MX2010010021A - Anticuepos anti-tyrp1. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos totalmente humanos y anticuerpos quiméricos que unen el antígeno TYRP1 humano con una afinidad comparable con o más alta que TA99, un anticuerpo de murino específico para TYRP1. La invención además proporciona ácidos nucleicos y células huésped que codifican y expresan estos anticuerpos. La invención también proporciona métodos para modular la actividad de TYRP1, tratar el crecimiento de una célula cancerosa, y tratar un melanoma maligno en mamíferos administrando una cantidad efectiva de un anticuerpo, ya sea solo o en combinación con un agente anti-cancerígeno o tratamiento.

Description

ANTICUERPOS ANTI-TYRP1 erencia cruzada Esta solicitud reivindica el beneficio icitud Provisional de Estados Unidos No. sentada el 12 de marzo de 2008. po de la invención La presente invención está dirigida a an anos y quiméricos, incluyendo fragmentos o porc mismos, que son específicos para la p acionada con la tirosinasa humana (TYRPl) . Los an utilizan para el tratamiento del crecimiento ulas cancerígenas y pueden usarse solo o en co un tratamiento o agente anti-neoplásico . ntificado anticuerpos y células T para TYRPl en melanoma. Parece que las respuestas celulares y eficaces en la eliminación del melanoma in nsferencia adoptiva de células T reactivas de bién resulta en la regresión de tumor. La resp icuerpo inducida por la vacuna de TYRPl tambi ibir el crecimiento de melanoma y la metástasi males .

Aunque se han estudiado una variedad de op tamiento para el melanoma incluyendo los inhibi écula pequeña, quimioterapéuticos , inmun luyendo vacunas (por ejemplo Patente de Estado 68,946), terapia de genes/inmunoestimuladores, iogénicos, en la actualidad, no existen terapias a los pacientes con melanoma. El desarrollo d tamientos para esta necesidad médica insatisfe 7-42 (1996).

Los ratones tratados con TA99 a menudo pi or del pelo (despigmentación) , sugiriendo la de melanocitos en la piel. La activación efectora me receptor Fc parece desempeñar un papel fundament minación de las células dirigidas por TA99. E i-tumor de TA99 se redujo drásticamente en ckout de FcR. Ver Clynes et al., Proc. Nati. A 95: 652-656 (1998) . Sin embargo, la naturaleza 9 significa que podría ser excluido del uso apéutico en humanos debido a problemas potenc unogenicidad y aún más su capacidad para act ciones efectoras inmunitarias cadena abajo po itada .

Por lo tanto, hay una necesidad de pro icuerpos anti-TYRPl alternativos que son eficac ellos anticuerpos conocidos en la técnica.

Además, existe una necesidad de pro icuerpos anti-TYRPl alternativos que unogenicidad reducida en humanos y capacidad mejo ivar las funciones efectoras inmunitarias cadena o la citotoxicidad celular dependiente de an CC) . La presente invención proporciona anticuerp P1 quiméricos y humanos que tienen inmuno ucida en humanos y una capacidad mejorada para ac ciones efectoras inmunitarias cadena abajo tal otoxicidad celular dependiente de anticuerpos { paración con aquellos anticuerpos conocidos en la También permanece una necesidad para pro icuerpos anti-TYRPl alternativos que tienen es orada a través de una reducción del mal plegamien teina y procesamiento incorrecto. Los an Una modalidad de la presente invenció icuerpo monoclonal que específicamente enlaza a ana con una constante de disociación, KD, a tempe iente de laboratorio (20°C-25°C) , en el rango en M a 1.6 x 10~9 M, en donde los valores de D se d resonancia de plasmón superficial. En otras mo la presente invención, el anticuerpo monoc mérico o humano. Los fragmentos de tales anticue gmentos retienen la capacidad de enlazar especifi P1 humana, forman parte de la invención, a pesa constantes de disociación para tales fragmentos el rango especificado.

En otras modalidades de la presente inven icuerpo monoclonal específicamente enlaza a TYRP una KD de aproximadamente 0.1 x 1( 9 M a aproxi x 10"9 M, aproximadamente 0.1 x 10"9 M a aproxi 1), una CDRH2 que tiene la secuencia WINTNTGN C ID NO: 2), una CDRH3 que tiene la secuencia R C ID NO: 3) , una CDRL1 que tiene la secuencia RA C ID NO: 4), una CDRL2 que tiene la secuencia DAS NO: 5) y una CDRL3 que tiene la secuencia QQRSNW NO: 6) en donde el anticuerpo además compr titución de aminoácido dentro de una de las secu . En otra modalidad, las CDRs antes mencionadas sustitución de aminoácido en una de las secue . En todavía otra modalidad, el anticuerpo que t s mencionadas antes específicamente enlaza a TYR una constante de disociación KD en el rango des M a 1.6 x 10"9 M.

En otra modalidad de la presente inven icuerpo o fragmento del mismo que específicamente P1, comprende una CDRH1 que tiene la secuencia G Otra modalidad de la presente invenció icuerpo o fragmento del mismo que enlaza a prende VL que tiene la secuencia: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQA SNRATGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN TKLEIK (SEC ID NO: 16) na secuencia de VH de QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTSYA NWVRQAPGQ NTNTGNPTYAQGFTGRFVFS DTSVSTAYLQISSLKAEDTAIY SWYLDYWGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 13) QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQ NTNTGNPTYAQGFTGRFVFSMDTSVSTAYLQISSLKAEDTAIY SWYLDYWGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 14).

Otra modalidad de la presente invenció lados que codifican tales anticuerpos y porcione mos. Otras modalidades de la presente invención ácido polinucleico aislado que comprende una sec leótidos que codifica el anticuerpo, o un frag mo; un vector de expresión que comprende la sec leótidos enlazada a un una secuencia de expresi ula huésped recombinante que comprende el v resión o una célula huésped recombinante o una pr mismos, en donde la célula expresa el antic gmento del mismo. Aún otra modalidad de la ención es un método para producir o puri icuerpo, o fragmento del mismo, que comprende el las células bajo condiciones que permitan la expr icuerpo o fragmento.

Además, la presente invención está di odos ara inhibir el crecimiento de una célula de un anticuerpo de la invención para la manufactu icamento para el tratamiento del cáncer. En una ferida el cáncer es el melanoma maligno.

Los anticuerpos pueden ser usados sol binación con un agente anti-neoplásico o tratami alidad de la presente invención está usa icuerpos descritos anteriormente en combinación tamiento o agente anti-cancerigeno adicional, alidad, el agente anti-cancerigeno es dacarbazina. cripcion detallada de la invención La presente invención proporciona an anos y quiméricos y fragmentos de los mismos, es a el antigeno TYRP1, asi como también secue inucleótido aisladas o purificadas que codif icuerpos. Los anticuerpos de la presente invenci icamente tienen dos cadenas pesadas idéntica enas ligeras idénticas con cada cadena alentemente enlazada a una cadena pesada por un ulfuro inter-cadena . Los múltiples enlaces de cionalmente enlazan las dos cadenas pesadas entre utiliza en el presente documento, el término "an luye moléculas de inmunoglobulina que comprenden ipeptidicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadena interconectadas por enlaces de disulfuro. Las ividuales pueden doblarse en dominios que tiene ilares (110-125 aminoácidos) y estructura erentes funciones.

La cadena ligera puede comprender un iable (abreviado en el presente documento como V inio constante (abreviado en el presente docume . Las cadenas li eras de anticuer os (inmuno l cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 reviados en el presente documento colectivamente humanos, las isotipos son IgA, IgD, IgE, IgG e e IgG adicionalmente subdivididos en subclases o Ai-2 e IgGi-4) . La presente invención incluye antic lquiera de las clases o subclases (isotipos) men IgGi humana es el isotipo preferido para los an la presente invención.

Por lo general, los dominios variables siderable variabilidad de secuencia de aminoáci icuerpo al siguiente, particularmente en la ubic io de enlace de antigeno. Tres regiones, llamadas ervariables o determinantes de complementariedad encuentran en cada una de VL y VH, que son sopor iones menos variables llamadas regiones de armaz aminoácidos se asi nan a una re ión articular inios VL y VH es designada Fv (Fragmento var stituye el sitio de enlace de antigeno. La cadena Fv) es un fragmento de anticuerpo que contiene u y un dominio VH en una cadena de polipéptido, en término de un dominio y el C término del otro d n mediante un enlazante flexible (véase, por ejem Estados Unidos No. 4,946,778 (Ladner et al.); O ston et al.); WO 92/01047 ( cCafferty et al.) de ualización de fragmentos de scFv en la superfici uetes de visualización genética recombinantes es como bacteriófagos.

Los enlazantes peptidicos utilizados para anticuerpos de cadena única pueden ser péptidos eccionados para asegurar que el plegamiento tridi opiado de los dominios VL y VH ocurra. El enla eralmente de 10 a 50 residuos ami ambiente natural; (3) es monoclonal; (4) está as proteínas de la misma especie; (5) se expresa ula de una especie diferente; o (6) no se presen uraleza. Los componentes contaminantes de su ural son materiales que podrían interferir gnósticos o terapéuticos para el anticuerpo luir las enzimas, hormonas y otros solutos proteí teínico. Los ejemplos de anticuerpos aislados in icuerpo que ha sido purificado por afinidad, un a ha sido hecho por un hibridoma u otra línea ce ro, y un anticuerpo humano derivado de u nsgénico.

El término "anticuerpo monoclonal", como s el presente documento, se refiere a un anticuerpo una población de anticuerpos sustancialmente ho ejemplo, los anticuerpos individuales ue compr ígido contra un determinante único sobre el ant ificador "monoclonal" indica el carácter del a o se obtiene de una población sustancialmente hom icuerpos, y no será construido como que req ducción del anticuerpo por cualquier método en par El término "anticuerpos", como se utiliz sente documento, también incluye anticuerpos "qu munoglobulinas ) en los que una porción de la cade ligera es idéntica con u homologa a s respondientes en anticuerpos derivados de una es ticular o que pertenece a una clase o sub icuerpo particular, mientras que el resto de la idéntico u homólogo con secuencias correspondi icuerpos derivados de otra especie (por ejemplo, a) o perteneciente a otra clase o subclase de an como fragmentos de tales anticuerpos, mien ano. La cadena ligera quimérica puede c lquiera de las regiones variables de cadena li scritas en el presente documento o mutantes o var mismos fusionados a una región constante de cade un anticuerpo no humano.

El término "anticuerpo humano", como se u presente documento, incluye anticuerpos qu iones variables y constantes correspondientes a s inmunoglobulina de linea germinal humana (como se Kabat, et al.f (1991) Seguences of Prot unological Interest, 5a Edición, Departamento de vicios Humanos de los Estados Unidos, Publicació 3242) . Los anticuerpos humanos de la invenció luir residuos aminoácidos no codificados uencias de inmunoglobulina de linea germinal hu m lO las mutaciones introducidas or azar o mu a especie de mamífero, tal como un ratón, se han re secuencias de armazón humanas.

La frase "anticuerpo humano recombinante" icuerpos humanos que están preparados, expresados aislados por medios recombinantes, tales como an resados utilizando un vector de expresión rec nsfectado en una célula huésped, anticuerpos ai biblioteca de anticuerpo humano comb ombinante, anticuerpos aislados de un animal nsgénico para los genes de inmunoglobulina h icuerpos preparados, expresados, creados o aisl lquier otro medio que involucra el empalme de s genes de inmunoglobulina humana a otras secuencia es anticuerpos humanos recombinantes tienen iables y constantes derivadas de secuen unoglobulina de línea germinal humana (Ver, Kabat, plejos de múltiples proteínas tipo IgG, la pleja requiere dominios constantes de Fe.

Asi, los anticuerpos de la invención inclu se limitan a, anticuerpos que se presentan natu icuerpos, anticuerpos humanos, anticuerpos hum icuerpos humanos recombinantes , anticuerpos mono gmentos de digestión, porciones especificas y var mismas, incluyendo miméticos de anticuerpo o c ciones de anticuerpos que imitan la estructura y/ un anticuerpo o fragmento especifico o porción d a uno contiene al menos una CDR. Los f cionales incluyen fragmentos de enlace de azan a un antigeno de TYRPl. Por ejemplo, fragrr icuerpos capaces de enlazar a TYRPl o a una por mo, y que son abarcados por la presente invención gmentos bivalentes tales como (Fab' )2 con en sina, reducción parcial y re-agregación) y Fv o mplOf por técnicas de biología molecular) . Los f anticuerpo también se propone que incluyan, por icuerpos con dominio eliminado, anticuerpos icuerpos de cadena única, scFv, anticuerpos de co, anticuerpos cadena única multivalentes , an tiespecífieos formados a partir de fragme icuerpos, incluyendo diacuerpos, triacuerpos, y se enlazan específicamente con los antígenos.

La región de bisagra separa las porciones anticuerpo, proporcionando la movilidad de Fabs os demás y con relación a Fe, así como también tiples enlaces de disulfuro para enlace covalent cadenas pesadas.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismo sente invención son específicos para TY icuerpo tiene más de una especificidad, los onocidos pueden estar asociados con un antigeno más de un antigeno. Por lo tanto, la presente porciona anticuerpos bi-especificos, o fragmento mos, que enlazan a dos antigenos diferentes, con especificidad para TYRPl.

La presente invención proporciona an lados o fragmentos de los mismos, específicos pa proteína TYRPl es de mamífero, y preferible ana. En una modalidad especialmente prefer icuerpo de la invención es capaz de enlazar tant ana como TYRPl murina [Shibahara et al., Nucle . 14(6) 2413-2427 (1986)] y, por tanto, es útil udios in vivo preclínicos y clínicos. Los anticu invención son capaces de una o más de las s ividades: 1) mostrando alto enlace de afinidad ha gmentos de los mismos, también incluyen aquellos les las características de enlace se han modi orado por mutación directa, métodos de madur nidad, expresión de fago o transposiciones de c nidad y especificidad pueden ser modificadas o CDRs de mutación y seleccionando sitios de e ígeno que tienen las características deseadas ( mplo, Yang et al., J. Mol. Biol., (1995) 254: CDRs son mutadas en una variedad de formas. Una atorizar los residuos individuales o combinac iduos de modo que en una población de sitios de ígeno idénticos de otra forma, todos los noácidos se encuentran en posiciones part ernativamente, las mutaciones son inducidas sobre residuos de CDR por métodos PCR propensos a erro ejemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol., (1992) son mutados para generar todas las sustituc noácido posibles en cada sitio. Las varia icuerpo asi generadas se muestran en una forma mo las partículas de fago filamentoso como fus ducto de gen III de M13 empaquetado dentro tícula. Las variantes de expresión de Fago l eccionadas para su actividad biológica (por eje nidad de enlace, especificidad, IC50, EC50, KD) ulga en el presente documento. A fin de identi ios de región de CDR candidatos para su modific agénesis de exploración de alanina puede realiza ntificar los residuos de región de CDR que co nificativamente al enlace de antígeno. Alternativ más, la mutagénesis aleatoria puede realizarse secuencias de CDR en una o más posiciones de re mientras que la CDR es operativamente enlaza Como se describe en este documento, ademá icuerpos específicamente descritos, otros an ificados "sustancialmente homólogos" pueden ilmente y manufacturarse utilizando diversas té recombinante bien conocidas por aquellos expert nica. Por ejemplo, las regiones de armazón pued las secuencias nativas en el nivel de estructura varias sustituciones de aminoácido, adic resiones terminales e intermedias, etc.. Ademá lizarse una variedad de diferentes regiones de anas sencillamente o en combinación como una base unoglobulinas humanizadas de la presente inven eral, las modificaciones de los genes pueden r ilmente por una variedad de técnicas bien conoc o mutagénesis dirigida al sitio.

La presente invención incluye polipép odo de búsqueda FASTA de conformidad con Pearson oe. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85:2444-8).

Los anticuerpos de la presente inven gmentos de los mismos, incluyen los anticuerpos tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis erminantes de complementariedad (CDR) seleccion po que consiste de las secuencias de aminoácido s tal como se describe en la Tabla 1.

En otra modalidad, los presentes anticu gmentos de los mismos, pueden tener una región va ena pesada de 20D7 o 20D7S y/o una región var ena ligera de 20D7 o 20D7S, resumida posteriorme 0D7S son anticuerpos particularmente preferido sente invención. Estos anticuerpos tienen reg azón (FRs) VH y VL humanas, asi como CDRs humanas.

La resente invención inclu e secuencias mas como se divulga en el presente documento.

Cada dominio de los anticuerpos de esta de ser un anticuerpo completo con el dominio va ena pesada o ligera, o puede ser un equivalente un mutante o derivado de un dominio que se uralmente o un dominio sintético construido, por vitro utilizando una técnica de tal como se descr 11236 (Griffiths et al.). Por ejemplo, es posi juntamente dominios correspondientes a los iables de anticuerpos, que están ausentes de al noácido. También se incluye un anticuerpo con u tituciones, mutaciones o eliminaciones de a tro de una de las secuencias de CDR. La acteristica importante es la capacidad de cada a asociarse con un dominio complementario para io de enlace de antigeno. En consecuencia, los racterization of Rodent and Human Hybridomas, , Eds., Laboratory Techniques in Biochemis ecular Biology, Volumen 13, Elsevier Science Pu terdam (1985); asi como por el método de ADN rec crito por Huse et al., Science 246:1215-1281 (198 Los fragmentos de anticuerpos pueden ser p escisión de un anticuerpo completo, o expresand codifica el fragmento. Los fragmentos de an dén ser preparados por métodos descritos por L , J. Immunol. Methods 56: 235-243 (1983) y por P unol. 131: 2895-2902 (1983). Tales fragmento tener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento e fragmentos también pueden contener anticuerpos iable de fragmento de cadena única, es deci cuerpos u otros fragmentos de anticuerpos. Los a producir tales equivalentes funcionales se rev ariotas, tales como las levaduras, se pueden util ernativa .

Las células huésped transformadas son c los métodos conocidos en la técnica en un medi contiene fuentes asimilables de carbono (carb o la glucosa o la lactosa) , nitrógeno (ami tidos, proteínas o sus productos de degradaci tonas, sales de amonio o similares) y sales in lfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, nesio y calcio) . El medio además contiene, por tancias que promueven el crecimiento, tales co mentos, por ejemplo hierro, zinc, manganeso y simi Donde se desea expresar un constructo de g adura, un gen de selección adecuado para su adura es el gene trpl presente en el plásmido de 7. Stinchcomb et al. Nature, 282:39 (1979); Kin plásmidos conocidos que portan el gene Leu2.

Los anticuerpos de la invención pueden ser purificados por cualquier método conocido en la luyendo la precipitación por sulfato de amonio sodio seguido por diálisis contra solución matografía de intercambio iónico, cromatogr nidad o inmuno-afinidad asi como filtración e ctroforesis de zona. Un método preferido de pur a los anticuerpos de la invención actual matografía de afinidad de proteína-A.

Los anticuerpos humanos codificantes de A preparados por recombinación de regiones cons iones variables humanas codificantes de ADN, dife CDRs, derivadas sustancialmente o exclusivament iones de anticuerpo humano correspondientes y ificantes de ADN derivadas de un humano. resión de fago de anticuerpos, como se conoc nica. Los anticuerpos e emplificados de la ual se realizaron a través de la tecnología de ratones inmunizados.

Además, la presente invención proporciona expresión que contienen las secuencias de polin viamente descritas operativamente enlazadas uencia de expresión, una secuencia promotora y me ha desarrollado una variedad de vectores de expré síntesis eficiente de polipéptido de antic temas procariotas, tales como bacterias y ariotas, incluyendo pero no limitado a la levadu temas de cultivo de células de mamífero. Los ve presente invención pueden comprender segme uencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sin Puede utilizarse cualquier vector de la combinación de vectores de mamíferos funcional o los descritos más arriba, y plásmidos funcional fago .

Los vectores de expresión eucariotas ad conocidos en la técnica (por ejemplo, P.J. Sou Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341 (1982); Sub Mol. Cell. Biol. 1: 854-864 (1981); Kaufmann a Mol. Biol. 159: 601-664 (1982); Scahill et al i. Acad. Sel. USA 80: 4654-4659 (1983); y Ur sín, Proc. Nati. Acad. Sel. USA 77: 4216-4220 (198 Los vectores de expresión útiles en la ención contienen al menos una secuencia de co resión que operativamente está enlazada con la ADN o fragmento que se expresa. La secuencia de c erta en el vector a fin de controlar y re resión de la secuencia de ADN clonada. Los eje mplo, los promotores temprano y tardío o SV40 uencias conocidas por controlar la expresión de células procariotas o eucariotas y sus binaciones de los mismos.

La presente invención también proporciona sped recombinantes que contienen los vectores de viamente descritos. Los anticuerpos de la ención pueden expresarse en las líneas celulares hibridomas. Los ácidos nucleicos, que compre uencia que codifica un polipéptido de acuerdo ención, pueden utilizarse para la transformació ula huésped de mamífero adecuada.

Las líneas celulares de preferencia se se ándose en el alto nivel de expresión, stitutiva de la proteína de interés y la cont ima de las proteínas huésped. Las líneas celu i HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli i DHI y E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, t cillus subtilis y Streptomyces .

Estas presentes células huéspedes reco dén utilizarse para producir un anticuerpo, o mismo, cultivando las células bajo condici mitan la expresión del anticuerpo o fragmento de ificando el anticuerpo o fragmento del mismos de sped o medio que rodea a la célula huésped. El anticuerpo expresado o fragmento para secreció ulas huésped recombinantes puede facilitarse me erción de una señal o secuencia de codificación d er secretora (ver, Shokri et al., (2003) Appl technol. 60 ( 6) : 654-64 , Nielsen et al., Prot. En :l-6 y von Heinje et al., (1986) Nucí. Acids Res. 0) en el extremo 5' del gene de codificación de a iduos de aminoácido pueden ser un indicador de zás para facilitar el aislamiento. También se c os residuos de aminoácido para encausar los anti anos o tejidos específicos .

Otra modalidad para la preparación de an la presente invención es la expresión del ácido codifica el anticuerpo de acuerdo con la invenc mal transgénico que tiene una porción sustan icuerpo humano que produce genoma insertado y s iciente en la producción de anticuerpos endóge males transgénicos incluyen, pero no se limitan a ra y conejo. Una modalidad adicional de la luye la expresión del gene de codificación de a por ejemplo, la glándula mamaria del animal reción de polipéptido durante la lactancia.

La presente invención también proporciona luyendo inhibir, desacelerar, disminuir o rev greso de la afección subyacente o cambio fi eseable asociado con una enfermedad o trastorno síntomas clínicos de una afección o prevenir la los síntomas clínicos de la afección. Los r nicos beneficiosos o deseados incluyen, pero s ita a, alivio de los síntomas, disminución de la una enfermedad o trastorno, estabilización ermedad o trastorno (es decir, donde la enfe storno no empeoran) , retraso o disminución gresión de una enfermedad o trastorno, alivio o la enfermedad o trastorno y la remisión (ya sea cial) de la enfermedad o trastorno, si es dete etectable. "Tratamiento" también puede signi longación de la supervivencia en comparación ervivencia esperada, si no recibe tratamiento. Aq anoma lentiginoso acral, melanoma invasivo y sí anoma y mola atípica familiar (FAM-M) . En una mod invención, el melanoma es una forma específica d otra modalidad el melanoma puede ser mali alidad de la presente invención podría ser utili describe a continuación, los anticuerpos anti-TY ualidad descritos para tratar el melanoma de ea . En otra modalidad, los anticuerpos anti-TYR ualidad descritos podrían ser el tratamiento de ea para el melanoma metastásico, es decir, se ut una primera ronda de tratamiento del melanoma me ién diagnosticado.

En los métodos de la presente invenc tidad terapéuticamente eficaz de un anticuerp ención se administra a un mamífero en necesidad d dosis efectivas de las composiciones de la puede obtener el resultado buscado. Pue inistrados, por ejemplo, intravenosame tramuscularmente . A pesar de que los anticuerpos h invención son particularmente útiles inistración a humanos, pueden ser administrados iferos también. El término mamífero como se util sente documento se propone que incluya, pero itado a, humanos, animales de laboratorio, ésticas y animales de granja. La cantidad terapéu caz significa una cantidad de anticuerpos de la ención que, cuando se administra a un mamífero, a producir el efecto terapéutico deseado, tal com crecimiento del tumor. Las dosis de tratamiento p stadas utilizando métodos de rutina conocidos por experiencia en la técnica para optimizar la se icacia . icuerpo para producir una respuesta deseada ividuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz ta en la cual cualquiera de los efectos t judiciales del anticuerpo o porción de antic pensado por los efectos terapéuticamente benefici imenes de dosificación pueden ajustarse para pro respuesta deseada óptima (por ejemplo, una apéutica o profiláctica) .

La identificación de tal enfermedad e tro de la capacidad y reconocimiento de un exper nica. Por ejemplo, los individuos humanos q eciendo melanoma maligno o que están en r arrollar síntomas clínicamente significati cuados para la administración de los presentes an i-TYRPl .

Los presentes anticuerpos anti-TYR paciente. Las programaciones de dosificación iarán con el estado de enfermedad y el es íente, típicamente variarán de una dosificación ca o infusión continua a múltiples administraci (por ejemplo, cada 4-6 horas), o como se indic ico tratante y la condición del paciente. mplar no limitante para una cantidad terapéu caz de un anticuerpo de la invención es 0.1-50 m ferentemente 3-35 mg/kg y más preferentemente 5—2 cantidades y frecuencias de dosificació erminadas por los médicos que tratan al paciente luir dosis de menos de 1 mg/kg y más de 100 mg/ riamente, tres veces por semana, cada semana, una semanas, o con menos frecuencia. Las dos inistración pueden estar en el rango de 1 a 100, mg/kg. Sin embargo, debe señalarse que la falan y dacarbazina (DTIC) . Los estudios in viv la administración de 20D7 en combinación con da IC) demuestra actividad anti-tumor más fu paración con la mono-terapia en un xenoinjert ano. En una modalidad de la presente invenc icuerpos anti-TYRPl descritos en la actualidad s binación con dacarbazina. Los ejemplos de antime luyen, pero no se limitan a, doxor norrubicina, paclitaxel, irinotecan (CPT-11) y t ndo el agente anti-neoplásico es la radiación, 1 la radiación puede ser externa (terapia de radi externo - EBRT) o interna (braquiterapia íente que es tratado. La dosis de agente anti-n inistrada depende de numerosos factores, incluye mplo, el tipo de agente, el tipo y la severidad se trata y la vía de administración del age la afección neoplásica del paciente. Mal erentes pueden requerir el uso de anticuerpos a ecificos y agentes anti-neoplásicos específicos, erminarán en una base de paciente a paciente. Las inistración incluyen, por ejemplo, la administrac ravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramusc as parenterales son las preferidas. Debe destaca argo, que la presente invención no se limita a odo o ruta de administración en particular.

En otro aspecto de la invención, un a i-TYRPl de la invención puede ser quimica sinteticamente enlazado a uno o más agente plásicos o anti-angiogénicos .

La invención adicionalmente contempla an i-TYRPl enlazados a porciones objetivo o re luyendo por vía de ejemplo solamente a ente ptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno a, solución salina, solución salina amortig fato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, binaciones de los mismos. Los portadores farmacéu ptables pueden comprender además pequeñas canti tancias auxiliares tales como agentes humec lsionantes, conservadores o amortiguadores, que m a en anaquel o efectividad de la proteina de en posiciones de la inyección pueden, como es bien técnica, ser formuladas para proporcionar una l ida, sostenida o retardada del ingrediente activ la administración al mamífero.

Por otra parte, incluido dentro del ámbi sente invención está el uso de los presentes an vivo e in vitro para métodos de investigaci gnóstico, que son bien conocidos en la técn iones CDR de 20D7 o 20D7S.

En una modalidad, el anticuerpo enlaza a tasa constante de disociación (K^ o koff) entre 1 (s_1, 1/segundos) y 5 x 10"4 1/s, como se mid onancia de plasmón de superficie, descrita en la temperatura ambiente de laboratorio (20°C-25°C) . alidad, el anticuerpo enlaza a TYRPl con una Kd o x 10"4 1/s y 3.5 x 10~4 1/s. En una modalidad a anticuerpo enlaza a TYRPl con una tasa cons ociación, como se mide por resonancia de pí erficie, que está dentro del 10% de la tasa con ociación determinada para 20D7, 20D7S, o CTA99 mas condiciones.

Una modalidad de la presente invención com icuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, especi P1 que comprende una o más regiones determin ocional, o un fragmento del mismo, que comprende ión variable de cadena ligera seleccionada del siste de 20D7, 20D7S y CTA99 y (ii) una región va ena pesada seleccionada del grupo que consiste 7S y CTA99. En otra modalidad, la invenció icuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, especi P1 que comprende (i) una región variable de cade CTA99 (ii) una región variable de cadena pesada d i) regiones constantes inmunoglobulina Gi (hlgGi) Otra modalidad de esta invención es un m tamiento del cáncer en un mamífero que comp inistración al mamífero de una cantidad efecti icuerpo o fragmento del mismo, de cualquiera alidades ya descritas. La invención también propo odo para tratar un melanoma maligno. Otro m tamiento proporcionado por esta invención se Todas las referencias que se mencionan umento están incorporadas en su totalidad. mplos Los ejemplos que siguen ilustran la invenc deben ser construidos para limitar el alcance de era. En ninguna forma deberán se construidos, sin o limitantes del amplio alcance de la inven cripción detallada de los métodos convencionale o los empleados en la construcción de ve smidos, la inserción de genes que codifican pol tales vectores y plásmidos, la introducción smidos en las células huésped y la expresi erminación de los mismos de genes y productos de obtenerse de numerosas publicaciones, i brook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A L York, NY) . 624mel y 1102mel fueron obtenidos ve Rosenberg (National Cáncer Institute, Bethes 5 fue comprado a la Colección Americana de Cult nassas, Virginia) . Ratones Nu/Nu hembras de sei anas de edad fueron comprados a Taconic Farms (Ge . resión y Purificación de Anticuerpos Anti-TYRPl Hu méricos Para cada anticuerpo, modificar genéticam uencia de nucleótidos de cadena pesada adecú mplo SEC ID NOs 21, 22 ó 23 (para 20D7, 20D7S pectivamente) en un plásmido de expresión adecú mplo pGSHC y modificar genéticamente una secu leótido de cadena ligera adecuada, por ejemplo SE ó 27 (para 20D7/20D7S y CTA99 respectivamente azado a enzimas (ELISA) y seleccionar el mayor cultivo en matraces giratorios. Purificar los an iante un método adecuado, como la cromatog nidad de proteina-A.

Una modalidad de la presente invenció icuerpo monoclonal humano recombinante 20D7, una relacionada con la tirosinasa (TYRP1 o TRP1) exp superficie celular dirigida a IgGlK de longitud anticuerpo está comprendido de una cadena pes ma-1 humana (subgrupo I) y una cadena ligera kap bgrupo III) . 20D7 fue mostrado que enlaza selecti Pl humana con alta afinidad y potente actividad a iada en modelos de xenoinjerto por un mecan olucra la activación de la función efectora inmuni Una modalidad de la presente invenció icuerpo monoclonal humano recombinante 20D re tiene el potencial para mal aparearse c teinas que participan en el puenteo de disulfuro er-cadena de polipéptidos de cadena pesada y li apareamiento podría potencialmente resu gamiento y procesamiento inapropiado, aument erogeneidad del producto y, potencialmen abilidad. El análisis de gel SDS PAGE descrit sente confirma la presencia de la cadena ligera ena pesada libre en la preparación de 20D7, sencia de cadenas ligeras libres y cadenas pesad reduce o elimina en la preparación de 20D7S.

Otra modalidad de la presente invención e anticuerpo quimérico con una región constante hum anticuerpo murino TA99 (Patente de Estados 98,790) contiene dos cadenas ligeras; una caden 9 es específica de TYRP1 y la otra es de cé noáciclo y SEC ID NOs de las diversas CDRs de la ención. La tabla 3 proporciona las SEC ID NOs ersas secuencias relacionadas con la presente i secuencias de ácido polinucleico que codif uencias de aminoácidos divulgadas posteriorm bién incluidas dentro del ámbito de la presente i la 1: Secuencia de aminoácidos de anticuerpos 20D7 s de región variable de cadena ligera y pesada.

SEC ID dena Pesada Cadena Ligera NO.

R1 GYTFTSYAMN RASQSVSSYLA R2 WINTNTGNPTYAQGFTG DASNRAT R3 RYSSSWYLDY QQRSNWLMYT la 2: Secuencia de aminoácidos de anticuerpo CTA9 esado CDR de la región variable de cadena.

Los anticuerpos utilizados en los exp án comprendidos de cadenas ligeras y pesadas de pleta sin señales, tal como se indica en la Tabla la 4: Resumen de datos de anticuerpo 20D7, 20D7S y no determinado. ayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas de compete ISA) Recubrir las placas de fondo plano de 96 ar la placa 3x y añadir 50 L/cavidad de ! , 5, 5 ' -tetrametilbencidina (TMB; KPL, Gaithersbur placa. Leer las placas a 450 nm, utilizando un 1 roplacas (tal como Molecular Devices) . la 5: Ensayo Inmunoabsorbente Enlazado a Enzimas ( La concentración de un efecto mínimo medio e en molar (M) . Los anticuerpos, incluyendo 20D7 7S humano y CTA99, exhiben enlace específico ana en un ensayo de ELISA. mplificado en la presente exhiben el enlace a TYR se expresa en las lineas de células humanas S el23, en comparación con el IgGi humana de cont mo modo, el análisis de citometria de flujo que a anticuerpos CTA99 y 20D7 ejemplificados en la iben el enlace a TYRP1 que expresa la linea célul mel cuando se compara con el IgGi humana de contro lisis de Biacore / Resonancia del Plasmón de la Su Medir la cinética de enlace de los antic P1 . humana recombinante a temperatura ambi oratorio (20°C - 25°C) usando la resonancia de erficial, por ejemplo un biosensor Biacore (Ph ovilizar la proteina TYRP1 en un chip de sensor investigación de CM5 e inyectar los anticue centraciones que varían desde 0.5 nM a 100 nM. mplificados en el presente documento, TA99, CTA99, 7S, se resumen a continuación en la Tabla 6. la 6: Cinética de Enlace de Anticuerpos para TYR ombinante El análisis Biacore del enlace de 20D7 y 20 P1 humana demuestra afinidades de enlace e tancial; en consecuencia los 20D7 y 20D7S son c idos para anticuerpos terapéuticos. ayo de Citotoxicidad Dependiente del Complemento ( cavidad e incubar durante 1 hora a 37 °C. Co ulas para viabilidad con Trypan Blue (Invitro hnologies) .

La tabla 7 muestra el porcentaje de citoto erentes concentraciones de anticuerpos en el e . Los datos demuestran que los anticuerpos 20D7 ucen CDC contra células 624mel humanas TYRP1 (+) 20D7 desencadenó la lisis celular mediada plemento de depende de la dosis de células anzando la lisis celular completa en este ensayo centración de anticuerpos de 3.7 g/mL. En cons ste una fuerte respuesta efectora inmunitaria par 7 y CTA99. % de Lisis Especifica = % de P otoxicidad - % de Citotoxicidad de Control Negativ la 7: Datos de CDC que Demuestran la Activa Colectar y lavar las células 624mel co cuados, tales como medios AIM V (Invitrog hnologies) y colocar en placas las células a una 10,000 células/cavidad en un volumen de 100 µ?, cá de fondo de Falcon U de 96 cavidades, icuerpos a 5 µg/ml en un volumen de 50 µ? e incub 0.5 hr con células objetivo. Las células efector didas en un volumen de 50 µ? en distintas relac (efectora : objetivo) . Las placas fueron cionalmente durante 4 horas a 37 °C. Después ubación, las placas fueron giradas hacia abajo a µ? de sobrenadantes fueron transferidos suav cas de fondo plano de 96 cavidades. El reactivo d lactato deshidrogenasa fue añadido como se especi fabricante (Roche) y las placas fueron leídas a troles de ensayo: Espontáneo de Objetivo y M tra células 624mel humanas de TYRP1 ( + ) in vitr fuerte respuesta efectora inmunitaria para ADCC 7 y CTA99.

% Citotoxicidad = (Experimental ontáneo) / (Máximo de Objetivo - objetivo espontáneo la 8: ADCC contra Melanoma Humano In Vitro ayos de Estabilidad de 20D7S y 20D7 Cargar 20D7 y 20D7S en gel SDS-PAGE (elect gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de cutar geles utilizando el aparato BioRad hasta adas libres. Por consiguiente, el 20D7S es una l más estable que 20D7. 99 y 20D7 Tratan Efectivamente los Xenoinje anoma Humano.

Para los siguientes estudios subcutáne úmenes de tumor se calcularon por la 6 (WlxW2xW2 ) ] , donde Wl representa el diámetro má tumor y W2 representa el diámetro más pequeño d C = 100 x (Volumen de Tratamient cial) / (Volumen de Control/Volumen Inicial). El adistico se realiza utilizando técnicas tradicion or p. Para los estudios subcutáneos que el val cula basados en el volumen del tumor de anim iben el anticuerpo anti-TYPR versos el volumen d los animales de control. Para los siguientes actividad del agente único in vivo del anticuer Pl en los modelos de xenoinjerto de melanoma human Recolectar, lavar y resuspender las célula tivadas en una solución de 50/50 de los medios de PMI 1640 (10% de FBS inactivado con calor) . Para tumor subcutáneo, inyectar 2 x 106 células cutánea en el flanco izquierdo de ratones desnudo tumores alanzan 200 mm3, tratar los rato icuerpos anti-TYRPl o controlar el IgG humana; ad icuerpos 1 mg/ratón tres veces por semana. Medir pinzas dos veces por semana y calcular % T/C. ividad del agente único in vivo de anticuerpo a los modelos de xenoinjerto de melanoma hu cimiento de xenoinjertos de SKmel28 se inhibió tamiento con 20D7 en comparación con el IgG h trol (T/C = 51%; P = 0.01 en el dia 43). Los tu icuerpo (T/C = 42%; P = 0.01 y T/C = 43%; P = 0. 5 y 1102mel respectivamente) . Los lisados de p erentes especies son incubados con TA99 (5 .g/m as a temperatura ambiente. Los lisados se p onces con proteina A y se someten a SDS-P diciones de reducción y de no reducción utilizan es de gradiente al 12%. Después de la electrofore es se transfieren a la membrana PVDF (Invitro hnologies) . La membrana es sondeada con 20D7S { uido por un IgG antihumana etiquetada con HRP th San Francisco, CA) . La mancha se desarrolla u sustrato quimioluminiscente (KPL, Gaithersburg, os muestran que D207 fácilmente tiene reacción cru TYRP1 de ratón. Sin embargo, ninguna toxicidad ma evidente en cualesquiera animales tratados con o corporal y la apariencia general no nco izquierdo de ratones desnudos. Cuando los anzan 200 mm3, tratar los ratones con anticuerp P1 (6 mg/kg, 20 mg/kg o 60 mg/kg) o IgG humana d s veces por semana. Medir los tumores con pinzas semana y calcular % T/C. El estudio de respue is de 20D7 en xenoinjertos SKmel28 indicó una itumoral dependiente de la dosis. Incluso en do kg, los tumores fueron inhibidos significativam 7 (T/C = 69%; P < 0.0001). Los efectos antitumo a dosis fueron estadísticamente significativos: 6 mg/kg (T/C = 50%; P = 0.04), 6 mg/kg y 60 mg/k ; P < 0.003) . ividad del agente único in vivo del anticuerpo a dos modelos de melanoma metastásico B16BL6 es un melanoma murino agre centraciones de dosis {200 pg/ratón, 500 g/ra ratón) . Sacrificar ratones en el dia 20, rem mones, contar los nodulos de la superficie pu cular el porcentaje de inhibición. Se detectan m adas sobre la superficie de los pulmones en tados con IgG humana; significativamente menos m observó en animales tratados con 20D7. Todas centraciones de 20D7 reducen el nivel de metás món (Inhibición = 65%, 74% y 95%, respectivamente) Modelo 2: Inyectar 1 x 105 células SKmel23 vía intravenosa. En el segundo dia después ección de tumor, administrar a los ratones an i-TYRPl o IgG humana de control, de acuerdo erentes concentraciones de dosis (200 g/rató ratón) . Sacrificar ratones el dia 20, quitar los ttar los nodulos de la superficie del pulmón y cal crecimiento de tumor sobre xenoinjerto subc élos metastásicos de melanoma humano Para el modelo de tumor subcutáneo, re ar y resuspender células cultivadas de 624mel ución de 50/50 de medios Matrigel y RPMI 1640 ctivado con calor) , luego inyectar 2 x 106 célul vía subcutánea en el flanco izquierdo de nudos . Cuando los tumores llegan a 200 mm3, tr ones con 20D7 o 20D7S, 40 mg/kg, dos veces por ir los tumores con pinzas dos veces por semana y /C. En el modelo de xenoinjerto subcutáneo de 624 ibió el crecimiento de tumor T/C = 21% y para 20 . Tanto D207 como 20D7S inhiben el crecimiento el modelo de xenoinjerto.

Para el modelo metastásico, recolectar, uspender células cultivadas 888mel en medios R 7S = 80%, p = 0.0005. 20D7 y 20D7S redujeron la m melanoma en el modelo metastásico. tratamiento de combinación de 20D7 y Dacarbazin ostró actividad anti-tumor más fuerte en compara mono-terapia en xenoinjerto humano Para el modelo subcutáneo, recolectar, ver a suspender las células cultivadas de 624mel ución 50/50 de medios Matrigel y RPMI 1640 ctivado con calor) . Inyectar 2 x 106 células 624 nco izquierdo de ratones desnudos. Cuando los gan a 200 mm3, tratar a los ratones con anticuer P1, DTIC o una combinación de anticuerpos anti C. Administrar 40 mg/kg de anticuerpos una vez po inistrar 5 mg/kg de DTIC una vez por semana. M ores con pinzas dos veces por semana y calcular e Como se demuestra en el modelo su tamiento de combinación de 20D7 y de DTIC in cimiento de tumor significativamente mejor que 2 001) o DTIC (p < 0.001) solo.

Resumen de las actividades anti-tumor de La Tabla 9 resume las actividades anti- o de 20D7S en comparación con la monoterapia co C en 4 modelos. Las actividades anti-tumor de 20D muestran por porcentaje de inhibición en los

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un anticuerpo monoclonal que específicamente enl ana (SEC ID NO. 28) con una constante de disocia el rango de 0.1 x 1CT9 M a 1.6 x 10"9 M, cara que la KD se determina por una resonancia de erficial a temperatura ambiente de laboratori C) . Un anticuerpo de conformidad con la reivindic acterizado porque tiene KD en el rango de 0.1 x x 10"9 M. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera vindicaciones 1-2, caracterizado porque compr H1 que tiene la secuencia GYTFTSYAMN (SEC ID NO: H2 que tiene la secuencia WINTNTGNPTYAQGFTG (SE una CDRH3 que tiene la secuencia RYSSSWYLDY { SE GSELKKPGASVKISCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLECMGWINTNTGN VFSMDTSVSTAYLQISSLKAEDTAIYYCAPRYSSSWYLDY GQGTLVTVS NO: 13) o una VH que comprende la secue noácidos : QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTSYA NWV WINTNTGNPTYAQGFTGRFFSMDTSVSTAYLQISSLKAEDTAIYYCAPRY GTLVTVSS (SEC ID NO: 14). Un anticuerpo de conformidad con cualquier reivi cedente, caracterizado porque es un a pletamente humano o quimérico. Un anticuerpo de conformidad con cualquier reivi cedente, caracterizado porque es un a pletamente humano. Un anticuerpo de conformidad con cualquier reivi cedente, caracterizado porque comprende una stante humana. Un anticuerpo de conformidad con cualquier reivi vindicaciones 1-9, caracterizado porque compr enas pesadas de SEC ID NO: 29 y dos cadenas liger NO: 32. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera vindicaciones 1-10, caracterizado porque compr enas pesadas de SEC ID NO: 30 y dos cadenas liger NO: 32. Un fragmento de cualquiera de los anticu formidad con cualquiera de las reivindicacion acterizado porque el fragmento específicamente P1 humana. Un ácido polinucleico aislado, caracterizad prende una secuencia de nucleótidos que cod icuerpo o fragmento de conformidad con cualquier vindicaciones 1-12. Un vector de expresión, caracterizado porque com Un anticuerpo o fragmento, caracterizado p duce cultivando la célula recombinante de confor reivindicación 15 de modo que el anticuerpo o fra duce y recuperando el anticuerpo o fragmento del Una composición farmacéutica, caracterizada prende un anticuerpo o fragmento de conform lquiera de las reivindicaciones 1-12 o 16 junt tador, diluyente o excipiente farmacéuticamente ac . Un producto, caracterizado porque contiene un a conformidad con cualquiera de las reivindicacione y un tratamiento o agente anti-cáncer adic binación para uso simultáneo, separado o consec apia . Un producto de conformidad con la reivindica acterizado porque el agente anti-cáncer es dacarba Un anticuerpo o fragmento de conformidad con c