukci amyloidové zátěže (Obrázek 4 individuální výsledky; Tabulka 26 - skupinové výsledky).

Tabulka 26 amyloidová zátěž frontálního kortexu

Střed (%AB)

Rozmezí

J?BS

7,90

0,00 27,37 % Redukce P Hodnota (M-W)

N

MPL SB

0,49

0,00 9,63 94 <0,0001

MPL SE t GM-CSF 0,00

0,00 - ,83

100 <0,0001

529 SE + GM-CSF 0,04

0,00 - 5,53

99,5 <0,0001 • ·

Neuritická zátěž

Imunohistochemicky byl stanoven účinek ošetření na vývoj neuritické dystrofie ve frontálním kortexu tak, jak bylo popsáno dříve (55). Všechny tři ošetřené skupiny signifikantně redukovaly rozsah neuritické zátěže ve srovnání s kontrolou PBS (Obrázek 5 - individuální výsledky; Tabulka 27 - skupinové výsledky) .

Tabulka 27

Heuritická zátěž frontálního kortexu

	PBS	MPL SB	MPL SB + GM-CSF	529 SE ♦ GM-CSF
Střed	0,35	0,14	0,04	0,02
Rozmezí	0,00 1,21	0,00 - 0,82	0,00 - 0,60	0,00 - 0,9
Redukce		60	88	95
P> Hodnota	—	0,0153	< 0,0001	< 0,0001
(M-W)
N	29	33	29	30

Astrocytosis

Rozsah astrocytosis v retrospleniálním kortexu byl kvantifikován tak, jak bylo dříve popsáno (55). Ošetřené skupiny obsahující GM-CSF signifikantně redukovaly astrocytosis (Obrázek 6).

» · · • · • ···

Příklad 9

Imunizace opice makak cynomolgus peptidem C4 (E9V)-V389._SP

Cílem tohoto pokusu bylo vyhodnotit imunogenicitu peptidového konjugátu C4 (E9V)-V3s9.6p odvozeného z HIV-lEnv podaného s a bez kombinace adjuvantního prostředku podle předloženého vynálezu jinému druhu primátů, opici makak cynomolgus (Macaca fascicularis) . Peptid C4-V3₈g.6p popsaný v příkladu 7 byl modifikován záměnou kyseliny glutamové v aminokyselinovém zbytku 9 za valin. Byl použit výsledný peptidový konjugát, označený jako C4 (E9V)-V3s9.6Př který má následující sekvenci:

Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Val Val Gly

Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn

Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Fly Pro Gly Arg

Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO:5).

Substituce kyseliny glutamové za valin (E9V) uvnitř oblasti peptidu C4 zvyšuje u myšího modelu imunogenicitu peptidu ve srovnání s nemodifikovanou sekvencí

Tento peptid odvozený z HIV-1 Env je schopen zvyšovat humorální imunitní reakci u myší. Nicméně, vzhledem k obtížnosti extrapolace výsledků získaných u myši na člověka, je nezbytné testovat potenciál HIV-1 imunogenních kompozic u primátů (s výjimkou člověka) před přistoupením do I fáze klinických zkoušek prováděných na člověku.

V tomto pokuse byl hodnocen způsob podání jak intramuskulárního IM), tak intranasálního (IN). Zvířata byla imunizována pět krát v týdnech 0, 4 ,8, 18 a 23.

V průběhu 25 týdnů v týdenních intervalech byly shromažďovány cervikovaginální a mukosální výplašky a analyzovány na přítomnost protilátek k imunogenní kompozici.

• · · ·

Projekt studie:

Pro pokus bylo použito celkem osm opic makaka cynomolgus, a to čtyři opice na skupinu. (Tabulka 28). Skupina 1 nedostala žádné adjuvans; skupina 2 dostala adjuvantní prostředek 529 SE plus GM-CSF. Zvířata byla chována a vyhodnocována v souladu s pravidly péče o zvířata.

Tabulka 28

529 SE plus GM-CSF versus bez adjuvans

Skupina # Dramo gen Adjuvans Způsob podáni

C4 (E9V)-V3e$,s_P peptid žádné

C4(E9V)”V3₈₉._6P peptid 5295E/GK-CSF IW

IN - intranasálně, ΓΜ- intramuskulárně

Imunizace:

Veškeré intranasální imunizace byly aplikovány nasálním rozprašovačem v dávce 100 μΐ. Veškeré injekce byly podány do čtyřhlavého stehenního svalu (mus.culus quadriceps) injekční jehlou a stříkačkou. Všechna zvířata byla imunizována podle plánu v týdnu 0, 4, 8, 18 a 23.

• ·

90 9 • · · · · 9

• · · · • · · 9 9 9 • 9 9 9 9 9 • · · · · 9 * * · · · ·

Prostředky:

Skupina 1: 1 000 μς peptidu C4 (E9V)-V3₈₉._6P v normálním solném sterilním roztoku, v konečném objemu 200 μΐ (100 μΐ do každé nosní dírky).

Skupina 2: 1 000 μ9 peptidu C4 (E9V)-V3₈₉.₆p, 50 μ9 529 SE a 250 μς lidského GM-CSF, konečná koncentrace oleje 1 %, konečný objem 1,0 ml (500 μΐ do každého kvadricepsu IM injekcí).

Zkoušky monitorování imunitních reakcí indukovaných imunogenem:

Bezprostředně před a po imunizaci byla všechna zvířata testována na imunogenem indukovanou humorální reakci následujícím stanovením:

(1) Sérových titrů IgG protilátek proti peptidu C4(E9V)V3₈₉._6p metodou ELISA.

(2) Slizničních (cervikovaginálních, nosních) titrů IgG protilátek proti peptidu C4 (E9V)-V3₈₉._6p metodou ELISA.

Výsledky:

Imunogenní bezpečnost a přijatelnost

Když byl peptid C4 (E9V)-V3₈₉._6p podáván samotný nebo v kombinaci s adjuvans 529 SE(GM-CSF), byl extrémně dobře tolerován. Nebyly zaznamenány žádné nežádoucí reakce v místě vpichu injekce u zvířat imunizovaných intramuskulární cestou s použitím injekčních jehel a stříkaček. Všechna zvířata byla pečlivě sledována z hlediska změn v tělesné teplotě během 24 hodin bezprostředně následujících po každém podání imunogenu.

• · · · • · ·· ·· ·· • · · · • · · · · · • · · · · · • · · · · · • ·· ·· ··

Během studie v žádném období žádné ze zvířat nevykazovalo abnormálně zvýšené hodnoty tělesné teploty (údaje neuvedeny).

Protilátkové reakce specifické pro imunogen v séru.

Vzorky sér ze všech zvířat byly získány bezprostředně před a jeden a dva týdny po každé imunizaci (v průběhu 25 týdnů). Dva týdny po konečné imunizaci byly všechny vzorky sér analyzovány na přítomnost IgG protilátek proti peptidu C4(E9V)-V3. Intanasálně imunizovaná skupina zvířat 1 (samotný peptid C4 (E9V)-V3₈₉.6p) nevykazovala sérové protilátkové titry proti peptidu C4 (E9V)-V3₈₉.6_P vyšší než byla hladina před imunizací (Obrázek 7). Naopak, skupina zvířat 2 (IM podání C4 (E9V)-V3₈₉._6P + 529 SE/GM-CSF) vykazovala signifikantní hladiny sérových specifických IgG protilátek anti-C4 (E9V)-V3₈9.6p (Obrázek 7). Uvedené geometrické průměry konečného titru byly vypočteny s použitím nejnižšího titru z každého jednotlivého zvířete, který je trojnásobný oproti údajům pro skupinové (pooled) naivní sérum při stejném ředění.

Skupina zvířat 1 (bez adjuvans) měla hodnoty titrů IgG protilátek anti-C4 (E9V) -V3₈₉.6p ve vzorcích z cervikovaginálních laváží vyšší než titry před imunizací pouze po čtvrté imunizaci, avšak tyto potom poklesly (Obrázek 8). V porovnání s tím, skupina zvířat 2 (s adjuvans) měla titry IgG protilátek anti-C4 (E9V)-V3₈₉._6P ve vzorcích z cervikovaginálních laváží vyšší než titry před imunizací po prvé imunizaci a tyto se zvyšovaly po každé následující imunizaci (i když v každém případě následoval později jejich určitý pokles) (Obrázek 8).

Skupina zvířat 1 (bez adjuvans) nevykazovala titry IgG protilátek anti-C4 (E9V)-V3₈₉.6p ve vzorcích z nasálních • · · · • 4 4 • · 4 · • 4 4 · 4 · · • · · • » » · • · · • · ··· • 4 · • 4 · ·· 44

výplašků vyšší, než byly hladiny před imunizací (Obrázek 9). V porovnání s tím, skupina zvířat 2 (s adjuvans) měla titry IgG protilátek anti-C4 (E9V)-V3₈₉.6p ve vzorcích z nasálních výplašků o signifikantních úrovních (Obrázek 9) .

• · · ·

BIBLIOGRAFICKÉ ODKAZY

1. Mosmann, T.R., et al., J. Immunol,, 136, 2348-2357 (1986).

2. u:s. Patent Number 5,057,540

3. U.S. Patent Number 6,113,918.

4. Ahlers, J.D., et al., J. Immunol., 158, 3947-3958 (1997).

5. Scharton-Kersten, T., et al., J.

Immunol. 154, 5320-5330 (1995).

6. Ghalib, H.W., et al., J. Immunol., 154, 4623-4629 (1995).

7. Murray, H.W., and Hariprashad, J., . J. Exp. Med., 181, 387-39! (1995).

8. U.S. Patent Number 5,571,515.

9. U.S. Patent Number 5,723,127.

10. U.S. Patent Number 5,976,539.

11. Finkelman, F.D., and Holmes, J., Ann.

Rev. Immunol., B, 303-333 (1990).

12. Snapper, C.M., et al., J. Exp. Med.,

175, 1367-1371 (1992).

13. Kobayashi, M., et al., J. Exp. Med.,

170, 827-845 (1989).

14. Published International Patent

Application Number WO 90/05147.

15.	U.S. Patent Number	5,078,996.
16.	U.S. Patent Number	5,229,496.
17.	U.S. Patent Number	5,073,627.
18.	Alderson, M.R., et	al. , J. Exp. Hed,
669-674	(1993).
19.	Snapper, C.M., et al., J. Immunol.,

154, 5842-5850 (1995).

20. U.S. Patent Number 5,679,356.

21. Published International Patent Application Number WO 00/69456.

22. U.S. Patent Number 5,013,548.

• · • · · · • · 9

9·99 9 •» ·· • «

I · · · ·

23. U.S. Patent Number 5,019,387.

24. Charbit, A., et al., Vaccine, 11, 12211228 (1993).

25. Natuk, R.J., et al., AIDS Re3. Hum. Retroviruses, £, 395-404 (1993).

26. Johnson, R.P., et al., J. Virol., 68, 3145-3153 (1994).

27. Fuller, D.H., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 10, 1433-1441 (1994) .

28. Berzofsky, J.A., et al., J. Clin.

Invest., 88, 876-884 (1991).

29. Pálker, T.J., et al., J. Immunol., 142, 3612-3619 (1989).

30« Hart, Μ · K · , et al ·, J· Immunol·, 14 5, 2677-2685 (1990).

31. Haynes, B.F., et al., J. Immunol., 151, 1646-1653 (1993).

32. Hart, M.K., et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 9448-9452 (1991).

33. Bartlett, J.A., et al., AIDS, 12, 12911300 (1998).

34. Haynes, B.F., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 11, 211-221 (1998) .

35. U.S. Patent Number 5,861,243.

36. U.S. Patent Number 5,932,218.

37. U.S. Patent Number 5,939,074.

38. U.S. Patent Number 5,993,819.

39. U.S. Patent Number 6,037,135.

40. Published European Patent Application Number 671,947.

41. U.S. Patent Number 6,024,965.

42. Miller, M.D., et al., J, Immunol., 147,

320-329 (1991).

43. Kuroda, M.J., et al., J. Exp. Med., 187,

1373-1381 (1998).

• * ···· • * · « • w · • · ··· • ♦ · • · · ·» ·· ·· ····

44. Liao, H-X, et al., J. Virol., 74, 254263 (2000).

45. Staats, H.F., et al., J. Immunol., 157, 462-472 (1996).

46. Porgador, A., et al., J. immunol., 158, 834-841 (1997).

47. Published International Patent Application Number WO 99/27944.

48. U.S. Patent Number 4,666,829.

49. Games, D., et al., Nátuře, 373, 523-527 (1995).

50. Published International Patent Application Number WO 98/20734.

51. U.S. Patent Number 5,830,877.

52. Published International Patent Application Number WO 99/51259.

53. U.S. Patent Number 5,593,972.

54. Johnson-Wood, D., et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 94, 1550-1555 (1997).

55. Schenk, D., et al.. Nátuře, 400, 173-177 (1999).

• · · « • · « · • · · • »··« · ·« ·· « · · • * »·· • « ·· *·«· ·« »· sekvenční protokol <110> American Cyanamid Company <120>’ Adjuvantní kombinované prostředky <130> AM100449PCT <160> 8 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213>

Umělá sekvence z viru lidské imunodeficience <400>

Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met 15 10

Tyr Ala 15

Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Xle His Ile Gly Pro 20 25 30

Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys 35 40 <210> 2 <211> 39 · <212> PRT <213> _sekvence z viru lidské imunodef icience <400> 2

Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 10 15

Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly 20 25 30

Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys 35 ' <210> 3 <211> 28 <212> PRT umělá sekvence z viru lidské imunodeficience <400> 3

Arg Gin Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu 15 10 15

Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin Met Leu 20 25

• · »··· · 9

Λ 9 9 • · · • · · « ·· <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Umělá sekvence z viru lidské imunodeficience <400> 4

Lys 1

Gin

Ile

Ile

Asn 5

Met

Trp

Gin

Glu

Val 10

Gly

Lys

Ala Met

Tyr 15

Ala

Thr

Arg

Pro

Asn 20

Asn

Asn

Thr

Arg

Glu 25

Arg

Leu

Ser

Ile Gly 30

Pro

Gly

Arg

Ala

Phe

Tyr

Ala

Arg

Arg

• ·

<210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> umělá sekvence z viru lidské imunodeficience <400> 5

Lys Gin Ile Ile Asn

Met

Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala

1

5

10

15

Thr

Arg

Pro

Asn

Asn

Asn

Thr

Arg

Glu

Arg

Leu Ser

Ile Gly

Pro

Gly

20

25

30

Arg

Ala

Phe

Tyr

Ala

Arg

Arg

<210> 6 <211> 42 <212> PRT <213> v_nj_tf_n£ fragment z amyloidového prekursorového proteinu <400> 6

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 7 <211> 28 <212> PRT ^<213> Vnitřní fragment z amyloidového prekursorového proteinu <400> 7

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys

·· • a • · • · • · · ·· ♦ • · ···· «· • · • ··· • · · • · · «· « · • · • · · • · ·· ····

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 8 <211> 10 <212> PRT ^<213> Umělá sekvence z viru lidské imunodeficience <400> 6

Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile

5 10

Claims (63)

1. Patentové nároky

   1. Antigenní kompozice vyznačující se tím, že obsahuje antigen vybraný z patogenního viru, baktérie, houby nebo parazita, nebo z rakovinných nebo nádorových buněk, nebo z alergenu, vlastní molekuly, a účinné adjuvantní množství kombinace: (1) aminoalkyl glukosamin fosfátová sloučenina (AGP) nebo její derivát nebo analog; a (2) cytokin nebo lymfokin, nebo agonista uvedeného cytokinu nebo lymfokinu, kde kombinace adjuvans zesiluje imunitní odpověď na uvedený antigen u obratlovce.
2. 2. Antigenní kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že vybraným antigenem je polypeptid, peptid nebo fragment získaný z proteinu.
3. 3. Antigenní kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že AGP je použit ve formě stabilní emulze olej-vevodě.
4. 4. Antigenní kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že cytokin nebo lymfokin je vybrán ze skupiny zahrnující faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů a interleukin-12.
5. 5. Antigenní kompozice podle nároku 4 vyznačující se tím, že cytokinem nebo lymfokinem je faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů.
6. 6. Antigenní kompozice podle nároku 5 vyznačující se tím, že AGP je použit ve formě stabilní emulze olej-vévodě .

   VŽ- φφ ·· • φ φ • φφφφ • φ φ φ • φ φ φ φφ φφφφ
7. 7. Antigenní kompozice podle nároku 4 vyznačující se tím, že cytokinem nebo lymfokinem je interleukin-12.
8. 8. Antigenní kompozice, podle nároku 7 vyznačující se tím, že AGP je použit ve formě stabilní emulze olej-vevodě .
9. 9. Antigenní kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že dále obsahuje ředidlo nebo nosič.
10. 10. Antigenní kompozice podle nároku 9 vyznačující se tím, že AGP je použit ve formě stabilní emulze olej-vevodě .
11. 11. Antigenní kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že AGP je 2-[ (R) -3-tetradekanoyloxyte.tradekanoylamino] ethyl 2-deoxy-4-0-fosfono-3-0-[ (R) -3tetradekanoyoxytetradekanoyl]-2-[ (R)-3tetradekanoyoxytetradekanoylamino]-p-D-glukopyranosid (529) .
12. 12. Antigenní kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že antigen je vybrán z viru lidské imunodeficience (HIV).
13. 13. Antigenní kompozice podle nároku 12 vyznačující se tím, že vybraným HIV antigenem je HIV protein, polypeptid, peptid nebo fragment získaný z uvedeného proteinu.
14. 14. Antigenní kompozice podle nároku 13 vyznačující se tím, že vybrané antigeny jsou HIV peptidy vybrané ze skupiny zahrnující peptidy mající aminokyselinové sekvence: Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met ·· ♦*·· ···

    Ή

    VB-

    Tyr Ala His Ile NO:1); Cys Gly Thr Pro Arg Gly Pro Arg Asn Ala Tyr Phe Asn Tyr Lys Thr Arg Thr Lys Lys Arg Ile (SEQ ID Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO:2); Arg Gin Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO:3); Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEC ! ID NO:4);

    a

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ! ID NO: 5)
15. 15. Antigenní kompozice podle nároku 14 vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID

    NO:1).
16. 16. Antigenní kompozice podle nároku 14 vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met «♦·· ··· ··

    Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID N0:2).
17. 17. Antigenní kompozice podle nároku 14 vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Arg Gin Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO:3).
18. 18. Antigenní kompozice podle nároku 14 vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ! ID NO: 4)
19. 19. Antigenní kompozice podle nároku 14 vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 5
20. 20. Antigenní kompozice podle nároku 12 vyznačující se tím, že AGP je použit ve formě stabilní emulze olej-vevodě .
21. 21. Antigenní kompozice podle nároku 12 vyznačující se tím, že cytokin nebo lymfokin je vybrán ze skupiny zahrnující faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů a interleukin-12.

    • * · • · · · • · ·*·· •99 99 9 • 9

    9 9 9 · • · ··♦ 9 ♦ · · · » 9
22. 22. Antigenní kompozice podle nároku 21 vyznačující se tím, že cytokinem nebo lymfokinem je faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů.
23. 23. Antigenní kompozice podle nároku 22 vyznačující se tím, že AGP je použit ve formě stabilní emulze olej-vevodě.
24. 24. Antigenní kompozice podle nároku 21 vyznačující se tím, že cytokinem nebo lymfokinem je interleukin-12.
25. 25. Antigenní kompozice podle nároku 24 vyznačující se tím, že AGP je použit ve formě stabilní, emulze olej-vévodě .
26. 26. Antigenní kompozice podle nároku 12 vyznačující se tím, že dále obsahuje ředidlo nebo nosič.
27. 27. Antigenní kompozice podle nároku 26 vyznačující se tím, že AGP je použit ve formě stabilní emulze olej-vevodě.
28. 28. Antigenní kompozice podle nároku 12 vyznačující se tím, že AGP je 529.
29. 29. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující antigen vybraný z patogenního viru, baktérie, houby nebo parazita vyvolat imunitní reakci u obratlovce vyznačující se tím, že zahrnuje podání antigenní kompozice podle nároku 1 uvedenému obratlovci.
30. 30. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující antigen vybraný z patogenního viru, baktérie, ·· ·» • 9 9 • · 999 • · 9 9 * 9 9 9 9 ** » ·· ·« houby nebo parazita vyvolat imunitní reakci u obratlovce vyznačující se tím, že zahrnuje podání antigenní kompozice podle nároku 9 uvedenému obratlovci.

    *· 9 99 9
31. 31. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující HIV antigen vyvolat imunitní reakci u obratlovce vyznačující se tím, že zahrnuje podání antigenní kompozice podle nároku 12 uvedenému obratlovci.
32. 32. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující HIV antigen vyvolat imunitní reakci u obratlovce vyznačující se tím, že zahrnuje podání antigenní kompozice podle nároku 26 uvedenému obratlovci.
33. 33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že zvolenými HIV antigeny jsou HIV peptidy vybrané ze skupiny zahrnující peptidy mající aminokyselinové sekvence:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Al 3 Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His NO: ' Ile i); Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO:; Arg Gin Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu (SEQ ID Glu Gly NO: 3) ; Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin Met Leu Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: ‘

    ♦ ♦ 4 • 0 4 • 0 4 4 • 44040 •·0 *4 0 *4 00 • 4 > 444 *4 0

    0 4 4

    44 4044

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO:5).
34. 34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID

    NO:1).
35. 35. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO:2).
36. 36. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Arg Gin Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO:3); 37. Způsob podle nároku 33, vyznačuj ící se tím, že HIV

    peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO:4). 38. Způsob podle nároku 33, vyznačuj ící se tím, že HIV

    peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    • · · · f • · · · · ·* ···· * · · • · 4

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met

    Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser

    Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO:5).
37. 39. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující antigen vybraný z patogenního viru, baktérie, houby nebo parazita vyvolat cytotoxické T-lymfocyty u obratlovce vyznačující se tím, že zahrnuje podání antigenní kompozice podle nároku 1 uvedenému obratlovci.
38. 40. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující antigen vybraný z patogenního viru, baktérie, houby nebo parazita vyvolat cytotoxické T-lymfocyty u obratlovce vyznačující se tím, že zahrnuje podání antigenní kompozice podle nároku 9 uvedenému obratlovci.
39. 41. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující antigen vybraný z patogenního viru, baktérie, houby nebo parazita vyvolat cytotoxické T-lymfocyty u obratlovce vyznačující se tím, že zahrnuje podání antigenní kompozice podle nároku 12 uvedenému obratlovci.
40. 42. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující antigen vybraný z patogenního viru, baktérie, houby nebo parazita vyvolat cytotoxické T-lymfocyty u obratlovce vyznačující se tím, že zahrnuje podání antigenní kompozice podle nároku 26 uvedenému obratlovci.
41. 43. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že zvolenými HIV antigeny jsou HIV peptidy vybrané ze skupiny zahrnující peptidy mající aminokyselinové sekvence:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile

    <P2- ·· · • · · • · · · • · • · · • · · • · · • · · • · • · · · • · • · · · • · · · • · · ·· ·· • · · • · • · • · · · • • His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO:1); Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO:2); Arg Gin Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO:3); Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg a Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO:4); Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO:5).
42. 44. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO:1).
43. 45. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO:2).

    • · &

    n rv υ v • · • ·< • ·
44. 46. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci.:

    Arg Gin Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO:3);
45. 47. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že HIV peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci:

    Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO:4). 48 . Způsob podle nároku i 43, vyznačuj ící se tím, že HIV peptid ; je peptid mající aminokyselinovou sekvenci: Lys Gin Ile IΣ Θ Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Ans Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ > ID NO:5).
46. 49. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující vybraný nádorový nebo s nádorem-asociovaný antigen z rakovinných nebo nádorových buněk vyvolat terapeutický nebo profylaktický protinádorový účinek u obratlovce, vyznačující se tím, že zahrnuje podání uvedenému obratlovci antigenní kompozice obsahující uvedený nádorový nebo s nádorem asociovaný antigen z rakovinných nebo nádorových buněk a účinné adjuvantní množství kombinace:(1) AGP, nebo její derivát nebo analog; a (2) cytokin nebo lymfokin, nebo agonista uvedeného cytokinu nebo lymfokinu.
47. 50. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující vybraný alergen zmírnit alergickou reakci u obratlovce vyznačující se tím, že zahrnuje podání uvedenému • · • · • · · · • · · · • · · · · · • ··· · · · · · • ······· · · · • · · · · · · • · » · · · · obratlovci antigenní kompozice obsahující uvedený alergen a účinné adjuvantní množství kombinace:(1) AGP, nebo její derivát nebo analog; a (2) cytokin nebo lymfokin, nebo agonista uvedeného cytokinu nebo lymfokinu.
48. 51. Antigenní kompozice obsahující antigen vybraný z molekuly nebo její části, která představuje molekulu produkovanou příjemcem nežádoucím způsobem, v nežádoucím množství a místě tak, aby byl snížen takový nežádoucí účinek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné adjuvantní množství kombinace:(1) AGP, nebo její derivát nebo analog; a (2) cytokin nebo lymfokin, nebo agonista uvedeného cytokinu nebo lymfokinu.
49. 52. Antigenní kompozice podle nároku 51 vyznačující se tím, že antigen je vybrán z polypeptidu, peptidu nebo fragmentu získaného z amyloidového prekursorového proteinu, nebo protilátky k takovému peptidu.
50. 53. Antigenní kompozice podle nároku 52 vyznačující se tím, že vybraný antigen je peptid Αβ, který je vnitřním fragmentem amyloidového prekursorového proteinu o aminokyselinách 39-43, nebo fragment tohoto peptidu Αβ.
51. 54. Antigenní kompozice podle nároku 53 vyznačující se tím, že vybraný antigen je peptid Αβ mající aminokyselinovou sekvenci:

    Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

    (SEQ ID NO:6).

    • · · · • 0 · ·· ·· • · · · · · • ··· · 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 /»/—’ · · · 0 0 0 0

    Χϊ ·· · ·· <·
52. 55. Antigenní kompozice podle nároku 54, vyznačující se tím, že AGP je 529.

    55. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice obsahující antigen vybraný z molekuly nebo její části, která představuje molekulu produkovanou příjemcem nežádoucím způsobem, v nežádoucím množství a místě tak, aby byl snížen takový nežádoucí účinek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné adjuvantní množství kombinace:(1) AGP, nebo její derivát nebo analog; a (2) cytokin nebo lymfokin, nebo agonista uvedeného cytokinů nebo lymfokinu.
53. 57. Způsob pro zlepšení schopnosti antigenní kompozice bránit nebo léčit onemocnění charakterizované ukládáním amyloidu u obratlovce vyznačující se tím, že zahrnuje podání polypeptidu, peptidu nebo fragmentu získaného z amyloidového prekursorového proteinu, nebo protilátky k takovému peptidu, a účinného adjuvantního množství kombinace:(1) AGP, nebo její derivát nebo analog; a (2) cytokin nebo lymfokin, nebo agonista uvedeného cytokinů nebo lymfokinu.
54. 58. Způsob podle nároku 57 vyznačující se tím, že vybraný antigen je peptid Αβ, který je vnitřním fragmentem amyloidového prekursorového proteinu o aminokyselinách 3943, nebo fragment tohoto peptidu Αβ.
55. 59. Způsob podle nároku 58 vyznačující se tím, že vybraný antigen je peptid Αβ mající aminokyselinovou sekvenci:.

    Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His

    Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys •ee*

    Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (SEQ ID NO:6).
56. 60. Způsob podle nároku 59 vyznačující se tím, že AGP je 529.
57. 61. Adjuvantní prostředek vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci: (1) aminoalkyl glukosamin fosfátová sloučenina (AGP) nebo její derivát nebo analog; a (2) cytokin nebo lymfokin, nebo agonista uvedeného cytokinů nebo lymfokinu.
58. 62. Adjuvantní prostředek podle nároku 61 vyznačující se tím, že AGP je použit ve formě stabilní emulze olej-vevodě.
59. 63. Adjuvantní prostředek podle nároku 61 vyznačující se tím, že cytokin nebo lymfokin je vybrán ze skupiny zahrnující faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů a interleukin-12.
60. 64. Adjuvantní prostředek podle nároku 61 vyznačující se tím, že dále obsahuje ředidlo nebo nosič.
61. 65. Adjuvantní prostředek podle nároku 61 vyznačující se tím, že cytokinem nebo lymfokinem je faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů.
62. 66. Adjuvantní prostředek podle nároku 61 vyznačující se tím, že cytokinem nebo lymfokinem je interleukin-12.
63. 67. Adjuvantní prostředek podle nároku 61 vyznačující se tím, že AGP je 529.