HUP0400284A2

HUP0400284A2 - Rekombináns, tumorspecifikus ellenanyag és alkalmazása

Info

Publication number: HUP0400284A2
Application number: HU0400284A
Authority: HU
Inventors: Stephen D. Gillies; Kin-Ming Lo; Xiuqi Qian
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2001-05-03
Filing date: 2002-05-03
Publication date: 2005-02-28
Also published as: EP1383785A4; EP1383785B1; DE60239454D1; JP2004533248A; DK1383785T3; PT1383785E; RU2306320C2; WO2002090566A3; AU2002308562B2; RU2306320C9; US7803618B2; BR0209177A; PL367831A1; US20030157054A1; CA2446087C; MXPA03009924A; RU2003132705A; ES2361664T3; US6969517B2; PL205352B1

Abstract

A találmány rekombináns ellenanyagokra vonatkozik. Közelebbről, atalálmány tárgyát humán epitelsejt adhéziós molekulához (<EpithelialCell Adhesion Molecule<; EpCAM) specifikus módon kötődő ellenanyagok,valamint azok diagnosztikus, prognosztikus és terápiás hatóanyagokkénttörténő alkalmazása képezik. A találmány szerinti ellenanyagokmódosított variábilis régiókat, közelebbről, módosított keretrégiókat(FR) tartalmaznak, amelyek humán szervezetnek beadva csökkentmértékben immunogének. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi arekombináns ellenanyagokat expresszáló expressziós vektorok, valaminta találmány szerinti ellenanyagok alkalmazása EpCAM-hiperexpresszióvaljáró tumorban szenvedő betegek kezelésére. Ó

Description

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

Rekombináns, tumorspecifikus ellenanyag és alkalmazasa

A találmány rekombináns ellenanyagokra vonatkozik. Közelebbről, a találmány tárgyát humán epitelsejt adhéziós molekulához („Epithelial Cell Adhesion Molecule·, EpCAM) specifikus módon kötődő ellenanyagok, valamint azok diagnosztikus, prognosztikus és terápiás hatóanyagokként történő alkalmazása képezik.

A találmány szerinti ellenanyagok módosított variábilis régiókat, közelebbről, módosított keretrégiókat (FR) tartalmaznak, amelyek humán szervezetnek beadva csökkent mértékben immunogének. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi a rekombináns ellenanyagokat expresszáló expressziós vektorok, valamint a találmány szerinti ellenanyagok alkalmazása EpCAM-hiperexpresszióval járó tumorban szenvedő betegek kezelésére.

Az ellenanyagok, megfelelő egységekkel összekapcsolva alkalmazhatók tumorok diagnosztizálására, tumoros betegségek prognózisának felállítására és/vagy kezelésére.

Az ellenanyagok alkalmazásán alapuló terápiás eljárások jelentős fejlődésen mentek át az elmúlt években. Például, a kutatók nem csupán különböző tumormarkereket azonosítottak, hanem ezekhez a markerekhez specifikus módon kötődő ellenanyagokat is. Ellenanyagok alkalmazásával bizonyos molekulák, például toxinok vagy immunstimuláns egységek, például citokinek, célzottan eljuttathatók a markert expresszáló tumorsejtekhez, ezáltal az ilyen sejtek szelektív módon elpusztíthatok (lásd például az 5 541 087 és 5 650 150 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat).

A KS-l/4-ellenanyag egéreredetű, humán epitelsejt adhéziós molekula (EpCAM) ellen irányuló monoklonális ellenanyag. Az EpCAM igen alacsony szinten expresszálódik bizonyos epitelsejtek apikális (csúcsi) felszínén. EpCAM expresszióját figyelték meg például bélsejteken, a felvett táplálékkal érintkező, és a keringéstől távol eső sejtfelszínen, ahol az az immunrendszer legtöbb proteinje és sejtje számára nem hozzáférhető [Balzar és mtsai.: J. Mól. Med. TL, 699 (1999)].

Bizonyos körülmények mellett azonban az EpCAM nagy mennyiségben expresszálódik bizonyos sejteken, például epitel eredetű tumorsejteken. Tipikusan, ezek a tumorsejtek elvesztették polaritásukat, ami azzal jár, hogy az EpCAM a sejt teljes felszínén expresszálódik.

Az EpCAM tehát olyan tumorsepcifikus marker, amelynek alkalmazása kézenfekvőnek tűnik ellenanyag-alapú immunstimuláns egységek tumorsejtekhez történő közvetlen eljuttatására [Simon és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2755 (1990); Perez és mtsai.: J. Immunoi. 142, 3662 (1989)].

- 2 Az ellenanyagok azonban maguk is immunogének lehetnek az emlős gazdaszervezetben. Ennek valószínűsége nagyobb, ha az ellenanyagok nem autológok. Következésképp, az ellenanyagok alkalmazásán alapuló terápia hatásosságát gyakran befolyásolja az ellenanyag ellen irányuló immunválasz. Az immunválasz rendszerint erősebb, ha az ellenanyag teljes egészében vagy részben a gazda emlőstől elérő emlősből, például egérből származik, és a recipiens ember. Előnyös lehet tehát, ha az egéreredetű ellenanyagot úgy módosítjuk, hogy humán ellenanyagokhoz sokkal hasonlóbb legyen, ezáltal csökkentjük vagy minimalizáljuk az egéreredetű ellenanyag immunogenitását.

Különböző megközelítési módokat dolgoztak ki, például kiméra ellenanyagok előállítását, ellenanyagok humanizálását, és „veneered' ellenanyagok (olyan humanizált ellenanyagok, amelyekben a felszíni epitópok egy részét visszacserélték az eredeti ellenanyagban található aminosavra) előállítását, továbbra is szükség van tumorspecifikus markerekhez kötődő, embernek beadva csökkent immunogenitású ellenanyagokra. Igény mutatkozik továbbá olyan ellenanyagok kifejlesztésére, amelyek alkalmasak toxinok vagy immunstimuláns egységek eljuttatására - például fúziós proteinekként vagy immunkonjugátumokként - tumorsepcifikus markerekhez, ezáltal alkalmasak a tumorsejtek szelektív módon történő elpusztítására.

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldás lényegét.

A találmány szerinti megoldás, legalább egyrészt, humán EpCAM-proteinhez specifikus módon kötődő, de embernek beadva a templát, egéreredetű anti-EpCAM-ellenanyagoknál kevésbé immunogén rekombináns ellenanyagok azonosításán alapul. Közelebbről, a találmány tárgyát képezik rekombináns KS-ellenanyagok, amelyekben az ellenanyag egy vagy több keretrégiójának és/vagy komplementeritást meghatározó régiójának aminosav-szekvenciája módosítva lett, ezáltal azok immunogenitása emberben csökkent.

A leírás szerinti értelemben az „ellenanyag” és „immunglobulin” kifejezéseket: (i) intakt ellenanyagokra (például monoklonális ellenanyagokra vagy poliklonális ellenanyagokra); (ii) azok antigénkötő fragmentumaira, például azok Fab-fragmentumára, Fab’-fragmentumára, (Fab’h-fragmentumára, Fv-fragmentumára, egyszálú ellenanyag kötőhelyekre, sFv-fragmentumokra; (iii) bispecifikus ellenanyagokra és azok antigénkötő fragmentumaira; valamint (iv) multispecifikus ellenanyagokra és azok antigénkötő fragmentumaira vonatkoztatva használjuk.

A „specifikus módon kötődik”, specifikus módon köt” és specifikus kötődés” kifejezéseken azt értjük, hogy az ellenanyag adott antigénnél szemben mutatott kötoaffinitasa lega-

- 3 lább körülbelül 10⁶ mol/1, előnyösebben legalább körülbelül 10⁷ mol/1, előnyösebben legalább körülbelül 10⁸ mol/1, és legelőnyösebben legalább körülbelül 1O¹⁰ mol/1.

A leírás szerinti értelemben „komplementeritást meghatározó régiókon” és „CDR”-eken immunglobulin variábilis régiójának az antigénnel elsődlegesen kölcsönhatásba lépő hipervariábilis régióit vagy hurokrégióit értjük. Az immunglobulin nehézlánc variábilis régió (VH) és immunglobulin könnyűlánc variábilis régió (VL) egyaránt három CDR-t tartalmaz keretrégiók közé beillesztve (lásd 1. ábra). Például, a KS-l/4-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc variábilis régiójának megfelelő aminosav-szekvenciában (lásd 1. aminosav-szekvencia) a CDR-régiókat a Ser24-Leu33 (CDR1), Asp49-Ser55 (CDR2) és His88-Thr96 (CDR3) aminosav-szekvenciák határozzák meg. A KS-l/4-ellenanyag immunglobulin nehézlánc variábilis régiójának megfelelő aminosav-szekvenciában (lásd 2. aminosav-szekvencia) a CDR-régiókat a Gly26-Asn35 (CDR1), Trp50-Gly66 (CDR2) és Phe99-Tyrl05 (CDR3) aminosav-szekvenciák határozzák meg. A leírásban említett egyéb ellenanyagok CDR-régióit az l.A-l.C ábrákon mutatjuk be megfelelő KS-1/4 nehéz- és könnyűlánc szekvenciákhoz rendezve.

Keretrégióknak” és FR”-régióknak az immunglobulin variábilis régiójának a komplementeritást meghatározó régiókkal szomszédos régióit nevezzük. Az immunglobulin nehézlánc variábilis régió (Vh) és immunglobulin könnyűlánc variábilis régió (V_L) egyaránt négynégy FR-régiót tartalmaz, az 1. ábra szerinti elrendezésben. Például, a KS-l/4-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc variábilis régiójának megfelelő aminosav-szekvenciában (lásd 1. azonosítószámú szekvencia) az FR-régiókat a Glnl-Cys23 (FR1), Trp34-Phe48 (FR2), Gly56-Cys87 (FR3) és Phe97-Lysl06 (FR4) aminosav-szekvenciák határozzák meg. A KS1/4-eIlenanyag immunglobulin nehézlánc variábilis régiójának megfelelő aminosav-szekvenciában (lásd 2. azonosítószámú szekvencia) az FR-régiókat a Glnl-Ser23 (FR1), Trp36-Gly49 (FR2), Arg67-Arg98 (FR3) és Trpl06-Serl 16 (FR4) aminosav-szekvenciák határozzák meg. A leírásban ismertetett egyéb ellenanyagok FR-régióit az 1 .A-l .C ábrákon mutatjuk be a megfelelő KS-1/4 nehéz- és könnyűlánc szekvenciákhoz rendezve.

„KS-ellenanyagon” olyan ellenanyagot értünk, amely specifikus módon ugyanahhoz a humán EpCAM-antigénhez kötődik, mint a hibridóma által expresszált, egéreredetű KS-1/4 ellenanyag [lásd például Cancer Res. 44(2), 681 (1984)]. A KS-ellenanyag előnyösen: (i) immunglobulin könnyűlánc CDR1-szekvencia legalább egy részét meghatározó szekvenciaként SASSSVSY aminosav-szekvenciát (az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 24-31. Aminosavakat); (ii) immunglobulin könnyűlánc CDR2-szekvencia legalább egy részét meghatározó szekvenciaként DTSNLAS aminosav-szekvenciát (az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti

- 4 49-55. aminosavakat); (iii) immunglobulin könnyűlánc CDR3-szekvencia legalább egy részét meghatározó szekvenciaként HQRSGYPYT aminosav-szekvenciát (az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 88-96. aminosavakat); (iv) immunglobulin nehézlánc CDR1-szekvencia legalább egy részét meghatározó szekvenciaként GYTFTNYGMN aminosav-szekvenciát (a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 26-35. aminosavakat); (v) immunglobulin nehézlánc CDR2-szekvencia legalább egy részét meghatározó szekvenciaként WINTYTGEPTYAD aminosav-szekvenciát (a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 50-62. aminosavakat); vagy (vi) immunglobulin nehézlánc CDR3-szekvencia legalább egy részét meghatározó szekvenciaként SKGDY aminosav-szekvenciát (a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 101-105. aminosavakat) tartalmaz; vagy a felsoroltak bármilyen kombinációját tartalmazza.

A találmány egy szempontja szerint, a találmány tárgyát EpCAM-hoz specifikus módon kötődő rekombináns ellenanyag képezi, ahol az ellenanyag immunglobulin V_L-domén keretrégióját meghatározó részt magában foglaló aminosav-szekvenciát tartalmaz. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a keretrégiót (FR1) az 5. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-23. aminosavak határozzák meg, ahol Xaal jelentése Q vagy E; Xaa3 jelentése L vagy V; XaalO jelentése I vagy T; Xaall jelentése M vagy L; Xaal3 jelentése A vagy L; Xaal8 jelentése K vagy R; Xaa21 jelentése M vagy L; azzal a megkötéssel, hogy az Xaal, Xaa3, XaalO, Xaall, Xaal3, Xaal8 vagy Xaa21 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos az 1. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosavval. Az egyes pozíciókban található aminosavakat azok szakirodalomban elfogadott egybetűs kódjával adtuk meg.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a keretrégiót (FR2) az 5. azonosítószámú szekvencia szerinti 34-48. aminosavak határozzák meg, ahol Xaa41 jelentése S vagy Q; Xaa42 jelentése S vagy A; Xaa45 jelentése P vagy L; Xaa46 jelentése W vagy L, azzal a megkötéssel, hogy az Xaa41, Xaa42, Xaa45 vagy Xaa46 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos az 1. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosawal.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a keretrégiót (FR3) az 5. azonosítószámú szekvencia szerinti 56-87. aminosavak határozzák meg, ahol Xaa57 jelentése F vagy I; Xaa69 jelentése S vagy D; Xaa71 jelentése S vagy T; Xaa73 jelentése I vagy T; Xaa77 jelentése M vagy L; Xaa79 jelentése A vagy P; Xaa82 jelentése A vagy F; és Xaa84 jelentése T vagy V; azzal a megkötéssel, hogy az Xaa57, Xaa69, Xaa71, Xaa73, Xaa77,

- 5 Xaa79, Xaa82 vagy Xaa84 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos az 1. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosawaL

A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát EpCAM-hoz specifikus módon kötődő rekombináns ellenanyag képezi, amely immunglobulin V_L-domén keretrégiót meghatározó részt magában foglaló aminosav-szekvenciát tartalmaz. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a keretrégiót (FR1) a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-25. aminosavak határozzák meg, ahol Xaa2 jelentése I vagy V; Xaa9 jelentése P vagy A; Xaall jelentése L vagy V; és Xaal7 jelentése T vagy S; azzal a megkötéssel, hogy az Xaa2, Xaa9, Xaal 1, vagy Xaal7 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos a 2. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosavval.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a keretrégiót (FR2) a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 36-49. aminosavak határozzák meg, ahol Xaa38 jelentése K vagy R; Xaa40 jelentése T vagy A; és Xaa46 jelentése K vagy E; azzal a megkötéssel, hogy az Xaa38, Xaa40, Xaa46 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos a 2. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosavval.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a keretrégiót (FR3) a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 67-98. aminosavak határozzák meg, ahol Xaa68 jelentése F vagy V; Xaa69 jelentése A vagy T; és Xaa70 jelentése F vagy I; Xaa73 jelentése E vagy D; Xaa76 jelentése A vagy T; Xaa80 jelentése F vagy Y; Xaa83 jelentése I vagy L; Xaa84 jelentése N vagy S; Xaa85 jelentése N vagy S, Xaa88 jelentése N, A vagy S; Xaa91 jelentése M vagy T; és Xaa93 jelentése T vagy V; azzal a megkötéssel, hogy az Xaa68, Xaa69, Xaa70, Xaa73, Xaa76, Xaa80, Xaa83, Xaa84, Xaa85, Xaa88, Xaa91 vagy Xaa93 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos a 2. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosavval.

A találmány egy még további előnyös megvalósítási módja szerint, a keretrégiót (FR4) a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 106-116. aminosavak határozzák meg, ahol Xaal 08 jelentése Q vagy T.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, az immunglobulin VLdomén: (i) a 9. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-23. aminosavak; vagy (ii) a 8. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-23. aminosavak által meghatározott FR1-szekvenciát tartalmaz. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, az immunglobulin Vn-doménok a 18. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-25. aminosavak, és/vagy a 18. Azonosítószámú szekvencia szerinti 67-98. aminosavak által meghatározott FR-szekvenciát tartalmaznak.

• · · · · · · :.:. .· :.:. t .· • ··*· · ··· *

- 6 Előnyösebben, a V_L-domén a 9. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-106. aminosavak által meghatározott aminosav-szekvenciát tartalmaz, és/vagy a Vn-domén a 18. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-116. aminosavak által meghatározott aminosav-szekvenciát tartalmaz.

Az említetteken felül, adott esetben, az ellenanyag CDR-szekvencia legalább egy részét meghatározó szekvenciaként például: (i) az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 24-31. aminosavakat; (ii) az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 49-55. aminosavakat; és/vagy (iii) az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 88-96. aminosavakat magában foglaló aminosav-szekvenciát is tartalmazhat. Hasonlóképp, adott esetben, az ellenanyag CDR-szekvencia legalább egy részét meghatározó szekvenciaként például: (i) a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 26-35. aminosavakat; (ii) a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 50-62. aminosavakat; és/vagy (iii) a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 101-105. aminosavakat magában foglaló aminosav-szekvenciát is tartalmazhat.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, az ellenanyag [ellenanyag-citokin] fúziós protein antigént célzó részét tartalmazza. A citokin előnyösen interleukin, előnyösebben interleukin-2.

A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát a találmány szerinti ellenanyag legalább egy részét kódoló expressziós vektor képezi. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az expressziós vektor a 40. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotid-szekvenciát tartalmaz.

A találmány egy még további szempontja szerint, a találmány tárgyát eljárás képezi EpCAM hiperexpressziójával kapcsolatos betegségben (például olyan betegségekben, ahol az EpCAM nagyobb mennyiségben van jelen a beteg szövetekben, mint a nem-beteg szövetekben) szenvedő humán betegeknél a diagnózis felállítására, a betegség kimenetelének prognosztizálására és/vagy annak kezelésére. A fenti eljárás szerint, a találmány szerinti ellenanyagok egyikét adjuk be olyan egyénnek, akinél ilyen betegség diagnózisát kívánjuk felállítani, prognózisát kívánjuk megállapítani, vagy aki ilyen betegség miatt kezelésre szorul.

Az ellenanyag, adott esetben, diagnosztikus és/vagy terápiás egységet is tartalmaz az ellenanyaghoz kapcsoltan. Ez az egység az ellenanyaggal lehet fozionáltatva, miáltal íuziós proteint kapunk. További lehetőség szerint, az ilyen egység kémiai úton van az ellenanyaghoz kapcsolva, miáltal immunkonjugátumot kapunk. Az említett egység lehet toxin, radioaktívan jelölt citokin, leképező ágens vagy hasonló. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyag fúziós proteinként citokinnel van fuzionáltatva. Előnyösen, ilyen citokinek lehetnek interleukinek, például interleukin-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6,

- 7 IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 vagy IL-18; hemopoetikus faktorok, például granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor (GM-CSF), granulocita kolóniastimuláló faktor (G-CSF); eritropoetin; tumomekrózis faktor (TNF), például TNFa; limfokin, például limfotoxin; anyagcsere-folyamatok szabályozói, például leptin; interferon, például interferon a, interferon β és interferon γ; valamint kemokinek. Előnyösen, az ellenanyag-citokin fúziós protein a citokinre jellemző biológiai aktivitással is rendelkezik.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1 .A, 1 .B és 1 .C ábrákon KS-ellenanyagok nehéz- és könnyűláncának variábilis régióit és konszenzus szekvenciáit rendeztük egymás mellé páronkénti összerendezéssel. Az immunglobulin keretrégiókat (FR1-FR4) ’’-’’jellel jelöltük. Az immunglobulinok komplementeritást meghatározó régióit (CDR1-CDR3) ”*”-val jelöltük. A KS-ellenanyagok könnyűlánc Vrégió szegmenseit ”VK”-szegmenseknek neveztük, ahol K arra a tényre utal, hogy a könnyűlánc kappa-lánc. Az egyes KS-ellenanyag nehézlánc V-régió szegmenseket ”VH”-szegmenseknek neveztük. A szubsztituálható aminosavakat ”X”-vel jelöltük a konszenzus szekvenciákban.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

A találmány tárgyát humán epitelsejt adhéziós molekulához (EpCAM) specifikus módon kötődő rekombináns ellenanyagok képezik. Előnyösen, a találmány szerinti ellenanyagok módosított variábilis régiót tartalmaznak, miáltal azok immunogenitása emberben csökken.

A találmány szerinti ellenanyag variábilis régiók különösen alkalmasak arra, hogy ellenanyagokat és ellenanyag fúziós proteineket célzottan EpCAM-proteint hiperexpresszáló tumorsejtekhez juttassunk el humán betegekben. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat citokinnel fuzionáltatjuk, miáltal immun-citokint kapunk.

A találmány szerinti proteinszekvenciák

A találmány tárgyát ellenanyag variábilis régió vagy V-régió szekvenciák képezik, amelynek tagjai - megfelelő módon heterodimerizálva - humán epitelsejt adhéziós molekulához (EpCAM), más néven KS-antigénhez vagy KSA-hoz kötődnek. A találmány szerinti proteinek, a leírásban ismertetettek szerint, alkalmasak humán betegek kezelésére. Ennek megfelelően, előnyös KS-ellenanyag-variánsokat humanizálunk, dezimmunizálunk, vagy mindkét fenti megoldást alkalmazzuk annak érdekében, hogy a beadott ellenanyagok immunogenitását emberben csökkentsük. A találmány szerinti megoldással összhangban, egéreredetű KS-ellenanyagokat dezimmunizálhatunk vagy humanizálhatunk például olyan dezimmunizáló eljárá- 8 sokkal, amelyekben a potenciális T-sejt-epitópokat kiküszöböljük vagy gyengítjük a pepiid epitóp MHCII-antigén-molekulákhoz történő kötődését csökkentő mutációk beiktatásával (lásd például WO 98/52 976 és WO 00/34 317 számú nemzetközi közzétételi iratokat); vagy olyan eljárásokkal, amelyekben nem-humán T-sejt-epitópokban hozunk létre mutációkat úgy, hogy azok megfeleljenek a humán ellenanyagokban jelenlévő saját epitópoknak (lásd például 5 712 120 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).

I. Variábilis könnyűlánc szekvencia

A rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a következő aminosav-szekvenciájú immunglobulin variábilis könnyűlánc-szekvenciát tartalmaz:

X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C-S-A-S-S-S-V-S-T-X-L-W-YX-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-X-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-XI-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C-H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-X-E-I-K (3. azonosítószámú szekvencia).

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAMellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR1-régióként a 3. azonosítószámú szekvencia 1-23. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, nevezetesen X-I-X-L-T-Q-S-P-A-XX-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR1-régióban: Q vagy E az Xaal-pozícióban; L vagy V az Xaa3-pozícióban; I, T vagy S az XaalO-pozícióban; M vagy L az Xaal 1-pozícióban; S vagy A az Xaal2-pozícióban; A, L vagy V az Xaal3-pozícióban; E vagy Q az Xaal7-pozícióban; K vagy R az Xaal 8-pozícióban; V vagy A az Xaal 9pozícióban; és M, L vagy I az Xaa21-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét tartalmazza az FR1régióban: E az Xaal-pozícióban; V az Xaa3-pozícióban; T vagy S az XaalO-pozícióban; L az Xaal 1-pozícióban; A az Xaal2-pozícióban; L vagy V az Xaal 3-pozícióban; Q az Xaal7-pozícióban; R az Xaal 8-pozícióban; A az Xaal9-pozícióban; vagy L vagy I az Xaa21-pozícióban.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc CDR1-szekvenciaként a 3. azonosítószámú szekvencia 24-33. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, nevezetesen S-A-SS-S-V-S-T-X-L szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza a CDR1-régióban: M vagy I az Xaa32.:λ ^:·;· ;*

- 9 pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag aminosav-szubsztitúciót hordoz a CDR1-régióban, például I aminosavat hordoz az Xaa32-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR2-szekvenciaként a 3. azonosítószámú szekvencia 34-48. aminosavpozícióinak megfelelő szekvenciát, nevezetesen W-Y-X-Q-K-P-G-X-X-P-KX-X-I-X aminosav-szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR2-régióban: Q vagy L az Xaa36-pozícióban; S vagy Q az Xaa41-pozícióban; S, A vagy P az Xaa42-pozícióban; P vagy L az Xaa45- pozícióban; W vagy L az Xaa46 pozícióban; vagy F vagy Y az Xaa48-pozícióban. Még előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét tartalmazza az FR2-régióban: L az Xaa36-pozícióban; Q az Xaa41pozícióban; A vagy P az Xaa42-pozícióban; L az Xaa45-pozícióban; L az Xaa46-pozícióban, vagy Y az Xaa48-pozícióban.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR3-szekvenciaként a 3. azonosítószámú szekvencia 56-87. aminosavpozícióinak megfelelő szekvenciát, nevezetesen G-X-P-X-R-F-SG-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C aminosav-szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR3-régióban: F vagy I az Xaa57-pozícióban; A vagy S az Xaa59-pozícióban; S, D vagy T az Xaa69-pozícióban; I vagy T az Xaa71-pozícióban; I vagy T az Xaa73-pozícióban; S vagy N az Xaa75-pozícióban; M vagy L az Xaa77-pozícióban; A vagy P az Xaa79-pozícióban; A vagy F az Xaa82-pozícióban; és T vagy V az Xaa84-pozícióban. Még előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét tartalmazza az FR3-régióban: I az Xaa57-pozícióban; S az Xaa59-pozícióban; D vagy T az Xaa69-pozícióban; T az Xaa71-pozícióban; T az Xaa73-pozícióban; N az Xaa75-pozícióban; L az Xaa77-pozícióban; P az Xaa79-pozícióban; F az Xaa82-pozícióban; vagy V az Xaa84-pozícióban.

A találmány egy még további előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR4-szekvenciaként a 3. azonosítószámú szekvencia 97-106. aminosavpozícióinak megfelelő szekvenciát, nevezetesen F-G-G-G-T-KX-E-I-K aminosav-szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR4-régióban: L vagy V az Xaal03-pozícióban. A fentiek szerint, a találmány szerinti rekombináns anti-EpCAM-el^:·:· .:1. ^:·:· .:.

- 10 lenanyag aminosav-szubsztitúciót hordoz az FR4-régióban, például V aminosavat hordoz az Xaal 03-pozícióban.

II. Variábilis nehézlánc szekvencia

A rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin variábilis nehézlánc szekvenciaként a következő aminosav-szekvenciát tartalmaz:

Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-I-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-NW-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G-W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A—D-X-F-X-G-R-X-X-XX—χ.χ-Τ-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-X-S-K-G-D-Y-WG-X-G-T-X-V-T-V-S-S (4. azonosítószámú szekvencia).

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FRl-régióként a 4. azonosítószámú szekvencia 1-25. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, nevezetesen Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-XK-K-P-G-X-X-V-K-I-S-C-K-A-S szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR1-régióban: I vagy V az Xaa2-pozícióban; P vagy A az Xaa9-pozícióban, L vagy V az Xaal 1-pozícióban; E vagy S az Xaaló-pozícióban; és T vagy S az Xaal7-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag az alábbi aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR1-régióban: V az Xaa2-pozícióban; A az Xaa9-pozícióban; V az Xaal 1-pozícióban; S az Xaaló-pozícióban; vagy S az Xaal7-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR2-régióként a 4. azonosítószámú szekvencia 36-49. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciat, neveztesen 3V-V-X-Q-X-P-G-X-G-LX-W-M-G szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR2-régióban: K vagy R az Xaa38-pozícióban; T vagy A az Xaa40-pozícióban; K vagy Q az Xaa43-pozícióban; és K vagy E az Xaa46-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag az alábbi aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR2-régióban: R az Xaa38-pozícióban, A az Xaa40-pozícióban; Q az Xaa43-pozícióban; vagy E az Xaa46-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc CDR2-régióként a 4. azonosítószámú szekvencia 50-66. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciat, neveztesen W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-YA__D-X-F-X-G szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag ··♦· 9 ···· » · • ···· * »·· · a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza a CDR2-régióban: D vagy K az Xaa63pozícióban; és K vagy Q az Xaa65-pozícióban.

Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag az alábbi aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza a CDR2-régióban: K az Xaa63-pozícióban; és Q az Xaa65-pozícióban.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR3-régióként a 4. azonosítószámú szekvencia 67-98. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, neveztesen R-X-X-X-X-X-XT-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR3-régióban: F vagy V az Xaa68-pozícióban; A, T vagy V az Xaa69-pozícióban; F vagy I az Xaa70-pozícióban; S vagy T az Xaa71-pozícióban; L vagy A az Xaa72-pozícióban; E vagy D az Xaa73-pozícióban; A vagy T az Xaa76-pozícióban; A vagy L az Xaa79pozícióban; F vagy Y az Xaa80-pozícióban; I vagy L az Xaa83-pozícióban; N vagy S az Xaa84-pozícióban; N vagy S az Xaa85-pozícióban; N, A vagy S az Xaa88-pozícióban; M vagy T az Xaa91-pozícióban; és T vagy V az Xaa93-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag az alábbi aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR3-régióban: V az Xaa68-pozícióban; T vagy V az Xaa69-pozícióban; I az Xaa70-pozícióban; T az Xaa71-pozícióban; A az Xaa72-pozícióban; D az Xaa73-pozícióban; T az Xaa76pozícióban; L az Xaa79-pozícióban; Y az Xaa80-pozícióban; L az Xaa83-pozícióban; S az Xaa84-pozícióban; S az Xaa8 5-pozícióban; A vagy S az Xaa8 8-pozícióban; T az Xaa91-pozícióban; és/vagy V az Xaa93-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc CDR3-régióként a 4. azonosítószámú szekvencia 99-105. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, neveztesen F-X-S-K-G-D-Y szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza a CDR3-régióban: I vagy M az XaalOO-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag aminosav-szubsztitúciót hordoz a CDR3-régióban, például M aminosavat tartalmaz az XaalOO-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR4-régióként a 4. azonosítószámú szekvencia 106-116. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, neveztesen W-G-X-G-T-X-V-T-V-SS szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt ami.· :.:. j .* nosavak legalább egyikét tartalmazza az FR4-régióban: Q vagy T az Xaal08-pozícióban; és S vagy T az Xaal 11-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR4-régióban: T az Xaal08-pozícióban; és/vagy T az Xaal 11-pozícióban.

III. Tökéletesített variábilis könnyűlánc

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a következő aminosav-szekvenciájú immunglobulin variábilis könnyűlánc szekvenciát tartalmaz:

X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C-S-A-S-S-S-V-S-Y-M-L-W-YQ-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-F-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-XI-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C-H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-L-E-I-K (5. azonosítószámú szekvencia).

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR1-régióként az 5. azonosítószámú szekvencia 1-23. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, nevezetesen X-I-X-L-T-Q-S-P-A-XX-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR1-régióban: Q vagy E az Xaal-pozícióban; L vagy V az Xaa3-pozícióban; I vagy T az XaalO-pozícióban; M vagy L az Xaal 1-pozícióban; A vagy L az Xaal 3-pozícióban; K vagy R az Xaal8-pozícióban; és M vagy L az Xaa21-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR1-régióban: E az Xaal-pozícióban; V az Xaa3-pozícióban; T az XaalO-pozícióban; L az Xaal 1-pozícióban; L az Xaal3-pozícióban; R az Xaal8-pozícióban; és/vagy L az Xaa21-pozícióban.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR1-régió aminosav-szekvenciája a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR1-régióban: Q vagy E az Xaal-pozícióban; A vagy L az Xaal 1-pozícióban; és/vagy M vagy L az Xaa21-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR1-régiót meghatározó aminosav-szekvenciája a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FRl-régióban: E az Xaal-pozícióban; L az Xaal 1-pozícióban; és/vagy L az Xaa21-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR2-régióként az 5. azonosítószámú szekvencia 34-48.

« · » · · · · ··:·.:.. *·:· .:. ?

- 13 aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, nevezetesen W-Y-Q-Q-K-P-G-X-XP-K-X-X-I-F szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR2-régióban: S vagy Q az Xaa41-pozícióban; S vagy A az Xaa42-pozícióban; P vagy L az Xaa45-pozícióban; és/vagy W vagy L az Xaa46-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR2-régióban: Q az Xaa41-pozícióban; A az Xaa42-pozícióban; L az Xaa45-pozícióban; és/vagy L az Xaa46-pozícióban.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR2-régiót meghatározó aminosav-szekvenciája a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR2-régióban: S vagy A az Xaa42-pozícióban; P vagy L az Xaa45-pozícióban; és/vagy W vagy L az Xaa46-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR2-régiót meghatározó aminosav-szekvenciája a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR2-régióban: A az Xaa42-pozícióban; L az Xaa45-pozícióban; és/vagy L az Xaa46-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR3-régióként az 5. azonosítószámú szekvencia 56-87. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, nevezetesen G-X-P-A-R-F-S-G-S-GS-G-T-X-Y-X-L-X-I-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR3-régióban: F vagy I az Xaa57-pozícióban; S vagy D az Xaa69-pozícióban; S vagy T az Xaa71-pozícióban; I vagy T az Xaa73-pozícióban; M vagy L az Xaa77-pozícióban; A vagy P az Xaa79-pozícióban; A vagy F az Xaa82-pozícióban; és/vagy T vagy V az Xaa84-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR3-régióban: I az Xaa57-pozícióban; D az Xaa69-pozícióban; T az Xaa71-pozícióban; T az Xaa73-pozícióban; L az Xaa77-pozícióban; P az Xaa79pozícióban; F az Xaa82-pozícióban; és/vagy V az Xaa84-pozícióban.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR3-régiót meghatározó aminosav-szekvenciája a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR3-régióban: F vagy I az Xaa57-pozícióban; S vagy D az Xaa69-pozícióban; A vagy P az Xaa79-pozícióban; A vagy F az Xaa82-pozícióban; és/vagy T vagy V az Xaa84-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin könnyűlánc FR3-régiót meghatározó aminosav···· 9 ···· ί · « ··*« · »·· *

- 14 szekvenciája a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR3-régióban: I az Xaa57-pozícióban; D az Xaa69-pozícióban; P az Xaa79-pozícióban; F az Xaa82-pozícióban; és/vagy V az Xaa84-pozícióban.

IV. Tökéletesített variábilis nehézlánc szekvencia

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a következő aminosav-szekvenciájú immunglobulin variábilis nehézlánc szekvenciát tartalmaz:

Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-I-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-NW-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G-W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A—D-X-F-X-G-R-X-X-XS—L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-I-S-K-G-D-Y-W-GQ-G-T-S-V-T-V-S-S (6. azonosítószámú szekvencia).

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR1-régióként a 6. azonosítószámú szekvencia 1-25. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, neveztesen Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-KK-P-G-E-X-V-K-I-S-C-K-A-S szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR1-régióban: I vagy V az Xaa2-pozícióban; P vagy A az Xaa9-pozícióban, L vagy V az Xaall-pozícióban; és/vagy T vagy S az Xaal7-pozícióban. Ennek megfelelően, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag az alábbi aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR1-régióban: V az Xaa2-pozícióban; A az Xaa9-pozícióban; V az Xaall-pozícióban; és/vagy S az Xaal7-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR1-régiót meghatározó szekvenciaként a felsorolt aminosavak legalább egyikét magában foglaló aminosav-szekvenciát tartalmaz: I vagy V az Xaa2-pozícióban; P vagy A az Xaa9-pozícióban; és/vagy L vagy V az Xaal 1-pozícióban. Ennek megfelelően, a találmány szerinti rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR1-régiót meghatározó aminosav-szekvenciája a felsorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR1-régióban: V az Xaa2-pozícióban; A az Xaa9-pozícióban; és/vagy V az Xaall-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR2-régióként a 6. azonosítószámú szekvencia 36-49. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, neveztesen W-V-X-Q-X-P-G-K-G-LX-W-M-G szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a fel

- 15 sorolt aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét tartalmazza az FR2-régióban: K vagy R az Xaa38-pozícióban; T vagy A az Xaa40-pozícióban; és/vagy K vagy E az Xaa46-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag az alábbi aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR2-régióban: R az Xaa38-pozícióban; A az Xaa40-pozícióban; és/vagy E az Xaa46-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR2-régióként például a következő aminosav-szubsztitúciót magában foglaló aminosav-szekvenciát tartalmaz: K vagy E az Xaa46-pozícióban. Előnyösebben, a találmány szerinti rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR2-régiót meghatározó aminosav-szekvenciaként az FR2-régióban aminosav-szubsztitúciót, például az alábbi aminosav-szubsztitúciót hordozó aminosav-szekvenciát tartalmaz: E az Xaa46-pozícióban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc CDR2-régióként a 6. azonosítószámú szekvencia 50-66. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, neveztesen W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-YA—D-X-F-X-G szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza a CDR2-régióban: D vagy K az Xaa63pozícióban; és/vagy K vagy Q az Xaa65-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag az alábbi aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza a CDR2régióban: K az Xaa63-pozícióban; és/vagy Q az Xaa65-pozícióban.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR3-régióként a 6. azonosítószámú szekvencia 67-98. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, neveztesen R-X-X-X-S-L-XT-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag a felsorolt aminosavak legalább egyikét tartalmazza az FR3-régióban: F vagy V az Xaa68-pozícióban; A, T az Xaa69-pozícióban; F vagy I az Xaa70-pozícióban; E vagy D az Xaa73-pozícióban; A vagy T az Xaa76-pozícióban; F vagy Y az Xaa80-pozícióban; I vagy L az Xaa83-pozícióban; N vagy S az Xaa84-pozícióban; N vagy S az Xaa8 5-pozícióban; N, A vagy S az Xaa88-pozícióban; M vagy T az Xaa91pozícióban; és/vagy T vagy V az Xaa93-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag az alábbi aminosav-szubsztitúciók legalább egyikét hordozza az FR3-régióban: V az Xaa68-pozícióban; T az Xaa69-pozícióban; I az Xaa70-pozícióban; D az Xaa73pozícióban; T az Xaa76-pozícióban; Y az Xaa80-pozícióban; L az Xaa83-pozícióban; S az • · · · · · ··:· ·*:* z* 5

- 16 Xaa84-pozícióban; S az Xaa8 5-pozícióban; A vagy S az Xaa8 8-pozícióban; T az Xaa91-pozícióban; és V az Xaa93-pozícióban.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns antiEpCAM-ellenanyag immunglobulin nehézlánc FR4-régióként a 6. azonosítoszamu szekvencia 106-116. aminosavpozícióinak megfelelő aminosav-szekvenciát, neveztesen W-G-X-G-T-SV-T-V-S-S szekvenciát tartalmaz. Közelebbről, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag például az alábbi aminosavakat tartalmazza az FR4-régióban: Q vagy T az Xaal08-pozícióban. Előnyösebben, a rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag aminosav-szubsztitúciót hordoz az FR4-régióban: például T aminosavat hordoz az Xaal08-pozícióban.

Ennek megfelelően, az előnyös V-régiók szubsztitúciót hordoznak az egéreredetű KS1/4-ellenanyag variábilis régióinak megfelelő Vh^- és VK-régiók FR4-doménjában. Ezen felül, a találmány szerinti V-régiók nem tartalmaznak aminosav-inszerciót vagy -deléciót az egéreredetű KS-1/4-ellenanyag variábilis régióihoz képest.

Előnyös variánsok például az egéreredetű KS-1/4-ellenanyag variábilis régióival több, mint 80% azonosságot/homológiát mutató variábilis régiókat tartalmazó proteinek. Az egéreredetű KS-l/4-ellenanyag variábilis régiójának szekvenciája vagy annak része referenciaszekvenciaként szolgálhat annak meghatározására, hogy adott szekvencia elegendő szekvencia-hasonlóságot mutat-e a referencia-szekvenciával ahhoz, hogy ésszerű elvárás szerint sikeresen alkalmazható legyen a találmány szerinti eljárásokban. Előnyösen, a variáns szekvenciák legalább 70% hasonlóságot vagy 60% azonosságot, előnyösebben legalább 75% hasonlóságot vagy 65% azonosságot, legelőnyösebben 80% hasonlóságot vagy 70% azonosságot mutatnak az egéreredetü KS-ellenanyag variábilis nehéz- vagy könnyűlánc FR- vagy CDR-régiójával.

Annak megállapításához, hogy adott szekvencia a megfelelő szintű százalékos hasonlóságot vagy azonosságot mutatja-e az egéreredetű KS-szekvenciákkal, először a jelölt aminosav-szekvenciát és az egéreredetű KS-szekvenciát a Smith és Waterman által leírt dinamikus algoritmus [J. Mól. Bioi. 147, 195 (1981)] és a Heinkoff és Heinkoff által leírt BLOSUM62 helyettesítési mátrix [PNAS 89, 10 915 (1992)] kombinációjának alkalmazásával összerendezzük. A találmány szerinti megoldással összhangban, új hézag beszúrásakor -12 büntetőpontot, meglévő hézag növelésekor -4 büntetőpontot alkalmazunk. Az összerendezést a Smith-Waterman algoritmus és a BLOSUM62-mátrix alkalmazásával végző számítógépes programok, például a GCG-programok (Oxford Molecular Group, Oxford, Anglia) kereskedelemben hozzáférhetőek, és szakemberek által széles körben alkalmazottak. Miután a jelölt szekvencia és referencia-szekvencia összerendezését elvégeztük, százalékos hasonlósági pont< * · · * · * •’S' .2., ·’!· d. t

- 17 számot számolhatunk. Az egyes szekvenciákban előforduló aminosavakat, egymás után, hasonlóságuk figyelembevételével összehasonlítjuk. Amennyiben BLOSUM62-mátrixban kapott érték a két összerendezett aminosavra nézve nulla vagy negatív érték, a párra vonatkozó hasonlósági pontszám nulla; más esetben, a páronként! hasonlósági érték 1,0. A nyers hasonlósági pontszám az összerendezett aminosavak páronként! hasonlósági pontszámainak összege. Ezután, a nyers hasonlósági pontszámot oly módon normalizáljuk, hogy azt ajelölt vagy referencia-szekvencia közül a kisebbikben előforduló aminosavak számával osztjuk. A normalizált nyers pontszám felel meg a hasonlósági százalékértéknek. A százalékos azonosság megállapításánál szintén úgy járunk el, hogy az egyes szekvenciákban előforduló összerendezett aminosavakat összehasonlítjuk. Amennyiben az aminosavak nem egyeznek meg, a párra vonatkozó azonossági pontszám nulla; egyébként, az azonossági pontszám az adott párra 1,0. Ezután, a nyers azonossági pontszámot oly módon normalizáljuk, hogy azt a jelölt vagy referencia-szekvencia közül a kisebbikben előforduló aminosavak számával osztjuk. A normalizált nyers pontszám felel meg az azonossági százalékértéknek. A hasonlósági és azonossági százalékérték kiszámításánál az inszerciókat és deléciókat figyelmen kívül hagyjuk. Ennek megfelelően, ennél a számítási módnál, hézag beszúrásakor nem alkalmazunk büntetőpontokat, bár azokat számításba vesszük az eredeti összerendezésnél.

Szintén a találmány tárgyát képezik eljárások KS-ellenanyagok expressziójának vizsgálatára sejtekben, például emlős sejtekben, rovarsejtekben, növényi sejtekben, élesztősejtekben, vagy más eukariota vagy prokariota sejtekben (lásd 1. példa). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, KS-ellenanyag V-régiókat intakt humán ellenanyag részeként expresszáltatunk, és az ellenanyagok expresszióját eukariota sejtvonalakból a humán Fc-régió kimutatására alkalmas ELISA-eljárással teszteljük. A KS-ellenanyag és EpCAM közti kötődés kvantitatív meghatározására Biacore vizsgáló eljárást alkalmazhatunk.

Humán megbetegedések kezelése KS-ellenanyag fúziós proteinekkel

Ugyancsak a találmány tárgyát képezik [KS-ellenanyag - IL2] fúziós protein szekvenciák amelyek alkalmasak humán megbetegedések, például tumoros betegségek kezelésére. Bizonyos [KS-ellenanyag - IL2] fúziós proteinek, például a KS-1/4-IL2 (lásd például a 3. konstrukciót az 5. példában) alkalmazhatók tumoros elváltozásban szenvedő humán betegek kezelésére, akiknél előnyösen, meglepően alacsony szintű immunválasz alakul ki az ellenanyaggal szemben.

Azt találtuk, hogy humán tumorok KS-l/4(VH2/VKl)-IL2-ellenanyaggal történő kezelése során még kisebb fokú immunogenitás tapasztalható, mint KS-1/4(3. konstrukció)-IL-2'*·· .si. Η* J. t'

- 18 ellenanyaggal történő kezeléskor. Közelebbről, klinikai vizsgálatokban még kisebb gyakorisággal észleltünk anti-idiotípus ellenanyagokat, az ellenanyag-IL-2 kapcsolódási helyével szemben irányuló ellenanyagokat, vagy magával az IL2-egységgel szemben irányuló ellenanyagokat a betegekben, mint a KS-l/4(3. konstrukció)-IL-2-ellenanyaggal történő kezelés során. A találmány szerinti ellenanyag variábilis régiók más citokinekkel, például az alább felsoroltakkal is fuzionáltathatók: interleukin-1, -2, -6,-10 vagy -12; interferon-alfa és béta, TNF, vagy IFN-gamma. A találmány szerinti megoldás még világosabb lesz a csatolt példák alapján.

1. példa

Eljárások és reagensek KS-ellenanyagok expresszáltatására és azok antigénkötő aktivitásának tesztelésére l .A Sejttenyészetek és transzfekciós eljárás

A csatolt példákban ismertetett kísérletekben az alábbi szokásos technológiákat alkalmaztuk. Tranziens módon történő transzfekcióhoz, a plazmid-DNS kalcium-foszfáttal történő koprecipitációjával plazmid-DNS-t juttattunk humán „293” jelzésű vesesejtekbe [Sambrook és mtsai.: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, New York (1989)]. Stabil módon transzfektált kiónokat úgy kaptunk, hogy plazmid-DNS-t juttattunk elektroporációs eljárással az NS/0 jelzésű egér mielómasejtvonalba. Az NS/O-sejteket 10% totális borjúszérummal kiegészített Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben tenyésztettük. Körülbelül 5x10⁶ sejtet PBS-sel egyszer mostunk, és 0,5 ml foszfát-pufferes fiziológiás sóoldatban (PBS) szuszpendáltunk. Ezután, 10 percig, jégen, 10 pg linearizált plazmid-DNS-t inkubáltunk a sejtekkel “Gene Pulser Cuvette” küvettában (0,4 cm elektródtávolság BioRad). Elektroporációt “Gene Pulser” készülék (BioRad) alkalmazásával végeztünk 0,25V és 500 pF paraméterek beállítása mellett. A sejteket 10 percig, jégen hagytuk regenerálódni, majd tenyésztő tápközegben szuszpendáltuk, és 96-lyukú lemezekre oltottuk. Stabil módon transzfektált kolóniákat 100 nmol/1 metothrexát (MTX) jelenlétében történő növekedés alapján szelektáltunk, amelyet a transzfekciót követően két nappal adtunk a sejtekhez. A sejteket még két vagy három alkalommal, három napos időközönként friss tápközeggel láttuk el, és MTX-rezisztens kolóniák megjelenését figyeltük meg 2-3 héten belül. A kolóniák felülúszóit anti-humán-Fc-ELISA-elj árassal teszteltük az ellenanyagot magas szinten expresszáló kolóniák azonosítására [Gillies és mtsai.: J. Immunol. Methods 125, 191 (1989)]. Az ellenanyagot magas χ e

- 19 szinten expresszáló kolóniákat izoláltunk, es azokat 100 nmol/1 methotrexátot (MTX) tartalmazó tápközegben felszaporítottuk.

1:B ELISA-elj árások

Három különböző ELISA-eljárást alkalmaztunk a proteintermékek koncentrációjának meghatározására a MTX-rezisztens kolóniák felülúszójában és más mintákban. Anti-huFcELISA-t alkalmaztunk humán Fc-régiót tartalmazó proteinek, például kiméra ellenanyagok mennyiségének meghatározására. Az anti-hu-kappa-ELISA-t a kappa könnyulanc mennyisegének meghatározására alkalmaztuk (kiméra vagy humán immunglobulinokban). Az antimuFc-ELISA-eljárással a muFc-régiót tartalmazó proteinek mennyiségét határoztuk meg a tesztmintákban (lásd az 1 .C pontot az alábbiakban).

Az anti-huFc-ELISA-eljárást az alábbiakban részletesen is ismertetjük.

A. Lemezek bevonása

ELISA-lemezeket vontunk be Affmi-Pure-tisztított, kecskében termelt anti-humán-IgGvel (H+L) (Jackson Immuno Research), amelyet 5 pg/ml koncentrációban oldottunk PBS-ben, és lyukanként 100 μΐ mennyiségben mértünk a 96-lyukú lemezre (Nunc-Immuno lemez, Maxisorp). A bevont lemezeket lefedtük, és egy éjszakán át, 4°C-on inkubáltuk. Ezután, a lemezeket 0,05% Tween-detergenst (Tween-20) tartalmazó PBS-pufferrel négyszer mostuk, és lyukanként 200 μΐ térfogatú, l%BSA-t/l% kecskeszérumot tartalmazó PBS-sel blokkoltuk. Miután a lemezeket a blokkolópufferrel 2 órán át 37°C-on inkubáltuk, azokat 0,05% Tween-t tartalmazó PBS-sel négyszer mostuk, és papírtörölközőre kivertük.

B. Inkubálás tesztmintákkal és második ellenanyaggal

A tesztmintákat megfelelő koncentrációig olyan mintapufferben hígítottuk, amely 1% BSA-t, 1% kecskeszérumot és 0,05% Tween-t tartalmazott PBS-pufferben. Standard görbét vettünk fel ismert koncentrációjú kiméra ellenanyag (humán Fc-t tartalmazó ellenanyag) alkalmazásával. A standard görbe felvételéhez sorozathígítást készítettünk mintapufferben, hogy a 125 ng/ml-3,9 ng/ml koncentráció-tartományt átfedő standard görbét kapjunk. A hígított mintákat és standardokat lyukanként 100 μΐ térfogatban a lemezre mértük, és azt 2 órán át, 37°C-on inkubáltuk.

Az inkubációt követően, a lemezt 0,05% Tween-t tartalmazó PBS-sel nyolcszor mostuk. Ezután, a lyukakhoz 100 μΐ második ellenanyagot, tormaperoxidázzal (HRP-) konjugált antihumán-IgG-t (Jackson Immuno Research) adtunk, amelyet körülbelül 1:120 000 arányban hígítottunk a mintapufferben. A második ellenanyag pontos hígítását mindegyik HRP-konjugált

- 20 anti-humán-IgG esetében külön-külön meg kellett határoznunk. Miután a lemezeket 2 órán át, 37°C-on inkubáltuk, 0,05% Tween-t tartalmazó PBS-sel nyolcszor mostuk.

C. Előhívás

A szubsztrátoldatot 100 μΐ/lyuk mennyiségben adtuk a lemezhez. A szubsztrátoldatot úgy állítottuk elő, hogy 30 mg o-feniléndiamin-dihidroklorid (OPD)-t (1 tabletta) oldottunk 15 ml térfogatú, 0,03% frissen készített H₂O₂-t tartalmazó 0,025 mol/1 citromsav / 0,05 mol/1 Na₂HPO₄ összetételű pufferben (pH=5). A színreakciót 30 perc alatt, szobahőmérsékleten, sötétben hagytuk előhívódni. Az előhívási időt a bevont lemezek, a második ellenanyag, stb. tételről-tételre változó jellemzőinek megfelelően változtattuk. A standard görbe esetében jelentkező színreakciót figyeltük, és annak alapján állapítottuk meg, hogy mikor állítsuk le a reakciót. A reakciót lyukanként 100 μΐ 4 normál H₂SO₄ hozzáadásával állítottuk le. A lemezt 490 nm és 650 nm hullámhosszra beállított lemezolvasóval mértük le, amelyet úgy programoztunk, hogy a 650 nm hullámhosszon mért háttér OD-t levonja a 490-en mért OD-értékből.

Az anti-hu-kappa-ELISA-t a fentivel megegyező módon végeztük, azzal az eltéréssel, hogy második ellenanyagként tormaperoxidázzal konjugált, kecskében termelt anti-hu-kappa ellenanyagot alkalmaztunk (Southern Biotechnology Assoc. Inc., Birmingham, AL) 1:4000 hígításban.

Az anti-muFc-ELISA esetében hasonló módon jártunk el, azzal az eltéréssel, hogy az ELISA-lemezeket Affini-Pure-tisztított, kecskében termelt anti-egér-IgG-vel (H+L) (Jackson Immuno Research) vontuk be, amelyet 5 pg/ml koncentrációban oldottunk PBS-ben, és 100 μΐ/lyuk mennyiségben mértünk a lemezekre, és második ellenanyagként tormaperoxidázzal konjugált, kecskében termelt anti-muIgG Fcy-ellenanyagot alkalmaztunk (Jackson Immuno Research) 1:5000 hígításban.

l .C KS-antigén (KSA, EpCAM) klónozása, és a szolúbilis forma expresszáltatása [humán EpCAM-egér Fel-ellenanyagként

Hírvivő RNS-t (mRNS-t) LnCAP-sejtekből állítottunk elő „Dynabeads mRNS Direct Kit” (Dynal, Inc., Lake Success, NY) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva. Miután az első cDNS-szálat oligo(dT) és reverz transzkriptáz segítségével megszintetizáltuk, epitelsejt adhéziós molekulát (más néven KS- antigént vagy KSA-t) kódoló teljes hosszúságú cDNS-t klónoztunk PCR-reakcióval (PCR-technológiával). A PCR-láncindítók szekvenciája Perez és Walker által közzétett szekvencián alapult [J. Immunoi. 142, 3662 (1989)]. A „szensz” láncindító TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGCA (27. azonosítószámú szekvencia) szekvenciájú, az antiszensz láncindító CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT (28. azo- 21 nosítószámú szekvencia) szekvenciáju volt, ahol a transzlációs kezdokódont es a transzlációs stopkódon antikódonját vastagbetűvel jelöltük; az Xbal restrikciós helyet (TCTAGA) és Xhol restrikciós helyet (CTCGAG) aláhúzással jelöltük. A PCR-terméket klónoztuk, a KSA-szekvencia helyességét több, egymástól független klón szekvenálásával ellenőriztük. Az LnCAPsejtekből származó KSA cDNS-szekvenciája lényegében megegyezett az UCLA-P3-sejtekből származó KSA szakirodalomból ismert szekvenciájával [Perez és Walker (1989)]. A 115. aminosav-pozíciónál azonban az LnCAP nukleotid-szekvenciája ATG ACG helyett (Met Thr helyett), és a 227. aminosav-pozíciónál az LnCAP nukleotid-szekvenciája ATA ATG helyett (He Met helyett).

A KS-l/4-ellenanyag kötődését rekombináns KSA-antigénhez immunfestéses eljárással mutattuk ki. A KSA-antigén felszíni expresszióját úgy értük el, hogy sejteket, például CT26-, B16-sejteket, stb., transzferáltunk megfelelő emlős expressziós vektorba (pdCs; lásd az 5 541 087 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) klónozott teljes hosszúságú KSA-génnel, majd a sejteket KS-l/4-ellenanyaggal immunfestéses eljárással megfestettük. A KSA-t szolubilis antigénként úgy expresszáltattuk, hogy a KSA transzmembrán-doménját kódoló cDNS egy részét deletáltuk. A szolubilis KSA-antigén expressziójának, kimutatásának és tisztításának elősegítésére azt KSA-muFc-proteinként expresszáltattuk, amelynek előállítását a következőkben ismertetjük. A szolubilis KSA-antigént kódoló 780 bp Xbal-EcoRI restrikciós fragmentumot egy kapcsoló adapteren:

5’ AA TTC TCA ATG CAG GGC 3’ (29. az. sz. szék.) 3 ’ G AGT TAC GTC CCG AAT T 5 ’ (30. az. sz. szék.) keresztül (lásd az 5 726 044 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) a muFC-régiót kódoló AflII-XhoI-fragmentummal ligáltuk.

A szolubilis KSA-muFc-proteint kódoló Xbal-XhoI-fragmentumot a pdCs-vektorral ligáltuk. A kapott expressziós vektorral - pdCs-KSA-muFc - sejteket transzferáltunk, és antimuFc-ELISA-eljárással KSA-muFc-t expresszáló stabil kiónokat azonosítottunk.

I.D Antigénkötés meghatározása

A kondicionált tápközegbe expresszálódott KSA-muFc-proteint Protein A-romatográfiával tisztítottuk a gyártó (Repligen, Cambridge, MA) utasításai szerint eljárva. A 96-lyukú lemezeket (Nunc-Immuno Plate, Maxisorp) 5 pg/ml koncentrációban PBS-ben oldott, tisztított KSA-muFc-proteinnel vontuk be úgy, hogy az oldatot 100 μΐ/lyuk térfogatban adtuk a le

- ²² mezekhez. A vizsgálatot az l.B pontban ismertetett ELISA-eljárashoz hasonló módon végeztük. Röviden, a lemezeket az antigénbevonattal feltöltve lefedtük, és egy éjszakán át, 4°C-on inkubáltuk. Ezután, a lemezeket mostuk, és blokkoltuk. A tesztmintákat megfelelő koncentrációig mintapufferben hígítottuk, és 100 μΐ/lyuk mennyiségben a lemezre mértük, majd a lemezt 1 órán át, 37°C-on inkubáltuk. Az inkubációt követően, a lemezt 0,05% Tween-t tartalmazó PBS-sel nyolcszor mostuk. Ezután, a lyukakhoz 100 μΐ második ellenanyagot, azaz tormaperoxidázzal (HRP-) konjugált anti-humán-IgG-t (Jackson Immuno Research) adtunk, amelyet körülbelül 1:120 000 arányban hígítottunk a mintapufferben. A lemezen a színreakciót előhívtuk, és az 1 .B pontban leírtak szerint lemértük.

LE EpCAM-anti génre specifikus KS-l/4-ellenanyagok „on-rate” és „off-rate” (asszociációs és disszociációs) sebességi konstans értékeinek meghatározása Biacore-eljárassal

A KS-1/4- és KS-IL2-molekulák affinitását EpCAM-antigénnel szemben az ellenanyagantigén kölcsönhatás felszíni plazmon-rezonancia analízisével mértük, Biacore-készülék (Biacore International AB, Uppsala, Svédország) alkalmazásával. EpCAM-egérFc fúziós proteint kötöttünk CM5-szenzorchiphez amino-csoportokon keresztül, a gyártó utasításai szerint eljárva. A chip felett KS-1/4- és KS-IL2-ellenanyagokat áramoltattunk át 25 nmol/1 és 200 nmol/1 közé eső koncentrációjú oldatok alkalmazásával, és az ellenanyagok chiphez történő kötődését mértük. A Biacore program szerves részét képező görbeillesztési eljárásokkal kiszámítottuk az asszociációs és disszociációs sebesség konstansokat (“οπ-raíe” és “off-rate”), valamint az asszociációs és disszociációs konstansokat.

F KS-l/4-ellenanyagok kötődésének mérése EpCAM-antigént expresszáló sejtvonalak alkalmazásával

Tisztított KS-l/4-ellenanyagokat ismert technológiák szerint ¹²⁵I-vel jódoztunk, és ajelölt proteint növekvő koncentrációban az EpCAM-pozitív PC-3-sejtvonallal inkubáltuk. Telítési kötődésgörbéket vettünk fel, és Scatchard-analízissel disszociációs konstanst számoltunk.

. példa

Egéreredetű KS-l/4-ellenanyag V_H- és V_K-régióit kódoló cDNS-ek klónozása, és vektor előállítása hibridóma-eredetű KS-l/4-ellenanyag expresszáltatására

Egéreredetű KS-l/4-ellenanyagot expresszáló hibridómát (R. Reisfeld, Scripps Research Institute) írtunk át hírvivő RNS-sé reverz transzkripciós eljárással, oligo(dT) alkalmazásával, és az így kapott mRNS-t alkalmaztuk templátként PCR-reakcióban a nehézlánc V-régiót (V_H) és könnyűlánc variábilis régiót (V_K) kódoló szekvenciák amplifikálására. A PCR-

- 23 láncindítókat a szakirodalomból ismert szekvenciák alapján terveztük [Beavers és mtsai.: (lásd fent)] A V_H-régió amplifikálására a következő szekvenciájú láncindítót alkalmaztuk:

V_H „előre” láncindító: (5’) GACTCGAGCCCAAGTCTTAGACATC (3’) (31. azonosítószámú szekvencia);

V_H „reverz” láncindító: (5’) CAAGCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGACGTTC 83’) (32. azonosítószámú szekvencia), ahol a CTCGAG és AAGCTT szekvenciák a V_H-régió expressziós vektorba történő ligálására alkalmazott Xhol és HindlII restrikciós helyeket képviselnek (lásd az alábbiakban); és a reverz láncindítóban található TAC-nukleotidok GTA-szekvencia — az összeillesztési donor konszenzus szekvencia - beiktatását eredményezik a PCR-termék szensz szálába.

A V_K-régió amplifikálására a következő szekvenciájú PCR-láncindítókat alkalmaztuk:

VK „előre” láncindító: (5’) GATCTAGACAAGATGGATTTTCAAGTG (3’) (33. azonosítószámú szekvencia);

V_K reverz” láncindító: (5’) GAAGATCTTACGTTTTATTTCCAGCTTGG (3’) (34. azonosítószámú szekvencia), ahol a TCTAGA és AGATCT szekvenciák a V_K-régió expressziós vektorba történő ligálására alkalmazott Xbal és BglII restrikciós helyeket képviselnek (lásd az alábbiakban); ATG a könnyűlánc transzlációs kezdőkódonja; és a reverz láncindítóban található TAC-nukleotidok GTA-szekvencia - az összeillesztési donor konszenzus szekvencia - beiktatását eredményezik a PCR-termék szensz szálába.

Az egéreredetű KS-l/4-ellenanyag V_H- és V_K-régióját kódoló PCR-termékeket pCRIIvektorba (Invitrogen, Carlsbad, CA) klónoztuk. Több V_H- és V_K-klónt szekvenáltunk, és a konszenzus szekvenciákat mindegyik esetében meghatároztuk. A V_H- és V_K-szekvenciákat egymást követően pdHL7 expressziós vektorba inszertáltuk. A ligálásnál, a V_H-szekvencia esetében az egyedi Xhol- és HindlII-helyeket, a V_K-szekvencia esetében az egyedi Xbal- és BglII/BamHI-helyeket használtuk fel (az egyedi BglII-hely a V_K-iszertben és az egyedi BamHI-hely a vektorban kompatibilis túlnyúló végeket eredményez). A kapott konstrukciót pdHL7-Hybridoma chKS-l/4-vektomak neveztük, és az már transzkripciós szabályozó elemeket és humán lg konstans régió szekvenciákat tartalmazott a kiméra ellenanyagok expreszszáltatására [Gillies és mtsai.: J. Immunol. Methods 125,191 (1989)].

A pdHL7 elnevezésű expressziós vektor a pdHL2-vektorból lett származtatva [Gillies és mtsai.: Hybridoma 10, 347 (1991)] a következő módosítások végrehajtásával: a pdHL2 expressziós vektorban, a könnyűlánc és nehézlánc-citokin transzkripciós egység a nehézlánc im-

- 24 munglobulingén enhaszer-szekvenciájából és a metalothionein-promóterből áll. A pdHL7vektorban, a fenti két transzkripciós egység a CMV-enhanszer-promótert tartalmazza [Boshart és mtsai.: Cell 41, 521 (1985)]. A CMV-enhanszer-promótert kódoló DNS a kereskedelemben hozzáférhető pcDNAI-vektor AflIII-HindlII-fragmentumából származott (Invitrogen Corp., San Diego, CA).

3. példa

Expressziós vizsgálatok egéreredetű KS-l/4-ellenanyagok alkalmazásával

Az alábbi példában a 4 975 369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett, V-régió szekvenciákat kódoló ellenanyag expressziós plazmid alkalmazásával végzett expressziós vizsgálatokat ismertetünk.

. A Plazmidkonstrukció

Ahhoz, hogy a Hybridoma KS-l/4-szekvenciák által kódolt kiméra ellenanyagok és a 4 975 369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett szekvenciák által kódolt ellenanyagok közvetlen összehasonlítását elvégezhessük a 4 975 369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett V_H-szekvenciákat kódoló cDNS-t szintetizáltunk. Ezt a szekvenciát a KS-l/4-ellenanyag V_K-szekvenciáját már tartalmazó pdHL7 expressziós vektorba ligáltuk.

Ahhoz, hogy a 4 975 369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett V_H-szekvenciát megkapjuk, a V_H-szekvencia egy részét kódoló Ndel-HindlII-fragmentumot állítottunk elő tisztán kémiai szintézissel. Átfedő oligonukleotidokat szintetizáltunk kémiai úton, és azokat ligáltuk. Ezután, a ligáit duplexet pBluescript-vektor (Stratagene, LaJolla, CA) Xbal-HindlII-helyére szubklónoztuk.

Ez a DNS a 4 975 369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból már ismert IQQPQNMRTM proteinszekvenciát kódol. A kódoló szekvenciától közvetlenül 3’irányban, a GTA-nukleotidokkal kezdődő összeillesztési donorszekvencia található. A felső szál 5’-végén található CTAG az Xbal-klónozóhely túlnyúló végének felel meg. Az Xbal-helyet csupán azért hoztuk létre, hogy a szekvenciát a pBluescript-vektor többszörös klónozó helyére tudjuk klónozni. Ezt közvetlenül követte a Ndel restrikciós hely (CATATG). Az AGCT-szekvencia az alsó szál 5’-végén a HindlII-klónozóhely túlnyúló végét képviseli. Ezt a HindlII ragadós véget később a Cyl-gént megelőző intronban található HindlII-hellyel ligáltuk [Gillies és mtsai.: Hybridoma 10, 347 (1991)].

•··· · ···· ♦ · • ···· · ·*· ·

- 25 Miután a szekvencia helyességét szekvenálással ellenőriztük, a Ndel-HindlII restrikciós fragmentumot izoláltuk. Ezt, a V_H-régió N-terminális felét kódoló Xho-Ndel-fragmentummal együtt, a KS-l/4-ellenanyag V_K-régióját már tartalmazó, XhoI-HindlII-enzimekkel emésztett pdHL7 expressziós vektorba ligáltuk. A kapott konstrukció - pdHL7-’369 chKS-1/4 - a 4 975 369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett V_K- és V_Hszekvenciákat tartalmazta (a továbbiakban US 4 975 369 chKS-1/4).

3.B A Hybridoma chKS-1/4 és az US 4 975 369 chKS-l/4-ellenanyagok összehasonlítása

A pdHL7-hybridoma chKS-1/4 és pdHL7-’369 chKS-l/4-szekvenciákat kódoló DNS-eket egymással párhuzamosan, a fent említett kalcium-foszfát koprecipitációs eljárással, „293” jelzésű humán vesesejtekbe juttattuk. A transzfekciót követően öt nappal a kondicionált tápközeget anti-huFc-ELISA- és kappa-ELISA-clj árasokkal analizáltuk (az ELISA-elj árások ismertetését lásd az 1. példában); eredményeinket az 1. táblázatban összegeztük.

1, táblázat

Ellenanyag	huFC-ELISA	Kappa-ELISA
Hybridoma chKS-1/4	254 ng/ml	200 ng/ml
US 4 975 369 chKS-1/4	14 ng/ml	0 ng/ml

Eredményeink szerint, a hybridoma chKS-1/4 normá isan expresszálódott és szekretálódott, és a két különböző ELISA-meghatározás pontosságát figyelembe véve a szekretálódott ellenanyag hozzávetőlegesen equimoláris mennyiségben tartalmazott nehéz- és könnyűláncokat. Ezzel szemben, az US 4 975 369 chKS-l/4-ellenanyag esetében csak kis mennyiségű nehézlánc volt kimutatható a kondicionált tápközegben, és azzal kappa-lánc nem asszociálódott.

Westem-blot analízist végeztünk a teljes sejt lizátumok és a két tranziens módon transzfektált sejtvonal kondicionált tápközegének alkalmazásával. A Westem-blot-analízist Sambrook és mtsai. által leírtak szerint végeztük [Sambrook és mtsai.: (1989) lásd fent)]. A teljes sejt lizátumok vizsgálatához, a transzfektált sejteket lizáltuk, a törmelékek eltávolítására centrifugáltuk, és egy-egy sávra 5xl0⁵ sejtnek megfelelő lizátumot vittünk fel. A kondicionált tápközeget oly módon analizáltuk, hogy először 300 μΐ kondicionált tápközegben található proteinterméket tisztítottunk Protein A Sepharose-kromatográfiával, majd SDS-PAGE-analízist végeztünk redukáló körülmények mellett. Westem-blot transzfert követően, a blotot tormaperoxidázzal konjugált, kecskében termelt anti-humán-IgG Fcy-ellenanyaggal hibridizáltattuk (Jackson ImmunoResearch) 1:2000 hígításban.

··:· .... ^:·:· j. s’

- 26 A Wstem-blot-analízis szerint, a kísérletben alkalmazott körülmények mellett, a nehézlánc a pdHL7-hybridoma chKS-l/4-konstrukcióval transzfektált sejtek kondicionált tápközegében és a lizált sejtekben egyaránt kimutatható volt. Ez azt jelenti, hogy a chKS-l/4-ellenanyag nehézlánca a sejtekben termelődött, és hatékonyan expresszálódott (a könnyűlánccal együtt). Másrészt, a pdHL7-’369 chKS-l/4-konstrukcióval transzfektált sejtek esetében, a nehézlánc csak a sejtlizátumban volt kimutatható, de a kondicionált tápközegben nem. A fenti eredmények szerint, annak ellenére, hogy a sejtekben az előzővel összehasonlítható mennyiségű nehézlánc termelődött, az nem szekretálódott. Ezt a megfigyelést igazolta az ELISAvizsgálat is, amely szerint, az US 4 975 369 chKS-l/4-eIlenanyag esetében a kis mennyiségű szekretálódott nehézlánccal nem kapcsolódott kappa-lánc. Ismert, hogy immunglobulin-nehézláncok tipikusan nem szekretálódnak megfelelően immunglobulin könnyűláncok hiányában [Hendershot és mtsai.: Immunology Today 8, 111 (1987)].

A már ismertetetteken felül, NS/O-sejteket transzferáltunk elektroprációs eljárással, egymással párhuzamos kísérletekben, a pdHL7-HybridomachKS-l/4- és pdHL7US 4 975 369 chKS-l/4-konstrukciókkal. Stabil kiónokat szelektáltunk 100 nmol/1 MTX jelenlétében, az 1. példában ismertetett módon, és a MTX-rezisztens kolóniák kondicionált tápközegét anti-huFc-ELISA-eljárással 96-lyukú lemezeken teszteltük, az 1. példában ismertetettek szerint. Eredményeinket a 2. táblázatban foglaltuk össze.

2. táblázat

Ellenanyag	Szűrt kolóniák teljes száma	Átlagos expresszió*	Legmagasabb expressziós érték*
Hybridoma chKS-1/4	80	0,1-0,5 pg/ml (41)	10-50 pg/ml (4)
US 4 975 369 chKS-1/4	47	0-10 ng/ml (36)	0,1-0,4 pg/ml (4)

(* A zárójelbe tett számok a számításnál figyelembe vett kolóniák számát jelentik, vagy a terméket a legmagasabb szinten expresszáló kolóniák számát jelentik anti-Fc-ELISA-eljárással történő meghatározás szerint.)

A 96-lyukú lemezeken végzett szűrővizsgálat szerint, a pdHL7-hybridomachKS-l/4konstrukció alkalmazásával kapott kiónok többsége körülbelül 100 ng/ml-500 ng/ml ellenanyagot termelt, és a legmagasabb szinten termelő kolóniák körülbelül 10-50 pg/ml ellenanyagot termeltek. Ezzel szemben, apdHL7-’369 chKS-l/4-konstrukcióval történő transzfektálással kapott kolóniák túlnyomó többsége körülbelül 0 ng/ml-10 ng/ml ellenanyagot termelt, és az ellenanyagot legmagasabb szinten termelő kiónok esetében 300-400 ng/ml ellenanyag• · · · · * · ··:· .:.. ··:· .:. ’

- 27 termelést mértünk. Az US 4 975 369 chKS-l/4-ellenanyag összetételének és kötési tulajdonságainak vizsgálatára az ellenanyagot 300-400 ng/ml mennyiségben termelő kiónokat fel kellett szaporítanunk. Két ilyen kiónt választottunk felszaporításra. Azok expressziós szintje azonban igen instabilnak bizonyult. Mire a tenyészeteket 200 ml-re szaporítottuk, az anti-FcELISA-eljárás szerint mindkét klón expressziós szintje körülbelül 20 ng/ml-re csökkent. Amikor ugyanezt a kondicionált tápközeget anti-kappa-ELISA-eljárással teszteltük, kappa-könynyűláncot nem tudtunk kimutatni, ahogy a tranziens módon transzfektált “293”-sejtek esetében sem.

Az alábbi kísérletben igazoltuk, hogy nem asszociálódik kimutatható mennyiségű kappa-könnyűlánc az US 4 975 369 chKS-l/4-ellenanyaggal. Röviden, mindegyik klón kondicionált tápközegéből 50 ml-t Protein A-kromatográfiával koncentráltunk. Az eluátumokat antiFc-ELISA- és anti-kappa-ELISA-elj árasokkal teszteltük. Kontrollként, hybridoma chKS-1/4ellenanyagot termelő kiónt kezeltünk a fentiekkel azonos módon, és vizsgáltunk azonos időpontban. Az ELISA-eredményeket a 3. táblázatban összegeztük.

3. táblázat

Ellenanyag	huFc-ELISA	Kappa-ELISA
Hybridoma chKS-1/4	42 pg/ml	44 pg/ml
US 4 975 369 chKS-1/4 1. klón	253 ng/ml	0 ng/ml
US 4 975 369 chKS-1/4 2. klón	313 ng/ml	0 ng/ml

Eredményeink szerint, valóban nem asszociálódott kimutatható mennyiségű kappakönnyűlánc az US 4 975 369 chKS-l/4-nehézlánccal. Ezen felül, a hybridoma chKS-l/4-ellenanyag KS-antigént kötött 10-20 ng/ml koncentrációban, míg a két kiónból származó US 4 975 369 chKS-l/4-ellenanyag egyike sem kötött KS-antigént, még 253 ng/ml-re és 313 ng/ml-re bekoncentrálva sem (a KS-antigén kötődésének meghatározását lásd a 9. példában).

4. példa

Variáns KS-ellenanyagok expresszáltatása és jellemzése

Valamely ellenanyag expresszióját vagy célmolekulához történő kötődésének affinitását csökkentő mutációkat hordozó ellenanyagok várhatóan kevésbé hatásosak terápiás célra emberekben. Számos, az ellenanyagok immunogenitását csökkenteni hivatott megközelítési mód, például „veneering (humanizált ellenanyagban, a felszíni epitópok egy részének vissza- 28 cserélése az eredeti ellenanyagban található aminosavakra), „humanizálás” (például egér CDR-ek beépítése humán IgG-be) vagy „dezimmunizálás” (potenciális T-sejtes epitópok kiküszöbölése), számos aminosav-szubsztitúció beiktatásával jár, amelyek csökkenthetik az ellenanyag kötődését az antigénhez (lásd például az 5 639 641 és 5 585 089 számú amerikai 5 egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat; valamint a WO 98/52 976 és WO 00/34 317 számú nemzetközi közzétételi iratokat). Szükség van olyan ellenanyag-szekvenciákra, amelyek képesek kötődni epitel adhéziós molekulához, de különböznek a fenti antigént felismerő eredeti, egéreredetű monoklonális ellenanyagoktól.

KS-1/4 nehéz- és könnyűlánc variábilis („V”) régiók különböző kombinációit teszteltük 10 arra nézve, hogy képesek-e expresszálódni, és EpCAM-antigénhez kötődni. Eredményeinket az alábbiakban, a 4-6. táblázatokban összegeztük.

4. táblázat

KS-l/4-ellenanyag nehéz- és könnyűlánc V-régiók szekvenciái

Könnyűláncok:

20 30 40 50 60

VK0 qilltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymlwyqqkpgsspkpwifdtsnlasgfpar

VK1 QiyLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYILWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPSR

VK6 EIVLTQS PATI.SLS PGERVTUTCS ASS S VS YMLWYQQKPGQAPKLI.I FDTSNLASGIPRR

VK7 QILLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPAR

VK8 EIVLTQSPATLSIiSPGERVTIiTCSASSSV’SYMLWYQOKPGSSPKPWI FDTSNLASGFPAR

80 90100

VK0 FSGSGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:1)

VK1 FSGSGSGTSYTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:11)

VK6 FSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:7)

VK7 FSGSGSGTSYSLIISSMEPEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK. (SEQ ID NO:8)

VK8 FSGSGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:9)

- 29 Nehézláncok:

20 30 40 50 60

VHO QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

VH1 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYIGEPTY

VH2 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVEQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

VH2.5 QIQLVQSGPEIjKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

VH6 QVQLVQSGAEVKKPGESVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTY

VH7 QIQLVQSGAEVKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

VH369 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

80 90 100 110

VHO ADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLRNE. DMATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQIDNO:

VH1 ADDFKGRFTITAETSTSTLYLQLNNLRSE . DTATYFCVRFMSKGDYWGQGTTVTVSS (SEQIDNO:

VH2 ADDFKGRFTITAETSTSTLYLQLNNLRSE. DTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: VH2.5 ADDFKGRFTITAETSTSTLYLQLNNLRSE. DTATYFCVRFISKGDYWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: VH6 AQKFQGRVTTSLDTSTSTAYLQLSSLRAE. DTAVYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: VH7 ADDFKGRFAFSLETSTSTAFLQINNLRSE . DTATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQIDNO: VH369 ADDFKGRFAFSLETSASTAFLQIqqpqnmrtMATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:

2)

21)

22)

19)

17)

18)

35)

5. táblázat

KS-l/4-ellenanvagvariánsok szekvenciái és egyetlen aminosavinszerciót hordozó

CDR3 -nehézlánc-variánsok

20	' VH2 partial seq.: ·	. ATYFCVRF I S K GDYWGQG. .	. (amino acid residues
	i 92-109 Of SEQ ID NO: 22) 1 VH2.1: · ·	. ATYFCVRF IIS K GDYWGQG. .	. (SEQ ID NO: 36)
	j VH2.2: * ·	. ATYFCVRF TVS K GDYWGQG. .	. (SEQ ID NO: 37)
	j VH2.3: ·	. ATYFCVRF I SAK GDYWGQG. .	. (SEQ ID NO: 38)
	VH2.4:	. ATYFCVRF I S KTGDYWGQG. .	. (SEQ ID NO: 39)

6. táblázat

Variáns KS-l/4-ellenanyagok expressziós szintje és kötőaktivitása

Konstrukció	_____Expresszió— _	I EpCAM-affinitás
1 ranziens (* ^{() () (***)}) (ng/mL)	Stabil (*) (pg/mL)		Relatív	\| Kd (nmol/1)
1 csoport___					~·
VK0/VH0 (Hybridoma chKS-1/4)		10-50	1x	1.0 x10‘^a
VK0/VH'369 ('369 chKS-1/4)_		0.1 - 0.4(*“)	»30x
VK8/VH7 (3. konstrukció)		10-50		1.0x10’“
VK6/VH6 (1. konstrukció)	300		n.d.
VK7/VH7 (2. konstrukció)	30			-
VK8/VH7-IC2		10-50		1.0x10“
VK1/VH1-IL2 _______________		10-50		7.9 x 10’“
VK1/VH2-IL2		10-50		3.1 x 10’“
—_____
2. csoport__________
VK8/VH7(3. konstrukció;kontroll)___1500		1x
VKO/VHi____________	1500		8x
VK1/VH7	1500		1x	---
VK1/VH1____________________	1500		2x
VK1/VH2	1500		1x-2x	—
VK1/VH1-IL2	1500		5x
VK1/VH2-IL2	1500		1.5x
VK1/VH2.5-IL2	1500		3x-4x
_ ------------- _
3. csoport
VK8/VH7-IL2 (control)	760		1x
VK1/VH1-IL2	350		2x	_______________________________________'
VK1/VH2.1-IL2	290		>10x
VK1/VH2.2-IL2_________________	270		>10x
VK1/VH2.3-IL2	190		7x	'--,
VK1/VH2.4-IL2____________	210		3x	____________ \|

(*) Szokásosan elérhető expressziós szintek (**) „Relatív kötődésen” azt értjük, hogy azonos szintű kötődés eléréshez hányszorosá25 ra kell emelnünk a protein-koncentrációt. Ennek megfelelően, magasabb érték alacsonyabb affinitást jelent EpCAM-antigénnel szemben.

(***) Kappa-könnyűláncot nem sikerült ELISA-eljárással kimutatnunk (a háttérnek megfelelő értékeket kaptunk; funkcionális ellenanyagok tehát nem expresszálódtak.

(****) n.d. = nem-kimutatható.

L:j. :**

- 31 A 2. és 3. csoportban, az egyes proteinek relatív kötődését a csoport első sorában szereplő kontroll értékére normalizáltuk. Az ELISA-vizsgálat elsődlegesen a disszociációs sebességkonstansok értékeit tükrözi, mivel a több mosási ciklust követően kötődve maradt protein mennyiségének kimutatásán alapul. Az eljárást gyors szűrővizsgálatként alkalmazható a gyenge kötődést mutató ellenanyagok kizárására, de nem alkalmas az affinitás pontos meghatározására. A 3. csoportban, a VH-2-variánsokat - VH2.1-VH2.4 - a VH1-variánssal hasonlítottuk össze annak megállapítására, hogy aminosav-inszerciók beiktatása jobb relatív kötődési tulajdonságú ellenanyagokat eredményezhet-e.

A szekvenciák a következő kapcsolatban állnak egymással. A példákban ismertetettek szerint, a VH0- és VKO-szekvenciákat PCR-amplifikációval állítottuk elő az eredeti, egéreredetű KS-l/4-ellenanyagot expresszáló hibridóma-sejvonalból (1. és 2. azonosítószámú szekvenciák). A VH-‘369-szekvencia a 4 975 369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett VH-szekvenciának felel meg. A VH1-, VH2-, VH2.1-2.4-, VK1- és VK2-szekvenciákat vagy dezimmunizációs technológiával kaptuk, amelyben a potenciális Tsejt-epitópokat küszöböljük ki vagy gyengítjük a pepiid epitóp MHCII-molekulákhoz történő kötődését csökkentő mutációk beiktatásával; vagy olyan eljárásokkal, amelyekben nem-humán T-sejt-epitópokat változtatunk meg úgy, hogy azok megfeleljenek a humán ellenanyagokban jelenlévő saját epitópoknak. Ezeknek a konstrukcióknak az előállítását és vizsgálatát az alábbiakban részletesebben ismertetjük. A 6. táblázatban szereplő konstrukciókat oly módon állítottuk elő, hogy emlős sejteket transzferáltunk a megfelelő nehéz- és könnyűlánc V-régiókat expresszáló nukleinsav-szekvenciák kombinációjával. A VH6-, VH7-, VK6-, VK7- és VK8-szekvenciákat úgy hoztuk létre, hogy a hybridomaKS-l/4-ellenanyag felszíni aminosavait az alább ismertetettek szerint a humán ellenanyagban található megfelelő aminosavakkal helyettesítettük azzal a céllal, hogy kiküszöböljük a potenciális B-sejtepitópokat. Az 1-3. konstrukciókat oly módon állítottuk elő, hogy emlős sejteket a 4. táblázatban és az alábbiakban ismertetettek szerint nehéz- és könnyűlánc V-régiókat - VH6, VH7, VK6, VK7 és VK8 expresszáló nukleotid-szekvenciák kombinációival transzferáltunk.

A Kevesebb humán T-sejt epitópot tartalmazó KS-ellenanyagok jellemzése

A VH2.1-VH2.5-szekvenciákat annak megállapítására állítottuk elő, hogy a KS-1/4 nehézlánc CD3-régiójában létrehozott bizonyos aminosav-inszerciók és -szubsztitúciók tolerálhatók-e. A VK0/VH1, VK1/VH7, VK1/VH1, VK1/VH2, VK1-VH1-IL2, VK1/VH2-IL2 és VK1/VH2.5-IL2 könnyű- és nehézlánc kombinációkat tartalmazó expressziós vektorokat állí- 32 tettunk elő, a megfelelő ellenanyagokat és ellenanyag-IL2 fúziós proteineket expresszáltattuk, és azokat az 1-3. példákban ismertetettek szerint teszteltük.

Közelebbről, a VH1-, VH2-, VK1- és VK2-szekvenciákat teljes egészében kémiai szintézissel kaptuk. Mindegyik fenti szekvencia esetében a kódoló és komplementer szálon a régiót átfedő oligonukleotidok sorozatát szintetizáltuk kémiai úton, majd azokat foszforileztük, és ligáltuk. A ligáit kettősszálú molekulákat a fragmentum végeinek megfelelő láncindítók alkalmazásával, PCR-technológiával amplifikáltuk, pCRII-vektorba inszertáltuk (Invitrogen, Carlsbad, CA) és a szekvenciák helyességét ellenőriztük. Ezután, ezeket a DNS-fragmentumokat a pdH17 expressziós vektor megfelelő hasítási helyeivel ligáltuk, hogy a teljes nehéz(„H”) és könnyűláncot („L”) megkapjuk.

A VH2.5-szekvenciát a VH2-szekvenciából származtattuk ismert molekuláris biológiai technológiákkal, egyetlen kódon módosításával, ami a 108. pozícióba Thr beépülését eredményezte Gin helyett (lásd 4. táblázat).

Az ellenanyagokat ELISA-eljárással (6. táblázat) és felszíni plazmonrezonancia technológiával teszteltük (Biacore készülék és programcsomag alkalmazásával), hogy azok kötődési képességét EpCAM-antigénhez összehasonlítsuk. Az ELISA-vizsgálatok eredményei elsődlegesen az disszociációs sebességkonstansok („off-rate”) - és nem az asszociációs sebességkonstansok („on-rate”) - értékeit tükrözik, és általánosságban kevésbé pontosak, ezért azokat arra használtuk, hogy a gyenge ELISA-eredmények alapján bizonyos konstrukciókat kizárjunk a további vizsgálatokból. AZ ELISA-vizsgálat szerint megfelelő kötődést mutató ellenanyagok azonban további jellemzést igényeltek.

A felszíni plazmonrezonancia analízis eredményeit az alábbiakban foglaltuk össze:

Fúziós protein	kon [1/mol sec]	kotr [1/sec.] 3,2x10’⁴	K_D[mol/1] Ι,ΟχΙΟ'⁹
VK8/VH7-IL2	3,lxlO⁵
VK1/VH2-IL2	l,7xl0⁵	5,3xl0'⁴	3,lxl0’⁹
VK1/VH1-IL2	2,8x10³	2,2xl0‘³	7,9xl0’⁹ ___I 4. - ΧΓΊΖ1 A 70 TT

_{Mivel a} VK1/VH1-IL2 „off-rate” értéke sokkal gyorsabb volt, mint a VK1/V2-IL2vagy VK8/VH7-IL2-ellenanyagoké a VKl/VHl-IL2-ellenanyagot tekintettük a legkevésbé előnyösen alkalmazható fúziós proteinnek.

Tekintve, hogy a VK1/VH1-IL2 és VK1/VH2-IL2 csupán egy metionin/izoleucin cserében térnek el a VH-CDR3-régió 100. pozíciójában, a VK1/VH1-IL2 fokozott „off-rate? értéke a VKl/VH2-IL2-ellenanyaghoz képest azt sugallja, hogy ez a pozíció hidrofób kontaktust lé• ·♦·« · ♦*·

- 33 tesít az EpCAM-antigénnel, és a kissé hosszabb metionin-oldallánc kevésbé hatékony kontaktus létrejöttét teszi lehetővé. A protein-protein-kölcsönhatásokkal foglalkozó szakterületen általánosan elfogadott, hogy a hidrofob kölcsönhatások jelentős szerepet játszanak az „off-Fate értékek meghatározásában, de sokkal kevésbé lényegesek az „on-raté” értékek meghatározásában.

R Egyetlen aminosav-inszerciót hordozó KS-l/4-variánsok jellemzése

A nehézlánc V-régióban található CDR3-szekvencia jelentőségét a KS-ellenanyag EpCAM-antigénnel szemben mutatott affinitásának meghatározásában olyan variánsok sorozatának vizsgálatával szemléltettük, amelyek egyetlen aminosav-inszerciót vagy -szubsztitúciót hordoztak ebben a régióban. A VH2.1-, VH2.2-, VH2.3- és VH2.4-variánsokat VH2- és VK1-régiókat kódoló expressziós vektor módosításával nyertük, ismert rekombináns DNStechnológiák alkalmazásával. A kapott expressziós vektorokat NS/O-sejtekbe transzfektáltuk, és a szekretált ellenanyag-proteineket az 1-3. példákban ismertetettek szerint tisztítottuk.

Azt találtuk, hogy a VH1-variáns kevésbé volt előnyös a VH2-variánshoz képest, ami arra utal, hogy az izoleucin a CDR3-régióban nem helyettesíthető metioninnel. Következő célkitűzésünk annak megállapítása volt, hogy egy aminosav inszertálása a CDR3-régióba a VH1-szekvenciáénál előnyösebb kötési tulajdonságokkal rendelkező KS-1/4 nehézlánc V-régiót eredményez-e. A 6. táblázatban a VK1/VH2.1-, VK1/VH2.2-, VK1/VH2.3- és VKl/VH2.4-variánsok kötődési tulajdonságait hasonlítottuk össze a KV 1/VH1-ellenanyagéval. A KS-1/4 V_H CDR3-régióban aminosav-inszerciót hordozó konstrukciók egyikének antigénkötő sajátsága sem bizonyult előnyösebbnek, mint a VEI 1-régiót hordozó ellenanyagé; ehelyett, az inszerciós mutánsok antigénkötő aktivitása csökkent vagy nagymértékben gyengült.

Eredményeink szerint, aminosavak beiktatása a CDR3-régióba általában hátrányosan befolyásolja a KS-l/4-nehézlánc V-régiók antigénkötő aktivitását. Közelebbről, a KS-1/4 V_Hrégió 84-108. aminosav-pozícióknak megfelelő szegmense, amely az Asn-Asn-Leu-Arg-AsnGlu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg-Phe-Ile-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln aminosavakból áll, fontos a KS-l/4-ellenanyag antigénkötő aktivitása szempontjából. A szegmens Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg keretrégió szegmenst tartalmaz, amely megengedő egyszeres és aminosav-szubsztitúciókra, de nem toleráns aminosav-inszerciók beiktatásával szemben, amely utóbbiak hátrányosan befolyásolhatják az expressziót és összeépülést. Ezen felül, eredményeink szerint, a 86., 91., 94. és 95. aminosav’···* J. :*

- 34 pozíciókban előnyösen hidrofób aminosav található a hatékonyan expresszálódó és EpCAMantigénhez hatékonyan kötődő ellenanyagokban.

Aminosav inszerciója a Phe-Ile-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr V_H CDR3-szegmensbe általában megszünteti a KS-l/4-ellenanyag EpCAM-antigént kötő aktivitását, bár némely inszerció tolerálható, csupán az aktivitás részleges elvesztésével. Hasonlóképp, a fenti pozíciókban létrejövő szubsztitúciók általában az EpCAM-antigénhez történő kötődés megszűnését eredményezik, bár egyes szubsztitúciók megengedettetek, és csak az aktivitás részleges elvesztésével járnak.

4.C KS-l/4-ellenanvag aktív származékainak előállítása, amelyekben egéreredetű felszíni aminosavak humán megfelelőikkel lettek helyettesítve

Ellenanyagokat úgy állítottunk elő, hogy a KS-l/4-ellenanyagban található aminosavakat humán ellenanyagokban, azonos pozícióban szokásosan előforduló aminosavakkal helyettesítettünk annak érdekében, hogy az egéreredetű V-régiók immunogenitását minimalizáljuk. Előnyösen, a KS-l/4-származékok specifikus kötőaffinitásukat megtartották humán EpCAMantigénnel szemben.

1. konstrukció: Azt találtuk, hogy a KS-l/4-ellenanyag könnyűlánca a humán III. konszenzus alcsoport szekvenciájával, nehézlánca az I. alcsoport szekvenciájával mutatja a legnagyobb fokú hasonlóságot. A fenti hasonlóság alapján, a humán konszenzus alcsoport aminosavait és KS-l/4-eredetű CDR-eket és nem-konszenzus aminosavakat tartalmazó szekvenciát terveztünk. A fenti és a következőkben ismertetett konstrukciók előállítására háromdimenziós modellt készítettünk a „Silicon Graphics Workstation” és „BioSym” molekuláris modellező programcsomagok alkalmazásával.

A háromdimenziós modell szemrevételezése alapján megállapítottuk, hogy bizonyos humáneredetű aminosavak a CDR-régiók közelében találhatók, és valószínűleg befolyásolják azok konformációját. A fenti analízis alapján, a könnyűláncban, a humán Ser22, Arg44 és Phe66 aminosavakat a Thr, Lys és Tyr aminosavakra cseréltük vissza. A nehézláncban, ilyen változtatásokat nem tartottunk szükségesnek. Az 1. konstrukció végleges tervében, a könnyűlánc 18 humán aminosavat tartalmazott, amely nem fordul elő az egéreredetű könnyűláncban; a nehézlánc pedig 22 humán aminosavat tartalmazott, amely nem fordul elő az egéreredetű nehézláncban.

Az 1. konstrukciót expresszáló DNS-eket szintetikus oligonukleotidok alkalmazásával állítottunk elő. Az 1. konstrukció által kódolt protein hatékonyan expresszálódott, de aktivitása több mint tízszer maradt el az EpCAM-antigénkötő vizsgálatban az eredeti ellenanyagétól.

^:·!· .L '*’* ·^?· ¹

2. konstrukció: A 2. konstrukció előállítására kevésbé agresszív megközelítési módot alkalmaztunk, amely szerint csak a következő változtatásokat hajtottuk végre a szekvenciákban:

könnyűlánc: K18R, A79P;

nehézlánc: P9A, Ll 1V, A76T, N88S és M91T.

A 2. konstrukciót expresszáló DNS-eket szintetikus oligonukleotidok és ismert rekombináns DNS-technológiák alkalmazásával állítottunk elő. A 2. konstrukció által kódolt protein nem expresszálódott hatékonyan. Azt találtuk továbbá, hogy a 2. konstrukció könnyűláncának és az egéreredetű KS-l/4-ellenanyag nehézláncnak kombinációja nem expresszálódik hatékonyan, míg a 2. konstrukció nehézláncának és az egéreredetű KS-l/4-ellenanyag könnyűláncának kombinációja hatékonyan képes expresszálódni. Arra a következtetésre jutottunk tehát, hogy az expressziót hátráltató tényező a 2. konstrukció könnyűláncában keresendő.

3. konstrukció: A 2. konstrukció esetében megfigyelt nyilvánvaló expressziós deficiencia alapján új könnyűláncot terveztünk, amelyben az 1. konstrukció N-terminális részét az egéreredetű könnyűlánc C-terminális részével fuzionáltattuk. Ehhez, a 35. és 36. pozícióban található aminosavakat kódoló KpnI-helyet használtuk fel. Amikor ezt a könnyűláncot kombináltuk a 2. konstrukció nehézláncával, hatékony expressziót tapasztaltunk, a kötőaktivitás jelentősebb gyengülése nélkül.

Mivel a 3. konstrukció a proteinexpresszió és az antigénnel szemben mutatott affinitás tekintetében az 1. és 2. konstrukciókat felülmúló ellenanyagot eredményezett, a 3. konstrukciót kódoló DNS-szekvenciákat pdHL7s-IL-2-vektorba inszertáltuk; a fenti módon kaptuk a pdHL7s-VK8/VH7-IL2-konstrukciót, amelynek szekvenciáját a 40. azonosítószámú szekvencián mutatjuk be. A fenti plazmid-DNS-t expresszió céljából, elektroporációs eljárás alkalmazásával NS/0 jelzésű egér-mielómasejtekbe juttattuk, hogy az 1. példa A pontjában ismertetettek szerint, stabil módon transzfektált sejtvonalat kapjunk. A stabil módon transzfektált kiónok felülúszóit az 1 .B pontban ismertetettek szerint, humán Fc-szegmenssel bevont lemezeken, ELISA-eljárással ellenanyag-expresszióra teszteltük. A fenti ellenanyag fúziós protein nehézláncának aminosav-szekvenciáját a 41., könnyűláncának aminosav-szekvenciáját a 42. azonosítószámú szekvenciákon mutatjuk be.

A már ismertetetteken felül, jódozott VK8/VH7 és VK8/VH7-IL-2 konstrukciók PC-3tumorsejtek felszínén expresszált EpCAM-antigénhez történő kötődését hasonlítottuk össze jódozott VK0/VH0-IL2-konstrukcióéval, lényegében az l.F pontban leírtak szerint. A kísérleti hibahatáron belül, lényegében azonos kötőaffinitást mértünk a VK8/VH7 és VK0/VH0, illetve VK8/VH7-IL-2 és VK0/VH0-IL2 konstrukciók esetében.

' ·* · · ·* .* i-l·.»: ’··’ λ ·

4. D Aktív KS-l/4-ellenanvagok előállításánál előnyösen figyelembe veendő struktúrafunkció összefüggések

Összefoglalva, a KS-l/4-ellenanyagok és a találmány szerinti V-régió-szekvenciákat tartalmazó fúziós proteinek antigénkötő aktivitásának ismerete iránymutatásul szolgál EpCAM-antigénhez kötődő, és megfelelően expresszálódó és szekretálódó KS-l/4-ellenanyag-szekvenciák tervezéséhez. Közelebbről, a KS-1/4 nehéz- és könnyűlánc V-régiók tolerálhatják többszörös aminosav-szubsztitúciók létrehozását, és megtarthatják aktivitásukat, amennyiben ezek az aminosav-szubsztitúciók kívül esnek a CDR-eken. A KS-l/4-ellenanyag nehéz- és könnyűlánc V-régiói általában nem engedik meg aminosavinszerciók beiktatását, különösképpen nem a CDR-régiókban vagy a CDR-ek közti keretrégiókban.

Amennyiben például a hibridóma-eredetű KS-l/4-szekvenciából indulunk ki „vad-típusú” szekvenciaként, eredményeink szerint, a nehézlánc V-régió az aktivitás megtartásával vagy annak csak kismértékű csökkenésével képes tolerálni a 9., 11., 16., 17., 38., 40., 69., 70., 71., 72., 76., 79., 80., 83., 88., 91. és 111. pozíciókban létrehozott aminosav-szubsztitúciókat. Hasonlóképp, a könnyűlánc az aktivitás megtartásával vagy annak csak kismértékű csökkenésével képes tolerálni az 1., 3., 10., 11., 12., 13., 17., 18., 19., 21., 41., 42., 59., 71., 73., 75., 77. és 103. pozíciókban létrehozott aminosav-szubsztitúciókat. Ezek a változtatások kívül esnek a KS-l/4-ellenanyag nehéz- és könnyűlánc V-régióinak CDR-szekvenciáin. A nehézlánc aminosav-szubsztitúciók végrehajtására egyértelműen megengedő 17 pozíció a CDR-szekvenciákon kívül eső aminosav-pozíciók mintegy 21%-át képviseli; és a CDR-szekvenciákon kívül eső azon aminosavpozíciók 68%-át képviseli, amelyekben aminosav-szubsztitúció végrehajtását megkíséreltük.

Hasonlóképp, a könnyűlánc aminosav-szubsztitúciók végrehajtására egyértelműen megengedő tizennyolc pozíció a CDR-szekvenciákon kívül eső aminosav-pozíciók mintegy 23%át képviseli; és a CDR-szekvenciákon kívül eső azon aminosav-pozíciók 72%-át képviseli, amelyekben aminosav-szubsztitúció végrehajtását megkíséreltük. Csak két olyan aminosavszubsztitúciót találtunk a CDR-szekvenciákon kívül, amelyek sokkal kevésbé előnyös protein keletkezését eredményezték: az Ala79Pro szubsztitúciót a könnyűláncban, amely úgy tűnik hátrányosan befolyásolta az expressziót; és a Q108T szubsztitúciót a nehézláncban, amely negatív irányban befolyásolta az antigénkötő aktivitást. Ennek megfelelően, aminosav-szubsztitúciót hozhatunk létre a KS-l/4-ellenanyag nehéz- vagy könnyűlánc szekvenciájában, a CDRrégiókon kívül, és nagy a valószínűsége annak, hogy a szubsztitúció aktív proteint eredményez.

: ·* · · ·· *·?- j*. X ¹

- 37 CDR-szekvenciákat érintő aminosav-szubsztitúciók létrehozásával beiktatott mutációk gyakran hátrányosan hatnak az antigénkötő képességre. Például, az I100M szubsztitúció beiktatása a nehézláncba mintegy nyolcszor csökkenti a kötőaktivitást. Aminosav-inszerciókkal járó mutációk általában negatív irányban befolyásolják a KS-l/4-szekvenciák alkalmazhatósagát. Például, a már említettek szerint, a VH’-369 nehézlánc V-régió nem képes könnyűlánccal megfelelően ellenanyaggá összeépülni. A VH2.1-2.4-mutációkat aminosav-inszerció eredményezi a nehézlánc V-régió CDR3-szegmensébe, és ezek mindegyike hátrányosan befolyásolja az antigénkötést.

5. példa

KS-l/4-ellenanyag (3. konstrukció)-IL2 fúziós proteinek immunogenitása emberben

Humán klinikai vizsgálatokban, húsz beteget részesítettünk egy vagy több olyan kezelésben, amelyekben három egymást követő napon, 4 óra alatt, KS-l/4-ellenanyag(3. konstrukció)-IL2 -t adtunk be intravénás infúzióval. Az egyes kezelési rendeket egy hónap különbséggel végeztük [Weber és mtsai.: Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 20, 259a (2001)]. A betegektől szérummintát vettünk a kezelés megkezdését megelőzően és azt követően, és azokat ellenanyag-reaktivitásra teszteltük teljes KS-ellenanyagé- konstrukció)-IL2-molekulával vagy az Fc-IL2-komponenssel (Fv-régiót nem tartalmazó konstrukcióval) szemben. A pre-immun szérumok egyike esetében mutattunk ki reaktivitást. Eredményeink szerint, csak 4 betegnél találtunk jelentősebb immunválaszt az önálló Fv-régió, vagy az Fc-IL-2-komponens Fv-régiójával szemben. Ezen felül, ez a válasz nem erősödött fel huKS-IL2-konstrukcióval történő ismételt találkozás után.

Az ellenanyag-IL2 fúziós protein alkalmazását különösen szigorú tesztnek tartjuk a Vrégió immunogenitásának meghatározására, mivel az interleukin-2-egység adjuváns hatású. Eredményeink szerint, a [KS-ellenanyag (3. konstrukció)] adagolható humán betegeknek, és a recipinesek csak igen kis számánál kell ellenanyagválaszra számítanunk a KS-ellenanyag (3. konstrukció)-IL2 fúziós proteinnel szemben. A fenti adatok különösen biztatóak annak tükrében, hogy a [KS-ellenanyag (3. konstrukció)] csaknem tejesen egéreredetű variábilis régiót tartalmaz, és abban csak néhány aminosav lett megfelelő humán aminosavakkal helyettesítve.

Egyenértékű megoldások

Miután a találmány szerinti megoldást teljes egészében ismertettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány tárgyköre kiterjed egyenértékű megoldásokra is anélkül, hogy a találmányi gondolattól vagy annak lényegi jellemzőitől eltérnénk. A találmány fenti előnyös

- 38 megvalósítási módjainak ismertetésén keresztül tehát csupán szemléltetni kívántuk a találmány szerinti megoldást, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk. A találmány tárgykörét tehát jobban tükrözik a csatolt a csatolt igények, mint az azt megelőző leírás, és az kiterjed egyenerteku változtatások szeles skalajara.

Hivatkozások:

Valamennyi idézett szabadalmi dokumentum és tudományos közlemény teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi.

• · · · · ···· · · · · • · · · · ·

A szekvencialistában található kötetlen szövegek fordításai

1. azonosítószámú szekvencia:

<223> Egéreredetű KS VK-szekvencia;

2. azonosítószámú szekvencia:

<223> Egéreredetű KS VH-szekvencia;

3. azonosítószámú szekvencia:

<223> Az EpCAM-ellenanyag variábilis könnyűlánc-szekvenciája, ahol:

Xaa jelentése az 1. pozícióban glutamin;

Xaa jelentése a 3. pozícióban valin;

Xaa jelentése a 10. pozícióban treonin vagy szerin;

Xaa jelentése all. pozícióban leucin;

Xaa jelentése a 12. pozícióban alanin;

Xaa jelentése a 13. pozícióban leucin vagy valin;

Xaa jelentése a 17. pozícióban glutamin;

Xaa jelentése a 18. pozícióban arginin;

Xaa jelentése a 19. pozícióban alanin;

Xaa jelentése a 21. pozícióban leucin vagy izoleucin;

Xaa jelentése a 32. pozícióban izoleucin;

Xaa jelentése a 36. pozícióban leucin;

Xaa jelentése a 41. pozícióban glutamin;

Xaa jelentése a 42. pozícióban alanin vagy prolin;

Xaa jelentése a 45. pozícióban leucin;

Xaa jelentése a 46. pozícióban leucin;

Xaa jelentése a 48. pozícióban tirozin;

Xaa jelentése az 57. pozícióban izoleucin;

Xaa jelentése az 59. pozícióban szerin;

Xaa jelentése a 69. pozícióban aszparaginsav vagy treonin;

Xaa jelentése a 71. pozícióban treonin;

Xaa jelentése a 73. pozícióban treonin;

Xaa jelentése a 75. pozícióban aszparagin;

Xaa jelentése a 77. pozícióban leucin;

Xaa jelentése a 79. pozícióban prolin;

Xaa jelentése a 82. pozícióban fenilalanin;

Xaa jelentése a 84. pozícióban valin;

Xaa jelentése a 103. pozícióban valin.

4. azonosítószámú szekvencia:

<223> Az EpCAM-ellenanyag variábilis nehézlánc-szekvenciája, ahol:

Xaa jelentése a 2. pozícióban izoleucin vagy valin;

Xaa jelentése a 9. pozícióban prolin vagy alanin;

Xaa jelentése all. pozícióban leucin vagy valin;

Xaa jelentése aló. pozícióban glutaminsav vagy szerin;

Xaa jelentése a 17. pozícióban treonin vagy szerin;

Xaa jelentése a 38. pozícióban lizin vagy arginin;

Xaa jelentése a 40. pozícióban treonin vagy alanin;

Xaa jelentése a 43. pozícióban lizin vagy glutamin;

Xaa jelentése a 46. pozícióban lizin vagy glutaminsav;

Xaa jelentése a 63. pozícióban aszparaginsav vagy lizin;

Xaa jelentése a 65. pozícióban lizin vagy glutamin;

Xaa jelentése a 68. pozícióban fenilalanin vagy valin;

Xaa jelentése a 69. pozícióban alanin, treonin vagy valin;

Xaa jelentése a 70. pozícióban fenilalanin vagy izoleucin;

Xaa jelentése a 71. pozícióban szerin vagy treonin;

Xaa jelentése a 72. pozícióban leucin vagy alanin;

Xaa jelentése a 73. pozícióban glutaminsav vagy aszparaginsav;

Xaa jelentése a 76. pozícióban alanin vagy treonin;

Xaa jelentése a 79. pozícióban alanin vagy leucin;

Xaa jelentése a 80. pozícióban fenilalanin vagy tirozin;

Xaa jelentése a 83. pozícióban izoleucin vagy leucin;

Xaa jelentése a 84. pozícióban aszparagin vagy szerin;

Xaa jelentése a 85. pozícióban aszparagin vagy szerin;

Xaa jelentése a 88. pozícióban aszparagin, alanin vagy szerin;

Xaa jelentése a 91. pozícióban metionin vagy treonin;

Xaa jelentése a 93. pozícióban treonin vagy valin;

Xaa jelentése a 100. pozícióban izoleucin vagy metionin;

Xaa jelentése a 108. pozícióban glutamin vagy treonin;

Xaa jelentése a 111. pozícióban szerin vagy treonin.

5. azonosítószámú szekvencia:

<223> Könnyűlánc konszenzusszekvencia ahol:

Xaa jelentése az 1. pozícióban glutamin vagy glutaminsav;

Xaa jelentése a 3. pozícióban leucin vagy valin;

Xaa jelentése a 10. pozícióban izoleucin vagy treonin;

Xaa jelentése all. pozícióban metionin vagy leucin;

Xaa jelentése a 13. pozícióban alanin vagy leucin;

Xaa jelentése a 18. pozícióban lizin vagy arginin;

Xaa jelentése a 21. pozícióban metionin vagy leucin;

Xaa jelentése a 41. pozícióban szerin vagy glutamin;

Xaa jelentése a 42. pozícióban szerin vagy alanin;

Xaa jelentése a 45. pozícióban prolin vagy leucin;

Xaa jelentése a 46. pozícióban triptofán vagy leucin;

Xaa jelentése az 57. pozícióban fenilalanin vagy izoleucin;

Xaa jelentése a 69. pozícióban szerin vagy aszparaginsav;

Xaa jelentése a 71. pozícióban szerin vagy treonin;

Xaa jelentése a 73. pozícióban izoleucin vagy treonin;

Xaa jelentése a 77. pozícióban metionin vagy leucin;

Xaa jelentése a 79. pozícióban alanin vagy prolin;

Xaa jelentése a 82. pozícióban alanin vagy fenilalanin;

Xaa jelentése a 84. pozícióban treonin vagy valin.

6. azonosítószámú szekvencia:

<223> Nehézlánc konszenzusszekvencia, ahol:

Xaa jelentése a 2. pozícióban izoleucin vagy valin;

Xaa jelentése a 9. pozícióban prolin vagy alanin;

Xaa jelentése all. pozícióban leucin vagy valin;

Xaa jelentése a 17. pozícióban treonin vagy szerin;

Xaa jelentése a 38. pozícióban lizin vagy arginin;

Xaa jelentése a 40. pozícióban treonin vagy alanin;

Xaa jelentése a 46. pozícióban lizin vagy glutaminsav;

Xaa jelentése a 63. pozícióban aszparaginsav vagy lizin;

·’·:’··’·:· J. :*

- 42 Xaa jelentése a 65. pozícióban lizin vagy glutamin;

Xaa jelentése a 68. pozícióban fenilalanin vagy valin;

Xaa jelentése a 69. pozícióban alanin vagy treonin;

Xaa jelentése a 70. pozícióban fenilalanin vagy izoleucin;

Xaa jelentése a 73. pozícióban glutaminsav vagy aszparaginsav;

Xaa jelentése a 76. pozícióban alanin vagy treonin;

Xaa jelentése a 80. pozícióban fenilalanin vagy tirozin;

Xaa jelentése a 83. pozícióban izoleucin vagy leucin;

Xaa jelentése a 84. pozícióban aszparagin vagy szerin;

Xaa jelentése a 85. pozícióban aszparagin vagy szerin;

Xaa jelentése a 88. pozícióban aszparagin, alanin vagy szerin;

Xaa jelentése a 91. pozícióban metionin vagy treonin;

Xaa jelentése a 93. pozícióban treonin vagy valin;

Xaa jelentése a 108. pozícióban glutamin vagy treonin.

7. azonosítószámú szekvencia <223> VK6-könnyűlánc

8. azonosítószámú szekvencia:

<223> VK7-könnyűlánc

9. azonosítószámú szekvencia:

<223> VK8-könnyűlánc

10. azonosítószámú szekvencia:

<223> „Veneered (olyan humanizált ellenanyag, amelyben a felszíni epitópok egy része az eredeti ellenanyagban található aminosavakra lett visszacserélve) KS VK-szekvencia

11. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag dezimmunizált VK1

12. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag dezimmunizált VK2

13. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag dezimmunizált VK3

14. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag dezimmunizált VK4

15. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag dezimmunizált VK5

16. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag egéreredetű VK

17. azonosítószámú szekvencia:

<223> Nehézlánc VH6

18. azonosítószámú szekvencia:

<223> Nehézlánc VH7

19. azonosítószámú szekvencia:

<223> VH2.5-nehézlánc

20. azonosítószámú szekvencia:

<223> „Veneered KS VH-szekvencia

21. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag dezimmunizált VH1

22. azonosítószámú szekvencia.

<223> KS-ellenanyag dezimmunizált VH2

23. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag dezimmunizált VH3

24. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag dezimmunizált VH4

25. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag dezimmunizált VH5

26. azonosítószámú szekvencia:

<223> KS-ellenanyag egéreredetű VH

27. azonosítószámú szekvencia:

<223> KSA „szensz” láncindító

28. azonosítószámú szekvencia:

<223> KSA „antiszensz” láncindító

29. azonosítószámú szekvencia:

<223> Kapcsolószekvencia adapter

30. azonosítószámú szekvencia:

<223> Kapcsolószekvencia adapter

31. azonosítószámú szekvencia:

<223> VH „előre” ^forward} láncindító

32. azonosítószámú szekvencia:

<223> VH „reverz” láncindító

33. azonosítószámú szekvencia:

<223> VK „előre” f forward’) láncindító

34. azonosítószámú szekvencia:

<223> VK „reverz” láncindító

35. azonosítószámú szekvencia:

<223> VH369-nehézlánc

36. azonosítószámú szekvencia:

<223> VH2.1-szekvenciarészlet

37. azonosítószámú szekvencia:

<223> VH2.2-szekvenciarészlet

38. azonosítószámú szekvencia:

<223> VH2.3-szekvenciarészlet

39. azonosítószámú szekvencia:

<223> VH2.4-szekvenciarészlet

40. azonosítószámú szekvencia:

<223> pdHL7s-VK8/VH7-I12-szekvencia

41. azonosítószámú szekvencia:

<223> Nehézlánc-IL2

42. azonosítószámú szekvencia:

<223> Könnyülánc

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag, amely immunglobulin könnyűlánc keretrégiót meghatározó aminosav-szekvenciaként:

(i) az 5. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-23. aminosavakat, ahol Xaal jelentése Q vagy E; Xaa3 jelentése L vagy V; XaalO jelentése I vagy T; Xaall jelentése M vagy L; Xaal3 jelentése A vagy L; Xaal8 jelentése K vagy R; Xaa21 jelentése M vagy L - azzal a megkötéssel, hogy az Xaal, Xaa3, XaalO, Xaall, Xaal3, Xaal8 vagy Xaa21 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos az 1. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosavval -;

(ii) az 5. azonosítószámú szekvencia szerinti 34-48. aminosavakat, ahol Xaa41 jelentése S vagy Q; Xaa42 jelentése S vagy A; Xaa45 jelentése P vagy L; Xaa46 jelentése W vagy L azzal a megkötéssel, hogy az Xaa41, Xaa42, Xaa45 vagy Xaa46 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos az 1. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosavval - vagy (iii) az 5. azonosítószámú szekvencia szerinti 56-87. aminosavakat, ahol Xaa57 jelentése F vagy I; Xaa69 jelentése S vagy D; Xaa71 jelentése S vagy T; Xaa73 jelentése I vagy T; Xaa77 jelentése M vagy L; Xaa79 jelentése A vagy P; Xaa82 jelentése A vagy F; és Xaa84 jelentése T vagy V - azzal a megkötéssel, hogy az Xaa57, Xaa69, Xaa71, Xaa73, Xaa77, Xaa79, Xaa82 vagy Xaa84 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos az 1. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosavval - tartalmazza.
2. Rekombináns antiEpCAM-ellenanyag, amely immunglobulin nehézlánc keretrégiót meghatározó aminosav-szekvenciaként:

(i) a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-25. aminosavakat, ahol Xaa2 jelentése I vagy V; Xaa9 jelentése P vagy A; Xaal 1 jelentése L vagy V; és Xaal7 jelentése T vagy S azzal a megkötéssel, hogy az Xaa2, Xaa9, Xaal 1, vagy Xaal 7 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos a 2. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosavval -;

(ii) a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 36-49. aminosavakat, ahol Xaa38 jelentése K vagy R; Xaa40 jelentése T vagy A; és Xaa46 jelentése K vagy E - azzal a megkötéssel, hogy az Xaa38, Xaa40 és Xaa46 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos a 2. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosavval -;

ι .· (iii) a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 67-98. aminosavakat, ahol Xaa68 jelentése F vagy V; Xaa69 jelentése A vagy T; és Xaa70 jelentése F vagy I; Xaa73 jelentése E vagy D; Xaa76 jelentése A vagy T; Xaa80 jelentése F vagy Y; Xaa83 jelentése I vagy L; Xaa84 jelentése N vagy S; Xaa85 jelentése N vagy S, Xaa88 jelentése N, A vagy S; Xaa91 jelentése M vagy T; és Xaa93 jelentése T vagy V - azzal a megkötéssel, hogy az Xaa68, Xaa69, Xaa70, Xaa73, Xaa76, Xaa80, Xaa83, Xaa84, Xaa85, Xaa88, Xaa91 vagy Xaa93 pozíciókban található aminosavak legalább egyike nem azonos a 2. azonosítószámú szekvencia megfelelő pozíciójában található aminosawal - vagy (iv) a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti 106-116. aminosavakat - ahol Xaal08 jelentése Q vagy T - tartalmazza.
3. Az 1. igénypont szerinti rekombináns ellenanyag, amely könnyűlánc keretrégióként:

(i) a 8. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-23. aminosavakat vagy (ii) a 9. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-23. aminosavakat tartalmazza.
4. A 3. igénypont szerinti rekombináns ellenanyag, amelyben a könnyűlánc a 9. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-106. aminosavakat tartalmazza.
5. A 2. igénypont szerinti rekombináns ellenanyag, amely nehézlánc keretrégióként:

(i) a 18. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-25. aminosavakat vagy (ii) a 18. azonosítószámú szekvencia szerinti 67-98. aminosavakat tartalmazza.
6. A 5. igénypont szerinti rekombináns ellenanyag, amelyben a nehézlánc a 18. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-116. aminosavakat tartalmazza.

Ί. Rekombináns anti-EpCAM-ellenanyag, amely a 9. azonosítószámú szekvencia szerinti 1-106. aminosavaknak megfelelő könnyűlánc-aminosavszekvenciát és a 18. azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc-aminosavszekvenciát tartalmaz.
8. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rekombináns ellenanyag, amelynek Kd-értéke EpCAM-antigénre vonatkoztatva legalább 10⁸ mol/L
9. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rekombináns ellenanyag, amely citokint is tartalmaz.
10. A 9. igénypont szerinti rekombináns ellenanyag, amely citokinként IL-2-molekulát tartalmaz.
11. Az 1. igénypont szerinti rekombináns ellenanyag, amely:

(i) az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 24-31. aminosavakat;

(ii) az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 49-55. aminosavakat vagy (iii) az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti 88-96. aminosavakat magába foglaló aminosav-szekvenciát tartalmaz.
12. A 2. igénypont szerinti rekombináns ellenanyag, amely:

(i) a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 26-35. aminosavakat;

(ii) a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 50-62. aminosavakat vagy (iii) a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 101-105. aminosavakat magába foglaló aminosav-szekvenciát tartalmaz.
13. Expressziós vektor, amely 1. vagy 2. igénypont szerinti ellenanyagot kódol.
14. Expressziós vektor, amely 7. igénypont szerinti ellenanyagot kódol.
15. Expressziós vektor, amely a 32. azonosítószámú szekvenciájú.
16. Eljárás EpCAM-hiperexpresszióval járó betegségben szenvedő humán beteg kezelésére, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti ellenanyagot adunk be a betegnek.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy citokint is tartalmazó ellenanyagot adunk be a betegnek.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ellenanyagot ellenanyagcitokin fúziós proteinként adjuk be a betegnek.

A meghatalmazott: DANUBIA Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.