[go: up one dir, main page]

HU230406B1 - Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására - Google Patents

Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására Download PDF

Info

Publication number
HU230406B1
HU230406B1 HU1500180A HUP1500180A HU230406B1 HU 230406 B1 HU230406 B1 HU 230406B1 HU 1500180 A HU1500180 A HU 1500180A HU P1500180 A HUP1500180 A HU P1500180A HU 230406 B1 HU230406 B1 HU 230406B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
aav
sequence
sequences
seq
capsid
Prior art date
Application number
HU1500180A
Other languages
English (en)
Inventor
Guangping Gao
James M. Wilson
Mauricio Alvira
Original Assignee
The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27502639&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU230406(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by The Trustees Of The University Of Pennsylvania filed Critical The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Publication of HU230406B1 publication Critical patent/HU230406B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human parvovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2750/14162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/90—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates avian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

Eljár-ás adeno-ítsszoebllt vírus (AAV) szekvenciák tortektálásdoa és/vngy azunosbásárs, és az azzal szsaosbott üj ssek.veneidk Izulslldsára
Az adeno-asszoeiált vírus (AAV) a Earvovlrusok csalúdjának a tagja, és egy kicsi, btsrokíaian 5 IkozahedtAhs vírus egyláneá üneárts DNS-gen.o?s?nal, amely 4,7-6 klíobázis (kbj hosszúságú. Az AAV-t a Dependovh-usok nemzetségébe sorolták be», mert a vírust tisztított adenovfeus tenyészetek szennyezőjeként fedezték fel. Az AAV életciklusa, tartalmaz egy látens szakaszt, amelyben az AAV gennmja a fertőzés után iselyspeoífikusan mtegrálődik a gazda kronío»zomnjnh<j, és tartalmaz egy fertőző szakaszt, amelybe® áz adsnovlí-ussal vagy ffernes súspfes vírussal tulo fertőzést követően az integrálódott gewm kiszabadul, rephkálódík és fertőző vírusokba psfeeiődik. Az AAV-t a nem paíogén, tág gazdasp<?eiStás — beleértve neesa osztódó sejteket is......és a potenciális heiyspecífíkss kosmeszómálls íxsfegrúcíó sdtóáonságek vonzó eszközzé teszik génátoitel céljára.
írtabb vizsgálatok azt sugallják, begy az AAV vektorok lehetnek :a génterápia előnyös hordozóeszközei. Mostanáig: az AAV 6 különböző szerotípnsát izolálták emberből vagy nem ember tbemlősökbői 8ΝΕΠ3), és jól jellemezték azokat.. Ezek között a 2-es humán szerotípns az első AAV, amelyet génátviteli vektornak kifejieszfettek; széles körbej?: alkalmaztak hatékony génátviteli kísérletekben különböző «díszövetekbe?? és állati modellekben. Az AAV2-alapú vektorok kísérleti alkalmazásának klinikai vizsgálatai bizonyos emberi beiogségmodeliekhoB folyamatban vannak, mim például olyan betegségek esetében, mint cisztús bbrozis és bemobha 3.
Amire igény van, azok tsz AAV-aiapú génhejutiafesi koaélrukctók,
Egy megvalósítási utód szerint a találmány tárgya üj eljárás AAV szekvenciák detektálására és azonosítására különféle feutuáu és nem-humán főemlős (NKP) szövetek celluláris DWfeból biőlnfonnatikai elemzés, PCK-alapú génampliSkáeiő és klőr?om>.i technológia aikaúnazásával, az AAV látenciájának a ter?nészete alapján ^egitóvirnssal való együttes fertőzés hiány ?ba??
Egy másfe megvaiósüást snod szerint >i tubhnanv íargva < fjajás új AAV szekvenciák deleittálására a fenti találmány szerűül eljárás alkaimazasávai A 'találmány tárgyát: képezik továbbá eljárások vektorok előállítására ezen áj AAV szerotipusok alapját:, szero lógsz és génátviteli vizsgálatok céljára, csapán a kapszidgéa szekvenciáinak és a repAmp kapcsolódási szakaszok szerkezete alapján.
Egv még további megvalósítási mód szedni a találmány tárgya uj eljárás szeroiőgíní, epldemielögfei, btodisztrtbúeiős és transzmissziós mód vizsgálatok végrehajtására, t&láimany szerinti reagensek alkalmazásával, amelyek: közé. tartoznak: lánclnditók/próbák generikus készletei és kvantitatív valósidejű PCR.
Egy még másik megvalósítási mód szerin? a találmány tárgya eljárás új AAV szerotipusok teljes és fertőző genomjansk az Izolálására különböző eredetű eeltolárls DNS-ből RACE és más molekuláris módszerek alkalmazásával.
Egy további megvalósítási mód szénát a találmány tárgya eljárás AAV genomok áj szerotipusainak a kimentésére humán és NBP sejivonalakböi. különböző eredetű adenovlms segitövlrnsok sikahnuzásávat
Egy még további. snegvalósítási mód szerint & találmány tárgyát új AAV szerotipusok, az azokat tartalmazó vektorok és az írnokot alkalmazó eljárások képezik.
A. találmány ezen és más megvalósítási módjai nyilváavalóak a találmány alább? részletes lelrásáböi.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat:
líőy-ő:*? it λ·ι
Az XÁ-1AAÁR. ábrákon az AAV szerotípusokböí legalább a esp fehérjét kódoló nukfeinsavszekvencíáh: egymás alá rendezéséi mutaljttk be. Bemutatják a teljes hosszúságú szekvenciákat — amelyek tartalmazzák az ITR-eket, a rep régiót és a kapszíd régiót......az új AAV ?~es szsrotipus: [i. azonositöszámú szekvencia] esetére, és a korábban nyilvánosságra hozott AAV'i [6,. azonosítószámú szekvencia), AAV2 [7.
azonosítószámú szekvencia] és AAV3 [8. azonosítószámú szekvenciái esetére. Az új AAV8 [4. azosositőszámá szekvencia] és AAV9 [5. azonosítószámú szekvencia'] AAV szerotípesok a jelen beieleniéssel egyívíóben: benyújtott bejelentések találmány tárgyát képezik. Az ebben az egymás alá rendezésben bemutatott takf raány szerinti:új kiónok az alábbiak:: 42-2: [9, azonosítószámú szekvencia), 42-8 [27. azonosítószámú szekvencia), 4215 [28. azonosítószámú szekvencia], 42-5b (29, azonosítószámú szekvencia), 42-lb (3ö, azonosítószámú szekvctíciaj; 42-13 131., azímostíószámú szekvencia],. 42-3s [32. azonosítószámú szekvencia], 42-4 [33, azonosítószámú szekvencia), 42-5a [34.. azonosítószámú szekvencia], 42-10 [35. azonosítószámú szekvencia), 42~3b [3ó. azonosítószámú szekvencia], 42-1 1 (37. azonosítószámú szekvencia), 42-éb [38.. azonosítószámú szekvencia]:, 43-1 [39. azonosítószámú szekvencia], 43-5 [49, azonosítószámú szekvencia], 43-12 [41.. azonosírótszámú szekvencia], 43-20 [42, azonosítószámú szekvencia]:, 43-21 (43. azonosítószámú szekvencia],
43-23 (44. azonosítószámú szekvencia], 45-25 [45. azonosítószámú .szekvencia], 44.1 [47. azonosítószámú szekvencia], 44.5 [47. azonosítószámú szekvencia], 223,18 [98, azmsosüószánrá: szekvencia), 223.2 [49. azonosítószámú szekvencia), 223,4 (50. azonosítószámú szekvencia), 223.5 (51. azonosítószámú szekvencia], 223.6 [52, azonosítószámú szekvencia), 223,7 [53. azonosítószámú szekvencia], A3.4 (54. azonosítószámú szekvencia], A3.4 (55. azonosítószámú szekvencia], A3.7 (Sú, azonosítószámú szekvencia], A3.3 [57, azonosítószámú szekvencia], 42,12 [58. aztnostk»zámú szekvencia], 44,2 [59. szonoshószátnú szekvencia]. Az AÁVIO [117, azonosítószámú szekvencia), AAV11 1118. azotiosiíószámú szekvencia] és AAV-2 [119. azonosítószámú szekvencia) szrgnaíúra régióinak a múdeobd-szekveneiált is bemutatjuk az ábrán. As. AAV genonrok szerkezetének kritikus jellegzetességeit is feltüntetjük. A réseket pontokkal ábrázoljuk. Az AAV1 [ó, azonosítószámú szekvencia] Γ íTS-jét a közzétett szekvenciákkal azonos konúgnráeiöhae mutatják be, „TRS” jelentése terminális feloldási hely („terminál resolation síte”). Megjegyezzük, hogy az AAV7 az egyetlen olyan ismert AAV, amelyben CTG a W3 iniciációs koó.onja.
Λ 2A-2E ábrákon a a vpl kapszídfehérjék ammosav-ssekventááinak az egymás alá rendezexe- matatom be: a korábban nyilvánosságra hozott 1-es AAV szerotípns [64, azonosítószámú szckvenei.:], .AAV'2 | ?o. azonositószamú szekvencia], AAV3 (71. azonosítószámú szekvencia], AAV4 [63. azonosítószámú szekvencia,,
AAV5 [1:14, azonosítószámú szekvencia] és AAVó [65. azonosítószámú szekvencia] esetében, vsteáat a találmány szerinti új AAV szekvenciák esetében, amelyek az alábbiak: Cl (60. azonosítószámú szekvencia], C2 [61. azonosítószámú ^sekv«n«bj, €3 [62. azonosítószámú szekvencia), Á3-3 (óé. azonosítószámú szekvencia], A3-7 (67. azonosítószámú szekvencia], A3-4 [68. azonosítószámú sz?kve«»'u|, \3-5 (69. azonosítószámú szekvencia], 3.3b [62. azonosítószámú szekvencia], 223,4 (73. szonomwama szekvencia], 223-5 [74, azonosítószámú szekvencia), 223-19 [75. azonosítószámú szekvencia], 223-2 '”o azonosítószámú szekvencia], 223-7 [77,. azonosítószámú szekvencia], 223-6 [78. azonosítószámú szekvenemd. 44-1 [79. azonosítószámú szekvencia]. 44-5 (80. azonosítószámú szekvenciái, 44-2 [81. az.enosnó,-v'ama szekvencia], 42-15 (84. azonosítószámú szekvencia]., 42-8 [85. azonosfwszámó szekvencia), 42-13 (8b. azonosítószámú szekvenciái. 423.A [87. azonosítószámú szekvencia], 42-4 [88, azenosífószámú szekvencia]:, 42-5.A [89. azonosítószámú szekvenciaj, 42-lS (90, azonosító,számú szekvencia], 42-5B [91. azonosítószámú szekvencia], 43-1 [92.
azonosítószámú szekvenciák 43-12 [93, azonos dőszátsú szekvencia), 43-5 [94. azonosítószámú szekvencia), 4321 [96. azonosítöszámú. szekvencia), 43-25 [97. azonosítószámú szekvencia], 43-20: [90. azönosifószámú szekvencia], 24,1 [lói. azonosítöszámá szekvencia], 42.2 [102. azonosítószámú szekvencia], 7,2 [103. azonosítószámú szekvencia], 27.3 [104. azonosítószámú szekvencia], 16.3 1105. azonosítószámú szekvencia],
42. 10 [106. azonosítószámú szöktem -a], 42 JB 1 507. azonosítószámú szekvencia], 42 - í 5 [508. azonosítószámú szekvencia], FI [109. azonosuoszamn szekvencia], F5 [110. azonosítószámú szekvencia], F3 [Hl. azonosítószámú szekvencia], 42-6B [112. a/onedtoszámú szekvencia], 4,2-12 [í13, azanositószámá szekvencia). Az: új AAV8 üzemtípus [95; azonesfíóssámé szekvencia] és AAV9 [100. azonosítószámú szekvencia] egyidpiúleg benyújtott szabadalmi bejelentések tárgyút képezi.
A 3A-3C, ábrákon: az AAV7 rep fehérjék [3, azonesítoszántú szekveneia] smmosav-szekvenelájáí mutatjuk be.
A jelen találmány szerint olyan eljárást találtunk, amely kihasználja nz adeno-asszociáit vírus <AÁV>
azon képességét, heg) bejut a sejtmagba, és......segítő vírussal való együttes fertőzés hiányában.....integrálódik a eelhdáris DNS-he, es látens fertőzési hoz létre. Az eljárásban poíimeráz-láncreakciőn (FCR) alapuló stratégiát alkalmaznak az ÁAV-k szekvenciáinak a detektálásán. azonosítására és/vagy izolálására humán és nem humán, főemlősök szövetének 1 )\S-eből, valammt más forrásokból. Előnyősét· az eljárás alkalmas más integrálódott vitális és nem viráks szekvenciák detektálására,.azonosítására és/vagy izolálására is, amint alább ismertetjük.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti eljárásokkal azonosított rmkleinsavszekveneiák is. Egy ilyen adenö-asszoeíáít virus egy új szeroíípus, amelyet a leírás szerinti érteledben. 7-es széföíípusnak (AAV7) nevezünk, A találmány tárgyát képező más oj adeno-asszosiált vírus szerodpusok. közé tartozik az AAV 10. AAV11 és AAY52. A találmány szerinti eljárásokkal azonosított még .további új AAV szeretípasefc is a találmány tárgyát képezik. Lásd az ábrákat és a székve-neialístái, arat hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
A találmány tárgyát képezik továbbá ezen AAV szekvenciák iragmensel Is, A külSoSsen előnyös
AAV-fragmensek: közé tartozik a vpl, vp2, vp3, a Inpervísriábilís régiók,: a rpp Mérjék,. mint például a zpp 78, rep 68, re/? 52 és rep 40, és; az ezeket a Íshéíjéket kódoló szekvenciák. Ezen íragmensek mindegyikét könnyedén alkaluíazhádúk különféle vektorrendszerekben és gazdasejtefcfees. Az ilyen, ffegmsnssket: alkalmazhatjuk egyedid, más AAV szekvenciákkal vagy fegmensekkel kombinálva, vagy más AAV vagy nem AAV virális szekvenciákból származó elemekkel kombinálva. Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a vektor a találmány szerinti AAV épp és/vagy rpp .szekvenciákat tartalmazza.
A leírás szerinti értelemben az egymás alá rendezéseket különféle nyilvánosan vagy kereskedelmi forgalomban hozzáterhe-ö többszörös szekveneni egymás alá rendező programmal („Mnltíple Sequence M.cnment Program) mint poklául a H alkahrtaza^rtal hajthatjuk végre Mas megoldásképpen a ; <\ tor ,V77 programokat alksimazhapok. Szamos szakterületen ismert algoritmus van, amelyet alkalmazhatunk a
Uttkleötid-szekveuciák azonosságának a mérésem például a fenti prográmökban találhatókat. Egy másik példaként a polinukleotíd-székvenmákat a Eös/ő alkalmazásával hasonlíthatjuk össze, amely & GGG Version 61 programcsomagban található. A Artríű a keres® és kutatod szekvenciák legjobban átfedő régíéíuak az egymás alá rendezését és százalékos szekveseisnzonásságát: adja meg., Például a reukieissav-szekvetteiák közötti százalékos szekveneiaazonosságöt a Fdxto alkalmazásával hatúrcízhatjuk meg az alapérteltnezetf paraméterekkel (száméret 6 és NOPAM faktor az értékelő mátrixban), amint azok a GCC Version 6 1 programcsomagban
- 4 megtalálhatók, amely hivatkozás útján a kitaniíás részét képezi. Hasonló programok rendelkezésre állnak arnínosav-szekvnneiák esetére is, például a Cfasíal X program. Általában. ezen programok bármelyikét az alapértelmezett beállításokkal alkahnazzuk, habár a szakemter szükség szerint inegváiíozíatliaija ezeket a beállításokat. Más megoldásképpen a szakember másik algenhúnsi vagy számítógépi programot alkalmazhat, amely legalább ugyanazt az azonosságot vagy egymás alá rendezést biztosítja, mint a hivatkozott uferrnu ások és programok..
A „lényeges botpológia” vagy „lényeges hasonlóság” kifejezés alatt aukleinsav vagy feagntense vonatkozásában a leírás szerinti: értelemben azt értjük, hogy amikor optimálisan egymás alá rendezzék nukleotidek megfeleld inzereiújávai vagy deléciöjával egy másik nukteinsavval (vagy annak komplementer szálával), a nukleotiü-szekvescia azonosság legalább körülbelül 95-99% az egymás alá rendezett szekvenciák között, Előnyösen a bomolőgla a teljes hosszúságú szekvenciára vonatkozik vagy annak nyílt leolvasási iázisára, vagy egy másik megfelelő fmgmensre:, amely legalább 15 nnkleotid hosszúságú. A megfelelő íragmensek példáit bemutatjuk: a leírásbari.
A „lényeges homológja” vagy „lényeges hasonlóság” kifejezés: alatt aminosavak vagy feagmenseik vonatkozásában a leírás szerinti értelemben azt értjük, hogy amikor optimálist® egyjnás alá rendezzük sminosavak megfelelő inzereiöjaval vagy deléciöjával egy másik aminosawal, az arcnkmsav-szekvencia azonosság: legalább körülbelül 95-99% az egymás alá rendezett szekvenciák között. Előnyösen a homológta a teljes hosszúsága szekvenciára vagy fehérjém — például cnp fehérjére, rep fehérjére vagy azok legalább 8 sminosav, vagy előnyösebbe® legalább 15 aminosav hosszúságú íragmenséto — vonatkozik. A megfelelő feagmeíssek példáit feenmtaéiük a leírásban.
Az „erősen konzervált” kifejezés alatt legalább 80% azonosságot, előnyösen legalább 90% asouosságot és előnyösebben legalább 97% azonosságot értünk. Az, azonosságot a szakember könnyen meghatározhatja a szakember számára ismert algoritmusok és számítógépi programok alkalmazásával,
A „százalékos szokvenciaazonosság” vagy azonos'* kifejezés alatt ítukleinsav-pzekvenciák 25 vonatkozásában két: szekvencia azon oldalláncún értjük,, amelyek ugyanazok. amikor twdmáh's megegyezéssel egymás alá vannak rendezve. A szekvenciaazonosság összehasonlításának a hossza kivám.: esetben letet: a teljes hosszúságú genomra, a teljes hosszúságú kódoló szekvenciám, vagy legalább körülbelül 500-5080 nuldeötid humán feagtnensre vonatkoztatva. Azonban kisebb feagmensek, például legalább körülbelül kilenc sukleoíid, általában legalább körülbelül 20-24 nnkleotid, legalább körülbelül 28- ?2 nnkleotid, legalább körülbelül 3» vagy
3ö több nnkleotid hosszúságú fnigtaeosek közötti azonosságot. is meghatátcztóunk, Hasonlóképpen, a „százalékos szekvencíaazonosságöt” könnyedén meghatározhatjuk teitemv-szekvcnciák esetében is, a teljes hosszúságú tehérjére, vagy annak egy frágrúensére vonatkoztatva. Előnyösen egy fragmeos legalább körülbelül 8 atninosav hosszúságú, és akár 700 aunnosar hosszúságú is lehet. A megfelelő tragínensek példák bemutatjuk a leírásban.
.AzAAV szekvenciák és Iragmenselk hasznosak r.AAV előállítására, és ezenfelül hasznosak aníiszensz bejuttatásí vektoroknak, génterápiás vektoroknak, vagy vakcinavektoroknak. A találmány tárgyát képezik tovább nnkleinsav-moiekniák, génhejuttatásí vektorok, és olyas gazdasolíek, amelyek tartalmazzák a: találmány szerinti AÁV-szekvene.iákat.
Á. leirtís: szerinti értelemben a találmány szerinti AAV kapszidfeherjéket tartalmazó találmány szerintii vektorok különösen alkalmasak olyan alkalmazásokban, amelyekben semlegesítő ellenanyagok csökkentik a
- többi AAV-szerotipuson alapuló vektorok, valamint toás virális vőkkwök halékonyságát. A tsiálsütoy szerinti r AAV vektorok különösen előnyösek rAAV újbóli beadására és ismételt génterápiára.
A találmány ezen és más megvalósítási uródjáíf és előnyeit részletesebben is Ismertetjük az alábbiakban, A leírás és igénypontok szerinti érielemfeeti a „tartalmaz?’ kdejezés és variánsai alatt értendők más komponensek, elemek, egész számok, lépések es hastsolók is. Ezzel elleniéiben „.valamiből áll kifejezés és variánsai kizárjuk más'komportersek, elemek, egész számok, lépések ex hasonlók jelenlété?,
1. Találmány szerinti eljárások
Á. Szekvenciák detektálása molekuláris klónozással
Egy megvalósitási móri szerint s tfoáíanány tárgya eljárás célzóit mtklemsav-szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására mintában. Ez az eljárás különösen alkalmas olyan virális szekvenciák detektálására, ásnelyek: hriégridednak: egy sejt temoszómájáfea, példán! többek kozott ade&o-asszoeislt vírus (AAV) és reirovírusok detektálására. A leírásban az ÁAV-re hivatkozónk, ami csak szemléltető jellegit Azonban ezen információ alapján a szakember könnyedén végrehajthatja a taiáhnány szerinti eljárást többek között.
1S rvtrevíKiSökoa (például -macska leukémia vírus (EeLV), HTLV-í es HTEV-llI és lenih írásokon {például humán, ímninodefeleoeia vírus <HÍV% sajem immnodeficieímla vírus .(SÍV), macska immondeilcieneía vírus i'FlV), lő fertőző iméntin vírus és sgmn&viriosl)). Ezenfelül a találmány szerinti eljárást alkalmazhaijsk más vitális és nem, virális szekvenciák detektálására is, függetlenül átlók hogy integrálódva vannak-e vagy sess a gazdasejt genetpjába.
A leírás szentül értelemben snínte alatt hámülyen forrásból származó nnkleioxavsí ériünk, példán!
szövetből, szővenenyészetböl, sejtt«syészeibSl és biológiai folyadékokból, sem korlátozó példaként vizeiéiből és vérből származót. Ezek á ntskleinsav-székvönelák lehelnek plaznúdokból származó BMS vagy OS, htteilyett: forrásbők mint példán! baktériumokból, élesztőből vírusokból és magasabhreodő organizmusokból, mint póldáal növényekből vagy állatokból származó természetben előforduló DNS vagy kNS. A DNS-t vagy RNS-t o szakember szántára ismeri különféle módszerekkel extrabálhaíjuk a nüniábéb mint példán! a Ssmbrook és mtsai. (.foíoleeuiar Cionm.gr A Labonrioty Manual”, kiad.: New York: Coid Spring llárbor Lahoratory} állal leírtakkal, A nünte eredete és az az eljárás, amellyel a nukleinsavskat eiöáhitjuk a találmány szerinti eljárásban történő síkaítsazásm, pest korlátozó a találmány szempontjából. Adott cserben a találmány szerinti eljárást közvetlenül a DNS forrásán is végrehajthatjuk, vagy a forrásból származó- (például extrahált) nnkleinsavakom
A találmány szerinti eljárás magában foglalja a DNS-t tartalmazó minta araplifíkálását polimerázláuereakció (FCRj útján a kekszéin rmklemsav-szekveneiák egy első régiójára specifikus első lánsrindító-készfot alkalmazásával, ezáltal ampliííkált szekvenciákat előállítva.
A lékás szerinti értelemben a „régiók5' inmdegyikéí előre meghatározzuk iegsiíább két (például AÁY} szerotípus rmklernsav-székveítciájáríuk az egyórás alá rendezése alapján, ahol a régiók mindegyike erősen konzervált 5’ végi szekvenciákat, előnyösen, de sem szükségszerben. variábilis középső régiók és- erősen konzervált 3' véget tartalmaz, almi ezek mindegyike legalább két egymás alá rendezett AAV szeroílpushoz viszonyítva konzervált vagy variábilis 1 lou\»xe t az 5’ és/vagy 3’ vég erősen konzervált legalább körülbelül 8, és előnyösebben legalább körülbelül 18 bázlspsrra. (bp) vonatkoztatva. Azonban az. 5’ vagy 3' szekvenciák egyike vagy mísdkeítójhk lehet konzervált több mist: lő bp, több mist 25 bp, több mint. 38 bp, vagy több mint 58 bp esetében az 5’ végen. A variábilis régió tekintetében nincs előírva konzervált szekvenciák jelenléte, ezek a
-ό~ szekvenciák lehetnek vlszopylag komterváhak, vagy lehelnek kevesebb, mist 98, 88 vagy 78%~'b<m azonosak az egymás alá rendezett szerotípite.okra vagy :örzsékre vonatkoztatva,
A régiók mindegyike körülbelül 180 bp és körillbelül 18 kbp közötti hosszúságú tehet, Azonban kuionb\c:> cionsos ha a régió egy „Aígoteúra va/ eh in régió, amely elegendően e/y edi ahhoz, hogy $ pozitívan azo vsttsuk az ampliSkáit szekvenciái, intet a célforrásfeól származót. Például egy megvalósítást mód szerint az első régió kőrölbelől 258 bp hosszúságú, és elegendően; egyedi az AAY szekvenciák között ahhoz, hogy pozitívan azonosítsuk az amplifikák régiót, mint AAV-eredetűt Ezenfelül a régióban található variábilis szekvenciák elegendően egyediek ahhoz, hogy alkalmazhassuk azokat annak a szeroppussak az ^azonosítására, amelyből az aurpliíikált régió származik. Ha egyszer ampüftlíáitsk (és ezáltal detektáltuk}^ a. szekvenciákat azonosíthatjuk hagyományos restrikciós emésztés és a régió emésztési mistázatáuak az összehasonlításával az AAYi, AAY2, AAY3, AAV4,: AAVS vagy AAVő, vagy az AAY?, AAY18, AAVI1, AAYI2, vagy bármelyik, találmány szerhúi áj szeroripus álkahnazásával, amely előre meg van határozva, ős a találmány tárgyát képezi.
A. leírás szerinti uímmatás alapján a szakember könnyeden azonosíthat ilyen régiókat más integrálódott vírusokban, lehetővé téve ezen szekvenciák könnyé detektálását és azonosítását. Azután az erősen konzervált végeken található generikus lánc indítókat tervezhetünk, és tesztelhetjük azokat a kiválasztott régiónak mintákból történő hatékony amphrikáelájára. A találmány ezen megvalósítási módját könnyen adaptálhatjuk diagnosztikai resgenskésztethe a eélszekvencia (például AAY) jelenlétének detektálására, és az AA V szerotípus azonosítására, olyan standardok alkalmazásával, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti AAY szerotipusok restrikciós mintázatát, vagy amelyeket találmány szerinti módszerekkel izoláittmk. béldául 8C&-termékek gyors
28: azonosílását vagy molekuláris: szerotípízálását elvégezhetjük a kCR-íermékek restrikciós emésztésével ős a restrikciós mintázatok összehasonlításával.
Ily módon egy megvalósítási mód szerint az .AAY „szignáturá régiója*' köriiihelül 28oC és kntuihelaí 3280 hp-nyl régiét Ível át az AAVI: (ő, azonosítószámú szekvencia} szektercnvban. és a megfelelő bp~eka< az AAV2. AAV3, AAV4, AAV5 és AAV6 szekvenciájában. Előnyösebben e Og.o kmúlóeiu: 250 op, cs a 23So es körülbelül 3143 bp pozíció között helyezkedik el az AAVI Í6. azonositós/amá »/ekvenemj «.teksenmumhá, és. i megfelelő bp-ok között az: AAV2 [7. azonosítószámú szekvencia}, AAY3 [3. azonoki.?szárnn székéeneúri cs a többi AAY szerotipus szekvenciájában (lásd a I. ábrás). Az: AAY gyors detektálásának lehetővé tétele érdekében az ezt a szignálóra régiót specifikusan amplifikáló láncindítókat alkalmazunk, Azonban a találmány nem korlátozódik a leírásban megadott AAY szignálóra régiók pontos szekvenciájára, minthogy a szakember számára könnyen módosítható ez: a régié, hogy a szignálóra régiók rövídebb vagy hosszabb íragmenseh tartalmazza,
A PCR-láncindítőkat a szakember számára ismert módszerek alkalmazásával állítjuk elő. A PCRláneisdító-készletek egy 5' ős egy 3’ láncindilöból állnak (lásd például Sambrook és mtsai., mint feni). A .„ίόπνιηώϊό kifejezés alatt olyan ollgonukleotidoí értünk, amely a szintézis kiindulási pontjai képezi, amikor olysrs kötülntesyek közé helyezzük, amelyek: kozott a láscmdltó mikieinsavval komplementer szálának meghosszabbított termékéugk szintézise indukálódik. A lánciudhó előnyösen egy szalu. Azonban ha kétszálú iáncindítőt alkalmazunk, azt kezeljék a meghosszabbított termék előállítására \nlo alkalmazását megelőzően, hogy szétválasszak a szálait. A. iáacmdhők .körülbelül 15^25 vagy több mikleetíd hosszúságúak lehetnek, ős előnyösen legalább 1S nukleotid hosszúságúak. Azonban bizonyos alkalmazások esetében: rővídehb, például 740 15 nukleotid hosszúságú lánőíndítókat alkalmazunk.
Ο'
A BöefodsióW ágy választjuk meg, hogy elegendően kmple®e»1»rek legyenek az egyes amplilkálattdö specifikus szekvenciák, különböző szálaihoz, hogy hibridizáljanakamegfelelö szálakkal Tehát a láncmdltö szekvenciának nem kell tükröznie az amplinkálattdő régió pontos szekvenciáját. Például egy ásás kontplemeníer nnkleotid-fragmensf kapcsolhatunk a lástodítö 5’ vegéhez, és a láncmdhó fennmarad© része teljeset! komplementer a szálisi. Más megoldiísképpett nem komplementer bázisokat vagy hosszabb szekvenciákat szórhatunk he a lánemdítőha, amennyiben a iátictád86: szekvenciája elegendően kotnplemetof az smpllfikáiandó szál szekvenciájával, hogy hiferldizáljon azzal, és terápiától alkosson a másik láncinditóval a insghösszahbtott termék szintéziséhez.
A tslálmátty szerinti sziguatüra régióhoz való PCfolántodííök két vagy több egymás alá rendezett szekvencia (például két vagy több AAV szekvencia) erősen konzervált szekvenciáján alapulnak. A lánemdkök ehűrik a pontosnál kisebb mértékű azonosságot a két vagy több egymás alá rendezett AAV szerotipos esetében az 5’ végen és középen. Azonban, a láneMtók ,3’ végén található szekvenciák a két vagy több egymás alá rendezett AAV szerodpus olyan régiójának léiéinek meg, amelyekben a pontos azonosság legalább 5, előnyösen legalább 9 és legelőnyösebben legalább Iá házaspár hosszúságé a láöcindíiő 3^ végén. Ily módon a láncisdltók 3’ vége sz egymás alá rendezett szekvenciák legalább S nukieofidjávat 100%-bas azonos szekvenciát tartatom. Azonban adott esetben egy, kettő vagy több degencrah. nukleotldot alkalmazhatunk a láncmdltö 3’ végéto.
Például az AAV' szignálóra, régiójára specifikus iánemdítót az A.AV kapszid egyedi régiója alapján terveztok; amint az alábbiakban Ismerteíiük Az 5' láncinditó az AAV2 (7. azonosltőszárstá szekvencia] 2áö72891, noktotidjain alapult, S’-GGTAATTCCTCCGGAAArrGGCATI'-d' (lásd az L ábrát), A3’ láneiodítő az AAV2. (7, azonosítószámú: szekvenciái 3096-3122. mtkföoiidjshr alapalt, S5GAGTCáTCAACAACAA€7T<íOGGATTC-3’. Azönhatr a szakember könnyedén tervezhet láncinditőkészleteket: áz AAV), AAV3, AAV4, AAV5, AAW megfeleld szekvenciái alapján, vagy' a mlálmátty szentül AAV7, AAV 10, AAV 11, AAV) 2, vagy más találmány szerinti áj AAV szekvenciája alapján, Ezenfelül még: torabb; lanctndüo-kcszfetekot tervezhetünk a szignálóm régió astplilkálásám, a szakember számára ismert módszerek alkaónazásat al
Ö cctóekseni. .o, izo.etoa
Amint ismertetjük, a találmány tárgya egy első láncmdité-készlot, amely specifikusan atnplitikálja a vdszekreacta pdtod egy zlÁV szeroiipns — szignómra régióját a célpont detektálása érdekében. Olyan esetben,, amikor további szekvenciákra van igény, például ha öj AAV szsrotipnst azonosítunk, a szlgnatéza régiót sseghosszabbtlimtjuk. ily módon a találmány szerbit alkalmazlmtuak egy vagy több további láncindf tö-készleteí.
Megfelelő módon ezeket a láncmdító-keszteteket ügy tervezzük, hogy tartalmazzák az első táneinditokészleí 5’ vagy 3’ láncmáltóját. és a második lásscmdké egyedi a láscmáító-készleteí tekintve, ily módos a láncmditó-késziet a szignálóra régióhoz képest 5' vagy 3’ helyzetű régiót amphükák amely aneilálodtk a szignálóra régié 5' vagy 3’ végéhez. Példán! az első láÍScináiíó-keszhtt El 5' iascmdltóböi és 02 3’ lárrcinöitóhól áll a szignálóra régi© atnpüEkálásám. A szignálóra régió- 3' végén lörtéttő megfötsszabhltásártt egy második lásaiodííó-készlsí a Pl láneítidítóbő! és a 14 3’ lánclndiiöböl áll, amely a szignálóra régiót és a szignálóm régiótól leolvasással megegyező irányban található folyamatos szekvenciákat ampltiikálja. A szignálóm régió 5’ végén történő meghosszabbításám egy harmadik ísncindhő-készleí a 13 5' lánc indítóból és a ,P2 tocmdltőbó! áll, amely a szignálóm régiót és a szignálóra régiótól leolvasással ellentétes Irányban található folyamatos szekvenciákat amplifikálja. Izeket a meghosszabbítási lépéseket megismételjük (vagy egyidejűleg bájtjuk
- 8 végre), szükség vagy Igény szerint Azután az ezen at55pbbkáelős lépések eredruénykeppen kapott termékeket hagyományos lépésekkel fiizloÍrnhaijak, hogy ki vúrh hosszúságú izolált szekvenciát állítsunk elő,
A második és harmadik láncindifó-készletet ágy tervezzük......az első íánciadltő-készlethez hasonlóan hogy az egymás alá rendezett szekvenciák erősen konzervált szekvenciája régióját ampliftkálják. A leírás szerinti értelemben a ..jjbásoáík”· vagy „harmadik” láseírsditó-készlot kifejezést csak a. tárgyalás kedvéért, alkalmazzak, cs bem tekinthető soireodíségnek, amelyben. ezeket a klneinmtokat a reakcióelegybe adjak, vagy' amphűkációra. alkalmazzuk. A második láncmáitö-keuzfettel amgli&ált régiót úgy választjuk meg, hogy az ampkfikáeté fólyamás sz 5’ végevéi anelláiődjon a szignálóra régió 3’ végéhez. Hasonlóképpen a harmadik iáncmdítő-késslettel auíphhkák régiét úgy választják meg, hogy az anmhSkáeiő felyamán a 3’ végével lő aoellúlődjou a szignálóra regié 5’ vegéhez. További láneimhtő-készieteket: tervezhetünk: oly módon, hogy az általuk atnphflkáh régiók asellálódjanak a második vagy harmadik láneíndiié-feészlet, vagy további iáncindstókészletek által kialakított tneghosszafcbtton tennék 5' vagy Γ végéhez
Például amikor AAV a célszekveneta, az első iáncínditó-készletet (Pl és P2) aWnxazznk a szigsatúrs régió mintából történő ampiiGkáiésara. E§y: előnyős megvalósítási mód szerint ez a szigsatúra régié az AAV kapsziáoa beiül található. Egy második lánciadíió-készletet (Pl és P4) alkalmaznak a szigmutha régié 3’ végének a meghosszabbítására az AAV szekvencia olyan helye kányában, amely éppen az AAV 3’ 1TR előtt található, azaz olyan sneghosszablhtott termeket eresiményez, amely taftahnazza az AAV hapszíd teljes 3 ’ végét, amikor a szlgnatúrs régiét horgonyként alkahrtszzak, Bgy megvalósítási mód szerint a P4 láncmhító az ÁAV2 (7. azonosítószámú szekvencia] -4435-44S2, nukteotldjámak, és: más: AAV szerotipusok megfeleld s&kíeotídjainak felel meg, Sz- egy körülbelül 1,6 kb méretű régió amphTrkáeíóját eredményezi, amely tartalmazza a 0,25 kb tuéreta szigaatúra régiót Egy batmadtk láncmdító-készletet: (P3 és P2j alkalmazunk a szignálóra régto 5' végének a meghosszabbítására az: AAV szekvencia olyan helye irányában, amely a ren .gének 3’ végén található, azaz olyan megbosszablntsh terméket eredményez,, -amely tartalmazza az AAV kapszid teljés 5’ végéi, atnlkor a szignatúra régiót horgonyként alkalmazzuk. Egy megvalósítást mód szerint a P3 láneindító az
AA.Y2 (?.. azonosítószámú szekvenciái 1384-1489:. nukleotidjaísak, és tttús AAV s/emtipusok megfelelő: nnkleotidjainak: felel meg.. Ez: egy körülbelül 1,7 kb méretű régió ampliflkációjat eredményezi, amely tartalmazza a.0(25 kb méretű szignatúra régiót. Adott esetben egy negyedik tóncmdttá-keszieiet alkalmazunk a meghosszabbított termék további meghosszabbítására, amely tartalmazza az AAV kapszid teljes 5' végét és tartalmazza s :mp szekvenciákat is. Egy megvalósítási inöd szerint a P5 lanctnditó az. AAV2 [7. azonosítószánm szekvenciái lók-13:3, ankiesikíjaínak, és más AAV szerotípuspk megfelelő tntkleö-tídj:aín:ak felel meg, és a. P2. iúneindhővaí együtt: alkalmazzuk..
A kívánt száma meghosszabbítási; lépést követően a különféle meghosszabbított termékeket feziortáháguk, a szignálóra régiót alkalmazva horgonyként vagy markéiként, hogy intakt szekvenciát állítsunk elő. A leírás szerinti példában minimálisan az Intakt AAV e«p gént tartalmazó AAV szekvenciákat állítunk elő.
Nagyobb wtoctteitfea; ts t ioat:'thahtnk a segrehajtotí meghosszabbítási lépések szántától függőén.
Megfelelő modote a meghosszabbított termékeket intakt AAV szekveitelává dilit juk Összes a Szakember számára ismert eljárások allmlmszásával. Például a meghosszabbított termeket megemészthetjük Draílí enzimmel, amely szignálóra régión belül található Dtafll helyet hasítja el, olyan restrikciós feagmenst előállítva, amelyet ajrsligákmk (mmimdhs esetben) ogy intakt AAV eap gént tartalmazó terméket előállítva. Azonban más:
alkalmas módszereket is alkalmazhatunk a meghosszabbított termékek intakt szekvenciává történő összeáílítesára (általában lásd Sambrook és mtsai., mint fent),
A. fent ismertetett többszörös meghosszabbítási lépések ahernabvajukení a találmány egy másik snegvalösítári médiának tárgyit egy 3/1 kb hosszúságú fragmeas közvetlen am pH ísfeáiúsa,· ami tehetővé teszi a
S teljes hosszúságú cnp szekveneísk izolálását, A 3,1 kb mérető teljés hosszúságú aj/> ímgmensMIP szövetből és vér DNSfitől történő közserien aíophfkakAam két másik erősen konzerváii régiót a/cmosfíötíunfe az AAV genomokbatr nagy fracmensok PCR-es. ampbfiLxiasáta. A rep gén közepén taialható konzervált régióban lévő iancÍBŰitdl (AV 1 ns: 5*-GCrGCGTCAACTGGAC€AA'fG AGAAC-3', 6. azonosítószámú szekvencia) alkalmazunk együtt a rup géntől leolvasással megegyező irányban található konzervált régióban, elhelyezkedő 3’
W láucindítővnl (AVSoas: .S’-CGCAGAGACCAAAGTTCAACTöAAACOA-y, 7. azonosítószámú szekvencia) a teljes hosszúságú AAV nop-ot tartalmazó AAV szekvenciák amplirikálásám. Tipíkussn az amplíiikácíőt követően a termékeket klónozzuk, és 99,9%-ná) pontosabb szefeveneiaelemzést végzünk. Ezen eljárás alkalmazásával legalább 50 kapszid klóm izoláltunk; amelyeket azt követően jellemeztünk. Ezek .között 37 klón származott £ta mórzígae szövetekből trh. l - rh.3?>, 6 felen .szármstzott Cv«Of»o/<>go«s majmokból <vy.l 15 cy.ő), 2 klón szármázott páviánokból (bb.,1 és bb.2) és 5 klón származott csimpánzokból (eh. I - cb,5). Ezeket a kiónokat máshol azonosítják a leírásban, együtt azzal az állatfajjal, amelyből azonosítottuk azokat, és: az állat ázott szövetével, amelyben ezek az új: szekvenciák elhelyezkednek.
C, Alternatív eljárás új AAV-k Izolálására
Egy másik megvalósítást mód szerint a találmány iárgya alternatív eljárás új AAV Izolálására sejtből.
Ess® éljárás szerint a sejtéi az AAV számára segítő funkciókat biztosító vektorai fertőzzük: meg; AAV~t taftalnrazó fertőző kfemokat izolálunk; az izolál· AAV-ket megszekvenáljuk; éa összehasonlítjuk az, izolált .AAV-k szekvenciáját ismert AAV szerotípusokkal, miáltal az izolált AAV és: az ismert AAV szerotípüsok szék véne iájának a különbségei jelzik az új AAV jelenlétét.
Egy raegr alósítási mód szerint, a segítő funkciói, biztosító vektor esszenciális adenovirus funkciókat biztosít, mini például Ela-í, Elb-í, E2&-Í, EdOREő-ct Egy megvalósítási mód. szerint a segítő funkciót adenovirussal biztosítják. Az adenevíras lehet vad típusú adenovírus, és tehet, humán vagy nem humán eredetű, előnyösen nem humán főemlős: (NHP) eredetű. Számos adeuavírus típus DHS-szekvencüg:a hozzáférhető: a öenbank-bói, köztük az Ad5-é is (Genbaak hozzáférési szám: M732ŐŐ). Az adenevírus: szekvenciákat bármilyen ismert adenovírus szerotípusból. elóállíthariuk, mmt például a 2-és, 3-as, 4-es, 7-es, I 2~es: és 4ö-es, és továbbá a jelenleg azonosítod humán típusok bármelyikéből ís (lásd például: Bönvltz, mini fent):, Hasonlóképpen nem humán állatokat (például csimpánzokat) ismert módon megfertőző adenovírusókat ís alkaimazbattmk a találmány szerinti vektörkonstrukeiőlíban (lásd például 083 71b. számú amerikai: egyesült államokbeli szabadalmi írat). A vad típusú aáenovteusek mellett a szükséges segíts funkciókat hordozó rekornbináns vírusokat vagy nem virátte vektorokat (például plazmidokat, őpiszőmakaí, stb.) is áikahsazhahmk,
Ilyen rekotnbináos vektorok ismertek a szakterőfeten, és közismert módszerekkel állíthatók elő (lásd például sz 5 871 982. és ő 351 677. számú amerikai egyesült államokbeli, szabadalmi iratekak, ^melyek iubríd Ad/AAV vírust tárnak tel). Az aáeooviras· típus: megválasztását sem tekintjük a találmányt koriaiezórak, Különféle ade.no vírus törzsek, besserezhsíek az 'American Type Cúhure Collectisn· intézettől (Manussas, Virgínia), vagy kérésre: hozzáférhetők különféle kereskedelmi vagy intézményi forrásokból. Ezenfelül sok: ilyen törzs szekvenciája hozzáférhető különféle adatbázisokból, mint például a. PabMsd vagy Genbauk adatbázisból.
- 10 Egy másik alfernallvaként fertőző AAV-ΐ izolálhatunk genontséta íechnológia alkalmazásával is [Steherl és mtsai,, Nuelelc Acid Researeh, 23,1087-1088, síd. (1995); Eriezner-Degen és mtsai,, I, Bioi, C'fesnr. 261,6972-6985. old, (1986); BD Biosclences Clontech, Pato Alio, eA21. A genornséla különösen alkalmas a inláimány szerinti eljárással asoaosifeti áj szekvenciákkal szcanszódos: szekvenciák azonosítására és izolálására.
S Például ezt a módszer hasznos lehet az új AAV szerotípus ferdített terminális ismétlődésének: 0Tfej Izolálására, a találmány szerinti eljárással azonosítsd új AAV kapszid és/vagy rrp szekvenciák alapján. Ez a módszer hasznos a találmány széria azospsitott: és izolált ntáa AAV és nem ..AAV szekvenciákkal szomszédos szekvenciák Izolálására ss (lásd a 3, és 4, példát).
A találmány szerinti: eljárásokat könnyedén alkalmazhattok különféle epidemiológiai vizsgálatokra,
1Ö hiedsszíribuiriós vizsgálatokra. AAV vektorokkal és más integrálódó vírusokból származó vektorokkal végzett génterápia követésére, ily módon az eljárások jól alkalmazhatók klinikusok. kutatók és epidemoségnsok által alkalmazható előregyártón reagenskészletekhen történd alkalmazásit.
11. Diagnosztikai resgenskészteí
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya diagnosztikai magéoskészlet ismert vagy ismeretien adeno-asszociálí vírus (AAV) detektálására mintában. Egy ilyen reagenskésztet 5' és 3' PCR'táncindítók egy első készletét tartalmazhatja, amely specifikus az. AAV n kk nsav-szekvencia szigmuúm régiójára. Más megoldásképpen......vagy ezenfelül .....az itvea reagensfcésJe; tartalmazhatja 5' és 3’ PCRláncínditók egy első készletét, amely specifikus arra a 3.) kb mereíu feagtaensre. amely tartslmazzs a találmány szerinti teljes hosszúságú AAV kapszid sokfeinsuv-szekvenelát (például az AViss és AV2cas láneipditókj,
Adott esetben a találmány szerinti reagenskészlet továbbá mrtalrnazbatja 5’ és 3' láneindhók és/vagy ECRprobák két vagy több további találmány szerinti készletét. Ezeket a. lárscistdítókat és próbákat alkaíomzbújuk a találmány szerint az egyes AAV szerötígüsók szlgmitúm régiójának sz amplifíkalásám, példáid kvantitatív PCR
A találmány iárgyá: képezi továbbá tstótotóy szerinti eljárással detektált AAV azeroílpus azonosítására ésfeagy új AAV ismén AAV-től történő megkülönböztetésére alkalmas: reagenskészlsi. Egy ilyen teagenskészlet továbbá tartalmazhat egy vagy több restrikciós enzimei, AAV szeroiípusok standardjáé, amelyek tartalmazzák a „jellemző restrikciós enzimes emésztési elemzésüket”, ós/vagy más eszközöket a detektált AAV ezerotíposának .a meghatáríjzásám.
Ezenfelül a találmány szerinti reagenskésztetek tartalmazhatnak utasításokat, negatív és/vagy pozitív
31) kontrollt, tartályokat, oldószereket és pufierekeí a minta számára, szinnalúra régiók összefeísonlhasám szolgáló: jelzoabrákat, eldobható kesztyűket, dekontamlnáhfei utasitásokgí, mmíaiblvivö pálcákat vagy tartályokat, és: mlatselókészitési edényeket, valamint bármilyen kívánt reagenst, beleértve tápközegei, mosóreagenseket és koncentrált reagenseket. Az ilyen reagenseket könnyedén kiválaszthatjuk a leírásban ismertetett és a hagy ontáísvosan alkalmazott kooeentráh reagensek közú t. Egy előnyös megvalősitásl mód szerint a mosóreagens izotönlás sócldat, amely fiziológiás pH-rá van puriereíve, mint például: leszfét-pufeeli: sáoldat (PB<), íz dumo* mugeus 7,4 M \aCl-t íaruitnazo PÖS, es koncentrált reagensek és eszközök. Példáid szakember számára nyilvánvaló, hogy olyan reagensek, mint például polietiléu-glikol (PEG) vagy (NH4hSO4 megfelelő lehet, és elvan eszközök, mini például szúró eszközök. Például egy lőö K membránnal ellátóit szúró eszköz koncentrálja a rAAV-h
- π A találmány szériád mgeestósztóek alkalmasak a teláimásy szeriníi eljárások végrehajtására, és biödiaztribúciö, epidennólógia és éj AAV szörotípnsok átviteli módjának fanslmányozására eiaWbes és NHPkbpn.
Ily módos a találmány szerinti eljárások és reagenskészíeték tehetővé teszik vitális célszekvencíák, különösen integrálódod rirális szekvenciák detektálását, azonosítását és izolálását. Az: eljárások és reagesskészletek különösen alkalmasak AAV szekvenciák detektálásában, azonosításában és izolálásába® töriésö alkalmazásra, amelyek tehetnek új AAV szerotipugok Is.
Egy említésre méltó példában a találmány szerinti eljárás: elősegítette klónozott AAV szekvenciák: elemzéséi, és feltárta a provirális szekvenciák heterogenitását kSlöhbözőAlkitokból klónozott fragmensek között, amelyek mindegyike különbözött a hat ismert .AAV sseroripus között, és a variációk többsége a kapsziá lekapó htpervariábiHs régiójában volt található. Az .AAV szekvenciák meglepő divergenciáját megfigyeltük egyedi szövet; forrásokból izolált kiónokban js, mint például egyetlen réznstnígomből származó nyirokcsomóból. Ezt a heterogenitást legjobban az AA\ szekvencia nyilvánvaló evolúciójával magyarázhatjuk meg az: egyedi állatokban, részben a kiterjedt homológ rekombináció minit a korlátozott számú, sgyidöbert fertőző szülőt vitás között. Ezek. a vizsgálatok azt sugallják, hogy a szekvencia evolúciója széles körben elterjesztette a vérest az AAV fertőzés természetes lefolyása sósán, és feltehetőleg „kvázifasok” rajainak kialakulásához vezet, amelyek egymástól a kapszíd hípervariábllls régiójában különbőznek. Ez az. első példa egy DNS-víhss gyors moleknlsris evolúciójára olyan módon, amelyről korábban azt gondolták, hogy csak az tfoíS-vímsokra jellemző.
Számos új AAV szerotipus szekvenciáját azoposltotmk & találmány szerinti eljárással, és a találmány tárgyát képezi ezeknek a szeredpaseknak a jellemzése,
01. Élj AAV szes'otipasok A, Nakteinsav-szekverteiák:
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárással azonosított új AAV szerotspusok. nukleinsavssekvsnciái. lásd az !:,, 9-59.. és: 117-120. azonosítószámú szekvenciákat, amelyek hivatkozás útján a ki tanítás részét képezik, lásd még az t ábrát és: a szekvenciglisíáL
Az új AAV? szerotipus esetéhen a teljes hosszúságú .szekvenciát, amely tartalmazza az AAV 5’ ITE-jét,
k.’Pfc/dun, rep géniét és a 3 ’ ITte-jéf, az 1. azonosítószámú szekvencián mutatjuk be,
A találmány szerinti új AAV szerodpusok esetében a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti eljárással Izolált megközelítőleg 3,1 kb hosszúságú fragsnens, Ez a fritgmens tartalmazza a teljes hosszúságú kapszld fehérjét kódoló szekveno iákat és a rep fehérje egészét vagy részletét kódoló szekvenciákat. Ezek közé a szekvenciák közé tanosmak az alább azonosított szekvenciák.
További új AAV szerotipnsíA esetében a találmány tárgyát képezi a kapszid fehérjét kódoló szignálóra régió, Fáidéul a találmány szerbül AAVIO nnkleinsav-szckvenciák közé tartoznak az: 1, ábrán beomtatottak tlásd a íl7. azöimskoszámú szekvenciát, amely 255 bázis hosszúsága], A tetálnsáuy szerinti AAVll nukteístsav-szekvencíák közé tartoznak az l. ábrán benüitatott feNS-szekvenciák [lásd a 118 azonosítószámú szekvenciái. amely 258 bázis hosszúságú}. A találmány szerimi AAV12 nuklemsav-szskversoiak ke te tartoznak az 1. ábrán bemnistott DNS-Szekveneiák (lásd a 119, azönsshószámó szekversciaí, amely 255 bázisból' állj,. A fest ismertetett módszer alkalmazásúval további. AAVIO, AAVll és AAV 12 szekvenciákat: könnyedén azonösííhaienk és alkalmnzhstosak különféle célokra, mist például amelyeket az AAV7~re és más új
4Ó szerotípnsokra ismertetúsfe a leírásban.
Áz L ábrán találmány szerinti ember főemlős (NHF) AAV nubeinsav-stecvenciábit mutatunk be egymás: alá rendezve korábban syitónosságra teáit AAV szemtte^kkal; AAV 1-gyei [6. azonosítószámú szekvencíaj, AÁY2-vel; [7.1. azonosítószámú szekvencia) és AAV3-rsal p, azonoshószámu szekvencia], Esek kosé .m új W szekvenciák közé tartósnak sz alábbi .t táblázatban bemntatoífak, amelyeket a klóitok számával azososítank;
1, Táblázat
AAV cup szekvencia Rión száma Forrás Ssekv. az. s?Am (DNS)
W Szövet
Rh.l Klón 9 (AA V9) Rhesus Szív 5
Rh.2 Kión 43,1 Rhesus MÉN 39
Rh.3 Klón 43,5 Rhesus MLN 40
Rh.4 Kión 43.12 Rhesus MI.N 41
Hh,5 Rión 43.20 Rhesus MÉN 42
Rh.6 Rien-M M Rhesus MLN 43
RfeV Klón 43.23 Rhesus MÉN 44
RAS Klón 43.25 Rhesus MIN 45
R.h.9 Klón 4a. 1 Rhesus Máj 46
Rh.iO Klón 44.2 Rhesus Máj 59
Eh. 11 Klón 44,5 Rhesus Mái 47
Rh.12 Klón 42. IB Rhesus MIN 30
Rb.D 42.2 Rhesus MÉN 9
Rh, 14 Klón 42.3A Rhesus MI.N 32
Rh.l 5 Klón 42.3B Rhesus MÉN 36
Rh.16 Klón 42.4 Rhesus MI.N 33
R.h.17 Klón 42.5A Rhesus MÉN 34
Rh, 18 Klón 42,5R Rhesus MÉN 29
Rh.í9 Kl0n.42.6B Rhesus MIN 38
Rh.20 Klón 42.8 Rhesus MÉN 27
Rh.21 Klón 42.10 Rhesus: MÉN 35
Rh.22 Klón 42.14 Rhesus MI.N 37
Rh.23 Klón 42.12 Rhesus MI.N 58
Rb.24 Klón 42.13 Rhesus MÉN 31
Rb.25 Klón 42.15 Rhesus MIN 28:
Rh.26 Klón 223.2 Rhesus Máj 49
Rh.27 Klón 223.4 Rhesus Máj 50
Rh.28 Klón 223.5 RlifiSoá Máj: 5.1
Rh.29 Klór· 223.6 Rhesus Máj 52:
Sb.30 Klón 223.7 Rhesus Máj 53
Rh.3i Klón 223.10 Rhesus Máj: 48
-13:-
Rh.32 Klón Cl Rhesas Lep, Duódén®!®, Vese, Máj: 19
Rh.33 Klón €3 Rhesus 20
Rh.34 KlónCS Rhcsas 21
Rh.35 Klón El Rhestís Máj ·>··> X»«y
RbJó Klón F3 Rhesus 23
Rb.37 Klón E5 Rhesns 24
CyJ Kiön 1.3 Cyno Vér 14
Cy.2 Klón 13.3B Cyno Vér 15
CyJ Klón 24,1 Cyno Vér ........ 16..............:
CvA Klón 27 J Cyno Vér 17
Cy.5 Kién 7,2 Cyno Vér | 13
Cy.6 Klón 16,3 Cyno Vér I 10
bb.í Klón 29. 3 Pávián Vér 11
bb,2 Klón 29,5 Pávián vér 13
cii KiőnAÜJ Csimpánz Vér 57
Ch.2 Κ1όπΛ3.4 Csimpánz Ver .54
Ch.3 Klón A3.5 Csimpánz Vér 55
CM Klón A3.7 Csimpánz Vér 56
Egy új 'WO* kiónt allitöttank. éld két: csimpánz adenövírus kapszid: feagmensaek AAV2 «?ρ konsímkeióba történő beillesztésével:. Ezt az áj klósí, az ÁS.bet: Cb,5-sék is nevezzük [28, azonosítószámú szekvencia]:. Ezenfelül a találmány tárgyát képezi két humán AAV szekvencia is, amelyeket H6-sak [25, azosositdszátnú szekvencia] ás 02-®ek pb. azonosítószámú szekvencia] nevezünk.
A találmány szerinti AAV szekvenciák tartalmazzák az a további szálat is, amely komplementer az 1. ábrán es a szekvescjahslában banomtötr szál szekveaciáfával p., 2-52, 1í 7-i:2Ö:. azonosiiaszánm szekvenciáid, tníklelssáv-szekvesciák, valamint RbíS és cDNS szekvenciák, amelyek megfelelnek az 1. ábsásr és a szekveaci&hstában bemutatott szekvenciáknak [í,, 9-59, 117-128, azönosilnszáiná szekvenciáid és azok komplementer szálainak. A: táiálsnány szerinti üúfelélnsáv-székvenciák közé tartóznak az 1, ábrán és a szekveoci&listában bemmstott szekvenciáknak {;L, 9-59, 117-128. azsoosltöszánfe székvenelakj és azok templememer szálainak természetes variánsai. Az ilyen módosítások közé tartoznak példán! a szakterületen ismert jelölések, metilálás, és egy vagy több természetben eloferdaló nnkfemid. szubsztitúciója. degeneráh nnkleodddal.
Ezenfelül a találmány tárgyát képezik olya® sukteissav-szekvensiák, amelyek: több mini 85%-htm, előnyösen legalább körülbelül 88%-han, előnyösebben legalább körülbelül 95%-ban és legelőnyösebben legalább körülbelül 98-99%-han azonosak a találmány szerinti szekvenciákkal, beleértve az 1, ábrás és a szekveiKialistáfean bemutatott szekvenciákat [1,9-59,117-128. azonosítószámú szekvenciák]. Ezen kifejezések jelentése a leírásban áétlnlált.
A találmány tárgyéi képeztk a találmány szerinti eljárással azonosított új AAV szekvenciák iragatensei is, A megfelelő feagmensek legalább 1$ nakíeotíd hosszúságnsk, és fenkcíooális impotensek, azaz biológiáikig jelentős íragmensek. Egy megvalósítási mód szerint ezek a feagmensek. az 1. ábrán és a szekvencialisiáhsn
Ηbemutatott: Szekvenciák (1., 9-59,117-Ί2&, azonosbészámú szelreeuciák], azok kompfeotsmter szálakeöNS-ei és az azokkal kompletnemer RNS-ek feagmensei,
A megfelelő iragmensek példáit azok AAVl, AAV2 vagy AAV? szekvenciáját}· belüli elhelyézksdesével á$afc meg- Azonban a találmány szerihti egymás alá rendezés aíkaltöszásávsl (amelyet a OMő/ W program és az alapértelmezett beállítások alkalmazásával kaptunk), vagy a találmány szerinti aj szerotipnsekkal való egymás alá rendezés előállítására szolgáló hasonló módszerekkel a szakember könnyedén szososhbstja a. kívánt feígmsnsék start és stop koáonjaít.
A megfelelő feagmenssk közé tartoznak az AAV kapszid három variábilis fehérjéjét (vp) kódoló szekvenciák, amelyek alternatív splieíng variánsok; vpd (például a 825-3849, nskleoóöok az AAV7-ben, 1,
IS azonosítószámú szekvencia]; vp2 [például uz 1234-3849, stukléobdok az AAV7-ben, 1, azonosltőszsmd szekvenciaj; és vp3 [például az 1434-3049. unkleotídok az AAV7-bcu, 1, azonosítószámú szekvencia], Megjegyzendő, hogy az AAVT-beu a szokatlan GTG síartfcödon található. Néhány háztartási gén kivételével nem számoltak be korábban ilyen stertkodos jelenlétéről DNR-vírttsokban. A lobbi AAV szehóttpx® vpl, vp2 és vp3 génjének Aartkodonjaíről ágy gondolták, hogy olyanok, amelyek lehetővé teszik a gazdasejf celluláris neduom n-ramah Ixzsaspt v >2 o- spí i,'v jakét 10 - ?<ν λ >>- ,i g- ju’fc innak crdefebe’' logv lehetővé tegye a virion hatékony összeállúásá· Azonban az AAV virionról azt találtuk, hogy hatékonyan összoállittxhk még ezzel a ritka GTG startkodotmal ts. Ily módon ágy érezzük, hogy kívánatos a többi AAV szerotlpaa vp3 staríkodonjáuak a megváltoztatása, hogy ezt a ritka GTG startkodont tartalmazza, annak érdekében, hogy jafetsuk a pakolódás hatékonyságát, megváltoztassuk a virion szerkezetet és/vagy megváltoztassuk a többi AAV szerotipnsbas az epitöpok (például semlegesítő ellefssnyagok eplíópjainak) elhelyezkedését, A shutkodonokat hagyosnáuyoS: technológiák, mórt példánl helyspeetbkss amíagenezis alkalmazásával változtathatjuk taeg, öy mádon a laláfesány tárgykörébe tartoznék bármilyen szerotípusú wgváltoztatet: AAV vadonok, amelyek GTG-re változtatott síartködommí rendelkező vpA-feót és/vagy adott esetben vpl-bol es/vagy vp2-völ állnak,
Az AAV más megfelelő feagmensei tartalmazzák az: AAV kapszid fehérje startkodoojáí {például a 4683098, nukleotiáok az AAV?-ben, I. azonosítószámú szekvencia, 725-3898, nukfeorídőkaz AAV7-ben, 1. azono sböszánm szekvencia, és a megfelelő régiók a többi AAV szerotípssbas]. Az: AAV7 és a találmány szerinti eljárásokkal azonosított többi új AAV szerodpus még további feagmensei keze tartoznak a rep fehérjéket kódolok, ndat például a rop?k fpéldául a 334, nakleofedaál lévő inieiáetóskodon az: 1. ábrán az AAV7 esetében), rvp 68 [a 334. nukfeoíidnál lévő ímcsáeíö» kodon az I, ábrán az AAV? esetében], rep 52 :{az IbOő, núkleoíiduál lévő Inieiáetós kodon az I, ábrán az-AAV? esetében] és rop 48 [az 1Ö06. mikleoíídnál lévő irnciáeíős kodon az 1. ábrán az AÁV? esetében], Más jelentőséggel bíró íragroensek közé tartoznak az AAV 5' ferdifett terminális ismétlődések Sz ITR-ek [az 1-:107. nukleotid az 1. ábrán az A.AV7 esetében];: az AAV 3’ ITR-je [a 4704-4721. nukleotid az í. ábrán az AAV? esetében], Ρ19 szekvenciák, AAV 848 szekvenciák, a rep-kötö hely, és a terminális feloldási hely (TRfe):. Még más megfelelő feagmeusak nyilvánvalóak a szakember számára. A találmány szerinti lobbi új szerodpns meg felelő regiéit könnyen tneghaíarözhatfek az I, ábra alapján, vagy hagyományos egymás alá rendezési módszerek alkalmazásával a leírás szerinti szekvenciák segítségével.
Az ábrákon és a szekyenejaiístában megadott nuklehtssv-szekvenciák mellett a feiálíaáay tárgyát képezik olyan nuklemsav-mofekulák és szekvenciák, amelyeket a találmány szormti AAV szerotiptrsok aesmosav-szekveseiáíutdí, fehérjéinek. és pepsldjsinek. expresszáltatasára terveztünk, ily módon a találmány
- 15 tárgyát képezik olyan nuklelnSav-szekveíieiák, amelyek az alábbi új AAV aminosltv-szekvéríclákat kódolják: C ί [60. azonosítószámú szekvencia], C2 [61, .azonosítószámú szekvenciái, €5 (62. azonositószásnú szekvencia], A3-3 [66, azonosítószámú szekvencia], A3-7 [67. tizonosítoszátnú. szekvencia], A3-4 [68. azonosítószámú szekvencia j, ,V-5 [fok azonosnószane szeksersaa . Vb ,62 uzonosíms/amn s/efo énein;, ??V A3 azoixjsíiószámú szekvencia], 223-5 [74. azonositószámó szekvencia], .223-10 [75. azonosítószámú szekvencia]., 223-2 [76, azonosítószámú szekvencia], 223-7 (?7. azonosítószámú szekvencia], 223-6 [78. nzoimsltószántú .szekvencia], 44-1 [79. azonosítószámú szekvewM 34-5 [80. azonosítószámú szekvencia]:, 44-2 [81, azoriosítószámú szekvencia], 42-15 (84- ;móxiofoószámú szekvencia]:, 42-8 [SS, azonosítószámú szekvencia], 4213 [86. szorsositúszámú szekvencia], 42-3A [87. azonosítószámú szekvencia], 42-4 [88. azonosítószámú szekvencia], 42-SA [89, azonosítószámú szekvencia], 42-1B· [98, azonosítószámú szekvencia], 42-5B (91. ;szonoskóssánxú .szekvencia], 43-1. [92. azeníísiisszánrú szekvencia], 43- i2 [93. .azcáiosúószarnú szekvencia], 435 [94, íOíonosúószámú szekvencia], 43-2.1 [96. azonosítószámú, szekvencia],. 43-25 (97, azonosítószámú szekvencia], 43-20 (99. azonositószámú szekvencia], 24.5 [101, azonosítószámú szekvencia], 42.2 [102. azonosítószámú szekvencia]:, 7.2 [103. azonosítószámú szekvencia]. 27.3 [184. azom-sítószamú szekvencia],
IS. 16.3 [105. azonosítószámú szekvencia], 4248 [106. tizoansífoszámú szekvencia], 42-313 [107. azonosítószámú szekvencia], 42-11 (188. azonosrtósziírnú szekvencia], FI [189. azonosítószámú szekvencia], F5 [110. azonosítószámú szekvencia], F3 [II1. azonosítószámú szekvencia], 42-68 [112. azonosítószámú szekvencia] és/vagy 42-12 [113, azonosítószámú szekvencia], és mesterséges AAV szerotigusofe, amelyeket ezeknek a a szekvenciáknak és/vagy egyedi iragsnenseiknek az alkalmazásával álíitoítonk elő.
A leírás szennti értelemben a mesterséges AAV szokteneía aem kerláfozó példái kiszé tartozik a természetben nem előforduló kapszid tehéné· tartalmazó AAV. ilyen mesterséges kapsztdoí bármilyen •megfeleld módszenei elóúlkfeúmk, találmány szerion. ns A kV szekvencia alkalmazásával [például a vp-1 krw fehérje fragtneasévelK «gyútt olyan heteroíóg s/ekvuKiakkal, amelyek egy másik AAV szerotípushól όντ értnél vagy újbóli, ugyanannak az AAV szerotípn-n.?k nem ósszetuggó részlcteibói, nem AAV virális forrásból vagy nem \ iráíis: forrásból állíthatók eió, Egy mesterséges .AAV szeroilpus sem korlátozó példaként lehet kiméra AAV kapszid, rekombináns AAV kapszid vagy „hnínanizúií'’ AAV kapszid.
B, AAV aminosav -szekvenciák, fehérjék és peptidek
A találmány tárgyát képezik olyan fehérjék és azok iragtnensei, amelyeket a találmány szerinti új AAV szeroiipusok nukleinsav-szekvenciáí kódolnak, mim például az AAV7 [a 825-3849. nukleoíidok az AAV7-ixín,
1. azonosítószámú szekvencia] és más találmány szerit?·! új szerotíptisok. Ily módon a találmány szerinti új szermipusok kapszid fehérjéi. mint példán! a H6 [25. azonosítószámú szekvencia], H2 [26, azonosítószámú szekvencia], 42-2 [9, azonosítószámú szekvencia], 42-8 [27. azonosítószámú szekvencia]:, .421-4.5 [2.8. azonosítószámú szekve?mía].: 42-50 [29, azonosítószámú· szekvencia]:, 42-lb [30. azonosítószámú szekvencia]:
42- 13 (31, azonosítószámú szekvencia], 42-3» [32, azonosítószámú szekvenciái, 42-4 [33, azonosítószámú szekvencia], 42-5a [34. azonrtsífoszfoná szekvetteia], 42-10 [35. azonosítószámú szekvencia], 42-3b [36.
azonoshószátsú szekvéncis]:, 42-II [37, azonosítószámú szekvencia], 42-60 [38, azönosífoszántú szekvencia],
43- 1 [39. :aáonositö$zámú szekvencia], 43-5 [48. azoitosítószámú szekvencia], 43-12 (41, szooosltóssániú .szekvencia], 43-20 [42, azonosítószámú szekvencia], 43-21 [43, aMtósííúszámá. szekverteta]:, 43-23 [44. azonosítószámú szekvencia], 43-25 [45, azonosítószámú szekvencia], 44.1 [47. azonosítószámú szekvencia],
44.5 [47. azonosítószámú szekvencia], 223.18 [48. azonosítószámú szekvencia], 223,2 [49. azortpsitószánfo wteftökl, 223.4 [58. aammhtetaú szekvencia], 223.5 (5L azonosítószámú szekvencia], 223.8 [52, azonoshószámú szekvencia], 223.7 (53. :ason.oshösz;lmú szekvencia), A.3,4 (54·. azonosítószámú szekvencia], A3.5 [55. azonosítószámú szekvencia], A3.7 [36. azonosítószámú szekvencia], A3.3 [57.. azonotfiíószámú szekvencia], 42.12: [58, azonosttószájnú szekvencia];, and 44.2 [39, azonosítószámú szekvencia], könnyen eiöállíthatók hagyományos módszerek alkalmazásával a fent felsorol klonok nyót leolvasási fázisaiból.
A találmány tárgykörébe tóreezuak továbbá a találmány szenna áj A.W szeroúpusok szekvenciáinak alkalmazásával előállított AAV szereíípasok, amelyeket szintetikus, rekombínáss vagy szakember számára ismert más módszerekkel állítottunk dó, A találmány nem korlátozódik a találmány szerinti új AAV tHikfeinsav-szekverteiákfói expresszálodó új AAV aminosav-szekvéHeiákra, pepíidekíe és feltésjékre, btnetst a szakterületen ismert: más eljárásokkal, mint például kémiái szintézissel, más: szintetikus módszerekkel vagy más eljárásokkal előállított tmnnosay-szekveneiák, fehérjék és peptidek is a találmány tárgykörébe tartoznak. Béldání a Cl [88. azonosítószámú szekvencia], C2 [61. azonosítószámú szekvencia], €5 [82. azormsiiószámá szekvenciái, Ά3--3 [68, azonosítószámú szekvencia], A3-7 [67,. azonosítószámú szekvencia], A3-4 [68.. azonosítószámú szekvencia]:, A3-5 [69. azonosítószámú szekvencia), 3.3b (62, azonosítószámú szekvencia]:,
223.4 (73.. azonosítószámú szekvencia), 223-5 [74. azonosítószámú szekvencia]:, 223-10 [75. azonosítószámú szekvencia], 223-2 [78. azonosítószámú szekvencia], 223-7 [77. azonosítószámú szekvencia], 223-6 [78.. azonosítószámú szekvencia]:, 44-1 (79. azonosítószámú szekvencia], 44-5 [8:8, azonosítószámú szekvencia], 44-2 (81, azoBíísitószánrú szekvenciái:, 42-15 (84, azonosítószámú szekvencia), 42-8: (85. azonosítószámú szekvencia], 42-13 (86. azonosítószámú szekvencia], 42-3A [87, azonosítószámú szekvencia], 42-4 [88.
azonosítószámú szekvencia], 42-5A [89, azonosítószámú szekvencia], 42-lS [98, azonosítószámú szekvencia], 42-513 [91. azonosítószámú szekvencia], 43-1 [92 a/ono^tószhnú szekvencia]. 43-12 [8?. azonosítószámú szekvencia], 43-5 [94. azejmsiíöszámá szekvencia] 43-21 [<«\ azonosítószámú szekvencia], 43-25 [97, azonosítószámú szekvencia], 43-26 [99. azonosítószámú szekvencia], 24.1 [181. azonosítószámú szekvencia], 42.2 [182, azonosítószámú szekvencia], 7.2 [183 Azooositösramú szekvenciái, 27.3 [184. <teesmsító«zámú szekvencia]:, Í6>3 [Iö5>: azsnositószáutó szekvencia], 42.18 [188, azonosítószámú szekvencia]:, 42-3B [187. azonosítószámú szekvencia], 42-11 [188. uzouosuoszamu szekvencia], FI [189, azonosítószámú szekvencia], F3 [116. azonosítószámú szekvencia), F3 [Ili. azonosítószámú szekvencia], 42-6S (1 12. azonrsshőszámú szekvencia) estoagy 42-12 fi 13. azonosítószámú szekvencia) szekvenciák: líármelyikeí könnyedén etösíhthsíluk kúiöntéle módszerek alkalmazásával.
Alkalmas előállítási módszerek jól ismertek,a szakember számára [lásd például Sambrook es mtsai., .Jkiolecular Cíonsng: A Laboratory Msnnaf. kiad: Cöld Spring Barbor Press, Coki Spríng Harbor, 8ÍY). Más megoldásképpen pepiidékor, megsxintetizál.hanmk a jól ismert peptidsziatózis-eljárások alkalmazásával is [Merrificíá, J, Am. Chem. Sec. 85, 21492149. old, (1962):; Síetvart és Vömig, ,,Sohd Pltase Pepííde ővníhesisA 27-62. old., kiad.: Freeman, San Francisco (1869)], Ezek ás más alkalmas előállítási eljárások a szakember számára ismertek, és nem korlátozzák a találmányt.
Különösen előnyös fehérjék közé tartóznak .sz AAV kapsziá fehérjék, amelyeket a fent említeti svkfcoíid-szekveneiák kódolnak. Több találmány szerinti kapszaí ichójjv s/ekveneieytt bemutatjuk egymás alá rendezve a 2, ábrás és/vagy a szekvmtclalistábíUt [2, és 66-115 azonosítószámú szekvenciák), mnslyek hivatkozás útján a kitanitás részér képezik. Az AAV kapszíd háromféle: febériéböl áll, a vpí, vp2 és vp.3 fehérjékből, amelyek alternatív splieing variánsok. Az ábrákon bemutatott teljes hosszúságú szekvencia a vpl szekvenciája. Az AAV? kapszid szekvenciája; (2, azonöritószáísú szekvencia) alapján a vp2 szekvenciája az .AAV? 138-737. ammosavait öleli föl, és a vp3 szekvenciája az AAV7 2Ö3-737. amínosavah öleli föl. Ezen irsformáció alapján a szakember könnyen sneghatározhatju a yp2 és vp3 fehérjék elhelyezkedését a találmány szerinti töfefer új szemtlpm esetében.
A kapszid fehérje rós előnyös. fehérjéi és Íragmensei közé tartoznak az állasdú és variábilis régiók, amelyek a hipereariábilis régiók íl-IPVj közön és magukban a ílPV szekvenciákban találhatók. Az AAV2 divergens szekveneiaterületeinek megha-ározására kifejleszted algoritmus 12 hiperv&nab-bs régtót (HVR) eredményezett, amelyek kezel 5 átfedő vagy része a korábban leírt: négy hipervariábiíís regien, k {Chiorini és mtsai,, X Vhol. 73, 1309-1319. föld. (1999); Rulledge és mtsaí, I. Víroí 72, 3Ö9-319. dd.}. Ezen algoritmus ctóvagy a leírásban ismcítetett egymás alá rendezési módszerek alkalmazásával meghatározzuk az áj AAV szerollpesok klVK-jest. Például az AA.V2 vpl [70. azonosítószámú szekvencia] számozása alapján a HVR-ek az alábbi módon helyezkednek eh íiVfti, 1^6-152. anúsosavafe; HVR2. 182-1.86, ámmosúvak; 1-1VR3, 262-204, annnosavah; HVR4, 361-383. aminosavak; HVR5, 450-474. aminosavak; HYRií 490-495; mmoossvak; BVR7, 500-504, aminosavak; .HVR8, 514-522, aminosavak; HYR9, 534-555, aminosavak: HVRIQ, 581-594, aadaosavak; BVRls, 658-662. aminosavak; és BVR.I2, 705-719. sminosavak, A hagyományos módszerek szerint elkészíted egymás alá rendezés és a találmmsy szerinti új: szekvenciák, (lásd például a 2. ábrát] alkalmazásával könnyeden meghaíámshaíjnk a. HVR elhelyezkedéséi: a találmány :szerln|j új AAV szeroripusokban. Például a 2, ábra alkalmazásával, meghatározhatjuk, hogy az: AAV7 [2. azortositószántú szekvenciái esetében a HVR2 a 146-152. aminosavaknál helyezkedik el; a tíVR2 a 182-187, ammosavaksál helyezkedik el; a BVS3 a 263-266. ashnösavaknál helyezkedik el; a 14VR4 a 383-385. aminosavakoúl helyezkedik eh a BVR5 a 451-475. aminosavaköál helyezkedik el; a MVRö a 491-496, amirtösavaksái helyezkedik el; a HVR? az 5:01-505. amlsosavaknál helyezkedik el; a BVS.8 az 513-521. aminosav&ksál helyezkedik eh 11VR0 az 533-554, .aminfösavaknál helyezkedik el; a BVR.10 az 583-596. antmosavaknál helyezkedik el; « HVR 11 a 660-669. amlnösavaknál helyezkedik el; a HVR 12 a 707-721. msinossvskhái helyezkedik el, A leírás szerinti Inlbrtuáció alkalmazásával a többi találmány szerinti ej szerotipus fíVR-jót is könnyen meghatározhatjuk.
Ezenfelül & kapszldbaa azonosság! ammosav-kazettákaf azonosítottunk. Ezek a kazetták különösen jelentősek, mivel hasznosak mesterséges szerotipusok létrehozására, például egy kiválasztoh szerotipus HV R1 kazettájának kicserélésével egy másik szerotipus: HV.Rl kazettájával. Ezen azonosság! kazetták némelyikéi bemutatjuk a.2. ábrán. A 2, ábrán......amelyen a C/móri A egymás alá rendezést mulatjuk be......egv számskálát mutatunk :be a szekvenciák alatt az eriö oldailanc 1. pozielőjáföl kezdve. Á. számskála felest; vonalat alkalmazzuk az érésért konzervált pozieiők: bejelölésére, Bárom karaktert (*, : , , 1 alkalmazunk, Á ,,*w jelöli azokat a pozíciókat, amelyeken egyetlen, teljesen konzervált oidálkme található. A,,;” jelöli azt, startkor egy „erős’' csoport teljesen kostzervák. A,,,” jelöl; azt, amikor egy „gyengébb” csoport teljesen konzervált. Ezek mind pozitív értékű csoportok, amelyek jelen vannak a „Bennet PatóSÖ” mátrixban. Az erős csoportokat >0,5 erős értékkel definiáljuk, és a gyenge csoportokat <0,5 gyenge értékkel definiáljak.
Ezenfelül az AAV kapszid más: alkalstas: íragmensei közé tartoznak.....az AAV 2 Í70. azonosítószámú szekvenciái számozása alapján — a 24-42. aminosavak; 25-28. aminosavak; 81-85. aminosavak; 133-165, sssluússvsk; 134-165. suüaosávak; 137-143, auunesavúk; 154-156. aminosavak; 194-208. ammosarak, 261274. anúnosayak:;: 262-274. aounosavak; 1.71-173, amiuossvak; 413-417, aminosavak; 449-478. aminosavak;
-18 494-525. anmtősavak;: 534-571, amlaosavsk; 581-őöl, sminosavakt 660-671. aminösavafo 709-723, ammosavak. Még további előnyös iragmensek közé tartoznak például az ÁAV7-ben a 2:. azonosítószámú szekvcncia 1-184. ammosavai; 179-259, aminosavaí; 274-259, aminosavaí; 603-259. armnosavaí; 67Ö-7Ö6. íusinossvak 724-736. átuinesavai; 1.85-198. asibsosavak 260-273, aminosavaí; 447-477, nannossvaí;, 447-662.
amínesavai; 666-659. ammosavat; és 707-723. amirmsaval. Még további előnyös régiók: -az. ÁAV7 (2. azonosítószámú szxAvencia] számozása alapján az alábbiak bármelyike; 185-198. aminosav-ak:; 2641-273. amlnosavak; 447-477,, ammosavak; 447-662, anrinosavsk; 660-669. ajninosavak; és 707-723. amísosavak. A leírás szerinti, idtoíré X program alapértelmezett beállításaival elkészített egymás alá rendezés alkalmazásával vagy kereskedelmi forgatómban vagy nyilvánosan beszerezhető egymás alá rendezési programok alapértelmezett
1*3 beúliüásamak az alkalmazásával a szakember könnyen meghatározhatja a találmány szerinti: új AAV kápszídok megfelelő ffagínenselt.
Más előnyös fehérjék az AAV r-φ fehérjék (az 1-623. aminosavak az AAV'7 3, £monnsítószám.ú szekvenciája szerint] és azx?k hmkc tonális fragmonsei, odúi például a 3, azonosítószámú szekveseín 1-171, ammossvai, 172-372. iutunosavai, 373-444, aminosavai, 445-623, aminosavak Megfelelő módon az ilyen
Iragmensek legalább: 8 amtoosay hosszúságúak, lásd a 3. ábrát. Összeh&sonlhhstó régiókat azonosithatunk a találmány szerinti többi új AAV fehérjében, a leirá» szerinti módszerek és a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával. Ezenfelül könnyedén a&slmazfeamak más kívánt hosszúságú fragmenseket is, Ilyen ftagstenseket rekombinánsan vágy más alkalmas módon úllíthatsmk elő, példán! kémiai szintézissel.
Találmány szerinti szekvenciákat, fehérjéket és fragmenseket bármilyen alkalmas módon állíthatunk
2.0 elő. például rekordbínáns termeléssel, kémiai szintézissel vagy más szintetikus módón. Áz Ilyen előállítási eljárások a szakember számára ismertek, és nesn korlátozzák a taláhnányt.
IV, lfj AAV kapszidot tartalmazó rAAV előállítása
A találmány tárgyát a találmány szerint azonosított új vad típusú AAV szerotípnsok képezik, amely vad dpusú AAV szeroíípasok szekvenciája nesn tartalmaz olyan DNS-t és sejtbeli anyagot, amellyé! ezek a vírusok kapcsolóiban állnak a termeszeiben. Egy másik megvalósítási snód szerint a találmány tárgyát olyan molekulák képezik, amelyek a találmány szerinti új AAV szekveaeiákaí......beleértve azok fragínenseit......alkalmazzák heterolög gén és más nakleinsav-szekveneíák eé'isepbe történő bejuttatására alkalmas molekulák előállítására.
A találmány szerinti, találmány szerinti új AAV szeroüpasok szekvenciáit tartalmazó molekulák: közé tartózik bármilyen olyan genetikai elem (vektor), amely bejuttatható gazdasejtbe, példáid csupasz DN S, piazmíd, ing, transzpozojí, kozmid, episzönia, aess virális bejuttató eszközben (példáid hpid-alapú hordozóban) található fehérje, vírus, stb., amely átviszi a rajta, hordozott szekvenciákat. A kiválasztott vektort bármilyen alkalmas eljárással bejuttathatjuk, beleértve: a imnszlekcíot, elsfcmoporáelőó hposzömás bejuttatást, msmbránfúziós módszereket, DNS-sel bevont nagysebességű sörétet, virális fertőzést és protoplaszt fúziói, A találmány bármelyik megvalósítási módjának előállítására alkalmazott eljárások ismertek a rsukleíssav-manipuláeiö területén járatos szakember számára, és ezek közé tartozik a génsebészet, .rekombináns manipuláció és szintetikus módszerek [lásd például Sambrook és mísai., ,A4o!eeular Cloning: A. Eaboraiory h-hmaul, kiad: Cőld Sprisg, Harbor Press, Cold Spring Hat-bor, NVj.
Egy megvalósítási mód szerint: a találmány szériád vektor a találmány szériád új AAV kapszidot [például AAV? kapszidóf, AAV 44-2 (rh.lS), AAVlö kapszidot, AAVíl kítpszidol, AAV 12 kapszidot], vagy
-19ezea AAV kapszidok kozni egyet vagy többet kódoló szekvenciákat tartalmaz. KW' ruegoláásképpeö a vektorok magát: a kapszld fehérjét, vagy aaask a feagínensét tartalmazhatják.
Adott esetbe» a találmány sxerisői vektorok AÁV rop fehérjéket kódoló szekvenciákat tartalmazhatnak. Ilyet? fep szekvenciák szártsazhatnak ugyanabból az .AAV .szerotípasböi, mint amelyből a c«p szekvenciák származnak. Más megoldásképpen a találmány tárgyát olyan vektorok képezik, amelyekben a rep szekvenciák olyan AAV szerotipasokbcl sBámazssk, amely különbözik azoktól, antelyekbol a ctg? szeksx;scíák számtaznak. Egy meg\ alósitásr ntöd szerit! t a rop és eap szekvenciákat: különbőzé ibrrásokból (például különálló vektorokról:, vagy gazdasejtböl és vektorról) eypresszáhatjak. Egy másik megvalósítási mért szerint ezeket a ?vp szfikvenciákat ugyanarról a íosrástól expresszáítatmk, mint a épp szekvenciákat. Ezen megyalősllási mórt szeri® a rop szekvenciákat fázisban fozionöitntnatjnk különböző AAV szerotspus épp szekvenciáival, fciméra .AAV vektort létrehozva, Adott esetben a találmány szénán vektorok továbbá minigént is tartalmasamat amely egy kiválasztott Eanszgént tartalmaz, amelyet 5’ AAV 1TR és 3’ AAV ITfe szekvenciák szegélyezitek.
ily módon egy megvalósítási mód szermi a találmány szerinti vektorok intakt .AAV kapszklot kódoló nnkletnsav-szekveneiákat tartalmaznak, amelyek. egyetlen AÁV xzeroíspasból (például AAV? vagy másik áj
15' .AAV xzeroíipnsból) származhatnak. Más megoldásképpen ezek a vektorok olyan mesterséges kapszidot kódoló szekvenciákat tartalmaznak, amely az AAV7 (vagy másik: új AAV) kapszírt egy vagy több Ssgmettséi heteroióg AÁV vagy nem AAV kapszid teltériéhez (vagy annak feagmensehez) feziosálttüva tartalmazzák. Ezeket a mesterséges kapszid lehósjéket az AAV? (vagy másik új AAV) kapszid nem ÖsszertíggS részletéből vagy más AAV seeroilpusok: kspszidjaiböl választják kí. Például kívánatos lehet az AAV vpl egy vagy több kódoló régiójának a módosítása, például egy vagy több hipervaríábilis régióban (azaz a BPVÍ -12~feen>, vagy a vp2-é es/vagy a νρ'3-é.. Egy másik példa szerint: kívánatos lehet a vp3 fehérje startkodonjái megváltoztatni GTG-re. Ezeket a módosítások® az expresszié, kitermelés növelésére végezhetjük, vagy a tisztítás javítására a. knaL-niod. extj’e''s’ios rends/e-ber vgv m<H ks$ «t „elool 'pe^u a rtopt unt4' nug>.<b<.vUía.\dn< ny, , semlegesítő ellenanyag epstópjaínak megváltoztatására).
A találmány szerinti vektorok— példáid egy plszmid — különféle célokra alkalmasaik, de kaiőnőses jól alkalmazhatók AAV szekvenciákat vagy azok feagmenselt tartalmazó rAAV előállítására. Ezek a vektorokat .....beleértve az rAAV-s......, az elemeiket, előállításukat· és alkalmazásukat részletesen ismertetjük a leírásban.
Egy megvalósítási mód. szerint a találmány tárgya -eljárás AAV? szetötípusé (vagy egy másik új AAV) kagsziddal vagy annak egy részletével rendelkező rekombináns adeno-asszoeiált vírus (AAV) előállítására. Ilyen eljárás: szerint olyan gazáasejW tenyésztünk, amely az alábbiakat kódoló nnkiemsavaí tartalmaz: adenoasszóciált vírus (AAV) 7-es szerötlpnsó (vagy másik új AAV) kapszid: fehérje, vagy annak fragrnense, amint a leírásban definiáljuk; möködöképes rep gén; mínigén, amely minimálisan: AAV feid&it fertstmáfe ismétlődésekből (ITR) és egy íranszgénböl áll: és elégséges segíts funkciókat, amelyek lehetővé feszik a minigén pakolását az AAV? (vagy másik áj .AAV) kapszid fehérjébe.
Az AAV mmigóanek AAV tetpszklha történő pakolásához szükséges, a gazdssejtben tenyésztendő komponensek transz helyzetben leijeinek: a gnzdasejtben. Más megoldásképpen a szükséges komponensek (például mimgém re/? szekvenciák, eap szekvenciák, és/vagy segltS femkelók) bármelyikét vagy többet is egy stabil gazdasejfben biztosíthatnak, amelyet gémsebészeti úton ágy módosítottnak, hogy tartalmazzon a szükséges komponensek közül egyet vagy többet a szakember számára ismert eljárások, alkalmazásával, Legalkalmasabb,
4Ö ha az ilyen, stabil gazdasejt a szükséges komponensíeklef indukálható proreoter szabályozása aktit: tartalmazza,.
- 20 AsKHtfeaa a szükséges komponenst eks állhatnak konstitutív promóter szabályozása akit is. Az alkalmas indukálható és konstitutív protnőtor-A poklait bemutat?A a leírásban, a trauszgénnei alkaimasbató szabályozó ©femeket tárgyaló észben. Egy még másik megvalosí-ásí mód -szerint, a kiválasztott gaztlaselt tartolmazhat kiválasztott kotoponessfekfet egy konstitutív promóter szabályozása alatt, és más kiválasztott tesgymens(ek)et egy vagy? több irtoukáiható promóter szabályozása alatt, Például elöállitbatuuk olyan stabil gazdasejteí, amely 293-áS: sejtekből (amelyek El segítő fenkclőt tartalmaznak konstitutív promóter szabályozása alatt) származik, de amely a rep és/vagy <w fehérjéket indukálható promötensk szabályozása alatt tartalmazza, A szakember még további stabil gazdasejteket is előállíthat.
A találmány szerinti rAAV elbállltásétez szükséges mmigém, rep szekvenciákat, esp sxtátoettctákaf és
El seghé funkciókat bármilyen olyan genetikai elemmel bejuttathatjuk a pakoló gazdasejtbe, amely átviszi a rajta hordozott szekvenciákat. A kiválasztott genetikai elemet bánrülyeíi alkalmas eljárássá! bejuitalhatjuk, mist például a leírásban tstnertelettokkel, A találmány bármelyik megvalósítási módjának előállítására alkalmazott ellátások ismerték a uukleíusav-matupaláciő területén járatos szakember szarnám, és ezek közé tartozik a génsebészet, rekemhisáas mamptdació és szintetikus módszerek (lásd például Sambrook és mtsaí., ,2döfeouiar
Cloning: A Láborattay Mádnál”, kiad: Goid Spring Harbor Press, Cöld Spring ilsrfeor, bí¥l, ífasoalóképpsm rAAV vsrionok előállítására szolgáló eljárások jól ismertek, és az alkalmas eljárás kiválasztása rém korlátozza a találmányt [lásd például K. kisbér és mts;n„ I. ViroL 78» 528-532. old. (198.31 és az 5 478 745. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat].
A. A minigén
A tninigén minimálisan a íranszgénhöl és a szabályozó szekvenciáiból» és az 5’ és 3’ tbrdítotí terminális ismétlődésekből (FfK) áll, A mimgép az, ami a kapszid fehérjébe pakolódik, és bejut a klvájászíótbgazdasejtbe, í. A trattszgen
A transzgén olyan uuklemsav-szekveneia, amely heterolog a ttanszgéttt szegélyező vektor ssekvensiákfeez képest, és amely jelentőséggel btró polipeptidet, fehérjét, vagy más terméket kódol. A nukfeinsav kódoló szekvencia működőképesen kapcsolva van szabályozó komponensekhez oly módon, ami lehetővé tesz! a transzgén transzkripcióját transzlációját és.· vagy expressziójáf a gszdasejtbea,
A ttonszgén szekvenciák összetétele függhet attól az alkalmazástól, amelyben a kapott vektort alkalmazzuk. Példán! egyfajta transzáén szekvencia, jebtoszekvsnelát tartalmaz, amely ax expresszlöja után detektálható lelet produkál. Ilyen jelzőszekvenciák nem korlátozó példás közé tartoznak az alábbiakat kódoló feNS-szekveneiáác (1-fektamáz, p-galaktozidáz íLaeZ), aikahkes fes/ímáz, ómldhukisáz, zöld fluoreszcens fehérje (GÉP), klőramfeuikol-tjeeulíranszfcráz tCAT), kuniéra/, nrembránitotott fehérjék, mint példán! CD2, CB4, GD8, az: lalíuenza hemagghton.m lékébe, és a szakterüfeten jól isméid más fehérjék, amelyekhez léteznek vagy·' hagyományos úton efeáilühatok magas aftmitású ellenanyagok, és fúziós fehérjék, amelyek metohráttkotótt fehérjét tartalmaznak megfelelően fezlöttáliatva antigén-címke doménbez, többek között bemaggíutmlsbőí vagy yyc-ből.
Ezek a kódoló szekvenciák — amikor kapcsolódnak az expressxiójttkat irányító szabályozó ele/uekbez: ---- olyan hagyományos módszerekkel detektálható jelet biztosítanak, amelyek közé tartoznak emómatikus. radioaktív, kelorimetriás, Eupfeszeests vagy tpáslűle spektrográftás vizsgálati eljárások, fereszeeps aktivált sejíválogatási vizsgálati eljárások és tonsnaoiégrai. vizsgálati eljárások, köztük euzámkapcsolt mmumadszorhens vizsgálati eljárások (EE1S A), radioaktív inimmtolögiai vizsgálati eljárások (Rí A! és immujfeisztokémia, Például • 21 amikor a ntarkerszskvcncfe a LacZ gém a szignált hordozó vektor jefeniétet a β-galaktoztdáz aktivitás mérésére szolgáló vizsgálati eljárással detektáljuk. Ahol a transzgétí a zöld finoreszcess feltétje vagy feeiferáz, a szignált hordozó vektort szín alapié® vizuálisa®, W htmisnméferben. fesrytezmelés alapján tnéridk.
Azonban: előnyösen: a transzáén, egy nettt-matker szekvencia, amely olyan. fennéket. kódol, amely hasznos biológiában vagy gyógyászatban, mim például fehérjék, peptidek, RNS, enzimek vagy katalitikus RNSek. Előnyös RNS-tnofeknlák kozó tartozik a íKNS, dsRNS,. Ahoszómális RNS, katalitikus RNS és antiszeusz RNS. Hasznos RNS-szekveneia egy példája olyan szekvencia, amely kioltja a célzott jmklemsav-szekveseia expressziöját a kezelt ália-feau.
Á íranszgéní génhibák kijavítására vagy enyhítésére alkalmazhatjük, amelyek közé íartezsak olyan lö hibák, amelyekben normális gének a normális szánt-alatt expresszálódoak, vagy olyan hibák, amelyekbe® & funkcionális géntennék sem expresszáíódik. A transzgén-szekvsncia előnyős típusa terápiás fehérjét vagy poEpeptidet kódol, amely expresszálódtk gazdasejiben. A találmány tárgyát képezi továbbá több tnmszgén alkalmazása, például iebb-alegységex fehérje által okozott génhiba kijavítására vagy enyhítésére.. Bizonyos helyzetekben kskihbóző traaszgéneket alkalmazhatunk a fehérje mindegyik alegységének kódolására, vagy különböző peptidek vagy fehérjék kódolására. Ez akkor előnyős,, amikor a fehérje-alegységet kódoló: DNS mérete nagy, például immunglobulin, véílemezke-eredetü ttövekedést faktor vagy bisztróim fehérje esetében. Atmak érdekében, hogy a sejt termelje a tőbb-afegységes fehérjét, a sejtet megfertőzzük a különböző alegységek ixsioáegyikét kódoló rekorabtoáös vírussal. Más megoldásképpen fehérje különböző alegységeit ugyanazon a transzgénen kódolhatjuk. Ebben az esetben egyetlen traaszgéo hatalmazza az egyes alegységeket kódoló DNS-t, és az egyes alegységek DNS~ét belső riboszóma-belépésl hely (ÍRES) választja el.. Ez akkor előnyős, amikor az egyes alegységekül kódoló DNS mérete kiesi, például amikor az alegységeket és az IRES-t kódoló DNS teljes mérete kisebb, mint 5 kb, Az: ÍRES altemtívájakéní a DNS-t 2A-peplióet kódoló szekvenciák választhatják el, amelyek, peszhírassziseiősan elhasalják salat magukat (lásd például M, 1, Donneliy és mtsai., X Gén, Virol. 78, 13-21, old, (19971' kűriét, S. és mtsai., Gene Tber. 8, 864-873. old. (2SÖtg Rfemp, H. és mtsai,, Szene Ther. 8,
811-817. óid. (2Őöl)J, Ez a 2Á-peptid szignifikánsan kisebb az iRESmél, ami jói alkalmazhatóvá teszi akkor, amikor a hely korlátozó tényező. Azonban a kiválasztod transzgén bármilyen, biológiailag aktív terméket vagy más terméket is kódolhat, példáid tanulmányozni kí vánt termeket.
Megfelelő transzgéneksá a szakember könnyen kiválaszthat. A transzgén kiválasztásai nem lekuojűk a találmányt korlátozónak.
3ó 2:. Szabályozó eleinek
A mínígén lent azonosított i® elemei melleit a vektor tartalmaz szükséges bagytanártyos szabályozó elemeket is, amelyek működőképesed kapcsolva vannak a tranazgénhez oly módon, ami lehetővé teszt annak transzkripcióját, transzlácíójá- és vagy evpresszupát a találmány szerint, előállított pl&zmsávekíocraí írauszfektáh, vagjf a találmány szerint előállított vírussal fertőzött sejtben. A leírás szerinti éberemben a ,,nrőköílők.ép«sen kapcsol;” szekvenciák közé tartoznak olyan expressziét? szabályozó szekvenciák, amelyek esybefeggöek a jelentőséggel bíró génnek es olyan szabályozó kontroll szekvenciák, amelyek franzz vagy távolt helyzetben: hatnak a jelentőséggel bíró gén szabályozására.
Az: expresszíős szabályozó szekvenciák köze tartoznak azok, amelyek megfelelő transzkripciós feídációs, termináciős, promóier és «tdtanszer szekvenciákat tartalmaznak.; itatékony RNS-feldolgozási szignálokat, mint például splictng és poliaáerníáoiós (polí-A) szignálokat tartalmadnak;: cifeplazntás RNS-t
Λ7 ...
stabilizáló szekveneiákat tartalmaznak; a transzláció hatékonyságát fokozó szekvenciákat (például Kozák feoasaeaxas' szekvenciát) tariuhnaxuak; a foltérje stabilitását fokozó szekvenciákat tartalmaznak; és kívánt esetben olyan szekvenciákat, amelyek fokozzák a kódolt termék szekrécióját. Nagyszáma olyan expresszíős szabályozó szekvencia — beleértve prométereket Is — ismert a szakterületen es alkalmazható, amely natív, .5 koastitatív, fodttkáihtrto és/vagy szóvekspeerfikös.
A? alkalmazható konstitutív promóterek nem korlátozó példái közé tartozik a retrovirus Rous szarkőma vírus (&SVt ITR promótere (adott esetben az RSV enhanszetrei), a citomegaiovírus ÍCMV) promótere (adptí esetóenaCMV enhanszertei) (lásd például Boshtat és mtsal,, Cell41t 521-530. old. (1985)], az- SWÖprotoóter, a dihldrofoláf-redukíáz promóter, a β-aktin premőíer, a foszfogüeerin-kináz (FGKt promóter és az ΕΠα pj’ötnóier {iavíírogen].
Az iudukálhatő promóterek lehetővé teszik a géuespresszió szabályozását, ás külsőleg adott vegyüietekkel, környezeti tényezőkkel, mint például hőmérséklettel, vagy specifikus fiziológiás állapok mint például akut fázis meglétével, & sejt egy adott differenciálódási stádiumával, vagy csak rephkálédó sejtekben szabályozbafók, Indukálbato promóterek és fednkálhaío rendszerek beszerezhetők különféle kereskedelmi ferrásbék nem korlátoz»·» példaként az tnvlmigen, Clonteeh és Áriad cégektől. Sok más rendszert leírtak és megfelelően kiválaszthatok a szakember szamára. A kívülről adott: promőterefckel indukálható promóterek példái kőzó tartozik az Indukálható juh metailotíonm íMT) promóter, a dexatnetazon- (Dex) -inőukáif egér emlődaganat vírus (&ÍMTV) promóter, a T7 polimeráz promóter rendszer (WOWíOOSK számú nemzetközi közzétételi irat); az ekdizon rovur-promóter (No és tufeai., Proe. NaC Aead, Sei. USA 93, 3346-3351., old.
(1996)] , a íeiraekiiuneí represszálható rendszer (Gossen ésnntsai., Proc. borii. Aead. Sei. OS A 89, 5347-5551.
old. (1992)1, a tetrackimnel indukálható rendszer (Gossen és mtsal., Sciesse 265, 17x56-1709. old. (1995), lásd még Harvey és misaL Curr. öpin. Chem. Bioi. 2, 512-518. old. (1998)1, az RU486-tal mdukáiimtő rendszer [W&ag és mísak, Nat. Bioteeh, 15, 239-243. old, (1997) és Wsng és mtsal.. Gese Ther, 4, 432-441. oki, (1997)) és a rap&naeinnel indukálható rendszer [Magari és mtsal., .1 Clin hívest, 100, >805-2872. old. (Í99?)j. Az ebben a vonatkozásban hasznos más típusú, indukálható promóterek azok, amelyeket egy specifikus biológiai állapot szabályoz, mint például hőmérséklet, akut fázis, a sejt egy adott differenciáétós állapota, vagy csak replíkálódó sejtekben működik.
Egy másik nmgvaiósitási mód szerint a ttanszgón natív promóteréi alkahuazhírtjúk. A natív gremóíer előoyös lehet, amikor az kívánatos, hogy a trastszgén expresszíója utánozza a natív expressziéi. A natív promptért akkor alkaiötazharink, amikor a transzgeo expresszíóját időlegesen vagy·· fejlódésileg keli szabályoz®), vagy szővet-speeítíkns utódon, vagy specifikus ttanszkrípelös stímulusokra válaszul. Egy további megvalósítási mód szerint más natív expressziós szabályozó elemeket, mint például enhanszer elemekei, polladeiülácíös helyeket vagy K.ozak-fole konszenzus szekvenciákat is alkaknazhstunk a natív expresszió utánzására.
A transzgén egy másik megvalósítási mórija szerint a íranszgén működőképesen vasa kapcsolva szövet35 specifikus pronfoterhez, Például ha vámomban való expresszié kívánatos, az izomban aktív préméiért kell alkalmazni. Ezek közé tartoznak az azon génekből származó promőierek, amelyek az alábbiakat kódoljuk: vázizom amktítt, míozio óÁ-könnyűláne, disztrophrn, izom kreafin-kináz, vatemmi szintetíkns izom promóterek, atneiveknek magasabb az aktivitása, mint a lemtészefoen előforduló prontótereknek (lásd például Li és mtssi., Hót, Bioteeh.. 17, 241-243, old. (1999)]:. Szövet-specifikus promőierek példái többek között ismertek a májban (albuntítg Míyatake és ártsák, X. Vlrol, 71, 5124-5132, old. (1997); hepatíösz: B vírus magprosttóter, Símdig és
23mtsai., Eless Tber, 3, 1092-1609, old, {1996); alfe.-fefepíotóa (ÁFP), Arhuthnot és mtsai,, Ham. Gén© Ite. 1593-1514. ©id. (1996)j, esőst oszteokatoin [Stem és mtsai., Moll Blol, Aep. 24, 135-196. obi. (1997)]: csont szialoprotem [Öten és mtsai., 1 Bőse Mmer. Rés, 11, 554-564. old, (199óij, lisdtxdiákban [Cl>2, Hassal és mtsai,, Immtutol, 161, 1663-1068. old. (1998); tomíungiobnlitt nefeézláne; T-sejí-receptor s-lástc), idegi, mint például sesros-spedfikus enoláz (NSE) promóler [Aftáersea és mtsai... Cdl, Mól. Neurobiol, 13, 593-515, old. (1993)'). neurofdametanm kösnyüiánc gén (Piecioli és mtsai., Prne. Hall. .Acad, 5d. USA SS, 5611-561 $> ©Id. (1991:)] és a seuros-speetllkus vgf ges [Pleeieli és mtsai.., Neuron 15,373-384. old. (1995)1.
Adott esetben terápiásán hasznos transzgéneket hordozó plazmátok taríalsiaztatsak ssNekiáibaí© markereket vagy jelzögénekei is, amelyek többek között gesetfein, hiaromtan vagy parintidn rezisztenciát kódéinak. Az ilyen szelektálhatöjelzó- vagy örnrketgéneket (amelyek előnyösen a a találmányszerinti eljárással kimentendő virális genomon kívál találhatók) alkateazhattHik a plazmái bakteriális sejtekbe® való jelenlétének jelzésre» mint például amputálta rezisztenciát, A plazmid más komponense; közé tartozhat a repHkádós origó. Ezek és más ábakhíos pronrótsrek és vektoreiemek kiválasztása megszokott, és sok ilyen szekvencia áll resdelkezesre [lásd például Samhrook és mteak, mint fent» és az abfem idézett irodaion helyek].
A íranszgé®, grontóíerfeohanszer és 5 ' és 3’ ITR-ek koummáeiójás. „msagórasek” nevezzük: az arra való hivatkozások megkönnyítése érdekében, A leírás szerint; kítamtás segásegevel az ilyen minigén megtervezését hagyományos módszerekkel elvégezhettük.
3. Minigén bejuttatása pakoló gazdasejíbe
A mlsígési bármilyen olyan alkalmas vektoron, például piaznhdon szállíttatják, amely gazdasejtbe bejuttatható, A találmány szerint alkabmizbató plazsnídökat génsebészeti úton módosíthattuk úgy, hogy alkalmasak legyenek reglikáeíöra, és: adott esetben prekarléta sejtekbe, emlőssejtekbe, stb, történő integrálódásra. Ezek: a: plazmidok (vagy más vektorok, amelyek hordozzák: az: 5' AAV 1TR —- betérőkig: nmlekula — 3’ 1TR mmigssí) a minigén cnkadőtáktan. és/vamr prökariotákban való replikáclöját lehetővé tévő szekvenciákat tartalmaznak, és az ezekben a rendszerekbe® megfelelő szelekciós markereket, A szelektálható marketek vagy jelződének. többek között geuettois, higromfein vagy portaiéin rezisÁetteiáí kódoló szekvenciákat tartatmázhatnak, A plazsadok tartalmazhatnak továbbá bizonyos -olyan szelektálható jelző- vagy markergéaeket A, amelyek alkalmazhatok. a vektor jelenlétének jelzésére a bakteriális sejtekben, mint: példán! smpfeillm rezisztenciát, A glazmldok: egyéb komponensei köze tartozhat rephkáoiós origója és mnpiíkom miín például az Epstein-Barr vírus sejtmag! antigénjét alkalmazó atnpiikon rendszer.. Ez az ampllkos rendszer, vagy más hasonló amplik.es konrmtnensek lehetővé teszik a. mags fcoplaszsmá. episzotnális replikádét a sejtekben. Előnyösen a misigést hordozó molekulát trasszfektábuk a sejtbe, ahol az tranziensen létezhet. Más megotoásképpen a misigén (amely az 5’ irR--heterolőg molekula—3’ STR szerkezetei hordozza) stabilan integrálódhat a gazdasejt cenosgába, akár kromoszómáiban, akár episzómálisan. Bizonyos megvalósítási; jnodok szenm. a miaigés több kópiában, lehet jelem adott esetben fej-lej, fej-lárokvagy .fcok-íarok konkatemerekben. Megfelel© transzfektálásí módszerek ismertek, és könnyen alkalmazhatók a minigén gazdasejtbe torsén© bejuttatására.
Általában amikor a minigént tartalmazó vektort transzféktálással juttatjuk be, a vektort körtükéiül 5 pg és körülbelül 190 pg közötti mennyiségű DNS-ben juttatjuk: be, és előnyösen körülbelül 1.0 és körülbelül 50 pg közötti mennyiségit SNS-t juttatunk he körülbelül 1. x 1Ö* és körülbelül 1 x 10!5 közötti számú sejtbe* es előnyösen körülbelül 1ÖS sejtbe. Azonban a vektor DNS és a gazdasejt relatív mennyisége megváltoztattató.
-24figyelembe véve olyan fényezőket, mini példáéi a kiválasziött vektor, a bejultatásí eljárás és kiválasztott gazdaseji.
B, fecm és Ccp szekvenciák
A mlnigén melfett s gazáassjt tartalmazza azokat a szekvenciákat, amelyek irányítják az új AAV 5 kapszíd fehérje (például az ÁAV'7 vagy másik új AAV kapszíd vagy mesterséges kapszíd fehérje, amely tartalmazza egy vagy több ilyen kapszldok iragmensót) expressmójái a gazáasejtben, és a mmígénbea található AAV LFR-rel megegyező szeretlpns rep .szekvenciák. Az AAV eap és mp-szekvcac iákat egymástól í&ggedeaöi állíthatjuk elő AAV lőrráslsól, amint fesd bírtak, és bejuttathatjuk azokat s gazdasejtbe a szakember számára ismert módon, amim feni: leírtuk. Ezenfelül amikor találmány szerinti új AAV kapszidöt pszeudotipizálauk, az
LÖ esszenciális rop fehérjék mindegyükét kódoló szekvenciák ugyanabból az· AAV: saerotípeshől származhatnak, vagy a rep fehérjéket kódoló szekvenciák különböző AAV szeröfipnsokből származhatnak (például AAV1, AAV2, AaV3, ÁAV'4, AAV5, AAVó, vagy a találmány szerinti új szmotípusek egyike), Példáíá a repWÖS szekvenciák származhatnak az AAV2-böl, míg a j-gp52/4Ö szekvenciák ssámmzhaiinak az AAVÍ-ból.
ügy megvalósítási mód szerint a gazdasejt stabilan tartalmazza, a kapszid fehérjét alkalmas promőtér, mini például a fent ismertetettek szabályozása alatt. Legelőnyösebben ezen meg valósítási mód szerint a kapszid fehérjét indukálható promóter szabályozása alatt expresszáltatjuk. Egy másik megvalösiiási mód szerint a kapszid fehérjét «hsz helyzetben biztosítjuk: a gasdasejt számára. Amikor iraxsz helyzetben Juttatjuk be a gazdasejtbe, a kapszid fehérjét olyas plazmidon juttathatjuk: be, amely tartalmazza a kiválasztott kapszid fehérjének a gazáasejtbes történő espresszáitatásához szükséges szekvenciákat. Amikor írrfusz helyzetben
2Ö juharjuk 'be, legelőnyösebben a kapszid fehérjéket hordozó piazotíd hordoz órás szekvenciákat is, amelyek szükségesek az rÁAY pakolásához, például a «?» szekvenciákat.
Egy másik: megvalósítási mód szerint a gazdasejt stabilan tartalmazza a rep szekvenciákat alkalmas promófer, mini például a fent ismertetettek szabályozása alatt. Legelőnyösebben ezen megvalósítási mód szerbit az esszenciális iéhérnAe- indukálható promóior szabályozása alatt expresszáltatjufe Egy másik megvalósítási mód szerint a λρ fehérjéket rtztsyz helyzetben biztosítjuk: a gazdasejt: számára.. Antikor feonaz helyzetbe» juítatjuk be a gazdagépbe, a rep fehérjét olyan plazmidsu jnísaihaijúk. he, amely tartalmazza a kiválasztott rcp fehérjének a gazdascjtben történő expresszájtaíásáhozszükségesszekvenciákat Amikor őomz helyzetben juttatjuk be, legelőnyösebben a kapszíd fehérjéket hordozó plazmid hordoz más szekvenciákat is, amelyek szükségesek az rA A V pakolásához, például a *ep és; c»p szekvenciákat.
3ö Ily módon egy megvalósítási mód szerint a rep és cap szekvenciákat egycöen nufeleínsttv-tuelekoíán íranszfektálhatjuk: be a gazdasejtbe, és epíszömaksnt stabilan létezhetnek a sejtben. Egy másik megvalósítási mód szerint a reg és csp szekvenciák stabilan integrálódva vannak a sejt geuornjábtm. Egy másik megvalósítási utod szerint a rtg? és szekvenciák tranziensen ezpresszáiodöak s gazdasejtben. Például az ilyen transzfektálásra alkalmas, nukfemsav-molekula S’~3' irányban az alábbiakat tartalmazza: promőtér, opcionális távtartó a prottmíer és a rep gén szekvenciájának starthelye között, AAV osp górt szekvencia, és AAV erp? gén szekvencia.
Adod esetben a rty> és/vagy sáp szekvenciákat olyan vektoron biztosíthatják, amely a gazdasejiekbe bejuttatandó más DNS-szekvencíákat is tartalmaz. Például a vektor taftalmazltapa a númgéut tartalmazó rAAY konstrukciót. A vektor tartalmazhat segítő feske lókat kódoló egy vagy több gént, például az adeiiovírus El, E2 és E4OSEŐ fehérjékéi, és a VAl RNS gémét.
25Előnyösen az ebben a konstrükciéban alkalmazott proasóter lehel a szakeírtber számára ismeri bármilyen konstitutív, indukálható vagy natív promöter, vagy amelyeket fent tárgyaltnak. Egy megvalósítási mód szerint ΛΑY P5 promótsr-szekveseiát alkalmszrsnk. Az AAV kiválasztása ezen szekvenciák biztosítására nem korlátozza a találmányt
Egy másik előnyős trtegvalösttásí mód szerint á rcp promótere indukálható proíuóter, amint fent tárgyaltuk a transzgének szabályozó elemeivel kapcsolatban. Egy előnyös promőtsr á rep «xpresszáliatása számára a T7 promóier,. A 17 promőter :s:odsályosáaa alatt állói ?up gént: és a. oup gént tartalmazó vektort olyan, sejtbe transzféktáljuk vagy imnsaiarcnáijok, amely fcmáhuirvan vagy índukállmtdan expresssálja a T7~ polintorázs (lásd a WO 98/11X0. számú nemzetközi közzétételi iratot H89S. március 1.2.)|
A távtartó opcionális elem a vektor szerkezetében. A távtartó a promőter és a rtg? gén ATG starthelye közé hedleszteü. DNS-szekvencia. A távtartó lehet humor, <~n '•rerkezetú; azaz lehet nukleotiőok véletlenszerű ον szekvenciája., vagy más megoldásképpen kódolhat geiúennéket, mist példáid markergént, A távtartó olyan géneket kódolhat, amelyek Epikusán start/stop és polí-A helyeket tartalmaznak, A távtartó lehet ptókarlóláből vagy eakariótáböl származó nem kódoló ONS-szekvenda. ismétlődő nem kődölő szekvencia, Iraószkripolős szabályozás nélküli kódoló szekvencia, vagy transzkripciós szabályozása alatt álló kódoló szekvencia. Két szemléltető forrás távtartó szekvenciákhoz a E lág: létraszekvenciái vagy az élesztő iéírsszékveneiáh amelyek kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, például többek között a Gibeo vagy Invkrogen cégektől. A távtartó bármekkora méreti! lehet, amely elegendő a r:?p78 és rcrpóS géatermékek expressziqjánák a csökkentésére úgy.
hogy a ?yp52, repO és -cap géntefttsékek: normális szítáén espresszálóának. Á távtartó hossza, lehat körülbelül bp és körtílbelül 18,8 kbp közötti lehel, előnyösen a körülbelül 100 bp és körülbelül k.8 kbp közötti tartományban. A rekombináció lehetőségének csökkentesére a távtartó előnyösen kevesebb, márt 2 kbp feosszűságú: azonban a találmány nem korlátozódik erre.
Habár a rop és eup szekvenciákat biztosító molekulák létezhetnek, tmnzkínsen a gazdsseiíben (azaz ttaoszfektalas áriánk előnyős ha a n?/> es «?φ fehérjék egyike vagy mindkettő, és az evpressziójnkat szabályozó promőterek stabilan ezprcssaálödrsak a gazdasejtben, például episzómán vagy a. gszdase-t krtmmszőmájába integrálódva, A találmány megvaiositast médiainak előállítására alkalmazod: eljárások bagyomásyos génsebészeti vagy rekombhtetís módszerek, mint amelyeket a fent hivatkozott .irixlalmi helyeken ismertetnék, Bár a leírásban bemutatjuk specifikus konstrukciók szemléltető példáit, a leírás szerbit! rníermásíó alkalmazásával a szakember kiválaszthat és megtervezhet megfelelő konstrukciókat, távtartók, PS-promóterek, és más elemek alkalrazzásávíth beleértve legalább egy transzlációs start és stop kedonk és poíisdeníláciős helyek opcionális alkalntazását.
A. találmány egy másik megvalósítási módja szerint a rep és <?.<zp fehérjéket stabilan biztosítjuk a gazdasejtbes.
C. A segítő funkciók
A. pakoló gazdasciieknek szükségük van segítő funkciókra is a találmány szerinti rAÁV pakolásához. Adott esetben ezeket a iunkciókat herpeszvírassal biztosíthatjuk, Legelőnyösebben a szükséges: segítő funkciók mindegyikét: bontátr vagy nem barnán: főemlős sdenovírus forrásból biztosiunk, mint például: amelyeket fent ismertettünk .és/vagy különféle Ibrrásokbő .beszerezhetők, mint például a 'American TypeCslíure Cölleetioö’ hítézettől -(ATCC,. Manassas, VA, USA); Egy jelenleg előnyösnek tartóit megvalósítási tnod szerbit a gazdasejtet ellátjuk és/vagy az tartalmaz egy El a gétrterméket. egy Elh génterméket, egy E2a génterméket
-26és/vagy egy E4- 0RE6 géstorméket. A gazdasejt tertalmszfed: más arfaíovfets géneket is, mint például VAI RNS -f, áe ezek a gének sem szükségesek. Egy előnyős megvalósítási mód szerint nincsenek más adenovirus gének vagy gén&nkciók jelen a gazdasejtben.
Ág JBla géniemtékeí expresszáló adenovirus DNS·” kifejezés «te bármilyen Ela-t vagy El a részletet kódoló adenovirus szekvenciát értünk. Az E2á géntormékef expresszáló adenovirus DNS-t és az E4 ORE6 gémerméket expresszálő adenovirus DNS-t hasonlóan definiáljuk. A találmány tárgyát képezik az adenovirus gén vagy funkfonáKs részének bármilyen allélfet vagy más aródosüásai. Az ilyen móde-siíásoknt szándékosan építhetjük be hagyományos génsebészed vagy mutagenezís móds/etekkel. Siogy fokozzuk: az adeáovirux fenkeiót valamilyen módon, valamint lelteinek azok természetben előforduló uilélikus variánsok. Az ilyest adenovirus génfonforiók elérésére szolgáiét DNS-mődosrtó és manipulációs eljárások ismertek a szakember számára.
Az adenovirus El a, Elb, E2a és/vagy E4 ORE6 géntermékeket, valamint: bármilyen: más segítő funkciói biztosíthatunk bármilyen olyan eszköz alkalmazásával, amely lehetővé teszi azok expresszáltaíásáía sejtben. Az. ezeket a termékeket kódoló szekvenciák mindegyike leltet különálló vektort®, vagy egy vagy több gén leltet ugyanazon a. vektoron. Á; vektor leket bánpilyen szakterületen ismert vagy fen· ismerteiéit vektor, beleértve plazmidökat, kozmidokat: és vírusokat is, A vektornak gazdasejtbe történő bejuttatását a szakterületen ismert bármilyen vagy fent ismertetett módon elérhetjük, beleértve többek között a transzicktálást, fertőzést, elektroporációí, liposzómás bejuttatást, membráníuziós módszereket, DNS-sel bevont nagysebességű sőrtétet, vh'álls fertőzést és protoplaszí fúziói. Az adenovirus. gének egyikét vagy többet is stabilan integrálhatjuk a
2Ó gazáasejt genontjába, stabilan expresszáltofearink episzómaként, vagy tranziensen expresszáliafoatjuk. A géntermékek mindegyikét expmsszáh.foutuik tranziensen, episzómán vagy stabilan mtegsálva, vagy a gfeitermékek némelyikét stabilan, axpresszaliatbafjuk, míg inasokat teaszlensen expresszáltsthatmik. Bzesfclnl az egyes: adenovirus gének promőtereít egymástól függetlenül választhatjuk meg, és ezek lehetnek konstitutív premóterek, indukálható promóterek vagy natív adenovirus promóterek. A promótereket az organizmus vagy
2:5 sejt specifikus fiziológiás stádiuma (azaz a dlSerenciáctós stádium vagy nyugvó sejtekben való repEkálódás) szabályozhatja, vagy például kívülről származó faktorok,
D. Cazsiasejtek és pakoló sepvonalak
Maguk a gazdasejtek bármilyen biológiai organizmusból származhatnak, mint például prokarióta (például bakteriális) sejtek és eukariófa sejtek, mist például rovarsejtek, élesztőseitek és emlőssejtek. Különösétől) előnyös gazdasejtek a bármilyen emiősiájből száonazők, nem: korlátozó példaként, olyan sejtek, mint példáid az A5< W, 3T3, ÍÖTI/2, SÍIK, MDCR, COS 1, COS 7, BSC I, BSC 4ö, BMT lö, VERŐ, W138, HeLa, 295as sejtek (amelyek LtakeionáíN adenovirus El-et expresszálnak), Saos, C2O12, L-sejtek, ΕΓΓ1030, HepG2 és printer fsbrofjiasztok, emlős és: humán eredetű hegatocite és ralohiaszí sejtek, beleértve emberi, majom, egér, patkány, nyúl és hörcsög eredetiteket. A sejteket biztosító stnlős&j megválasztása nem korlátozza a találmányt;
se® o· emlőssejt típusa, m fíbreblasri, hepatöcife, daganatsejk. sífe A legelőnyösebb sejtek ne® tartalmaznak az: EL E2a és/vagy E4 OREŐ mellett semmilyen más adenovirus gént; és nem tartalmaznak semmilyen olyan más vírus gént, amely szennyező vírus homológ rekombinációját eredményezné az rÁA V előállítása folyamim; és: képes fertőzésre vagy DNS transzfekeíőjára és a iranszfektálf DNS expresszáiásárs. Egy előnyős megvalósítási mód szerint a gazdasejt olyan, amely stabilan transzferálva tartalmazza & «ρ és cop génekéi a sejtben.
•ν'·?
A találmány szériát hasznos gazdasejt olyan gazdagép, amely stabilan transzformálva van a «g? és: cm? tefe&jéket kódoló szekvenciákkal, és amely trasszfektálva van az adenovirus El, E2a és E4 OREó DNS-sei, és egy leni ismerteteti mínigést hordozó konstrukcióval, Hasonlóképpen alkalmazhatunk rop és· vagy <w géneket stabilút! exptesssálú sejivottsiskat is, mini például s ö-SO-ei (8(717(159809403, számú nemzetközi szabadalmi bejelentés), vagy amelyeket az 5 658 785, számú amerikai egyesül· államokbeli szabadalmi iratban ismertetnek. Egy másik előnyös gszáaseji: minimális adenovíras I)fe$-t tartalmaz, amely elegendő az E4 ÖREó espresszálásához, Még más sejtvonalakat is előállíthatunk a találmány szerinti áj AAV wp-és/vagy új AAV cap szekvenelak alkalmazásával.
A találmány szerinti gassfesejiek előállítása olyan módszereket: foglal magában, mim: például kiválasztott DNS-sszekvenciák összeállítása.. Ezt az összeállítást hagyományos módszerek alkalmazásával végezhetjük el. Ilyen módszerek közé fertőzik oDHS és genomlálls klónozás, amelyek jól Ismertek, és Sambrook és mtsai. ismertetik (mint font), az adenovlms és AAV germtnok átfedő oligoaukleotidszekvenciáinak alkalmazása polímeráz-lánereakcíóval kombinálva, szirueokus eljárások, és bármilyen más alkalmas: eljárás, arneh r kívánt nukleotid-szskvenciát biztosítja, A molekulák (plazmidként vagy vírusként történő! be uth tását a gazdasejtbe szintén a szakember számára ismeri: módszerekkel bstjíhgtjuk végre, és amist a leírás tóm r elvén ismertetjük. Egy előnyős spegyalősriási mód szerbi szokásos transzfektálási módszereket: alkalmaznak, például CáPQ* tresszfektálást vagy elektroporációi, és/vagy hibrid adenovirusZAÁV vektorokkal történő fertőzést olyan sepvonafekban, mist például á BEK 293 humán embrionális vese sejtvonal (humáa vese sejt vonal, amely fonkekmális adenovlrus Él géneket tartalmaz, amelyek feonsz haló El fehérjéket
3Ö biztosítanak!,
A szakember által elkészített ezen új AAV-alapú vektorok hasznosak gének bejuttatására kiválasztod gazdssejiekbe és génterápiás páciensekbe, mivel sem taláitusk AAV7-et smnfegesilö ellenanyagokat az emberi populációban. Ezenfelül korai vizsgálatok, nem matatnák. ki semlegesítő ellenanyagokat üvso majom és csimpánz populációkban, és kevesebb, mim, 15% keresztreakclót mutassak Aőmms majokbas, abban a tájban, amelyből a szőrei jgust izoláltuk. A szakembóf könnyen eloállltet más rAAV virális vektorokat is, amelyek a találmány szerinti kapszid fehérjéket tartalmazzák, a szakember szarnám ismert különféle módszerek: alkalmazásával, Hasonlóképpen előállíthat még további rAAV virális vektorokat, amely AAV '· szekvenciát és tnás szeroílgnsu AAV kapszidjait tartalmazzák. Hasonló előnyöket biztosítanak a találtnam szerinti többi új AAV-u alapuló vektorok is.
ily módon a szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szermti: AAV7 szekvenciák könnyen adsíptálhstők ezekben és más virális vektmrendszerekben történő fe fefeo, ez vőv? vagy fe vöm génbejutsatási alkalmazásra. Hasonlóképpen a szakember könnyen kiválaszthatja a találmány szerinti új: AAV genom más fesgmeriselt: különféle rAAV és nem rAAV vekiorrendszerekben történő alkalmazásra, ilyet! vektorrendszerék közé tartoznak például többek között lemivirusok, rehovirusök, himlővífosok, Fhoeféfe városok ős adonovírus rendszerek. A vsktorrendsze? mégváfesztása nem korlátozó a találmány szempontjából.
Ily módon afeiáimáov tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti új AAV mtklemsav- és aminosavszekvenciáinak alkalmazásával, előállított vektorok. Ilyen vektorok különféle célokra alkalmazbafok, mint például terápiás molekulák bejuttatására és vakcloálásbau történő alkalmazásra, lérápiás molekulák bejuttatására különösen előnyösek a találmány szer inti áj AAV kapszidokat tartalmazó rekombisáns AAV-k,
Ezek— vagy a találmány szerinti áj AAV szekvenciákat tartalmazó más vektor-könstrukciók — alkalmazhatók vakcmáiásban, például, eltoklunöi együtt történő bejuttatásban, vagy magának az ímmmwgénnek a bejattatássm.
V. Rekombináns vítssak és azok alkalmazása
S A leírásban ismertetett módszerek alkalmazásával a szakember előállíthat olyan rAAV-ι, amelynek találmány szerinti új szerodpusú kapszidja vas, vagy találmány szerinti eljárással azonosított AAV szeroiípus egy vagy több új fragmeusét tartalmazó, kapszidja vám Egy megvalósítási mód szerint egyetlen szeroíipusbói származó- teljes hosszúságú kapsaídot alkalmazhatunk, például az A.AY?-h6! [2. azonoshőszánta szekvencia). Egy másik megvalósítási mód szerint olyan teljes hosszúságú kapszidőt állíthatok élő, amely találmány szerinti új szerotípus egv vagy több riagmonsét tartalmazza feziosáltatvu egy másik kiválaszsoít AAV szerotípuaból származó szekvenciákkal. Például az rAAV találmány szerinti AAV szeroíípas egy vagy több új hipervariábílis régióját tartalmazhatja. Más megoldásképpen a találmány szerinti egyedi AAV szerotipusokat alkalmazhatják más virálís: vagy nem vitális szekvenciákat tartalmazó könsSrnkcióklsm.
A. szakember számára nyilvánvaló egy megvalósítási mód, amelyben bizonyos találmány szerinti
1.5 szeroilpusok: különösen alkalmasak bizonyos alkalmazásokra. Például a találmány szerinti AÁ.V7 kapsziíiokön alapuló vektorok különösen alkalmasak izomban történe alkalmazásra; míg a. találmány szerinti rh. 18 (44-2} kspszidokon alapuló vektorok különösen alkalmasak tüdőben történő aik&latszásra. Az ilyen vektorok alkalmazásai nem korlátozottak, és a szakember alkalmazhatja ezeket, a vektorokat más sejttípusokba, szövetekbe vagy szervekbe történő bejmtíúásra, Széniéiül a: találmány szerinti kapszidokos alapuló vektorok alkalmazhatók ezekbe és más sejtekbe, szövetekbe: vagy szervekbe történő bejuttatásra,
A. Transzgén bejuttatása
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás transzgén bejuttatására gazdába, amely szerint kiválasztott gazdasagot transzfektáluak vagy megfertőzünk a találmány szerinti AAV szekvenciákkal előállított vektorral, A bejuttatás! eljárások a szakember számára ismertek, «& nem korlátozzák a találmányt,
Egy előnyös meg valósítási mód szerint a találmány tárgyé eljárás transzgén gazdába történő AAVközvetttett bejuttatására Ezen eljárás szerint kiválasztott gazdasejtet trausz&ktálnnk vagy megfertőzünk olyan rekombináns virális vektorral, amely tartalmam kiválasztott transzgém az annak és az AAV kapszid fehérjéknek a közvetlen expresszióját irányító szabályozó szekvenciák irányítása alatt.
Adott esetben a gazdából származó mintát először megvizsgálhatunk a kiválasztott AAV szsrotipus elleni ellenanyagok jelenlétére, Semlegesítő ellenanyagok detektálására szolgáld különféle vizsgálati eljárások jói ismertek a szakember számára. Az ilyen vizsgálati eljárás megválasztása nem korlátozó a találmány szempontjából (lásd például l’Aher es mtsai,, Natúré Med. 3, SOő-312. old. (1Ú07) és W. €, Manuing és mtsai,, Ihtman Oese Therapy 8, 477-4$ 5 töd. fl99§jj. A vizsgálati eljárás: eredményét aikahpszliaíjuk annak meghatározására, hogy melyik, adott szerotlpusá kapszld fehérjét tartalmazó AAV vektor előnyös a bejuttatásra, például zzon spee iflkus kapszid szeroíipus elleni semlegesítő ellenanyagok hiánya miatt.
Ezen eljárás egy megvalósítási módja szerint a kiválasztott. AAV knpszid fehérjéket tartabnazó vektor bejuttatását megelőzhet! vagy követheti egy gén ocmt utasa különbőzé szerotlpusá AA.V kapszid fehérjét: kírtnlmazó vektorral. Ihisordöképpem a találmány szenrtí sás AAV kapsztd fehérjét: tartalmazó vektor bejuítatását megelőzheti vagy követheti egy géa bejuttatása különböző szerotipasú AAV kapstrid fehérjét tartalmazó vektorral. Ily módon az rÁ.AV vektorokkal történő génbejuttatást ismételten alkalmazhatjuk
-29kiválasztott gazdasejtbe történő heitrttoíásra. Előnyösen a később beadott.rAAV vektorok ugy&B&zí a. trasszgésí hordozzak, mint az első rAAV vektor, de a később beadott vektorok az első vektor által hordozást szerodpnsö kapszid fehérjétől különböző kapszid fehérjéket teriaimaznsk.. Keldans ha az első vektorban AAV? kapszid fehérjék. (2, azonositószásná szekvencíuj vasssak, a később beadott vektorok a többi szerottposböl választolt kapszid fehérjéket taríaimazhatnak, mint például az alábbiak bármelyikét: AAV1, AAV2:, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV6, ÁAVIO, AAVH vagy AAV 12, vagy a. találmány szerint: azonosított többi: áj AAV kapszid bárnicsvikét, nesn korlátozó példaként: AU, K2, Hő, Cí. 02, 05, A3-3, A3-7, Λ3Α, A3-5, 3.3b, 223.4,223-5, 223-10, 223-2, 223-7, 223-6,44-1, 44-5, 44-2. 42-15,42-8, 42-13, 42-3A, 42-4,42-5A. 42-1B, 42-SB, 43-1.4312,43-5,43-21, 4J-25,43-20,24 í. 42 2. 2.2? 3 ío 3.42. tó. 42-33, 42-1 1, 11.1 5 53. 42-63 es vagy 42-12.
A fest ismertetett rekorabmans vektorokat ismert: eljárások szerint juttathatjuk be .gazdasejtekbe. A íAÁV-t,: előnyösen hziológissas kompat-hms hordozóban feíszuszpendálva, beadhatjuk ember vagy nem ember emlős paciensnek, Alkalmas hordozókat a χ/ákemhet könnyedén kiválaszthat azon indikáció függvényében, amelyre a transzfer vírus irányai. Például egv alkalmas hordozó a sőoláat, amelyet különféle: puíferelő oldatokkal (például íoszfát-pufféreli sootdatt szerelhetünk ki. Más szemléltető hordozók köze tartozik a steril sőoidat laktöz, szukróz, kalcmm-feszfát, zselatin,: dextran, agat, pekíia, földimogyoró-olaj:, szezámolaj és víz. A hordozó megválasztása nem korlátozó a találmány szempontjából.
Adott esetben a. találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak......az rAAV és a hordozö(k) mellen
...... más hagyományos gyógyászad alkotóelemeket is, mint példán! tartósítószereket vagy kémiát síafethzálószereköt. Alkalmas szemlelteid tartósítószerek közé tartozik a klbrbntannL, káliiam-szorbát, szorhmssv, kés-dtoxid, propil-gallát, parahének, eíilvamha, glicerin, fenol és paraklőr-feool. Alkalmas kémiai stahihzálöszerek közé tartozik a zselatin: és albumin.
A vitális vektorokat elegendő menny iségben adjtrk be a sejtek transzfektálásáte, ö?: hogy elegendő szintő génátviteli és expresszié! blztoshsanak terápiás: hatás biztosítására indokolatlan káros mellékhatások nélkül, vagy gyégyászatilag elfogadható fiziológiás hutással, amelyek meghatározhatók a gyógyászat területén járatos szakember által. A beadás hagyományos és gyögyászatiiag elfogadható útjainak nem korlátozó példás közé tartozik a közvetlen bejuttatás a tosamszíoü szervbe (például mímportális bejuttatás & májba), orális, hthaláció (beleértve az isíranazálls és totratrzeheáhs bejuttatást), mtraokulárís, mdavénás, intrarnnszkulárís, szubkusán. íntnuk-rcnáhs, és a beadas sná-. paíemerábs útjai. A beadási utakat kiránt cselben ketnbináihayuk.
A vitális vektor adagolása elsődlegesen olyan tenyezöklői függ, mint pékiául a kezelt áhapot, a páciens
3S kora, tömege és egészsége, és ily módon változhat a páciensek között. Például a vlrális vektor terápiásán hatásos barnán dózisa általában a körülbelül 1 és körülbelül 100 mi oldat közötti tartományban van, amelynek a koneemráctója körülhelfe 1 % ICE óx 1 x !Ö!Í> közötti vímsvektor-geitom. Egy előnyös humán dózis körülbelül 1 x 1ÖÍ;( és: 1 x tóió közötti AAV-gonsjra leltek Az adagolást mánsllhnaíjok, hogy kiegyensúlyozzuk a terápiás hasznosságot és· bármilyen mellékhatásokat, és az ilyen adagolások változhatnak a terápiás alkalmazástól függően, amelyre a rekombinátts: vektort alkalmazzak. A tenszgén expresszióján&k a szintjét követhetjük a mlnlgént tartalmazó vitális vektorok, előnyösen AAV vektorok beadási gyakmisagánsk a meghatározására. Adott esetben terápiás célokra leírt adagolási rendekhez hasonlókat alkalmazhatunk irnhnnnzálásra a találmány szerinti készifíKÓstyek aíkahsazasávak
A találmány szerinti ÁAV-taríahnű vektorokkal bejuttatható terápiás termékok ás tmmunogenikus termékek példáit ismertetjük alább. Ezeket a vektorokat különféle terápiás és vakoínálási rendekben fekalmazhaljak, amint a bírásban ismertetjük. Ezenfelül ezeket a vektofokítt egy vagy több további vektorral vagy hatóanyaggal együtt juttathatjuk be egy kívánt terápiás és/vagy vakcmálási rendben.
B, Terápiás transzgének
A írusszgétt által kódolt hosaos terápiás tennétek közé tartoznak Itortttenok és aöviekedési fektetek, amelyek nem korlátozó példái közé tartoznak az alábbiak: inzulin, ghítegon, növekedési termes (öli), pazaíítold termőn fPTHk növekedési termőn felszabadítást faktor (GRF’k fotlikafes stimuláló hormon (ESH), iutóhuzálö hormon (Ι.Κ). humán koriogonadotfopln (hCG). vaszkuláris endötéilális növekedési fektor (VEGE), angiopoietmek, angtosztatin, granalocita kolóniastímuláló faktor (ÖCSI' }- eritropoietm (EPtb, kölöszóvetl növekedést faktor (CTGF), bszikus fibrobiaszt növekedést faktor (bPGF), savas fibrobiaszt növekedési faktor (aFGE), enldermalrs növekedési faktor (EGE), transzformáló növekedési faktor « (TGFak vérlernezke-eredetü rfovekedésl faktor (FDGE), inzulin növekedési fektet 1 és lí (IGF-Í és föh-ffi, a transzformáló növekedési faktor β sznpemsalád bármelyik tagja, köztük a IGE β, aktivmek, iahibinefe vagy a esőst morfbgenikns fehérjék (BMP) bármelyike (BMP 1-15), a teraghdn/ítoureguim/ARIA'neu differeuciációs faktor (NBF) tevetedéat fektetők családjának bármelyik tagja, idegi növekedési faktor i NGF), agyi: eredeté néntetrofikus fektet (BBNE),
NT-3 és jNT-4/5 nemoírofmek, eibárís neurotrofikus fektet (CS 111, glia-sej ivónál eredetű neuretrofskus faktor fGDNE), neuj-tortn, agrin, szemafortn/koilapszin család bármelyik tagja, netriu~i és netrin-2, hepafoeita sövekedési fektof (BGF). cfónck, noggia, „Sonic bedgehog’ os tírozm-hidroxilsz.
hlás hasznos transzgén tennétek közé tartoznak, azok a fehérjék, amelyek az immunrendszert szabályozzák, nem kerlátezó példaként ohokinekés lirnfekinek, unni például tromtepoíetm íTPG}, mterteúkinok
2ö (IE) ÍL-l-toi ih-25-ig (beleértve IL-2, IE-4, iL-12 és 1L-1ST monocíla temoatímktáns fehérje, leukémia inhibitoros faktor, grasulöcüa-makrofeg kolöniastimuláló faktor, has ligamfem, temoraekrózis faktor « és β, interferon u, b és y, őssejt faktor, flk-2/flt3 Ugandám. Az immunrendszer által termel géntermák is alkaimaztetók a találmány szerint Ezek nem koriátezó példái közé tartoznak az IgG, ígM, IgA, IgD és. IgB imsmuglobulmok, kiméra ímmosglobuiinofe hnjoanizálí ellenaayugrsk, egyláneó ellenanyagok, I-sejt25 receptorok, kiméra T-sejt-raceptorok, egyláaeu T-sejt-receptorek, E és fi. osztályba tartozó MIK molekulák, valamim génsebészeti úton módosított immuaglübulinök és MHC-raolekulák. Hasznos géntermékek közé tartoznak a koraplmemer szabályozó fehérjék, mist például komplement-szabályozó fehérjék, membrán kofafetor fehérje (MCE), lebomlást gyorsító fekter (DXE), CRi, CE2 és CBSA
További hasznos géntermétek. közé tartoznak a különféle hormonok, növekedési faktorok, eítokfeek,
3ö: hmfekmek, szabályozó fehérjék és hmmmréndszeri fehérjék receptorai. A találmány tárgykörébe tartoznak a koies.'íerm .zabáiyoízásánnk a receptorai, mint például az. alacsony sűrűségű lipoproteú· (1-131-} receptor, magas sutoógt Itpoprorein (HBE) receptor, a nsgyon alacsony sűrűségű llpopreteln (VI.DE) receptor, és a „scavengeA receptor. A találmány tárgykörébe tartoznak olyan géntermékek, mint például a sstoroidhoitnoH-recepter sztípemsalúd tagjai, közöttük a glutokortiteid receptorok és öszmogén receptorok, B-vhamm. receptorok és más sejtmag! receptorok. Ezenfelül hasznos géntermékek közé tartoznak a transzkripciós faktorok, sünt például hm, jSmí, shx, mad, széramreakciös fekter (SRF), AF-f, AIF2, ette, MyoD és miogenfo, ETS-hoxot tartalmazó fehérjék, TFE3, E2E, A'EFE ATF2, ATF3, ATE4,.2F5, NFAT, CREB, BNF-4, C/ERF, SPE CCAAT-boxot kötö fehérjék, interferont szabályozó faktor (IBF-ly Wihus-tumörfehérju, ETS-kötb fehérje, STAT, GATAbosot kötő lehetjük, például GATA-3, és a számyashélix fehénék villásféjn családja.
Más hasznos^ géntermékek kasé tartozik a ksíbamoihszirttetáz-i, örnitúMrtmszkarbamiláz, m-gátoszukcinát-sziníeíáz, argiísosznksinát-liáz, arginás, femarilaeetaestát-hidroiáz, &ndafashn-hidröxiiáz, aifá-1 anhtripszia, glukorvő-ibsziáíáz, porfofeshnogéu-áeamlsáz, faktor Vili, faktor IX, eisztóíion-béta-azintaz, elágazod lánc kefoaosd-del'tórboztiáz, albumim izovaleHl-soA-debkhugenáz, proploml-CoA~karb<?xil.áz, meíd5 mslöxdl-CöA-xfiufe, glsxteríl-CoAMehidrogextáz, inzulin, béla-glakoridáz, pirőváí-karboxiláí, mái íosx&riiáz, feszlmtláz-kmáx, glieln-dekatboxiláz, El-fehérje, T-fehérj«. elsztás őbrozis iranszmembfáu regulator (C.FTR) szekveueiaés disztrotlh cDNS-szekveneia. Még további hasznos géatermekek közé tartoznak olyan extsúnek. amelyek hasznosak lehetnek enzittxheivettesito terápiában, amelyek hasznosak enzimes hiányos működéséből kővetkező különféle állapotokbati. Például azok az enzimek, amelyek maúaóz-ó-fbsziátot tartalmaznak, alkalmazhatók lizoszómális tárolási betegségek terápiájában jegy megfelelő get a ip-giukurtundázt kódoló gén (GUSBYj.
Más te» géntermékek közé tartoznak tentttészefben nem. előferáalő polipsptídek, mist példás! kimérák vagy hibrid pohpeptidek, amelyek természetben nem előfordul© amintxsav-szekvenciákat tartalmaznak, ammosavak mzereiőival, deléeiőival vagy szubsztitúcióival. Például génsebészed úton módosított egyláseú immunglobulinok hasznosak lehelnek bizonyos hibás immunrendszefe páciensekben. Más típusú természetben netn előforduló génszekvetxeiák közé tartoznak antlszensz molekulák és katalitikus nnkleinsavak, mint például ribozhsok, amelyek alkalmazhatók egy célpont túltermelésének csökkentésére.
Egy gén expressziójának csökkentése ésXagt modulálása különösen előnyős hiperproliféraíiv átlapolok kezelésére, amelyeket hiperproiiíéraio sejtek jellemeznek, úrim például rákok és pszoriázis. Á eéipobpeptídek közé tartoznak azok a poiipeptidek, amelyek kizárólag hiperprolífetáló sejtekben termelődnek, vagy normális sejtekkel összehasonlítva magasabb szinten termelődnek azokban A célantigét-ek közé tartoznak' onkogének — mint például mvh, mye, fyn — és srtmsxlokáetos gének.....ber-abl, xas, sic. P53, nem trk és EGRf — által kódolt polípeptldek. Az onkogének mellett a rákellenes kezelések és védő kezelések célpolipeptidjei közé tartoznak 'béla-sejtes limfómák áltól termeli ellenanyagok variábilis régiói és T-sejtes limfotnák T-sejí-receptemixtak variábilis regiói, amelyek bizonyos megvalósítási módok szerint szintén aikoimazhatok amoimmu® betegség céiantigénjekém. Daganattal kapcsolatos más pölipegtidekel is alkalruazfeatexk. eélpotipepíxdként, mint például azokat a polipepudeket, amelyek magasabb koneenteícíóban találhatunk meg daganatsebükben, beleértve a 1.7A1 moRokiosálls ellenanyag és föláikötö poiipeptidek által felismert poiipeptidek
Más alkalmas terápiás poiipeptidek és fehérjék közé tartoznak azok, amelyek hasznosak lehetnek:
atmferam betegségekben és rendellenességekben szenvedő személyek kezeléséré, és amelyek széleskörű védő immunválaszt biztosítanak olyan eéfeontok ellen, amelyek atstemmmmlással kapcsolatosak, beleértve sejtreseptoíöksk B olyan sejteket, amelyek saját atxyagok elles irányuló: ellenanyagokat termelnek. T-sejtkozvetited autoimmun betegségek közé tartozik a ívumsíoiá artrttisz (RA), szkiórőzás multiplex (MSE Sjogrem .szindróma, szcs.odo s inzuliuíuggö diabétesz tnellihrsz rtD13M), auíoimmua iíroiáííisz, reaktív ariribsz, összenövő szpota sht.sz szkleroderma, poiítniozítisz, derihatomiozdtóz, pszoriázisz, vaszkuiítisz, Wegerter-fele gmnulotPaiózls, Cndat-leie betegség és uleerabv kelkxsz. Ezen betegségek ndadegyikét olyan T-seji-reeepterok (s'SR) jelenléte jellemzi, amelyek endogén antigénekhez kötődnek, és az autoimmun betegséghez kapcsolódó gyulladásos kaszkádreakeiőf váltanak ki,
C. hxtmntiogemku» transzgének
- 32 Más mégoldásképpen ----- vagy ezeafeB —- a találmány szériád vektorok talátoásy szerinti AAV szefeenciákaí és olyan pepiidet, polipeptidet vagy fehérjét kódoló trasszgént tartalnucdlsinttk, amely egy kiválasztott ímmunogén elleni immunválaszt indukál Például az hmnunogének különféle vírusestoádokból szátwzhsfeak, Az előnyös vtasesaládok, amelyek elles előnyös az immunválasz, lehetnek Pteomavisneok, amelybe tartozik a Rklsovírusok nemzetsége, amelyek a közönséges meglázásos esetek körülbelül 50%-áért felelősék: az Enterövirnsök nemzetsége, amelybe tartoznak a Böllovírusók, Coxsackjevírusok, Echo vírusok és humán esferovírusok, mint például a hepatitisz A vírus; és Sz Aptlmvírusok, amelyek: a száj és körömfájás betegségekért felelések, elsősorban nem humán állatokban. A Pfeero&viruxök családjába tartozó vímsokhas s eéfení igének közé tartozik a VP1, VP2, VP'2, VP4 és VPí'l Egy másik vírusesalsd a Cafeivíresok családja, amelybe tartozik a vírusok Nortvalk csoportja, amelyek a járványos gasztroentendsz fontos kórokozói. Még másik viruse.salád áss mumínválsszí indukáló célartogénekkéní tortérte alkalmazásra emberekben és nem humán állatokban a Togavirusok családja, amelybe tartozik az Allavímsok nemzetsége, amelybe tartoznak a Sludhís vírusok, RossRíver vírus, es a Venezuelai, Relett és Nyugati kőeukelalitisz, és a Rubívirusok, köztük a Rubellá vírus, A Átourvöitoto családik tartoznak a dengue, sárgaláz, japán enkeiálltisz, St botos enketábiisz és falfestés
IS által hordozod: eehelhlítísz vírusok. Más eélantígéneket állkkabmk elő a Hepatitisz C vagy a Korosavírs» családból, amelyek tagjai közé· tartoznak különlele humán és nem humán vírusok, mint például fertőző broncbitisz vsrus (baromfi), sertés átvihető gasztroestcríkus vírus (sertés), sertés hemagglmlrtáctós enkefaiottneiifisz vírus (sertés), macska fertőző peníonltlsz vírus (macskák), macska cnterikus korosavírus (macska), kutya körooavírus (kutya) és humán respírtoörskus korona vonok, amelyek közönséges megfázást és/vagy nem· A, B vagy C hepatitiszt okozhatnak, A Koronavirus cs dadKm a cébmflgések közé tartozik sz El (más néven M vagy mátrix fehérje), E2 (más néven S vagy „Splké fehérje), E3 (más néven HE vagy hsmagglukíoeltetbz) glikoproteht ínhtes jelest mtodeo horöttsvístsktm} vagy N (sukfeokapszld}, Még trtás antigéneket is célozhatunk a Rhabdovíras család elten, amelyek közé tartozik a Vesíetoovirus család (például vezíkuiáris sztematitisz vírus), és a Eyssavírus nemzetség, (például veszettség). A Ehabdovíruv családban a megfelelő antigéneket a G fehérjéből vagy N fehérjéből száfrtraztalhtoiuk, A Eifefertd<re család, amelybe tartoznak a hemorráglás láz vírusok, mint például a Marburg: és Ebola vírus, antigének megfelelő forrásai lehetnek. A Paramyxovfrusok: családjába tartozik: a parasnfcenzavirus l-es típusa, parahrtluenzavlrus 3-as típusa, szarvasmarha partonBuenzavirus 3-as típusa, rabulavirus (mumpsz vírus, psratofluenzavirus 2-es típusa, paralnSaenzavlrus 4-endotéliáíis sejt típusa, Nervcasíle: betegség vírusa (csirkék), marhavész, mofhdEvrrusok, amelyek közé tartozik a kanyaró és szopornyica, és Pneumovírusök, amelyek közé tartozik a respiraíórtkus szmcítoális vírus, Az íuEuenzavímsí az öríhomyxovifosok családjába soroljuk, és antigének alkalmas forrása (például a HA fehérje, az Hl fehérje}, A Bnnyavlmsoh családjába tartoznak a Banyntoras (kaliforniai enkefabtísz, l..a Crosse), Phlefeovírus (Rlft Yalfey láz), ihmtavírtts (a puremnía, egyfajta hemorrágíás láz vírus). Nairovírus t Nairobi uibbetegség) nemzetségek, és kuleofefe nem osztályozott Bungavírosok. Az Arenavír-rsok
-családja LCM és Lassú láz vírusok ellem antigének lomha; A Reovistsok családjába tartoznak a Reevírus, Rotuvírtís (amely akut gasztroenterítíszt okoz gyermekekben), Grbfviras és Ctotivíros: (Colorado kullancs: láz, Eebombo (emberek), ló enkefálózis, kék nyelv) nemzetségek.
A retrovírusök családjába tartozik az ösoorívö-toto alcsalád, amely olyan homárt állatorvosi betegségeket tartalmaz, mim például macska leukémia vírus, ííTLV-i és HItV-lL a EentoAmo/ (amely (artafeuízza a komán immtmdeíkieííeis: vírust (HÍV), majom ímmundefiefencja urast (S1V), macska
- 33immnírdoflefenefe vírust (F1V), ló fertőző anémia vírust), és a 5>wav/r»tál A ffl'V és S1V között sok alkalmas antigéttt feltártak és könnyen kiválaszthatók. A mcgiefelo HÍV és S1V antigének nem korlátozó példái közé tartoznak a gag, poi,: Vifi Vpx, VER, Env, Tat és Rév fehérjék, valamint azok kúlöafele fragmenseL Ezenfelül ezen antigének, kálönfefe módosításait is ismertették, Aa erre » célra alkalmas antigének jól ismertek a.
szakember számára, Például kiválaszthatunk más fehérjék mellett egy gag, pöl, YiE esd Vpsr, Env, Tat vagy ífev fehéré? kodolö s»zcx\<.nea? Jusd példán, a node-men gag fehéret, atnthu az 55>7259ö.. számú amerikai egyesült áiiautökheli szabadalmi iratban, ismertetnek;: fesd még a. DM Barouch és mtsai. [1 Vhol, 75, 2462» 2467. old, (2081)1 és RA Asm és mtsai, [Science 392, 69-74. old, (208 i s által leírt IHV és S1V fehetjéket. Ezek a fehérjéket vagy alegységeiket egyedül juíiatbstfek he vagy kpjs&ínAtóbas, különálló vAtorokon. vagy egyetlen veksoroo.,
A Pspovavírus családba tartozik a Ifelyomavfeisok afesaláája (BRfe és JCU vírusok) és a Fstpllfemavirusok alcsaiádsa: (amelyek rákokkal és papíllőma rosszindulaté terjedésével kapcsolatosak), Az .Adenovírttsok családjában olyan vitások (EX, AD?„ ARD, O.E.) tartoznak, amelyek respiratórikas betegséget cfevagy enterittszí okoznak, A Parvovirasok csaladjába, tartozik a macska parvovírus (macska enterttisz), macska paníeuliepenia. vírus, knlya parvo vírus és sertés parvovírus. A Iferpeszvirus családba tartozik az: rtfettóámtpesrtrtmm alesaláá, amelybe: beletartozik a Sisnpfexvirus nemzetség (I3SV1, líSVIl), Varícehödrus nemzetség (álveszettség, ífettotffe wáer) és a amelybe beletartozik a Cylomegaloviras:
nemzetség: (HCMY, mmc-megalovirus) és a GaínmifemzícsvirtKoc alesaláá, amelybe beletartozik a Lyraplmeryptovírtis Mtiaetség, EBV (Burkítis-limlöma), fertőző rtsottscheíílsz, Marek-féíe betegség vírusa és a
Rhadsnovártts, A Poxvírus családba tartozik a CéeWop’orvfemíre alosalás, amelybe beletartozik az örthopokvlrus [Ifertofe (himlő) és Páecwt (tehénhimlő}]:, Parapoxvlrus, Avipoxvíms, Gaprlpoxvlrus, Itepörtpnxvhns, hutposvtrss nemzetség, és az E'nfemöpervó'tnöo alcsalád, A Bepttónavínts családba tartozik a .Hepatitisz 8 viras, Egy nem osztályozott vírus, amely alkalmas lehet antigének forrásaként a Hepatitisz: delta vírus. Még további vírnsfortásök közé tartozik a madár fertőző bmzálts betegség vírusa és a sertés .rexpiratérikux és reproduktív szindróma vírus. Az Alfevlrus családba tartozik a íö aneriúsz vírus és kúlnníele erkeíahtisz vírusok,
A találmány tárgyát képezik olyan immnnogének ts. amelyek hasznosak hantán vagy nem humán állat immunizálására más patogének ellen, mint például baktériumok, gombák, parazita nnfeoergmhzmosek vagy többsejtű paraziták ellen, amelyek; humán: és nem hnmán gerinceseket fertőznek meg, vagy ráksejtekből vagy daganatsebekből szúmmznak, A bakteriális patogénck példái közé tartó wk a patogén Gram-pozitiv kokkaszok, például pneumokoRknszok; sztaElokekknszek és sztreptekokkuszofc, Patogén öram-negatív kokkaszok közé tartoznak a meomgokokknsz; gonokokknsz. Patogén enterikus Grammegatív baelihtsök kézé tartoznak nz Ezífen?öí-íemz,’«t.eoe; Rmödíunottos-, A£i%etdbe&eifa és Ffeesdfe; Afeb'ö/dosfe; óöfeíenfefe; Thígfefe; őfeemppőífes; Von.tr-rtfe; 77 sincrevi (amely iágyfekéiyt okozt; őrnccife; TötoöASr mTömoA (amely túbrémíát okoz); féívfeát (TWenzdfe}; fezeptöböfeTEis .mmfebfemfei és ípirtEum; Gram-pozitiv baeillnsok, mint példán! Líxiet'iű! .WHtKtyíogeses; £ry.«/je/ö?ítm· ζ/ηοίορο,’ήύηη C»f>wéű<«er/w« dfe.feíWrá (dlfiéría); C&ofere; A, órtdwefe (Mtfax); donovanózis (Gt-mm/oam z»g.yt«ö&?) és bartoneíiózis. Patogén anaerob baktériumok által okozott betegségek közé tartozik a tetanusz; botelizmus: más Cios.vtofes-ok; tuberkulózis;: lepm, és más Mv:toK?tt;r®»s-ok. Patogén spiroclfeiá betegségek közé tartozik a szifilisz; trepesematózisok: ’yavíY’plnta^ és endemikus szifilisz; és leptosplrőzis, Más magasstbbrenátt baktériumok és patogén gombák által okozott
-34betegségek közé tartozik az akttsKustközís; tmkardiőzss; kripíokskkózis, btetomikózis, feztoplazmózís és: köksidiöidonrikőzis; kandidiázís, nszpergillózís és mukormjkbxis; sporotricbózis; parakokcidiodomikoizis, petríeliidiózís, törtdopszózis, micetóms és krontomikózis; és ócrmatnfifőzis, Jkekorisib-lertőzések közé tartozik a dfesz, kocky Mountaín fokos láz, Q láz és Afeáertsm-hsmlö, és fertőzések példái köze tartozik: 4fcígíkrt»Kí pn&nmeíwe: metem»»; pxzíkakőzís; és szöleíéskőrüii
Cáfemydm-féitőzesek. Pntogén enkaríóták közé tartoznak a patogéu egysejtűek és béitergek, és az általuk afeozott fertőzések közé tartózik: amebiázis; malária; teíshmaruAs tripanoszomtázis; wsopíazmózís;. /feaufsmyrtA cmésík ÍAeáíms; ídsöpfesmö go/feik bubezíoAs; giardiázis; öichiaózis; fiiariázis; schísíoszomiázis;. hengeresférgek; béigiliszták vagy mételyek; és galandférgek.
1.0 Ezen orea?dzmnsok. és/vagy tasinok közül sokat biológiai támadásokra alkalmasnak xiyílváriitott a ’ Centem fer Dísease Föntről’ intézet [(CDC), Deparimsm of Heath and hm Services, USA]. Például ezen biológiát ágensek közé tartozik. a Saerto tntffoacte (antrax), Cfesrridöím öoódimmr és a taxiuja (botuiizmas), Ikeő/íkí pertA (pestis), ífertofe ?mpor (bbníő), EA/nfesefez (ridsfemia), és virális hemorrágíás láz, amelyek mindegyikéi A kategóriás ágensnek sorolták be; C&xiePe Wwtó ÍQ láz); éteucelfe: fájok (bmcellózís),
IS $arkfeökfedö mfefei (takonykor), .kteöms amm és a ΐοχηρη (tieín toxlft), C7osmkto« pertrmgons és .» tompja (epszilon íoxis), .S'/eofe «»: fajok és a ioxiniaik (eníeroíoxln S), amelyek mindegyiket 8 kategóriás ágensnek sorolták be; és a Ntpan vrms és kanta vírusok, amelyek jelenleg C kategóriás ágensként vannak besorolva, Ezetsfelul más organizmusokat Is azonosíthatnak és/vaav alkalmazhatnak ilyen célra a jövőben» atnehok my vagy másképpen vannak ovtatye;\a, Nyh^nvaío. hogy a ’.dtlmanv vornu cuaks xekíooA <· más konstrukciók hasznosak ezekből az organizmusokból, vírusokból, toslnjaíkból vagy más nteiléktettnékeíkböl származó antigének bejuttatására, ami megelőzheti és/vagy kezelheti az: «fe» biológiai ágensek általi fertőzést vagy más káros reakciókat.
A találmány szerinti vektorok beadása a ?-se]:tek variábilis régiója elleni immnswének hejnrtatásám CTl..-eket magát» foglaló mnmmválaszt vált: ki ezen lAc; <Λ cáminálására. A. temnaioíd artritiszben (RA) T25 sejt íeccpiorok betegségben riszrtevo számos spemffeus variábilis muamd jellemeztek bzen ItR-ek kozó tartozik a V- 3, V- Μ, V · í't és V«-l 7. Ily módon az ezen pellpoptidek legalább egyikét kódoló nukieissavszekveuc ia bejuttatása oh an irmmmválaszt vált ki, amelyik az RA-bsm részt vevő T-sejtcket céloz. A szkierózis multiplexben (blS) TCR-ek betegségben résztvevő számos specifikus variábilis régióját jellemeztek. Ezen TCRekkőzé tartozik a V-7 és Ve-18, Ily módos az: ezen poüpeptldek legalább egyikél kódoló nukleínsav-azekvesKía bejuttatása olyan, immunválaszt vált ki, amelyik az MS-fcea feszt vevő T-spjfeket: céloz. A szkieredermáh;rn TCR-ek betegségben résztvevő számos specifikus variábilis régióját jellemezték. Ezen TCR-ek közé tartozik a V-ő, V< V-14 és Va-lÓ, W3C, Vu~7,: Vn-14, VmlS, Vn-íő,: Vete2k és Vo-12, ily módon az ezen polipeptidek legalább egyikét kódoló snkfeÍÍ5suv-molefoda bejuttatása olyan immunválaszt vált ki, .atróyík a szkierodennában részt vevő T-sejtekst céloz.
Adott esetben a találmány szerinti: AAV szekvenciákat: tartalmazó vektorokat bej oítmhamnk beindításmegerősítés rendszerben is. Különféle ííven adagolási rendeket írtak fe a szakirodalomban, amelyek közül könnyen választhatunk (lásd példáid n WÖ 80/11140. számú nemzetközi közzétételi iratot (közzétéve 2000. március 2,), amely hivatkozás utján a kitanitás részét képezi].
.Az ilyen belmtítás-megsrSsítés rendszerben tipikusan egy DfíS-alapú (például plazmíd) vektort adunk be az imnrnnrendszer beindítására egy snásodik, hagyományos antigénnel végzett megerősítő beadás szamára,
- 35 műit például fehérjével vagy ilyen antigént kódoló szekvenciákat hordozó r'ekösnbináns virussaí, Egy megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás egy kiválasztott antigén: ellesi immunválasz beindítására és megerősítésére, amely szerint bejuttatjuk az antigén; hordozó plazmiíl-DNS vektort, majd: megerősítési végzünk például találmány szerisíi AAV szekvenciát íartalmázó vektormi,
5' Egy megvalósítási ssőd szerint a. belndhásosregerŐsltés rendszer magába® foglalja muhiprötem expresszáltatásáí a beindító és/vagy megerősítő hoídozőeszkőzrŐl [lásd példán! R.&.. Antant, Science 292, 69-74. old, (2001)]:, amely irodalmi helyen multsproíetn rendet ismertetnek SfV és SíV ellesi irmntmválasz létrehozására alkalmas féhéije-alegységek expresszáltasására. Példáid a beindító DNS bejuttathatja a Gag, Fel, \ u, VPX es Vpr e» lm. 1 at. es Rés géneket egyetlen franszkripUintoa. Mas megoldásképpen a Sí V Gag, Fel es ló HÍV* 1 £av géneket juttatjuk be.
Azonban a beinditás-megerőshés rendszerek nem korlátozódnak HÍV ellesi imnnmlzálásm vagy ezen antigének bejuttatására. Például a beindítás inasában foglalhatja egy találmány szerinti első csimpánz vektor bejuttatását, majd megerősítést egy' második csimpánz vektorral, vagy magát az: antigént fohátje formában: tartalmazó készítménnyel. Egy másik példában a beinditás-megerósiíes rendszer védd immunválaszt biztosíthat azon vírus, baktérium vagy más: organizmus ellen, amelyhói az antigén származik. Egy másik elöísyős megvalósítási mód szériát a beindiíás-megerösltés rendszer terápiás hatást bizfositluu. amelyet Imgyonrányos vizsgálati eljárásokkal mérhetünk azon áll apot jelenlétének detektálására, amelyre a terápiát alkalmazzuk.
A beindító vakcinát különféle helyekre adhatjuk he a testben dőzisítiggő módon, amely attól az antigéntől függ, amelyre a kívánt immunválaszt célozzuk. A találmány nem korlátozódik az injekcióik) mennyiségére és helyére, vagy a gyógyászati hordozóra. Annái inkább a heiuditásí lépés magában foglal olyas kezelési rendeket, amelyek egyetlen dózist tartalmaznak Őráskertg naponta, hetente vagy havonta, vagy évente beadva. Példánl az emlősök egy vagy' két beindító: injekciót kaphatnak, amelyek körülbelül 10 pg és kőrölbelsi 58 pg közötti mettnyisegll plazmidot íartaimfomak hordozóban. A beindító DNS-vakcí-ua-készilrnény előnyös: beindító mennyisége vagy dózisa körülbelül az 1 pg és körülbelül I0ÖÖÖ pg közötti mennyiségű DNS-vakciaa tartományai esik. Az adagolás változhat körülbelül 1 pg: és 1800: pg BNfotesiíömeg-kg mennyiség közön.. Az injektálás mennyiségét vagy helyéi előnyösen a vakcináit emlős fajától és állapotától függően választják ki..
Az antigén emlősbe történd bejuttatására alkalmas DNS-vskcfoa egységdóztsás ismertetjük a leírásban, A DNS-vakcinát gyógysszaíllag vagy fiziológiailag elfogadható hordozóban szuszpendálva vagy feloldva készítjük elő a beadásra, például izoíómás sóoldaíban, vagy olytín másfele kiszerelésben, amely nyilvánvaló az ilyen beadásban: járatos szakember számára, A megfelelő hordozó nyilvánvaló a szakember számára, és nagymértékben a beadás dijától függ. A találmány szerinti ke-zn menyeket a fent ismertetett utakon adhatjuk be emlősnek, fenntnripd fokwbsdtdssli kiszerelésben biedegmdábdis bibkmnpatíbilis polimer alkalmazásával, vagy helyszínre történő bejuttatással mieellák, gélek és liposzömák alkalmazásával,.
Adott esetben a találmány szerinti beinditási lépés magában foglalja adjuváns tnegfélelő mennyiségének
33: a beadását is a beindító DNS-vakcitta-késziíínénayei együtt, amist azt a leirásban definiáljuk,
Előnyösen a megerősítő készítményt körülbelül 2 ítél és kőrillhelltl 27 hét közötti idővel a beindító
DNS-vákcina beadása után adjuk be az emlős alanynak. A megerősítő készítmény beadását megerősítő vakeihakészhmény hatásos mennyiségének az alkalmazásával érjük el, amely a beindító: DNS~yakelnáyal megegt ezo antigént tartalmaz vagy annak bejuttatására képes, A megerősítő készítmény rekombínáns vitális vektorból állhat, amely azonos vitális forrásból származik. vagy egy másik forrásból származik. Más megoldásképpen a
-36ntegerősíío készítmény olyan. késztonétty lehet, amely a beindító DNS-vakoísa által kódolt antigénnel megegyezd antigént tartalmaz, de fehérje vagy peptid tormájában, amely készítmény immunválaszt indukál a gazdában. Egy másik megvaldsitási utód szerint a megerősítő vakcina-készítmény olyan készítményt tartalmaz, amely az antigént kódoló ÖNS-szskvencíat iartalmaz az expressziójái emlőssejtben irányító szabályozó szekvencia Irányítása alatt, mini például jól ismert bakteriális: vagy virális vektorokat. A megerősítő vakcinakészitntenryel szemben elsődleges követelmény az, hogy a vakeina-készittnényben lévő antigén ugyanaz az antigén, vagy keresztreagálé antigén legyen, mist a DNS-vakcina által kódolt antigén.
Megfelelő módón a. talúiraáoy szintén jól alkalmazható olyan rendszerekben, amelyekben nem AAV vektorokat, valamim: fehérjéket, peptideket és/vagy más biológiailag: Itasznos terápiás vagy immunogemkus vegynleteket alkalmazunk, Ezek a rendszerek különösen alkalmasak terápiás óéin génltejuttatásra, és immunizálásra, beleértve védő immunitás kialakítását. Az ilyen slkahuazások nyilvánvalóak szakember számára.
Ezenfelül a találmány szerinti vektor hatékony géífbejaítatő eszközt biztosit, amely egy kiválasztott transzgent képes bejutüttn; egy kiválasztott gazdasejthe.is tóvá vagy ov vrvo, még akkor is, ha az organizmusban
1.5 vannak semlegesítő ellenanyagok egy vagy több: AAV szerofipus éhen, Egy megvalósítási mód szerint a vektort (például rAAV) és a sejteket összekeverjük er rivo; a megfertőzöd sejteket tenyésztjük hagyományos módszerek alkalmazásával; és a transzdukált sejteket újra bejuttatjuk a páciensbe. Ezenfelül a találmány szerinti vektorok alkalmazhatók kívánt géntennék út víoyj előállítására Is, Az ;>< utón termeléshez á kívánt terméket (példán! fehérjét) előállíthatjuk egy ki vám tenyészetből, mintán gszöásejteket ttanszfektáhunk:.a kívánt terméket kódoló molekulát tartalmazó rAAV-vei. és tenyésztettük a sejttenyészetei olyas körülmények között, amelyek lehetővé teszik az expressziőt. Az expresszáhaiott termékei azután kívánság szerint megtisztíthatjuk: es izolálhatjuk. Tranvzfekfálásra, se jttenyésztesro, tisztításra és izolálásra alkalmas módszerek Ismertek a szakember számára.
Az alábbi példákkal szemléltetjük a találmány számos megvalósítási módját,
Szabadalmi példák
í. példa: l.tj AAV szekvene iák PC R -aínphtikálása, klónozása és jellemzése, htem humán főemlősökből származó szöveteket szkrinsltünk AAV szekvenciákra PCR-es eljárás alkalmazásával ismert AAV-k erősen konzervált: régióín aktpotó öligíuíekktötksokkal. Az AAV'l (6. azonosítószámú szekvesehét 2886-3143.. bp-jai közötti szakaszt: válasz mt te ki PC':R.-ajnphfíkálásra, antelybert a. kspssid fehérje (Cbu) konzervált szekvenciákkal szegélyezett: hspers naotks régiója található,. amely egyedi mtndets ismeri AAV sztoriátotssban, es mndyef a leírásban „szignálóra reme»te” nevezünk. Későbbi elemzésben kimutattuk erről a srigmünra régióról i ogy a 3-as Inper variábilis régiót lefedő katszerválí oldalláncúk között: helyezkedik el.
Számos nem humán főemlős lőj perifériás veiének kezded vizsgálata detektálható AAV-t tárt. léi olyan fájókból szártnaző állatok csoportjaiban, mint például majmok, C t majmok, csimpánzok: és páviánok, Azonbart nem detektáltunk AAV szekvenciákat más tesztelt állatokban, mini {tóidéul japán: makákókhan, sertéslárkú tnakákőkban és írtőknsisajmokban, Végrehajtottuk a vektoreloszlás: kiterjedtebb elemzését Aáosus majmokból származó, boneslásker szerzett: szöveteken a Pennsylvania Egyetem és Tttlaoe kolóniák majmain. Ez AAV szekvenciát mutatóit kt szövetek széles körében.
A, ArAdE sohmuhtór régié ufpp/ijSáátoso
Az AAV 1-6 és a libáitól és kacsából izolált AAV-k DNS-szekvtmoíák egymás alá rendeztek a ,X3ustal
-37W” program és se alapértelmezett beállítások alkalmazásával, Az AÁVI-fi egymás alá rmtdezéséf — az ú] AAV? ínfennáeiójás'al együtt — az 1, ábrán mutatjuk he. Ósszehasoolrtotúsk az AAV-k szekveneiabasonlöságait
Egy vizsgálatban az AÁVi [6. azonosítószámú szekvencia) 2886-3143,. nukleotidjai közötti 25? bp régiót és az AAV2-Ő genomok ennék megfelelő régiók pásd az: 1. ábrát} azonosítottuk. Ez a régié az AAV kapszid génben helyezkedik el, és erősen konzervált szekvenciákat tartalmaz az 5’ és 3’ végén is, és viszonylag variábilis szekvenciákat a közepén. Ezenfelül a régió tartalmaz egy Orsii? restrikciós enzim helyet (C/ACCACGTC. 15. azonosítószámú szekvencia). Azt találtuk, hogy ez a régió specifikus szignatűrakén· szolgál mindegyik ismert AAV DNS esetében. Más szóval, a PCR-reakeiőt, az ismeri szerotlpusokra specifikus
11) erídonnkleázokkal történő emésztést és géielek-roforézis elemzést követően ezt a régiót alkalmazhatjuk az amplifikált DNS egyértelmű azonosítására: mint: !-es>: 2-es, 3-as, 4-es, 5-Ös, 6-os vagy másik szerotipus.
Az ÁAV1, 2 és 5 DNS-kontrollok alkalmazásával tervezőik meg: és valídsiiuk: a íáueituiítökm, es oplnnalizáitok a PCR körülmények, A láueindítők az AAV2 szekvenciáin alapultak: 5 láncíndítö IS;: az AAV2 (7. azonosítószámú szekvenoiá) 2867-2891, imkleotidtai. és 3’ láucmdltó, ISas, az AAV2· (7, azonosítószámú szekvencia) 3095-3121. nukleotidjai.
Különböző REmm? majmok, különböző szöveteiből — mint például vér, agy, máj, tüdő. here, stb. -származó cdkdárís: DNS-f vizsgáltunk meg a fönt ismertefelt stratégia aíkateaaásávat. Az eredmények azt mulatták, hogy a Ráesss majmok különböző szöveteiből származó DNS-ck erős ECR-errsplilíkáelőt eredményeztek. A PCR-termékek további restrikciós elemzése azt jelezte, hogy minden közzétett AAV
2Ö szekvenciától különböző AAV szekvenciákról smpiífíkálödtak.
A különféle majom szövetek DNS-éböl származó, körülbelííl 255 bp méretű PCR-senackeket. megklősoztttk és megszekvemtltnk. Ezen áj AAV szekvenciák bioínibrínatikaí vizsgálata azt matatta, hogy azok a kapszid gén új AAV szekvenciái, és különböznek egymástól. Az 1. ábrán bemutatjuk az .AAV 10-12 új AAV szignómra régióinak az egymás alá rendezését [sorrendben a 117., 118. és 119, azonosítószámú szekvencia].
Többszörös szekvencia egymás alá rendezést bajtpttusk végre a Eötsöü 01:.81) program alkalmazásával, Az alábbi táblázatban matatjuk be az AAV1-7 és .AAVIO-O. gesomek szignatúra régiói közötti szekvenciaazooesság százalékát.
2« Táblázat Az elemzésbe isevont székwttdák
Szekvencia száma AAV szerotíptts Méret (bp)
1 AÁVi 2 SS
'>· AAV2 255
3 AAV 3 255
4 AAV4 246
5 AAV5 258
6 AAV6 258
7 AAV7 258
10 AAV 10 255
Π AAV11 258
ί > i ·* AAVI2 ...............258...................:
-383, Táblázat hároskénü egymás alá rendezés (azonosság százaléka)
AAV2 AAVŐ : AAV4 AAV5 AAVŐ AAV? AAV 1Ó AAVlt AAV 5 2
AAVI 90 90 8i 76 9? 95 93 <Í4 93
AAV2 93 ?9 '78 99 ί 90 93 93 Q7
ÁÁV3 30 76 9:0 <2. 92 02 92
AAV4 ?ő: •8 i 84 82 81 79
ÁAV5 ........?5.......' .......?8........ 79 79 .....76.....
AAVő 91 $2 94 94
AAV? 94 92 92
AAV 10 95 93
AAVH «
A kiválasztott 25? bp méretű régiót: átivelö új AAV szerötipas .szekvenciát tartalmazó több mint: 30ö klóm izoláltunk és szekvenálrunk, Ezen 380-nál több klón hioinSörmatikal elemzése azt sagaUja, hogy ez a '257 bp hosszúságú régió kritikus, mivel jó markéiként vagy szignálóra szekvoneiaként, szolgái új: AAV szerortpnsok gyors izolálását^ és azotmsiíásám:,
B. A szignóiéra fogó? AMst BCk-mWirtkúhísA?,
A 257 bp hosszúságú szignálóra régiót ídkaimazotk: FCR-tatgoaykéat a: EGK-amplifíkáeiók meghosszabbítására a genom 5' Irányába, hogy lefedjük a rep és gének kapcsolódást régióját (1398 bp 31:43 bp, 6. szono-míxzamú szekvencia): es a genom 3’ irányába, hogy előállítsuk a teljes. <o;j gén szekvmtcí^m
W (28őÓ bp - 4b08 bp, 0, azonosítószámú szekvemöa). A PCk-amphhfcíci.őkat a xaAsmjs körülmények közeli hajtottak végre, beleértve áenateálásí 95 X'-on 8,5-1 percen keresztül, aneilálast oú-n5 “C-ott 0.5-1 percen keresztül és kiterjesztést 72 :Χ-οη kb-orsként 1 percen keresztül, összesen 28-42 ampliízkáelós cikluson kérésziül.
Az: egymás alá rendezeti szekvenciák 'A’ részben ismertetett alkalmazásával: kél. másik viszonylag konzervált régiót ;rzonosiiottmA a rey gén 3’ vege és 25? bp hosszúságé: régió 5’ vége között található szekvenciában és a: o 25? bp iragmetssíől. leolvasással, megegyező irányban, de az AAV 3’ 1TR előtt található szekvenciáim. Két új láoemdirő-készfetet terveztünk és a optimalizállak a PCR körülményeket az ój AAV szerotípusok teljes kagszídjának és a rap szekvenciák egy részének, előállítására, Közelebbről, sz. 3’ antpiiükációhoz az 5' AViNs iáneinditó szekvenciája GC'TGCG'ÍCAACTGGACCAATGAöAAC [az AAVi (ő. azonosítószámú szekvencia) 1398-1423, nekleotidjai]' volt, és a 3’ iáaoínóító a férni ISas volt, A 3’ ampESkáciőhoz az 5’ Iáneinditó: a fend is volt, és a 3’ iáneinditó sz AV2Lns volt TCGTTfCAGTTGAACTTTGöTCTCTGCG [az AAV2 (7, azonosítószámú szekvencia) 4435-44Ő2, nuklectidjaij.
Ezekben a PCE-amphEkációkhan a 257 bp hosszúságú régiót alkalmaztak ECK-horgortyként és tájékozódási pontként átfedő feagmensek létrehozásához, amelyekből teljes kapszid gént állrsottok: eto a. szlgnatnra régióban található Ötálll helyen végzett mzíoriákmássak az itt ismertetett módon előállított 5' és 3' meghosszabbított fesgmensek ampiiKkálását követően, Közelebbről, az: intakt AAV? mg? géa előállításához három ampliükáciés terméket: (a) a szignálóra régió szekvenciáját; íbj az: 5’ kiterjesztés szekvenciáját; és (c) a 5' küenesztes szekvenciáját kionoztuk be a />CEa-7bpo [iro üregen] plaznndeermcbe a gsaoó utasítása· szernt
30: Azmáo a plaztaidokat megernészteítúk öraHI ettzhraoek és rekembínálhtk intakt rap gént ksaíakíivs.
-39Ehbsn -a munkában az AAV 7 és AAW kapszid szekvenciájának körülbelül 89%-áí izoláiütk és elemeztük. Egy új: szcretípttst, az AAV9-et fedeztünk fel a 2-es számú majomban.
A fest ismertetett PCR-feorSlmésyek alkalmazásával izoláltuk az AAV? rop génjének fennmaradó részét, és megklónozfe-k olyan láncmáltők alkalmazásával, amelyek az .AAV genom life. és Mól. bp-ja közötti szakaszát ampliSkáljék farmi: az AAV 2 {?.. azosrosliöszámó. szekvencia) számozása alapján szátnltoítímkj. Ezt a kiént megszekvenáhnk az il'R-ek nélküh sebes AAV? genom elöállitásához..
C. A 3,1 kb <:·«;? iragmens közvetlen amplíítkálása
A 3.1 kb meretü teljes hosszúságú G.y; iragmens NHP szövetből és vér DNS-bőí tönértó közvetlen atttpliitkálására két másik erősen konzervált régiói azonosúonunk az AAV genomokban «agy iragsrsensek PCR19 es ampliiikálására. A rep geo közepén találkatő koatzervált régióban lévő láneindítót választottunk (AVlnst 5’GCTöCöTGAÁCTGGÁGCAA.TöAGÁAC-3', a ö. azoriosiiőszátnú szekvencia 1398-1423, wWotMR.) együtt a cet? géntől leolvasással megegyező irányban találkatő konzervált régióban: elhelyezkedő 3’ láocmáitőval (AV2cas:: 5',-CöGAöAGÁCGAAAGIl'GAACTGAAACGA3\ ?. azonosítószámú szekvencia) a teljes hosszúsága eap bngmensek ampltbkálásánoz. A PCR-termékekeí Topo-klősoztttk a gyártó utasításai szerint lő (Invítrogen), -és elemeztük a szekvenciáját Dfegertgcnomfer alkalmazásával (Qiagesgextönxícs:, Seaítfe, WA> > 99,9% pomossúggaL Összesest 59 fatpszid klóra izoláltunk és jellemeztünk. Ezek kozott 37 klón származott Λ» majom szövetekből (rh.l - rh.37), 6 klón származott ébno.moíogotís' majmokból <sy.t -- cy.ö), 2 kión szánttazotí páviánokból (bb.l és bb.2) és 5 klón származott csimpánzokból (eh,! - sh,5j.
Annak a lehetőségnek kizárására, hogy az új AAV csatádon belöli szekvencia-tiiveeziíás nem a PCR.
tnülemtéks, mint például PCE-kőzvetítclt gén: splicmg különböző: homológ szekvenciákat tartalmazó részleges: DNS-tetnplátök között átfedő hosszabbítással, vagy bakténumok rekombinációs felyamatainsk: sz eredmérsye, végrehajtódunk egy kíséríetserozatoi azonos körülmények között VEI antpliltkslássra teljes cslfeláris: DNS alkalmazásával. Először intakt AAV7 és AAW pbzmidökat kevertünk össze azonos mőlaráttyban, majd sorozatban, meghígitottuk. A sorozatban meghíghoö keverékeket alkalmaztuk terápiáiként 3 ,1: kb mérető VPI
Ifegmensek PCR-amphffefeiéjába® univerzális: Ifetomditők Alkalmazásával és azonos PCE. körülmények között, mint amelyeket a DNS ampEEkálására aikalmazímtk, hogy lassúk, kelelkeznek-e hibrrd. PCfe-fermekek. A keveréket baktériumokba úanszferrnáltuk, és: traoszfermánsokat szolaltnak hibrid: Hónokat keresve, amelyek lehetséges módos bakteriális sejtekben zajló rekombinációból származnak. Egy másik kísérletben élbasttortnk az AAV? és AAV8 piazhxidökat blspí, Avul és kittel enzimekkel, asheiyek mindegyike többször több helyen.
éltetett* a gcnomokat, összekevertük az enfes/Atttemeke; különböző kombinációkban, és VEI fegmensek. FGE-astpliEkáciőiára. ttíkalmazmk azokat: azonos körülmények körön, hogy teszteljük, vajon kelétkezaek-e ECR-fermékek a részleges AAV szekvenciák átfedő meghosszabbhásstauk es eminenseképpen. Egy másik: kísérletben gélen megtisztított 5’ 1,5 kb AAV? VEI iragmens: és 3’ 1,7 kb AAW A ER üaemeas szignálóra régióban átfedő keverékét sorozatban tsegbigiíoítak, és lAlR-ampliSkacióra alkalmaztuk vban mttjran sejtvottaiből extrahált 299 ng colhtláris: DNS jelenlétébe® és Ittányábaa, amely nem tmtahmt-ott AAV szekvenciákat TögAfen elemzéssel vizsgálva. Ezen kísérletek egyike sem mutatta átfedő szekvenciák: hatékony FCR-kőzveiiteh: keletkezését a gexsotníáőx DNS cop atnphőkáeiójávai azonos körülmények között (adatokat nem köziünk). További megerősítésként 3 pár láscínditőt terveztünk, amelyek. különböző HVR-ekbett találhatók, és szekvencia-specifikusak voltak a F9.S3 jelű Mesw soájőmhói származó 42s klón variánsaira, különböző kenfelnációban amplifikálva. rovídebb iragmenseket abból az F953AŐ1 származó ínezentcrlkss nyirokcsomó
-40(MIN) DNS-feSI, amelyből & 42s klóul szölálbtk. A. teljes hosszúságú nap klóitokban azonosított összes: szekveneia-vaóánsl. megtaláltuk ezukben a rövid írégpsensekfee» (adatukat m köziüsk).
2, példa: Az adeno-asszoelált vírasök létíyeges evoiüeíóu mamsek keresztül a főemiösdkbes a természetes fertőzések folyamán
Kiválasztat AAV izolátornak szekvenelaeíentzéSe divergenelát tán fel a genomban, amely a fespszid fehérjék hipervariábllis régióiban a legkoticentráhabb. Az epidemiológiai adatok azt mmaíják. hogy minden ismert szerotípss endemlkös a főemlősükben, habár a klinikai izolátomok hantái! csecsemők anális és torok kenetesből származó AAV2-re és AAV3-ta, valamint barnát! kondilómás szemölcsből származó AAV5-re korlátozódlak. Nem kacsolódott egyetlen ismert klinikai következmény sem AAV fertőzéshez.
ló Annak megkísérlésére, hogy jobban megértsük: az ÁÁV bkdóglájáí, aem: humúts: íömlősöket alkalmaztsnk modellként a természetes fertőzések következményeinek a jellemzésére. Nem humán löemldsükból származó szöveteket, szkrmelttínk AAV szekvenciákra a találmány szériád ECfe-ss eljárás alkídmazásával ismert AAV-k: eresen konzervált régióin alapuló oligonukleoiidokkal (lásd az 1, példát). Az AAV1 jó., azonosítószámú szekvencia] 283Ő-3143, bp-jal közepi AAV szekvenciát választottak ki FÜRlő ajdpliőkálásm, amelyben konzervált szekvetfelákkal szegélyezett htoerváfíshilis régiója található, amely egyedi mlndea ismert AAV szerosipusban, és amelyet a leírásban ..szignálóm régiónak nevezünk.
Számos nem humán főemlős, táj.....min? például /iötutís majmok, Qrm/wo/ogoK? majmok, csimpánzok <·» o.o,szaró pentonaí- verjek kezdet! ssogalut.! detekíalhcto \ W-t tan fel modegyd, habot s/artna/v állatok csoportjaiban. Végrehajtottuk « vektoreloszüs kltetjedtebb elemzését 3?áí-ií«' majmokból származó, boncoláskor szerzett szöveteken a Pennsylvania Lgyetem és 'faltam kolóniák majmain. Ez AAV szekvenciát matatott ki szövetek széles köreben.
Az ampidskált szignálóra szekvenciákat szabklösezfek plazmtdokba, es elemeztük egyedi transzfessstástsok szekvenciáját. Ez lényeges variációt tárt fel a kslönbdző állatokból származó: klóitok nakfeotidszekvenciájában:. A szigítaíará szekvencia variációját mögfigyeifeeltük az egyedi állatokból előállítóit kiónok
2Ő közöd Is, Két állattól begyűjtött szöveteket.....amelyekben egyedi szignálóra, szekvenciákat azonosbotfenk (azaz a 98E844 vastagbele és a ÜSEOSö szive)......tovább elemeztünk a szekvencia meghosszabbításával az erősen konzervált szekvenciákra specifikus oilgonnkitsaüdrskar alkalmazó PCE-rel. ily módon teljes provirális szerkezeteket rekonstruáltunk mindkét szövetből származó viráhs genom esetében, amint: a leírásban ismertetjük. Ezek a pruvirusek különböznek a többi ismert AAV-tői, és a legnagyobb szekveneia-divergencú'it a cnp gén régiójában fig » éltük meg.
Tövürb kísérleteket bajtottonk végre annak igazolására, begy a. nem humán: főemlős .szövetekben állandóan megtalálható AAV szekvenciák olyan fertőző vírus provlráiis geoamját képviselik, amely kimenthető és víríönökaf képes alkotni., A 98EÖ5Ó számú állat rnmszőveíéből származó geriomiáiis: DNS-t — timeíyből AAVŐ szignálóra szekvenciát detekláifek..... megetné.szteímk olyan: endonuMeázzal, amelynek nines: hasítási
3ő helye az AAV szekveociábast, és tmöszfekíáltnk :283-as sejtekbe, amely humán adersovíras mos szerotípus £1dcletáií genernját tartalmazza a segítő bmkciők biztosítására. A kapott lízátumot 293-as sejtekben passzáimk még: egyszer, és a lízáíamot visszanyertük és elemztók az AAV nap fehérje jelenlétére cup feisésje elleni széles reagálő-képessegú poliklosálís ellenanyag alkalmazásával, és áz olyas: PCR-rel ampliőkdü AAV pzmzims szekvenciák jelenlétére és gyakoriságára, amelyből az AA V8 származott, Áz eodoudkloázzal megemésztett szív
DNS és áz adenovírus: segítő plazubd bttnszfekiálása sagy mennyiségű A.AV8 vírust eredményezett, amint azt: a ctip fehétjék Wesfertí-hfottal történő detektálásával és 293-as sejtenként íö* .AAV8 vektor genom jelenlétével áettíonsírálfuk, Llzámmot állt'íötttmk elő nagyléptékű preparálással, és az AAV-t megflsztítotmk eézíumos elépítéssel. A tisztított preparátum 26 öm-es ikosaítedrális szsakezetet mutatott, amely azonmtnák látszott az AAV 2-es szerotipusévál, Az adénóvíms segítővel önmagában végzett transztektáfe m credntényezett AAV fehérjéket vágj' genomokat, kizárva a szennyeződést mint a kimentett AAV forrását.
Az AAV szignálóra szekvenciák állatok közötti és állatokon belüli variációjának további jellemzésére kiválasztott szöveteket vetettünk alá kiterjesztett fiCR-nelc, hegy amplifikáljuk a teljes c<rp nyűt leolvasási felsokak
A kapott fragmettseket bakteriális plazmáinkba klónoztok, és egyedi ímnszformáusekaí izoláltunk, és lő teljesen megszekvenáltttk azokat .Ez az elemzés mezesterikns nyirokcsomókat faglah magában bárosi Efezm rosjoiíttői (Taiase/V223 — ó klón; I'ulane/T6i2 — 7 kién; Tul&rrf953 — 14 kiótfsntájai. két Ékeset majomtól (TulafeV251......3 kloa; Fesn/ö0fiö33 — 3 klón), lápét egy Sássav níajomtól (Pemtt9?fiő43 — 3 kiön), szivet egy Mew majomtól (IHGT/9 8 E946......1 lelőj·} és perifériás vért egy csimpánztól (New iherta/X133 — 5 klóul, hat Gynomofogons tmyosüól (Charles Ríver/A1378, .A3Ő99, A3388, A3442, A2821, Á3242 — összesen 6 klón) és egy páviántól (SFRB.· 8644 .....2 klón), A 15 állattól származó 59 megsxekvesálí klón közül 39-at tekintettünk nem rcdmxlávvvk. legalább 7 aminosavttyi különbsége! találva közöttük. A nem redundáns VF1 klónokat az izolálás sorrendiében sorszámozóik, előíagkén; jelezve azt a ttetn humárt főemlős fejt, smeiyből származtak. Ezen 3(3 sem redundáns klón és a korábban ismertetett 8 AAV szerotlpus közötti szerkezeti rokonságot a φόΐϊ/Α?!? program: alkalmazásával határoztuk meg (Húson:, B, H,, „SplitsTre©; ímaiyzing and visualizíng evrdutiosary data,”, Biöisibrntaties 14,68-73, old. (1998)) , a „spiít deeojtiposlttöu” eljárás implernejttáeíéjávah Az elumzés a szekvenciák közötti homoplázlát fűszert! hálózatként ábrázolja, és nem pedig kettéágazó fekést. fismek az az: előnye, hogy lehetővé teszi olyan csoportok dmekíáiássí, amelyek konvergencia eredményűi, és kimutatja a filogenetikai rokonságot, még akkor is, amikor azt párhuzamos események eltorzítják. Kiterjedt filogenetikai kutatásra lesz szükség annak érdekében, hogy megvilágítsuk az AAV evolúcióját, míg a jelen szásdék csapán a különböző: klánok csoportosításs á, szekvenciafeasonlóságttk alapj án,.
Annak megerősítésére, begy az új VR1 szekvenciák fertőző vitális genosxokból származtak, megemésztettük a vitális DJáS-t nagy ntennylségbes tartalmazó szövetekből származó ceMáris DNS-t olyat! eisdosukleázzal, amelynek sem kelless az AAV-a. belül hasítania, és 293-as sejtekbe transzfektáltuk, maid megfertőztük azokat adenovlrussál, fiz AAV gesomók kimentését és ampliükáeloját eredményezte két különböze alkutól szármázó szövetek PNS-eboí ^dalokat nem kéziünk!
Az új AAV-k Vfil szekvenciáit tovább jellemeztük az ummosav-szekveacla variáció természete és elhelyezkedése szempontjából, Mind a 30 Vfil kiest, amelyekről kimutattuk, hogy különböznek egymástól több mint IS antinosav-szekvenciaban, egymás alá rendeztük és értékeltük a variációra minden egyes oidallánenáh Á divergens szekveseisterületek meghatározására kifejlesztett algoritmus 12 hipervsriábilis régiót (BVK) eredményezett, amelyek közül 5 átfedő, vagy része a korábban leírt négy hipervarsáhills régiósak (Rotín, mint feni; Kutledge, mint: fent). A háromszoros közeit csúcsok: tartalmazzák a legnagyobb variabilitást (HVR5-10). Érdekes módon, a 2- és S-szőrös tengelyen elhelyezkedő burkok is intenzív variációt mutatnak, A HVR I és 2 a kapszid fehérje N-ferminális részében található, amely nem bontható fel a. röntgen szerkezetben, azt sugallva, hogy a VP1 fehérje N-tcnainalisa a váriéit felszínén található,
Valósidejű PCR-t alkalmaztak 21 Mess® majom szöveteiből származó AAV szekvenciák: mennyiségi •42 megfealározására Ismert AAV-k rap jegy készlet) és ρφ (két készlet) génjének erősen konzervált régiói ellent láncindliék és próbák alkalmazásával. Mindegyik adatpont egy egyedi állattól származó szöveti DNS elemzését reprezentálja. Ez, megerősítette az AAV szekvenciák széleskörű eloszlását, habár a mennyiségi eloszlás különbözött az egyes állatok esetében. Az állatok forrása és a kezelések korább! loöénste látszólag sem belólyáselta az: AAV szekvenciák eloszlását Űfens majmokban. Az AAV mennyiségi meghatározására alkalmazott láncindltók -és próbák bárom kíílőnbSzö készlete konzisztens eredméuyeket adóit. Az AAV legmagasabb szintjét konzisztensen a mezeniorlkas nyirokcsomókban találtuk» átlagosan 0,01 kópiát diploid germmorsként a 13 pozitív állatban. A máj és lép szintén .nagy mennyiségű vírus DNS-í tartalmazott. Voltak példák nagyon magas AAV-ta, mint például a 98B05Ő jelű majom szívében, a 97B04) jelű Átesne majom lépőben és az RQ44Ö? jelit Etem majom: májában, amelyek sorrendben 1,5, 3 és 20 kópia AAV Szekvenciát tartalmaztak diploid geanmonkérh:, Viszonylag alacsony szinté vírus DNS-t figyeltünk meg a perifériás mononúkleártS: sejtekben, ami azt sogzlljs, hogy a szövetek adata nem a benőnk található vér miatt van (adatokat nets közlünk), Megjegyzendő, hogy' ez az. eljárás nem szükségszerűen detektál minden, .ma humán főemlősben állandó AAV-t, mivel a detektáláshoz nagyfoka hmnotöglára van szükség: mind az ollgonákleotídokkal, mind a valósidejű PCR próbával. Az ÁÁ.V DNS-f nagy mennyiségben strrtakuazó állatoktól származó szöveteket tovább elemeztük a DNS molekuláris állapotára DNS-hibridtzálási módszerekkel, és azok celiutázis eloszlására, /» «/;; hibridizációval,
A különböző állatokból izolált és ugyanazon állatok szöveteiben lévő AAV provirális fragmsnsekben feltárt szekvencia-variáció fajtája emlékeztet -arra az evolúcióra, amely sok RNS r-frassal történik sz általános
2S járványok során vagy akár egy személy megfertőzésekor. Bizonyos helyzetekben, a vad típusú vírus fogalmát helyeticsítetíe a kvázlfajok rajainak létezése, amelyek a gyors replíkáeiö es mutációk eredményeképpen evolvstoak szelekciós nyomás jelenlétében. Egy példa a HÍV általi fertőzés, amely immunológiai és farmakológia! nyomásra, adott válaszkém evolvál. Számos mechanizmus hozzájárul az: RNS-vírusok magas mutációs: rátájához, beleértve a reverz-üanszkríptáz alacsony pontosságai: ás: hibajavító képessegének a hiányát, és a nem homológ és homológ rekombinációt.
Ebben a vizsgálatba» kimutattuk az: AAV kváziíajat: kialakulásának a bizonyítékát több klónozott proviráhs fragtaous: szisztematikus szekversulásával. Valóban, nem. találtunk azonos .szekvenciát az állatok kősóit vagy azokon, belül izolált egyik meghosszabbítót;: klánban sem. Ezen szekvencia-evolúció egyik fontos: tnechaníztnösáttak tűnik a homológ rekombináció magas aránya egy korlátozott számú szülői vírus között. Az összesiíeú eredmény a ctg? fehérje hipervariáhilis régióinak kiterjedi cseréje, ami kimerák olyan; halmazához vezet, amelyeknek különböző leket a tropizmesa és: szerológiai tulajdonságai: (azaz a képessege az immunválasz elkerülésére, külőrsösen tani a sesnlegesitő ellenanyagokat illeti). Nem egyértelműek azok a mechanizmusok, amelyekkel a homológ rekombináció végbemehet, Egy lehetőség az, hogy a különböző egyszálú .AAV geuomok ’ ésszálai tmeliálódmík arepiskáció folyamán, amint azt leírták az AAV rekomhisánsokkal történő fertőzés magas szittfie esetébert. Nem egyértelmű, hogy más sneebamzsnnsok is hozzájárulnak-e a?,: AAV' fertőzések: szekvencia-evolúciójához. ráz AAV rspíikáeiőja alatt bekövetkező általános mutációs ráta viszonylag aa^sutvjdK trk t.s v iónok mm muaihlk a vuhkae 's htlw na^s „vákortstg s Vo b tt í* \k\ genotrsuk jelentős: átrendeződését írták le a httkus fertőzés Ady unan, ami delétho teíeríensio részecskék kialakulásához vezet. Függetlenül a szekvencht-dlvergeuciáltoz vezető mechanizmusoktól, néhány kivétellel n
4Ö kváztíájok VP1 szerkezetei intaktak. maradiak lázisietolódások nonszensz mutációk nélkül, azt sugallva, hogy a43legplőnyösefeb alkalmassági profilú vírusok kompeíiíiv szelekciója hozzájárul a. populáció ómarínkájáboa.
Ezek á vizsgálatok jelentüséggel bírnák a biológia ás gyógyászat számos területén, A. vírusok gyors evolúciójának az elvet.....amelyről korábban azt gondolták, hogy csak az. RNS-vírusokra jellemző tulajdonság
......figyelembe keli venni a ÓvS-vírusok eseteken is, amelyeket klasszikusan szerológial vizsgalati eljárásokkal jellemeztek, A Farvtnárnsok esetében fontos lehet új eljárások kifejlesztése a vírus Májútok letsásarx amelsek mgatös·. foglalják azok szerkezeiének és biológiájának a komplexitását, mint például a HÍV eseteben, amelyeket hasonló szerkezetű és funkciójú általános családokba osztályoznak, amelyeket kiadóknak neveznek Wó alternatív stratégia az rzolátomok kategorizálásának a fitlytatása a szerolögía specifitás szempontjából, és krífefitímok kiaktkllása a szerológia csoportokon belüli variánsok leírására.
lö A példa: AA¥2 íTR-t tsrtalsnazó refeombmúns AAV genomok vektorológiája AAV2 rop és új AAV cop géneket tartalmazó piazmidok alkalmazásával sxerolőgiai és génátviteli vizsgálatokhoz különböző állati modellekben,
Kánéra pakoló konstrukciókat álfitnrsk elő AAY2 íyp és az új AAV szerofípnsok cap szekvenciái fezionáltaiásával, Ezeket: a kimérá pakoló kottstrnkctókaí alkalmazzak kezdetben az AAV2 ITR-t hordozó rekombínáns AAV genomok pszendotípizálására 2Ö3-as: sejtekben tripla trznszfeketöval, Add segítő plazmid alkalmazásúval. Ezeket a pszeudotípizált vektorokat alkalmazzuk a tehesrínsény értékelésére te&tsszdukcio-alapú szerotógiat vizsgálatokban, és értékeljük az új \A\ ^zeroisposok génátviteli hatékonyságát különböző állati modellekben, beleértse NHF-ket és rágcsálókat. ntAi voblnű ezeuó) szerotipasok intakt és fertőző vírusait, A-M-ÍÍCOTA
AAV2 plazmád, amely tartalmazza az AAV2 ITR-t, és zöld fluoreszcens .fehérjét expresszáil konstitutív promóter szabályozása alatt Ez a plazmid az alábbi elemeket tartalmazza: az AAV2 H'R, CM V promóter és a GÉP kódoló szekvenciák,
B. Tíwíss ákbíozdsa
A rekombináxos pszeudotipizalt AAV7 előállítására .szolgáló kunéra Pzortz-plazstíd előállításához a p5E18 plazmidot [Xiao és mtsai., 1 Virol 73, 3994-4003. old. (1999)] részlegesért megemésztettük Xhol enzimmel, begy ünearizáljúk a plazmidof csak a 31ő9„ bp-nál található Xhol helyen Azután az Xhol enzimmel elvágok végeket betöltöttük és vfészaiigálfek. fizi; a módosított p5El8 plaznndot elhass tottnk Xbal és Xboí enzimekkel teljes emésztésben, hogy altávolitsnk az AÁV2 cup génszékvenciát és helyettesítsük egy 22ő? bp hosszúságú SpeVXhoI fiaesnenssel, amely tártalnuízza az AAV? cop gém, amelyet a pGRAAY? 0-5+15-4 piáznúdból izoláltunk, .A kapott, utaznod tartalmazza az AAV2 «gr szekvenciákat a Rep73,fok-re az AAV2 PS ptúmöter szabályozása alatt, és az AAV2 np szekvenciákat: a Rep52/4Ü-re: az. AAV2 F19 promóter szabályozása alatt. Az .AAV? kapszid szekvenciák az AAV P40 promóter szabályozása alatt: állnak, sasely a rsp szekvenciákon beiül található. Ez a plazmid továbbá tartalmazza a. ?vp ŐRE 5’ távtartó szekvenciáját..
C, RrtCKíúíílpfedk ο-IP E BídőSfiásö
Az rAAV részecskéket (AAV2 vektor AAV7 kapszklhapt adenovírus-mentes eljárás alkalmazásával állítjuk dó. Rövidem a cfiz-plazmldot <pAAV2,1 ItteX plaznúd, amely AAV2 ITR-t tartalmaz), és a p€RAAV7 0-0+15-4 fenssz-plazmídot (amely tartalmazza az AAV2 rep és AAV? cop géneket) é$ segítő plazsnídot: egyidejűleg iranszfektálíunk 293~as sejtekbe 1:1:2 arányban kalcimn-feszfeíos kícsapássai.
- -44
A pAd segítő plazmátok éldállkásáihoz pOÖ'18 plázmidot vásároltak a Microfeix cégtó! (Cánada). Az L2~t és O-at tartalmazó RsrS fragmenst deletákuk a pBEÍö!8-feői, előállítva az első- segítő plazmidet,. a pAdAF:l3-a:. Az: AdAFI plazmídot az Asp?88foalt fragmens Bbessaipt-be történő klónozásával állítottuk elő PmcVSgf delécídval izolálva a pBííökö-bol. Az MLP,. L2, L2 és 13 géneket deletáhuk a pAdÁFl pluzmidhmt,
Egy 2,3 kb Nrul. fragmens és azt követően egy 8,5 kb RsriENru! fngnmns öeléeldjával «leállítottuk sorrendben a pAdAES és pAdAFő segítő: plazmídokat;, A segítő plazn: id - amely et pAFó pkiznhdnak nevezünk — biztosítja az esszenciális E2a és E4 OREő segítő funkciókat, amelyeket nem biztosít az Ebet ekpresszáló segítő sejt, de belelátva vannak belőle az adenovírus kapsztd lekérjék és tünkésonahs ΕI régiók.
Tipikusan 58 ug ONS-t (cfe?:/z«».sr:ségRö} öanszfoktaHunk egy 150 mm-es szövetfenyésztő csészére.
A 293-as sejteket 72 órával a transzlektálúsf követően gyújtottuk be, szonlkáltak és 8,5% nákímn-deovikoiáíial kezeltük (27 X'-on 18 percen keresztül), A sejdizátuinokat azután: két metafeeu dszriteítuk CsGl-gradiensen. Az rAAV vektort tartalmazó csúcs frakciókat őwegyüjiőttük, összeSsíötíük és PRS-se! szemben dlahzáltuk.
4« példa: Intakt új AAV szerotipusokat tartalmazó fertőző klánok létrehozása az alapvető virológia tanulmányozására humán és NNE-eredetü sejtvenalakbas, és az új AAV szerotlpusek pategenexísének értékelése NHP és egyéb alaki modellekben.
Ezen cél elérésére: a genomséta rendszert alkalmazzuk 3’ és 5” terminális szekvenciák (1TR) előállítására és az Intakt: új AAV szeroiipus genotsfrkat tartalmazó teljes kiónok előállítására.
Röviden, a kereskedelmi forgalomban beszerezhető őta-eram dtamne lltata O reagenskészletet (Ctöntechj alkalmazzuk AAV? szekvenciák jelenlétére pozitívnak azonosítót; majom szövekkól és sejtvonalakhől származó genomiálís DNS megemésztésére Dral, EcoRV, PvuH és Stoi endosakleázokkal, és ősszeligáljtík azokat a- ítaow taRta adaptortal, hogy négy kúlönálló ftao.nse tarite' könyvferat (GWL) állítsunk elő, A GWE-ekból származó DNS -; mmpkhként alkalmazva az AAV7 es az azl körülvevő gsnomíáh's szekvencláka: PCR-rel ampísíikáhuk az 1-es adaptor Sátanáltőval (API, a reagenskészlsl része) és egy AAV725 re specifikus 1-es láncindífoval, majd beágyazott PCR-rel a 2-es adaptpr iáneindítóvai (AF2) és egy másik ?VW7~re specifikus 2-es Sánc-indítóval, amely mindkettő belső helyzetű az első iáneíndhó-készíeteez képest, A beágyazod PCR fö FÜR-termékeit megklónozzuk -és jellemezzük szekvencia-elemzéssel
Ebben a kísérlete a generikus AAV genom 257 fep-ját vagy más szignáléra fotgmenst lefedő lándaditókat alkalmazunk a Immár; és NI1P-eredetű sejtvosalakból extrahált eellűlárls DNS ECR38 amplifkálására, hogy azonosítsuk és jellemezzük a látens AAV szekvenciákat. Az azonosított látens AAV genemokat kimentjük a pozitív selívonalakhól különböző fajok és törzsek adenovírus segítőinek az alkahnazasáv al,
A fertőző AAV kiónok NBF-e?ede:ü sejtvonalakból történd izolálásához beszerzőnk egy kívánt sejtvonalat az ATCC-íöl, és EGR-rel szkríneijük, hegy azonosítsak a 25? bp méretű ampkkont, azaz a találmány
3.-5 szerinti szignáléra régiót, A 257 bp méretű FGR-tetméket megktónozzuk és szerotípízáliuk szekvenciaelemzéssel. Az AAV? szekvenciát tartalmazó Ilyen sejtvdnafek. esetében a. sejteket megfertőzzük S V-15 -fel (egy ATCG-iőI beszerzett májon: adenovírus), hanta Ad5~tei vagy transzífektáljuk: az AAV segítő frakciókért felelős humán Ad géneket hordozó piazmíd koastrtíkeiőval. A fertőzés vagy trasszfektálás után 43 órával a sejteket begyűjtjük, és „11 irt DNS-t preparálunk az AAV? genom klónozásához Xziao és mtsai. |1 Víroi, 73,3894-4083:.
old. 11989)1 eljárását követ: e.
S. pétd® AAV vektorok előállítása aA 3. példában az AA\ 1*7 esetében alkalmazotthoz hasonló pszeudotipizaló stratégiát alkalmazüink AAV1, AAV5 és AAVd kapszid fehérjékkel pakolt A.AV2 vektorok előállítására. Rövidén, AAV2 ÍTR-t tartalmazó AAV gsPonsOkat pakoltunk 293-as sejtek tripla iranszíekeiöjá.vái etsz-plaztttiádai, aáónoviras segítő plazmáddal & tóméra pakoló konstrukcióval, amelyben az AA.V2 rgp gés fezionáltatva van áj AAV szerodpusok c&p génjével, .A kánéra pakoló konstrukctók előállításhoz a pSEl S plazorid 3169. hp-játtál találkatő Xhol. helyet eltávolttettuk, és a módosított plazsnldot megemésztettük Xbal és Xhoí enzimekkel teljes emésztésben, hogy eltávoltak az AAV2 οφ: gépiéi és helyettesítsük az AAV8 o«p gént tartalmazó 2267 bp méretű Spsl/Xhol tfetgmenssel (Xiae, W. és mtsai., 3, Virol 73,3994-4083. old. (1990)]. Hasonló klóstozásí stratégiát alkalmaztunk
AAV2G és AÁV2/S kimérs pakoló plazmátok létrehozásához. Az összes rekomhináns vektort szokásos CsCI kiépítési eljárással tisztítottak meg az AAV2/2 kivételével, amelyet egylépéses heparin kromatográfíával tisztítottunk.
Az: AAV vektorok genom-kópia (GC) tifereít TaqMegt elemzéssel határoztak meg korábban leirt, az SV40 pöli-A régióját célzó próbák ős láríeináítók alkalmazásával íGao, G. és misaí,, Hűm,. Gene Ther. 11, 28791$ 2091. old, (2800)1,
Számos in vto és ór vívó vizsgálatra szolgáló vektort áhitottank elő mindegyik szeroíipus esetében. Nyolc különböző transzgés-kazsiiái építettünk be a vektorokba, és rekombináns vidonokat állítottunk elő minden szerottpus esetébe® A vírusok: kitermelését a genom-kópia alpján az alábbi 4. táblázatban foglaljuk ossza. A vektorok kusrnxelése mindegyik, szeroíipns esetében magas volt, a szerottpus közötti konzisztens különbségek nélkül, A táblázatban bemutatott adatok átlagos genom-kópia kitermelések szórással x 10! ! szorzóval, .59' csészén (1 Síi mm) végzett transzfekeiő több előállítási kísérletéből.
6, példa: A pszendotipizáh vektorok szetolögial elemzése €578126 egereket öltöttünk be különböző szerotiptrsá AAV03Á1AT vektorokkal Intramuszkulárisan (5 x lŐí( OCX és 34 nappal később szémmmmtákat gyujföttönk. Az AAV egyes szerotípussi ellent szérumok semlegesítő és kereszt-semlegeslíő aktivitásának tesztelésére a szérumokat Iraeszdukclóo alapuló ellenanyagot; vizsgálati eljárásban elemeztük [ö;to, G, P. és mtsai,, J, Vóok 78, 8934-8943. old, (1996)]:, Közelebbről, a semlegesítő ellenanyaguk jelenlétét a szérum 34-31-es sejtek különböző szeretipusd jelzővimsok (AAVCMk f'GFP) általi transzdukcinjat gátló kepes&esenek megaliapítavrtai határoztak mag, Né/elcbbtvi az egyes szerotiposá AAVCMVEGí·Ρ jelző vírusokat [olyan fertőzési szánt (MO1) mellett, amely a jelzősejtek 90%-ának transzxíukálődásához vezetett! elöinkubáltak az AAV különböző szerotípusait kapott állatokból vagy naiv egerekből származó, hővel inaktivált szérummal, 37 ANon egy órán keresztül történő inkubáiás után a vírusokat bozzáadluk 84-31 sejtekbe?. Pő-utétSkeiyes iníkretíterletnezeken 48 vagy 72. órára, a vírus szerotipusáíöi függően. A GÉP espresszióíát őteíwönoge?· (Moieeular Dynamics} készüléken mértük, és az ősugsébíonr szoftverrel elemeztük. A semlegesítő ellenanyag-litereket azzal a legmagasabb széruethigitássai. adtuk meg, amely 508á-nál jöbhím gátolta a iranssiukeiőí,
A GEP-t expresszálo vektorok hozzáférhetősége leegyszerűsítette a semlegesítő ellenanyag vizsgálati
1.5 eljárásának a kifejlesstését. amely egy pemássziv sejtvoual (azaz AdS-ból szártnazo i/4-et stabilan eaprosszáló 293-as sejtek) transzdukcíójának a gátlásán alapul. A kiválasztott AAV szerei tnusok elleni szertanokat a rekombináns vírusok intmmuszkuiáris injekciójával álistotíuk elő. Az. antíszérntnok ! ?0 és I 80 hígításával történő AAV-tmnszdukeió semlegesítését értékeltük (lásd az alábbi 5. táblazatoi). Az A/\V5, A,-\V?, AW5 es ΛΛΥ5 dfen: aof'.szémm.nk semlegesítitek azon vzeroopus ;r.rr.»zdukmój.it, amely GLrt leire leitek hozva (az
AAV5 és AAV8 kevésbé, mini az AAV 1 és AAV2) , de nem a többi szeron'pusét (azaz nem volt bizonyíték olyan kereszt-semlegesítésre. amely azt Igazolta volna, hogy az AAV8 igazán egyedi szerotípns).
5. Táblázat. Áz áj AAV szarotípnsnk szerslőgiar elemzése
84-31 sejtek %-oiigoszaeeharid fertőzése AAVCMVEGFP vírussal
AAV2/1 ÁAV2/2 AAV2/5 AAV2/7 AAV2/8
Szérumhlgltás Széramhigitás Szérttnmigiiás Szcrumbígítás Széfumhigitus
Szérum Immunizáló vektor 1/20 í/8ö 1/20 1/80 //20 //80 //20 1/80 1/20 7/fe?
1.csoport AÁV2/Í Ö 0 100 100 180 100 100 100 100 ’ÍOÖ
2, csoport AAV2/2 100 100 8 . 8 100 100 100 100 3 00 1.00
3, csoport AAV2/S 100 100 1.Ö0 1.00 16,5 16,5 100 100 108 100
4. csoport AAV2/7 ÍÖÖ iöo 100 1.00 100 100 fel ,5 100 100 100
5, csoport AAW8 500 100 180: 100 180 100 100 100 26,3 66
52 egészséges személytől származó itutnán szérumot szknnehűsk semlegesóésre kiválasztott verna'pasuk ellen. Nem találtunk elvan mintát, amely scmiegesjteíte az AAV? ~ es \A\ 2 3 rektorokat, Kig az AAV2'2 és AAV2A vektorok semlegesítődtek a szérumok sorrendben 28%-ában és 18%-ában. 60800 egyedi minta gyűjteményét reorezeníá’ó összsSmöít humán IgG frakciója nem semlegesítette az AAV2/?-et és ÁAV2/8~<tf, míg az AAV2/2 és ÁÁV2/'Í vektorok setalegeslíődtek sorrendben 1/1288 és 17648 szérttintlteníek megfelelő mértékben,
X példíü AAV vektorok különböző szcfötípusainak őr m értékelése
Ebben a vizsgálatban 7 rekombináns AAV genomoí -- ÁAV2C®bÁlAT, AAV2.AlbhAl.A.T,
AÁVSCMVrhCG- AÁV2TBGrbCS, AÁV2TSGcRX ÁAVXMYW2 és AAV2TSGLseZ.......pskolftmk be
47különböző szeroti'pusok kapszid fehétjéivel, Mind s bét konslrtíkeióban AAV2 f ÍR-ek szegélyezték a mimgén kazettái:. liüísán re-ímtiíripszm (Af AT) (Xiao, W. ésmissk, 4,. Virof 73, 3994-4003. old, (1999)), Xánms majom korlogonadoíropin hormon (Cö) β-alegysége [Zolfiek, R. W, és Wilsön, -k M., Mól Tber, 2, 657-059. old. (2000)1, W» fatoof4X (W&ng, I, ós falsai, Proc Natl. Acad. ScL USA 94, 0563-11560. old.. (1.997)1 0s bakteriálisβ-galakíoziáaz (azaz taeZ) gépiének eDN5-ét sikálmazíuk jelzőgénként. A májba irányuló gőnátvltel esőiében vagy egér alhmsin gén pmmőterét (Aló) (Xiao, W, (1999), mint fesi], vagy Ónnál? tirosd hormont kötő gbbul&r gén pretnőserét (TBG) |Wasg (1997), mint lent} alkalmaztuk a jslzőgének máj-spemískus expresszáltatásának irányítására. Az izmnba irányuló génátviteli kisérleíekben vagy a eitezsegalovirus teái pronróterél (CMV), vagy a csirke β-aktm promöteréf a. CMV enhanszerrel (CB) alkalmaztuk a jelzősének expresszá itatásának: irányítására.
Az izomba irányai© génátvhel esetébe® a vektorokat 4-6 hetes csupasz NCR vagy €5713176 (Tatamié, Germantown,.NY) egerek jobboldali riófe&s aúréí'ányiába injektáltuk. A májba irányuló génátviteli vizsgálatok esetébe® a vektorokat 7-9 hetes esapasz NCR vagy C57BI76 {Tárnáié» Germantowa, NY) egerekbe infuzlonáhuk intraportálisaa. A vektor beadása után különböző: idópouíokbaa iníraorbitáíís szérurnrakríákaf gyuiíöítifek. IzoiH- és májszövefeket gyűjtöttünk be különböző időpontokba fagyasztva metszéshez és Xgal-os insziokéniiai festéshez a Iac2 vektorokat kapott állatokból. Az újra-beadásl. kísérlet esetében a C56BI./6 egerek kezdetben: AAV 2 1, 2/2, 2/5, 2/7 és 2/3 CBAiAT vektorokat kaplak mirarmiszkulárrsaí?, és azután követtük azokat A1AT génsxgressziőra 7 héten keresztül. Azután az AAVX/^TÖGeflX vektorral kezelt állatokat mtraportáhsan kezehnk. es juegvi/svahuk ΟΊΧ geoexpress/tora
BOSA-alapú vizsgálati eljárásokat hajtottunk végre korábban leírt módos a hAlAT, rí?CG és oFfX fehérjék szérumkoneentráciojának mennyiségi meghatározására föao, G. R. és mtsai., I. Várok 79, 8934-Ő943. oki. (199Ő); Zoltiek, F. W. és Wilson, J. M„ kiöl. Ther. 2, 657-659. old. (2ŐÖG); Waag, L. és mtsai., Proc. Nutl. Acad. Sri. USA 94, 11.563-11566. old, (1997)), A. kísérleteket akkor végeztük, amikor az állatokat feláldoztuk az szó?»- és májszövetek levétele, és DNS-estrakcló és a celszővetben jelen lévő vektorok genom-kópia számának mennyiségi meghatározása céijáiróf, Rímk/ím-nal és ugyanazon lánoinditók és próba aikahnazásávai, anteiyekel a vektor-készhinények bírálásakor alkalmaztunk [Zhang, Y; és isísak. Mól.. Ther. 3, 697-707, old, {2091}).
Az új szerobpusokon alapuló vektorok íeljeshntényét izomba és májba irányuló génáivitel egérmodellje alapján értékeltük, és az ismert AAVf, AAY2 és AAV5 xzerotígasoko® alapuló vektorokhoz hasonlítottuk, A szekreíáh fehérjéket [aBh-l-amúripszin (Á1.AT) és koriogíntadoiropm (CG)l espresszálő -veteorokst alkalmaztuk a különböző szeroripusok relatív transzdakriős hatékonyságának snenstyíségi tneghatározásra a szérumok EUSA-siapá elen?ezésével, A transzdakció sélszervheli eelhdáris eloszlását laeZ-r expresssulló vektorok és X.Az AAV vektorok vázizombeli íefjesitményét a í/Ő/ő&s mwiór izmokba történő közvetlen bejuttatást .35 kővetően eientezlnk. A vektorok ugyanazt az AA¥2-alzpá genomöi.: iurtalmazfák, e CMV azösináh korái génjének vagy a CMV-javítotf g-aktín promóterrel együtt, ami a trartszgén expresszióját irányította. Korábbi vizsgalatok azt mutatták, hogy óninunkourpetens G57BC/6 egerek korlátozod Immorális választ fejlesztettek ki a humán. A1AT fehérje ellen, amikor AAV vektorokról ezp'Css.'áíkaíák azokat iXGo, W. és sasai., J. Viroi 75,
3994-4003. old, (1999)).
Mindea törzsben sz AAVXÜ vektor termelte a legtöbb AlAT-t, és az AAY2/2 vektor a legkevesebbet.
- 48 és az AAV2/7 és AAV2/8 vetetek közbenső expressziös szksfet: mutattok, A GC csócsszintje 28 s&ppol amknu NCR egerek injekcióját kővetőét! az AAVX7 esetében matatta a legmagasabb, és az AAV2/2: esetében a legalacsonyabb szintet, és az AAV2/8 és AÁV2/I köztes szinten volt Az: AAV2/1 és AAV2/7 laeZ vektorok injektálása génexpressziot sredntenyvmed az injektálás helyén az összes szomrostbatt és lényegeset! kevesebb lacE-pozsítv rostot Egyeltünk meg az AAV2Z2 és AAV 2/8 vektorokkal. Ezek az adatok azt matatták, hogy az ÁAV2/7 vektorokkal történő transzdnkció hatékonysága vázizomhan hasonló az AAV2.'i-gyel kapotthoz, ami a korábban leírt szerottpusok váztzmában a leghatékonyabb [Xtao, W. (1999). mint fent: Chao. ii. és mtsat.. Mok Ther.. 4,217-222. old. (2001): Chao. H. és sasai., Mól. T'her. 2, 619-623, old. (2ÜOö)j.
Hasonló egerraodelleket alkalmaztunk: a. májba irányuló gésátviiel értékelésére. A genont-kóplák száma: alapján azonos mennyiségű vektort juttattunk be IntoziÓval olyan egerek pottáhs vénájába, amelyeket azután elemeztünk a transzgén espresszáolán!, A vektorok mindegyike AAV2-u alapuló grammot tartalmazott a .korábban Istnorteteh máj-speciSkas promóíorek alkalmazásával (azaz alhtmtm vagy tlnaid hormont: kötő glöhíihn) a trauszgén expressziójának az K r> u nora Közelebbről, C.MVCG és TBGCö minlgén kazettákat áikatmszhmk az izomba és májba irányaié oémvvUel céljából. Az: rbCG koncentrációját relatív egysegében (RÍJ
IS x 10Jj adüík meg. Az adatok a vektor beadását követő 28. napon gyűjtött szénunmlníák méréséből száramzíak (csoportonként 4 állat). Amim a 3. tábláztában henrutaíiuk, a kapszid fehérjék hatása az Α1ΑΓ vektorok su/nu és C57.8I7S egerekbe és CG vektorok C57BE/6 egerekbe történő tom/todukeioj attak bafekonyságára koszisztet volt (lásd a 6. táblázatot).
6. Táblázat. Ráesn-j? majom koriogontsdotropm (rhCG) ^alegységének expressziója
Vektor Izom Máj
AAV2H 4,5 * 2,1 1,6 X 1,0
AAV2 :ÖJ±O,l 0,7 X 0,3
AÁV2I5 NIM 4,6 4 0,6:
AÁV2.-7 14,2 A 2,4 6,2 4.4,3
AAV2/8 4.0 .e 0,7 76,Ox 22,8
* nem Imare/tuk meg: ebben a kísérletben,
Minden esetben az AÁV2/8 vektorok erednréuyezték: a transzgén expressziójánafc a legmagasabb szintjét, asnely 16-Hö-szer nagyobb volt, mint amit az AAV2/2 vektorokkal értünk: eh az AAV2/5 és AAV2Z7 vektorokról való expressztö közepes volt. és az A.AV2/7 magasabb volt, mint az AÁV2/5, A megfelelő IncZ. vektort kapott állatok X-gal-taj megfestett rnáj metszeteinek elemzése korrelációt mutatott a transzdukáh sejtek száma és transzgén általános expressziós szintje között. Az Al AT vektorokat kapott C578L26 egerek májából extrahált ONS-t elemeztük a vektor-DNS gyakoriságára valósidejű PCR -technológia alkalmazásával
Az injektálás után 56 nappal a májban talált vefctor-DNS mennyisége korrelált a íranszgón expresszisjjának mértékével (lásd a 7. táblázatot). Ebben a kísérletben a vektor-genom $V4tt poli-A. régióját célzó próbát és l&seiadiíő-készletet alkalmaztunk a Jm/Aton PCS-hez. A bemutatott értékek károm: átlát:
átlagértékét és szórását jelentik. Az állatokat az Só. napot! feláldoztok, hogy májszövetet gyújtsunk DNS· extrahálásábez. Ezek a vizsgálatok art mulatják, hogy a towzdokáh heaptoeiták megnovekodett száma miatt az AAV8 a leghatékonyabb vektor májba Irásynlö gérsátviselhez.
7, Táblázat: AAV vektorok mestnyiségének valósidejű PCR elemzése au/a a egerek májában vektor I x IÓ!i genosn-kőpíájónak az injektálását követően.
AAV vectors/öose Genonm Coptes per Ceil
AAV2/ÍAÍbAlAT 0,6 * 0;3ő
AAV2AlbAlAT 0.003 *0,001
AAV2Z5AlbAl:Áf Ö,S3teö,64
AAV2/7AlbA:l.AT 2,241,7
AAV2/8AlbAlAT 1X411.
A fent ismertetett szerológísi adatok azt sagalpák, hogy az AAV2/8 vektor «em semlegesltőáik fis; Wt» a többi szeroílgusssl: történő immunizálást követően. C57BE/6 egerek kutya iákíor-lX-et expresszálö AÁV2Á8 vektor iírtraporiális injekciók kapták (10'5 genomAopsa) Só nappal azután, hogy különböze szerotipnsó Ai ÁT vektorok intramoszkuláris injekciói; kapták, A faktor-LX magas szintű expressztóját értük el 14 nappal az AAV2/8 naiv állatokba történő infúzióját követően (i7 * 2 pgúni, n,í;4), -ami nem különbözött szignifikánsan az AAV2/1 vektorsai intntnnizdlf állatokban: megfigyelni <3.1 * 23 ggrtnt, H). AAV2/2 tlh ug/snl, n~2> és AAV2/7 (12 pg/ml, n~2}> Ez ellentmond annak, anttt az ÁÁV2/8 vektortól immun izéit állatokban figyeltünk meg, amelyek: AAV2/8 faktor-lX vektor infúAóí kaptak, és aínelyekben nens figyeltünk meg detektálható lektorló ÍX-et (< 0,1 pg. mk n--'4),
A oop gén: konzervált régiói elleni olígotmkleotktek egyedi AAV-ket reprezentáló szekvenciákat amplifikáltak ftw majmokból. Azonos oop szignálóm szekvenciákat találtunk legalább két különbőzé kolóniából származó Maw majmok lőbb szövetében. Tefies bosszúságé .rop és oop nyílt leolvasási fözísoknt: izoláltunk és: szekvenáltonk meg egyedi forrásokból. Csak az új AAV-k nyílt leolvasási fázisai voltak szükségesek vektorként való alkalmazás lehetőségének értékeléséhez, mivel az AAV7 vagy AAV8 kapszidokat tartalmazó: vektorokat állítottunk elő az AAV2-ből: származó JTR-efc és rop gén alkahnazásával, Ez leegyszerűsítette a különböző vektorok összehasonlítását is, mivel az aktuális vektor genom azonos a különböző vektor szerotipusok kozott. Valóban, az ezzel a ntegkozelííésí móddal léb-ehozott rekomblnáns vektorok kitermelése nem különbözött a szeroiiptisok között.
Az AAV?--en és AAVS-ou alapuló vektorok tmmunológiaílag különbözőnek tűnnek (azaz nem semiegesitődtíek a többi szeröílpas ellen létrehozott ellenanyagok által). Ezenfelül a humán szérumok nem semlegesítik az AAV? ős AAV8 vektorok traoszdukcióját, ami egy lényeges előny a jelenleg fejlesztett bmnán eredetit AAV-kkei szemben, amelyek ellen a barnán populáció szignifikáns részének meglévő immunitása van, amely semlegesítő hatású [Clfirmule, X. és: misat., Cfette Ther. ö,1574-1583. old. (1999)].
Az. egyes új vektorok tröpizmusa előnyös fe vívó alkahnazásob'ú. Az AAV2/7 vektorok ugyanolyan hatékonynak tűnnék, vázszom ftanszdrAálására, mist az ÁÁV2.T, amely a mostanáig tesztelt főemlős ÁÁV-k közül a vázizosnbasr legnagyobb mértékű transzdokeíőí okozó szerotipus (Xíao, W., mint leni; Chou (2001). mitrt fent; és Chotí (20ÖS), mini fent]. Jelentős., hogy az AAV2/8 lényeges előnyt biztosit a többi szerotspussaf szemben a májba irányuló génátvitel hatékonysága tekintetében, amely mindeddig viszonylag kiábrándító volt a stabilan transzdukált hepaíöciták számának tekintetében. .Az AAV2/8 konzisztensen lÖ-lÖÖ-szoíos jávklaat ért el a génátviteli hatékonyságban a lobbi vektorhoz viszonyítva. Az ÁAV2Í8 tokozott hatékonyságának az alapja nem egyértelmű, habár feltehetőleg a különböző receptor általi fölvétel miatt: van, amely aktívabb a bepatoeiták basolaterális felszínén. Ez a fokozott hatékonyság eléggé hasznos lehet májba : irányuló génátvitel kifejlesztésénél, amikor a transzdukált sejtek: száma kritikus, mint például az urea-cíklus rendellenességei és
58órökletes hiperkolesztermémla esetében.
Ily mtidon a. találmány tárgyát egy új: megközelítési mód képezi új AAV-k izolálására: genomlális szekvenciák PCS-es visszanyerése alapján. Az ampliSsálr szekvenciákat kömryen beépitostglk vektorokba és tesztelhetjük állatokban. Az: AAV7 elleni meglévő immunitás hiánya ék a vektorok kedvező izom itúttfi íropizmusa azt omíatja. hogy ok AAV7 alkalmas humán génterápiában és egyéb m Avo alkalmazásúk has történő alkalmaznom. Hasonlóképpen a találmány szerinti AAV szerohpusók ellesi meglévő immunitás hiánya és a tropízmusdk hasznossá teszt azokat terápiás molekulák és egyéb hasznos srolekdák bejuttatására,
9. példa: Szöveti íxopizmus vizsgálatok
Az áj AAV konstrukciók nagykapacitásó funkcionális szkrineiósí módszerének tervezésekor nagyon aktív, nem szövetspeelltkus CB promptért (CMA’-javhott csirke β-aktín promóter) válsszpipsrik egy könnyen detektálható és mennyiségileg meghatározható jetzögén. a humán n-aniüripszm gén impressziójának az irányítására. Ily módon az új AAV kiónok esetében csak egy-egy vektort kell előállítani a. génátviteli vizsgálatokhoz, amelyek 3 különböző szövetet, a májat, tüdőt és Izmot célozzák, hogy szkrtseijhk az egyes adóit AAV konstrukciók szöveti teopizruusát. Az alábbi táblázatban négy új AAV vektorral a szöveti trepizmas '1.5 vizsgálatakor előállított adatokat foglalunk össze (AAVCÖA IÁT), amelyek közöl egy új: AAV kapszid klómul, a 4a.2-ról azt találtuk. hogy nagyon hatásos génátviteli eszköz mlndhárotu szövetben, különösen nagy előnnyel a tüdőben. A 8 táblázatban a vizsgálat 14. papján mórt adatokat mutatlak be (pg ÁlATlmh szérum mértékegységekben).
§. Táblázat
Azután nébúus további kísérletet végeztünk az AAV 44.2 tildószövetben tapasztalt kiváló troplztousúrtak a mege'osaererr Először a toco ^necldkus expresszió céljából CClÖhAl AT nrimgéní hordozó AAV vektort psxeádnopu'áhnk új AAV-k kapszidjídval, es inupuadelteleps állaioknak (NCR csupasz egereknek) adtuk be: azok n a xusos memíVlségbea <58 jú eredeti preparátum, hígítás nélkül) iutrairaoheális injekcióval, amint az alábbi ufoiazatban bemutatjuk, A ö. íáblázadjaa. egerenként (NCR csupasz egér) 58 pl eredeti preparátumot: alkalmaztunk, a detektálási határ 28,833 peónia 28, napos.
9. Táblázat
Vektor Összes G€58 pl pg ÁlAT/nú 50 pl pg A1A Tóni J Relatív géaátvitol ΐ rb.lO-hez (klón 44.2)
vektorban vektorban Ix W* vektorba® kasoníítva
2/5 ........................ 2,6 k 0.5 0,09 te 0,02 2,2
2/2 5,5x5 öu <0.0? <0.005 <0,1
2/5 tj-------- 0,65*0,56 0.02 ± 0,004 0,5
2/7 4.2xl0:2 I te 0,53 0,02 te 0,01 0,5
2-A 7,5xTö?T 0,9 te 0,7 0,(2 te 0,09 2,9
2-'cb.5 (A.3.1) ' ÖxÜF 1 z 0,7 0,04 te 0,030 0/24
2úhA (43.25) 4.6xlÖk' 26 te 21 0,56 te 0,46 137
2/rh.iO (44.2) 2,8x1 Ö’5 115 ± 3-8 4,5 te 5,4 100
2/rb, 13(42.2) 6x1 (F 7,3 ζ 0,8 0,12 te 0,84 2,9
2úh.2l (42.50) ——rs------ 9 te 0,9 0,38 te 0,04 9,3
2.0h.22 (-42. Π) 2,6<Gö’J 6 v 0,4 0,23 ζ 0,02 '................. 5.6-
2/rh.24í42.i3) :5.,5xíOi! 0,4 te 0,3 0,4 te 0,3 1
A vektorokat beadtak immunkempetess altoknak ÍS: (CSTSUd egetek) szőttes ge&oavkópla szántban (1 x ICÉ’ GC), ámmí a 10. táblázatban bemutatják (5 x40:iíG€ állatoskétjí, C57OI26, 14. riap, detektálási határ 40,033 pgOsl).
50, Táblázat
AAV vektor gg AÍAT/niS ixl0í! vektorban Relatív génátvRd rlíJO-hez (kiás 44.2) basnslítv®
2 1 0.076 te 0,031 2A
2/2 0,1 te 0,09 0,4
2/5 0,0840,033 2-9..................... :
2/7 0,33 α 0.01 Π
2/8 1,92 te i,3 2,9
2/ch.5 (Á.3.1) 0,048 te 0,004 t,6
2/--13.8 (43.25) 1,7 te 0,7 58
2/rb, 10 (44.2) 2,93 te 1,7 5:00
2/rb. i 3 (42.2) 075- 0,15 15
2/rb.21 (42.101 0,86 te 0,32 29
2 rh-22 <42. Ϊ 51 0,38 te 0,18 13
2-dí.24 (42.13) 0,3 V 0,19 10
A két kísérletből származó adaték megerősketíék a klón 44.2 kiváló trepízmusát: tüdőbe irányaid gésátvitelhen.
iö Érdekes, begy a klón 44.2 teljesítménye májba és: bomba irányuld gértáívúelhsm szitáén rendkívül jő veit, ntegközeihve a majái legjobban írartszdnkálót, az AAV8~a:t, essz izmot legjebbas femstokdiöí, az AAV Ιοί, azt sugallva, bogy ez az áj AAV érdekes bioiógj&í jelentőséggel bú.
., 52 ·
Az új AAV-k szeroídgiai tolaídbnságainak vizsgálatára pszsuántigizák ÁAVGFF vektorokat állítottunk elő nynlak bwunlzálására és 84-3 l-es sejtek wt vőw feanszdnkálására, kőlőnbőző kapszsdok elleni antiszértmtokjelenlétében és hiányában. Az adatokat az alább lakban fegfeljuk Össze:
Ha. Táblázni: Kereszt-sesífegestlö rtfeaaayag vizsgálati eljárás 8431 sejtekben és adettovírtis (Adv) égy öltés fertőzés. 8431 sejtek fertőzése (Λάν-al együtt fertőzve):
Az alábbiakkal imnranizáit nyálból származó szérűin 10QGC iO'OC ioí!gc 10lsGC
r&./3 rfe.2? rá, 22 r&>24
AAV2/42.2 ÁAV2/42.Í0 AAV2 <’ 11 AAV2/42.13
AAV2/1 1/20 V28 1/20 Nincs NAB
AAV2/2 1/640 1/1280 1/5120 Nincs NAB
A.AV2/S Nincs NAB :i/4Ö 1/160 Nincs N.AB
AAV2/7 ESI920 1/81020 1/40960 1/640
A.AV2.-8 1/640 1/640 1/320 1/5120
0.5 AAV2;A3 1/20 1/160 1/640 1/640
rOAAV? 45.25 í/20 1/20 1/20 1/320
rfe/Ő AAV2 44.2 Nsncs NAB Nincs NAB Nincs NAB 1/5120
rfe/5 AAV2.-42.2 1 5120 1-5120 1/5120 Nincs NAB
rts.5/ 5ΛΊ242 10 1/5120 1/10240 1.-5Í20 1 2.0
rfe.22 AAV2Z42.il i 204»; 1-20430 1/40060 Nincs NAB
rfe24 ÁAV2/42.13 Nincs NAB 1/20 1 2ü 1.5120
NAB ~ semlegesítő ellenanyag llfe, Táblázat: Kereszí-semlegesltö elfesanyag vtzsgúktd eljárás 8431 sejtekben és Adv együttes fertőzés. 8431 sejtek fertőzése (Adv-ai együtt fertőzve);
Az alábbiakkal .isnnúunzált nyálból származó száram HfGC 10’í:GC lO^GC W nf gc
rfe/2 c.8,5 r/í. 8 rfe/6 rfelfe
AAV2/42.1B ÁAV2/A3 AAV2-43.25 AAV 2/44.2 AAV2/42.8.2
AAV20 Nük-sNAB 1/20480 Nincs. NAB 1/80 ND
AAV2/2 Ϊ/20 Nincs NAB Nincs NAB Nincs NAB ND
AAV2/5 Nincs NAB 1020 NracsNAB Nincs NAB : ND
AAV'2/7 1/2560 1/640 BI6Ü 1/81920 ND
AAV2/8 1/10240 1/2560 1/2560 1/81020 ND
cő.5 AAV2/AÍ 0:280 1 10240 ND 1/5120 I/B20
rU AAV2.-A3.25 1/1280 ND 1/20400 i'5120 1/2560
rfe./ŐAAV2/44.2 1/5120 ND ND 15120 1/5120
rfe/,? AAV2/42.2 1/20 ND ND Nincs NAB 1/520
rfe22 A.A.V2/42.10 1/20 ND ND 140 1.-80
rtí,22AAV'2:42.!i Nincs NAB NI) ND ND Nincs NAB
j efo24AAV2/42,13 [ 1/5120 ND 1 NI) | ND 1/2560
Π. Táblázat
Nyálszsnim íhere Megerősítés utáni ti tér
Vektor liter a 21. napon
AAV2/A3 1/10240 1/40960
rá,# AAV2/43.25 i /20400 1 163840
ffo/d AAV2/44.2 1/10240 1:527680
AAV2A2.2 1/5120 1/20960
r/U/ AAV2/42.10 i/20400 1/81920
ét. 2 2 AAV2.42.11. 1/40960 NI)
r/t.24 AAV2/42.13 1-5120 ND
a. Tíihlázat: 8435 sejtek fertőzése (Adv-al egyóli fertőzve) GFP-vét
* 10' GC/ i mérőhely lo’GC mérőhely 10'·' GC mérőhely 10' GC·' mérőhely iö' GC mérőhely nwi mérőhely
AAV2/Í ÁÁV2~2 ÁAV2.-7 AAV2/8 Nt.5 AAV2/A3
O.RJ száma; 128 >200 95 56 13 1
látótér 83 >2ÖÖ 65 54 11 1
b- Táblázat: 8431 sejtek fertőzése (Adv-al egyí'itt fertőzve) GFP-vef
i:0vGC mérőhely 10 GC. mérőhely 10'GC/ mérőhely 1Ó'''GC7 mérőhely 10' GC mérőhely ií?GC mérőhely 3Cg(>' mérőhely
rő.8 rő./P NUJ és. 21 z/t.22 ét.24 rh.22
AAV2/43.25 AAV2/44.2 AAV 2'42,2 AAV2/42J0 AAV2/42.Í· AAV2/42.13 AAV2-42.13
GFJ szánta/ látótér 3 13 54 62 10 3 18
2 12 71 ......60............. .......... 14.......... .........2......... 2,0
48 47 16 3 12
10, példa; Az örökletes mperkeleszíermt-mm! egermcdelhe
Az alábbi kísérletben azt demonssxáljuL hogy a bdáhnány szeritől AAV2/7 konstrukció bejuttatja az
LDL-feceptsn és olyan mennyiségben expresszál í/DL-receptert, ami elégséges az örökletes Idperkolcsztcrinétnía állati modelljeiben a pt&zm:r-koleszlerte és íriglieeddek színijének csökkentésére, zí. Ftf.terök köastrtíkcíóm
AAV? és AAVS kapszid fehérjékkel rendelkező AAV vektorokat állítottunk elő psztmácfipizátö stratégia alkalmazásával p-ltldinger, Mi és nrtsai., 1 VtroL 7S, 619Ö-6203. old,- {2Ö01jj, AAV2 fordított terminális ismétlődéseket (l'TR) tartalmazó rekombináns .AAV genomokat pakoltunk 293-as, sejtek tripla, íranszfekíálás&val a dsz-plazmiddal, az. adenovírus segítő plazmádul és kítnéra pakoló konstrukcióval, ami az ói AAV szerotspösok kapszulának ész AAV2: #φ génjének a fóztoja. A kimérő pakold piazmidot korábban leírt
-54modorí állítottuk elő [Hildinger és mtsai.. mint fenti A rekotnbirsáns vektorokat szokásos CsCS Olepitési eljárással iíszdtottuk meg. A kitermelés megkaíározásáhrsK ArpAfou elemzést (Applied Biosysfems) végeztünk a vektorok SV4Ö polí-A régióját célzó próbák és lánciíidttók aikátiúazásával (Gao, G, B. és mtsai., ílum. Gége Ther. 11.2079-2091. old. (2.000)1, A kapott vektorok a hmuárí tiroiddtörttmui kötő globálist géniének promótere (TBC) szabályozása alatt evpresszáíják a trtrnszgém.
B. A/óízíÚ:
LDL-reeeptorrs nézve defefenx C57B1/Ó tölteni egereket vásároltunk a Jsekson Laboratory cégtől (Bár Bárkor, M'E, USA), és tsayészkolétriakésf tartottuk testi azokat Az egetek akadályozarlanüi kaplak vizet és magas zsírtartalmú ikhsferaí étrendet (ntagas koleszterin %>, bárom héttel a. vektor bemjektálását megelőzően kezdve. A ~7. és 0, napon vért: vettünk reirnorbstális véreztetéssel, és érieké link a lipidproSIt Az egereket: véfetleasaerüest bét csopsrrtra osztottuk: szét, A vektort iuiraportábs injekcióval injektáltuk be, korábban leírt módos. [Chert, S, J. es mtsai,, 'Mai, Therepy 2, 256-261. old. (2000)J. Röviden, az egereket, érzéstelenítettük ketsmmaal és xílazkmál, Basmetszést wgezta«U és fíkás-ntk a portál Is vénát. Egy 30g tű alkalmazásával 100 pl
BBS-hen: meghlgitort meglelek) dózisét i <. ektoj t injektáltunk közvetlenül a por-áiís vénába. Az injektálás helyére nyomást gyakoroltunk, hogy biztosítsuk a vérzés elállását. A bőrön ejtett sebei összezártuk. kendővel lefedtük., és sz egereket körültekintően ellenőriztük a következő napon. Hetenkénti vérvételt végeztünk a májba irányuló génátvlíel mám 14. naptól, kezdve a vériipjőek mérése eéijáböí. Csoportonként két állatot feláldoztunk a vektor injektálása utáni 6. héten és a 12. héten, hogy megvizsgáljuk az ateroszklerötikus plákkök méretei, vídamáut a receptor expressziöiát, A fennmaradó egerekét a 20. héten áldoztuk fel plakk-méréshez, és a tomszgén esprtíssziöjának meghatározásához.
14. Iá blúzai
l'í’B,·;;?' BőzA Ι «
i.csoport ÁAV2,7-T®G-hI..DI..r Is KT'gc j n
2. csoport AAV2/7*IBG~hLPLr 3x Kfogc 12
3. esoporJ AAV2/7 TBC hl. Bír Ix lő^ge: 12
4. csoport A,AV2/8-TBG-bIDÍ.r Ix Uf'gc 12
5. csoport AAV2A-TBG-hLf)i,r ás Hl ge 1 °
6. csoport AAV2/8-TBG-hLDÍr lx 10;igc 12
7. csoport AAV2/7-TBG- LacZ Is lÖ'S’c 1 16
C óAözun-Abí^í'ofeíí?: és mátíhíífezá etönzáse
A vérmintákat a retreortailálA fonatból vettük ö órás koplalás után. A szérumot eeütrí&gáíásxal választottuk el a plazmától A plazma lipoproteiuek és máj íranszamfoázok szérembeli mennyiségét autoníabítál; klimkíts kémiai anah stomtí detektáltuk s'ACE, Settöpparelli Btosystems, Alpha Wassetmaim),
B. ,4 .írez.vgí n ,'»/»í,>,ííf5ná' dcieáidúisct
Az LDt-receptor evprssszlpját immuuiluoreszecas festéssel és Westert-blodal értékeltük. A Western30 bloshoz fagyasztott májszö«et«t homogenizáltunk irzís pufforben ( 20 aM Tris, pH 7,4, 130 mM NaCi,
Triton X 100, profeitöz inhibitor — komplett, EDTA-mesfos, Roebe, Mamfeeim, Crermaayj. A fehérjekoneentrá.eiót a .tWerp ,SC< fAtíeöt Avsuy Xwgw O reagenskészlet alkalmazásával határoztuk: meg
-55 (Pieree, Rockfwá, ít). 4Ö pg fehérjét feltsúmk meg 4-:15¾ Bfo-MC; géleken (Biorad, Hercufes, CA), és vittünk át nhrocellulöz membránra (fnvitroges). Aaíi-hhDE-reesptor ellenanyagok elöáliitásáhez nyulakat oltottunk intravénása» A«MJ3tr prepatárunumd (1 x 1813 6G). Négy héttel később levettük a ayáiszérnttrot és. Wesieru-htmban alkalmaztak. A szérum 1:180 hígítását alkalmaztuk elsődleges ellenanyagként, majd DRfovél könjugalt atús-nyúl-dgö-t és kemkmmaeszeeaojás detektálást afaknszltmfc t£Cí. R'estera Bfoí ZMfeebos XA, Ámersharo, Adiugtmr Heights, fí..k E, ííHJ»««Cfe>tó»fe
Az: LDL-reeepior expressziójának fogyttszíoit isújmeíszetekben történő tnegbatározásához mmnmhisztokémiaí elemzést hajtottunk végre. 18 gm-es khosztát metszeteket rögzitefomk 5 percen keresztül
1.8 aeetoshan, vagy rögzteienal hagytunk. A blokkolást 1 órás tttkuhálást időszakon keresztül végeztük 18% keesfeeszérummai, A metszeteket ezután egy órán kérésziül inkúbáltúk az elsődleges ellemmyaggal szobahőmérsékleten, Nyúl polulonalts arsti-humáa-LDE ellenanyagot (Bíoraedíeaí Teehnolegiss iné., Stonghíon, MA) alkalmaztunk a cyárto utasításai szerint sncgaigüva. A metszeteket megmostuk PSS-sel, és 1A88 arányban nwglhguott ílnoresgeeín-keeske-amí -nyúl - IgG ellenanyaggal Inkubáltuk {Sigsta, St. EouiS Mü).
A mmtákst végül megvizsgáltuk Arkoa Mroropkoz-rX? fluoreszcens mikroszkóp alatt. Minden esetben az hskáhátást alapos mosás követte PSS-sei, A. negatív kontrolokban PBS-sel történő elölnkohálást, az elsődleges ellenanyag elhagyását és az elsődleges ellenanyag izotipus-íllesztett sem immun kontroli ellenanyaggal. tőriénő helyettesítését alkalmaztuk, A lent említett három típusú kontrollt: minden kísérletben elvégeztük ugyanazon a napon.
X. GenfoviAz úoíéfemyságö
Májszővatet vettünk az egerek meghatározok időpontokban történő Sbiáldozása után. A szövetet hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -SŰ eC-on tároltak a további feldolgozásig, DNS-f extraháltunk a májszővetböi & QDixtKp DéM Mint A'h raagenskészle? (Q1AGEN Gmbkk Gerraany) alkalmazásával: a gyártó utasításai «szerint, A rnájszöveíben található A.AV vektorok, genom-kópiáit rbgá&ó: elemzéssel értékeltük az
SV4Ö pók--A fiatok elleni próbák és lánctndítők alkalmazásával, amint lém leírtuk.
G, Az őíeromkferoífot<xrfotkksk tséréro
Az egér aortában található aíeroszkleroíikus plakke-k mennyiségi meghatározásához az egereket érzéstelenítettük (10% ketamín és silazln. l.p.), a ntellürege? íemybe-ttuk, és a artériás rendszer; periündáiíattuk jéghideg foszfát-pufferelt sóoldaítal balkamrán keresztül. Azután az aortát kivettük, felhasítottuk a centrális középvonal tseraén az aoríaivíoi lefele a combartériáit irányába, és formaimban rögzítettük. A lipidekhen gazdag ateroszkierotíkus pkoÁe-tat megfestettuk Szudán-lV (Sígrua, Gerroany) aikahmuíásávak és az aortát fekete viaszos felszínre sst u,tettük, Λ kenet Sony DXC~9Őd szirtes: videokamerával rögzítettük. Á ptakkok területéh valamint a tebes mmin-felszim Ftee 5 /wsgfeg Ójístmns alkateumásával határoztuk meg (Media Cyberneties).
Kísérleti csoportonként két állatot teszteltünk. I !~'~tel jelzett LDL~t (Dán Rader. U. Fenn. nagylelkű ajándéka) juttatunk be snflizíőva! a forokvénán keresztül 38 másodpercen keresztül fi <108008 cptn 11 állatonként 180 pl steril PBS-ben meghigitea). Az injektálás utáni 3 perces, 38 perces, 1.5 órás, 3 órás, 6 órás időpontban vérmintát vettünk a rotroorbhális fonaton keresztül. A plazmát elválasztottuk a teljes vérbők és 18 pl plazmát ménünk meg gammaszámlálóban. Végezetül kiszámítottak a fcakeionáhs katalitikus sebességet a
- 5ö lípoprotein ktűtülésí adataiból.
Ífoiií /éíkiífíKöaódásÓRíik érfeáeküi?
Fagyasztott tnájroetSKetek oi.m<.íős-:fesíését Isajtottak végre a hpüd fehíaimozódásának: meglmtározásárs. A fagyasztott májmeíszeíeket röviden, teőhlítetfük desztillált vízzel, majd 2 percen, kérészből
Inkőbáltnk abszolút praplién-ghkolban. A metszeteket :azníán megíésíehük: olaj-vörös oldatost (0.5% proptlénglikoihan) 16 óránkeresztül, majd ellenfesíettük Mayer-féle hemmoxíkn oldattal 38: rnásodpereen keresztül, és fehselegtteh gíteín-zselé oldatba ágyaztak be,
A máj koleszterin- és trigheerid-fartalom mennyiségi meghatározásához májsnetszeteket houmgemzáltunk, és klotoSbravtnetanol (2:1) keverékben takubákuk éjszakán keresztül o,oS» FBSEU hozzáadása és 18 percen keresztüli cenrrhbgálás után a minták alsó rétegeit összegyűjtőd m, -ret aiikvsítm. osztottuk, és nbrogétt alatt bcszárltotink. A koleszterin méréséhez az első aíikvot beszáritott lipjdjeit fefoldohők kloroformban oldott l'S Triton X-löö-ban. Bá egyszer feloldódott, az oldatot beszáritottdk nitrogén alatt Á hpidek kétszer desztillált vízben történő feloldása és 38 percen 37 ''G-on keresztüli rnkuhálás mán megmértük a íein', kok's.kotn -nemv;oocri /kod tömhm't'nk λ;? oagenAeszkí tWakv Ihagnostscs» Jkalnrazásával. Á
IS második alíkvol esetében a beszáritott lipideket alkoholos KÖB-ban oldottuk fél, és 60 sC-on inkubálnik 38 percen keresztül. Azután 1 M MgCb-t adtunk hozzá, majd jégen inkubálnik 18 perces kérésziül, és leetmfrifegá&tk: 14080 rpm-on. 38 perceit kérésziül. A felőlőszőt végezetül érfekeittik tríglieeridre (Wako Dsagriosiles}.
Az AAV2/8 vagy AAV27? kapsziddal pszendöíipizáit vektorok mindegyike csökkentette a a korfeülhsiS: viszonyítva a teljes koleszterint LDL~t: és irigkeeridet Ezek a tesztvektorok szintén kijavftotlák dózistüggő módon a hiperköteszterinémiás fenoilpust. Az AAV21S and és AAV2.·'? egerek esetében megfigyeltük a plakkofc terűié tőnek: csökkenését a kezek egerekben az első teszt időpontjában (2 hónap), és a. hatás fennmaradását figyeltük meg: a kísérlet teljes Időtartama alatt (ő hónap).
10, példát Működőképes Faktsr-lX expresszáitatása és henrolffiá kijavítása
A. Aiíííöti' p, ás;?ri-ft<í ‘0 egerek
A funkoíönáhs í&kíor-TX. (FTXj expresszióját B-hemcfihás egerekben vizsgáltuk. AAV1S AAV2, AAVS. AAV? vagy AAV8 kapszklekai tartalmazó vektorokat áiliioííurik elő AÁV2 5' ÍTR máj-specifikus proméíer [LSP] — kutya FIX — atormota hepatitisz poszí-regulatarifer» elem (WPRE) ----- AAV2 3’ ÍTR konstrukció besuísttására, A vektorokat Wang: és mtsai, [Molecular Therapy 2, 1.54-158. old. (2808)} leírása szerint állifethrk elő a megfelelő kapszidok alkalmazásával.
A kiütött egereket Wang es mísaj ife-oc Xafi, Aead, Sm USA 115tA t í5oa (:«9”} leírása szerint állítottuk elő. Ez a modell teljeses hasonlít á B-hernofiliá humán tenmípssára.
Különböző szerotípusú vektorokat (AAVl, ÁAV2, -AAV5, AAV7 és AAV-8) juttatnak he egyetlen inttítporlábs mjefcetöban felnőtt hemofillás C57BE6 egerek májába I x 10! * GC euó? dózisban az őt különböző szerotlpns esetében, és egy csoport AAVS vektort kapott alacsonyabb. 1 χ 10 ” <,f egér dózisban. A kontroll csoportot 1 x 18:i OC AAV2AÍ T.BG Lac23 vektorral oltottuk. Mindegyük csoport 5-18 isim és nőstény egeret tartalmaz. Az egereket a vektor beadása után kéthetente véreztettük,
1, ££Z$d
A kutya FIX kmreenüáciáját az egér plazmában a kutya. lakíor-fX-re specifikus BLISA vizsgálati eljárás alkalmazásával határoztuk meg, amelyet lényegében Aseirod és írásai, (kroc, Nash Aead; Sel USA 37,
-575173-517?, old, {199ö)'j leírása szerint végeztünk, módosításokkal. íuh antí-katya-fektor~ÍX-et (Eszyme Research Laboratories) alkalmaztunk elsődleges ellenanyagként, és nyúl a®iÍ-k®tya-fektoiAX~et (Enzyme Research Laboratories) alkalmazóink másodlagos ellenanyagként. Az injektálás után két hét elteltével kezdődően megnövekedetí FIX plaznrakoncentfációt detektáltunk mindegyik fesztvektor esetéhen, A megnővekedetí koncentráció terápiás szintes maradt a kísérlet folyamán, azaz a 12, hétig, A terápiás szintnek a normális szint 5%-fo tekintjük, azaz körülbelül 230 ag/mi-í,.
Az expresszié Isgmagasafeo szintjét az AAV3/8 esetében (IÖ!! dózisnál) és AAV2/7 konstrukciók esetében figyeltük meg, szuperfizíolőgiás eblX szintet fenntartva (a. normális szintnél tízszer magasabb szint). Az AAV2/8 (1Ö!') expresszíós színije megközelítőleg lö-szer magasabb volt, mint az AAV2/2 és AAV2/8 (IO50) esetében otegOgyelt. A. legalacsonyabb expresszíós szintet — habár még tinódig a terápiás szint felett......az
AAV2/5 esetében figyeltük meg,
2. fn vio'ö ííkiivdO rósc/cgcx rfOfahopfes:ríín-á:/d ι'νΕΓΓΐ vóxgtí/od c/ófedr
A llX-kiüföít egerek plazmájának funkcionális faktor-lX aktivitását ás Asm aktíváit részleges tromboplasztín-ldö (aPTT) vizsgálati eljárás slkahuazásával határoztak meg. Egér vérmintákat gyüjtodünk a retro-örbítáhs fonatból 1/10 térfogat citráí-puffetbe. Az aFTT vizsgálati eljárást: Wáng és tstot (Froc. Kati, Acad. Sci. USA. 84, 11563-11566. old. t19971] áínd leírt módon hajtottuk végre.
A vektorral injektált egerek misdegyske píazmamintámak aPTT vizsgálati eljárással mért aívadási ideje a normális tartományban volt (megközelítőleg 60 másodpere), atníkor az injektálás után két héttel mértük, és az alvodsst idő megmaradt a normális vagy tmrtnáltsnál rőt ioetíb tartományban a vizsgálati időszak (Íz hét) folyamán.
A. legalacsonyabb aívadási időt: az AAY2/8 (lőlí) és AAV2/7 vektort kapott állatoknál figyeltük meg, A 12, hétre az AAV2/2 is az AAY2/8-hez és AA¥2/7-hez hasonló aívadási időket fedukált. Azonban sem figyeltük meg ezt a lecsökkent aívadási idol: az AAY2/2 esetében a 12, hétig, míg lecsökkent alvadhat időt (a 254b másodperc tartományban) figyeltünk meg az AAV2/0 és ÁAV2/7 esetében a második héttol kezdve,
Jelenleg zajlik a kezelt: egerek némelyikétől begyűjtött májszövetek ínmmnhlsztokémlaí festése. A hepatoeiíák körülbelül 70-$ö%~a festődön pozitívnak a kutya ΕΙΧ-re az A.AV2/8.eRX vektorral öltolt egerekben.
B. B-áem<y?hd.x fogyná
Az F.IX gén. katalitikus doméfeeben pontnioiációf amely a modellezési vizsgálatok alapján instabillá teszik a fehérjét.....tartalmazó kutyák B-hettínfeitaban szenvednek (Ewds és mtsai.. Eroc, Háti Acad. Seb Uh,
86, 18Ó95-10099. old. (1989)1. llyeí?. kutyák egy kolóniáját tartották fenő több mim két évtizeden keresztól az University oí Nórát Cnrolina (Chapel ifill) egyeteme®. Ezen kutyák: homeosztarikas paraméí-emit tészk-tesen leírták, amelyek közé tartozik «plazma E.1X amigénhiánya, a lelje» véralvadási ideje több mint 60 pere, míg a normális kutyáké 6-8 perc, es Sb-hÖ másodpercre elnyfoíoít aktivált részleges írombeplasztin-idő, msg a normális kutyáké 13-28 másodperc.. Ezek a u kutyák visszatér® spontán vérzésektől szenvednek. Tipikusan a szignifikáns vérzéseket sikeresen kezelik Ifi mkkg normális kutya plazma egyetlen. intravénás infúziójával: alkalomadto ismételt infáziöra van szükség a vérzés megállításához.
Négy kutyát uhunk he intraports&an AAVAFIX vektorral az alábbi rend szörítít, Egy első kutya egyetlen AAV2 2 cl IX injekciót kap v7 \ 10 * genom-kópia (Gt'Ukg JnJwai Lgy második kutya eg> cNo
4ö ÁAV2/2,cElX injekciói kap (.2,8 x 10'1 GC/kg), majd egy második AAV2/7.cFlX injekciót (2,3 x fÖw GC/kg)
- 58 az ‘ISO. napon. Egy harmadik kutya egyutlss AAVddheFIX injekciót kap 4,6x Ib1’ GC/kg dózissal. A negyedik kutya egy AAV2-'2,«FIX injekciót kap (2,8 x IO;U GC/kg) és egy másik mjekeiót a 995. napim AAV2/7.cf 1.X (5 x IO,; GC/kg) dózissal.
A heutofíltás kutyák hasátaszeptikusán fodtéiíleg felnynjtik általános érzéstelenítés mellett, cs a vektor egyetlen. infúzióját adjuk be a portálta vénába. A állatok vérzését megakadályozzuk az. Operáció korall ídbszakban normál kutya plazma intravénás beadásával. A kutyát nyugtatjuk, foíabáljuk az általános érzéstelenítés Indükálásához, és a basát leborotváljuk és előkészítjük. Mintán a hasüreget íetoyÍíottnk, a léget az. operáció tájára húzzuk. Lokalizáljuk a lepvénáí, és lazán egy varratot: helyezőnk a vénán tett egy díszialís kis: bemetszés közelében. Gyorsan egy tűt vezetünk be a vénába, és azután: a varratot meglazítjuk és egy 5F kanált lö tizünk be intravénásait a portállá véna közelében annak elágazása mellett. Mintán csillapítottuk a vérzést és egy katéter ballont letoljunk, rnegközehtőleg 5,0 :n;:l, FRS-liea megltigított vektort jaííattrok be 5 percen keresztül in&síevai a portába vénába. A vektor iuinzíojái 5,0 túl sóotóat istfeidja kövek. Azután a ballont leeresztjük, a kiürült étövolüjük, és a vénás vérzést megáHltjok. Azután u légei visszahelyezzük, a vérző ereket kiégetjük, és a műtéti sebet lezárjuk. Az: állatot extobáljak, miután jól toleráltá a műtét; eljárást, A vórntlutákat leírt módon elemezzük. (Wáng és mtsai,, Moleenlar Ttierapy 2, 154-156, old, (2000)), konok K ! , rgv rCVí CgCx -< i . V, oi nutefo e ,\ün. nvcket \<>r Ά. ÍZ \ \\ 2 Ά-ví\ ne ’
A leírásban idézett mindegyik publikáció hivatkozás útját; a kífctnhás részét képezi. Míg a taláknányt különöset; előnyös megvalósítási módokra történő hivatkozással irtuk le. nyilvánvaló, hogy végretogthatok módosítások anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől. Az ilyen módosítások szinten az mellékelt igenvpojttök oltalmi körébe esnek.
A szek^tteítoAtábaa található szabad szövegek fordítása <2íö> 46
- 22 A- lehet a. c. c sagy s <2IO> 75 <223> bármilyen aminosav lehet
3ö

Claims (12)

1. Adeno-asszoeiálí Árus (AAV), amely tarfelmaz olyan. AAV kapszidol, amely a 9.5. ;monosítószámó. szekvencia 1-738. aminosavai szerinti AAV8 atnuiosav-szsfeesciát vagy aszal legalább 95%-bas azonos
5 szekvenciái tartalmaz; ás olyan miaigént, amely AAV ferdíiolttemrlsáíis ismétlődésekéi (ITR) és betérőkig gént tartalmaz, amely annak gazdasejtben való expresszióját irányító szabályozó szekvenciákhoz van srtákódőképeses kapcsolva.
2. Az 1, igénypont: szerinti AAV, ahol az AAV kapszid tartalmaz vpl kapszid iéhérjét, kapszid fehérét és vp3 kapszid fehérjék azzal jellemezve, hogy a vpl kapáidé fehérjének olyan a szekvesciája, amely
19 legalább 95%~ban azonos a 95, aabnosítteSsiá szekvencia 1 -738, atmnosavaíval,
3. Az 1, vagy 2, sgénypom szerinti AAV, ahol az aminesav-szekveneia legalább 99%-ban azonos a 95, azonosítószámú szekvencia 1-733. smmossvsivat
4. Az 1-3, igénypontok, bármelyike szerinti AAV, ahol az AAV kapszid tartalmaz vpl kapszid. fehérjét, yp2 kapszid fehérjét ás vp3 kapszid fehérjéi, azzal jellemezve, hogy a vpl kapszid fehérje amfeosav15 szetefistteiája a 95. azorsositássámn: szekvencia 1-738, amúmsavai,
5. Az 1-4. igénypontok: bármelyike szerinti AAV, ahol sz AAV vp2 kapszid fehérje ammosavsxekvescíáfe a 95. azonosítószámú szekvencia 138-738. amínosavíd.
ó, A 3-5, igénypontok bármelyike szerinti AAV, ahol az AAV vp3 kapszid fehérje amlsosavszekvencíája a 95. azonosítószámú szekvencia 293-738. rmhaosaval.
29 7. Az 1 ~§, igénypontok bármelyike szerinti AAV, ahol az ϊ'1'R-ek AAV2-bdi származnak.
8. Adeno-asszociah vírus (AAV), amely tartalmaz olyant AAV kapszídos, amely legalább a 95, azonosítószámú szekvencia 283-738, aminosavai szerinti aozinosav-szekvenesájú AAVS vp3-at vagy azzal legalább 95%-baa azonos szekvenciát tartalmaz; és olyan minigént, amely AAV fordított terminális Ismétlődéseké· (ITR) és heteroiög gént tartalmaz, amely annak gazdasejtben való expresszié^ irányító
25 szabályozó szekvenciákhoz van működőképesen kapcsolva,
9. A 3. igénypont szenna AAV. ahol az AAV kapszid tartalmaz vpl kapszid fehérét, vp:2 kapszid fehérjéi és vp3 kapszid fehérjét, azzal jellemezve, hogy vp3 kapszid fehérjének, olyan a szekvenciája., amely legalább 93%-ban azonos a 95. azonosítószámú szekvencia 293-738, ansirsosavaival.
18. A 8, igénypontok bármelyike szerinti AAV, ahol az .AAV vp3 kapszid fehérje amirtosav38 szekvenciája; a 95, azonosítószámú szekvencia 283-338, aminosavai.
11, A 8-ÍO. Igénypontok bármelyiké szerinti .AAV, ahol az AAV vp2 kapszid fehérje aminosavszekveneíája a 95. azonosítószámú szekvencia 138-738. aminosavai,
12. Készítmény, amely 1-1L igénypontok bármelyike szerinti: ,4AV-t: és iizlológiásan kompatibilis hordozót tartalmaz,
3.5 1' Izol.ih hap\,od tehetio, amely AÁ8 fehérjéi tartalmaz. amely az alábbiak bármelyike:.
kap^/td fehege, a 95. azonesbószámú szekyeneía 1-738, amtnosavai;:
vp2 kandid tehege,, a 95. azonosítószámú szekvencia 138-738, mmnosavd; és xp3 kapvsd tekerje, a:95,:azonoaÍlószámúszekvencia293-?38, amínosavaí:,
14. Izolált vagy szintetikus sakícínsav-molekala, amely 13. igénypont szerinti fehérjét kódol.
- 6015. Izolál; vagy szintetikus ítnkteinsav-psölskala, amely 8-as sderso-asszoeiáit toros tapszid fehérje feagmenséí kódolja, amely nakieinsav-moleknla az alábbiak bármelyike:
5 lé 17 tartalmaz. vpl, az 4, azonosítószámú szekvencia 2121 -4335. nnkfeötídjaí; vp2, az 4, azonosítószámú szekvencia 2532-4335. oökleotídjai: és vp3, az 4, azonosítószámú szekvencia :2730-4335. nnkleotidjai. . A 14. vagy 15. igénypont.szerinti rnoktela, amely plazmid. , A 14-16. igénypontok bármelyike szerinti molekula, amely továbbá lunkeionális .AAV reg gént is
18. Eljárás. AAV § szeretlpúsú kíipszkiöt tartalmazó takosfethámi adeno-asszoeláb vírus (AAV) 10 előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbiakat tartalmazó gazdasejtet tenyésztőnk: (a) 14-16, igénypontok bármelyike szerinti molekulát, amely adeno-asszociált vírus kapszidot kódol; tb) működőképes rep gént; (ej AAV fordított íemrmátis ismétlődéseket (1TR) és transzgént tartalmazó mínigént; és. (dj elégséges segitó fonkciókat, amelyek lehetővé teszik a mnúgénnek az AA V tapszid fehérjébe történő pakolódásáí.
19 , .I s vitro gazdssejí, amely l-ll. igénypontok: bárénelyike szerinti adens-assztítoáli. torost vagy 13-16. 15 íséoyponmk bártrtelyíke szerinti nmlekulát tartalmaz.
HU1500180A 2001-11-13 2002-11-12 Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására HU230406B1 (hu)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35060701P 2001-11-13 2001-11-13
US60/350,607 2001-11-13
US34111701P 2001-12-17 2001-12-17
US60/341,117 2001-12-17
US37706602P 2002-05-01 2002-05-01
US60/377,066 2002-05-01
US38667502P 2002-06-05 2002-06-05
US60/386,675 2002-06-05
PCT/US2002/033629 WO2003042397A2 (en) 2001-11-13 2002-11-12 A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU230406B1 true HU230406B1 (hu) 2016-04-28

Family

ID=27502639

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1500180A HU230406B1 (hu) 2001-11-13 2002-11-12 Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására
HU0600229A HU229379B1 (en) 2001-11-13 2002-11-12 A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0600229A HU229379B1 (en) 2001-11-13 2002-11-12 A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby

Country Status (22)

Country Link
US (15) US20030138772A1 (hu)
EP (4) EP2338900B1 (hu)
JP (6) JP4677187B2 (hu)
KR (2) KR101014207B1 (hu)
CN (6) CN105671005B (hu)
AT (2) ATE520707T1 (hu)
AU (1) AU2002361573B2 (hu)
BR (3) BR122016004546B8 (hu)
CA (8) CA2864537C (hu)
DE (1) DE60209193T2 (hu)
DK (1) DK1310571T3 (hu)
ES (3) ES2455126T3 (hu)
HU (2) HU230406B1 (hu)
IL (11) IL161827A0 (hu)
MX (3) MX346493B (hu)
NO (4) NO334379B1 (hu)
NZ (7) NZ564506A (hu)
PH (2) PH12014501487A1 (hu)
PL (4) PL217623B1 (hu)
SG (5) SG10202108118RA (hu)
WO (1) WO2003042397A2 (hu)
ZA (1) ZA200403360B (hu)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10693918B2 (en) 2017-06-15 2020-06-23 Palo Alto Networks, Inc. Radio access technology based security in service provider networks
US10708306B2 (en) 2017-06-15 2020-07-07 Palo Alto Networks, Inc. Mobile user identity and/or SIM-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks
US11722532B2 (en) 2017-06-15 2023-08-08 Palo Alto Networks, Inc. Security for cellular internet of things in mobile networks based on subscriber identity and application identifier
US11805153B2 (en) 2017-06-15 2023-10-31 Palo Alto Networks, Inc. Location based security in service provider networks
US11838326B2 (en) 2017-06-15 2023-12-05 Palo Alto Networks, Inc. Mobile equipment identity and/or IoT equipment identity and application identity based security enforcement in service provider networks
US12010148B2 (en) 2017-06-15 2024-06-11 Palo Alto Networks, Inc. Access point name and application identity based security enforcement in service provider networks

Families Citing this family (622)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030215422A1 (en) 1996-09-11 2003-11-20 John A. Chiorini Aav4 vector and uses thereof
ES2313784T3 (es) 1998-05-28 2009-03-01 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Vector aav5 y usos del mismo.
US20040121311A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7718354B2 (en) 2001-03-02 2010-05-18 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
WO2004060278A2 (en) 2002-12-06 2004-07-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
HU230406B1 (hu) 2001-11-13 2016-04-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására
WO2003052052A2 (en) * 2001-12-17 2003-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 9 sequences, vectors containing same, and uses therefor
FI3517134T3 (fi) * 2001-12-17 2024-04-03 Univ Pennsylvania Adeno-assosioituneen viruksen (aav) serotyypin 8 sekvenssejä, niitä sisältäviä vektoreita ja niiden käyttöjä
EP1359217B1 (en) 2002-04-29 2006-12-13 The Trustees of The University of Pennsylvania Method for direct rescue and amplification of integrated viruses from cellular DNA of tissues
US7419817B2 (en) 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
US7220577B2 (en) * 2002-08-28 2007-05-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Modified AAV
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
WO2005017101A2 (en) 2003-05-19 2005-02-24 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH Avian adenoassociated virus (aaav) and uses thereof
DK2657247T3 (en) 2003-06-19 2017-07-10 Genzyme Corp AAV virions with reduced immunoreactivity and applications thereof
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9233131B2 (en) * 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
NZ545656A (en) * 2003-09-01 2009-02-28 Amc Amsterdam AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis
AU2010201278B2 (en) * 2003-09-01 2012-11-15 Academisch Medisch Centrum AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US20120122101A1 (en) 2003-09-11 2012-05-17 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of bacteria
AU2011250849B2 (en) * 2003-09-30 2013-09-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
DK2292779T3 (en) * 2003-09-30 2017-02-27 Univ Pennsylvania ADENOASS-ASSOCIATED VIRUS (AAV) CLADES, SEQUENCES, VECTORS CONTAINING SAME AND APPLICATIONS THEREOF
US8137960B2 (en) 2003-12-04 2012-03-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Bovine adeno-associated viral (BAAV) vector and uses thereof
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
WO2006033672A2 (en) * 2004-04-28 2006-03-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
EP1742668B1 (en) * 2004-04-28 2011-02-09 The Trustees of The University of Pennsylvania Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations
JP4810533B2 (ja) 2004-05-24 2011-11-09 アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド ディジタルスレショルド化による選択的イオン濾過作用を用いた質量分光測定法
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
EP1771571A2 (en) * 2004-07-30 2007-04-11 Targeted Genetics Corporation Recombinant aav based vaccine methods
US7309589B2 (en) * 2004-08-20 2007-12-18 Vironix Llc Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing
EA200700807A1 (ru) * 2004-10-05 2007-08-31 Мерц Фарма Гмбх Унд Ко. Кгаа Новые циклические и ациклические пропеноны для лечения заболеваний цнс
US20060205040A1 (en) 2005-03-03 2006-09-14 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of adventitious viruses
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
WO2006110689A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
US8283151B2 (en) 2005-04-29 2012-10-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (AAV) serotypes
WO2007014045A2 (en) 2005-07-21 2007-02-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
EP1957678B1 (en) * 2005-11-28 2012-06-13 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
JP5268890B2 (ja) 2006-04-28 2013-08-21 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖの規模適応性の製造方法
WO2008013692A2 (en) * 2006-07-25 2008-01-31 Celladon Corporation Extended antegrade epicardial coronary infusion of adeno-associated viral vectors for gene therapy
US9149473B2 (en) 2006-09-14 2015-10-06 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
EP2126132B1 (en) 2007-02-23 2013-03-20 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid foresnsic dna analysis
PL2191001T4 (pl) 2007-04-09 2017-01-31 University Of Florida Research Foundation, Inc. Kompozycje wektora RAAV mające białka kapsydu zmodyfikowane tyrozyną i sposoby ich zastosowania
US9611302B2 (en) 2007-04-09 2017-04-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. High-transduction-efficiency RAAV vectors, compositions, and methods of use
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
EP2058401A1 (en) * 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
GB2472964B (en) 2008-05-20 2013-04-24 Eos Neuroscience Inc Vectors for delivery of light-sensitive proteins and methods of use
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
WO2010033627A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
US8550694B2 (en) 2008-09-16 2013-10-08 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
EP2344893B1 (en) 2008-09-16 2014-10-15 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and methods
US8158936B2 (en) 2009-02-12 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
HUE044522T2 (hu) 2009-04-30 2019-10-28 Univ Pennsylvania Adeno-asszociált vírus konstrukciókat tartalmazó légúti vezetõ sejtek célzására szolgáló kompozíciók
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
WO2010143761A1 (ko) * 2009-06-12 2010-12-16 (주)바이오니아 미지시료 내 감염성 미생물을 신속하게 검출하는 방법
WO2011008971A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
EP2454000A4 (en) 2009-07-17 2016-08-10 Ibis Biosciences Inc SYSTEMS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES
US20120244127A1 (en) 2009-10-01 2012-09-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV Vectors Expressing SEC10 for Treating Kidney Damage
ES2628739T3 (es) 2009-10-15 2017-08-03 Ibis Biosciences, Inc. Amplificación por desplazamiento múltiple
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
EP2553106A2 (en) 2010-03-29 2013-02-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
WO2011133874A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
WO2011133901A2 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Aav-based treatment of cholesterol-related disorders
EP3514232A1 (en) 2010-04-23 2019-07-24 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
CA3128549A1 (en) 2010-07-12 2012-01-19 Universitat Autonoma De Barcelona Gene therapy composition for use in diabetes treatment
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2012145572A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
WO2012145624A2 (en) 2011-04-21 2012-10-26 University Of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies
KR102202908B1 (ko) 2011-04-22 2021-01-15 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 변이체 캡시드를 지니는 아데노-관련 바이러스 및 이의 사용 방법
EP2748185A1 (en) 2011-08-24 2014-07-02 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University New aav capsid proteins for nucleic acid transfer
US20130136729A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-30 University of Virginia Patent Foundation, d/b/a University of Virginia Licensing & Ventures Group Compositions and methods for targeting and treating diseases and injuries using adeno-associated virus vectors
AU2013221212B2 (en) * 2012-02-17 2018-08-09 The Children's Hospital Of Philadelphia AAV vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues
US10093947B2 (en) * 2012-02-28 2018-10-09 Cornell University AAV-directed persistent expression of an anti-nicotine antibody gene for smoking cessation
WO2013154744A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Cornell University Development of a highly efficient second generation nicotine-conjugate vaccine to treat nicotine addiction
US10294281B2 (en) 2012-05-15 2019-05-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use
US12358954B2 (en) 2012-05-15 2025-07-15 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Capsid-modified rAAV vector compositions and methods therefor
EP2692868A1 (en) 2012-08-02 2014-02-05 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue
JP6387350B2 (ja) 2012-09-28 2018-09-05 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 希突起神経膠細胞を標的とするアデノ随伴ウイルスベクター
EP2954051B1 (en) 2013-02-08 2019-03-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified aav8 capsid for gene transfer for retinal therapies
EP4223772A3 (en) 2013-02-15 2023-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor viii gene
US8957044B2 (en) 2013-03-01 2015-02-17 Wake Forest University Health Sciences Systemic gene replacement therapy for treatment of X-linked myotubular myopathy (XLMTM)
PT2984166T (pt) 2013-03-15 2020-07-16 Univ Pennsylvania Composições para tratar mps i
WO2015012924A2 (en) 2013-04-29 2015-01-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and use thereof
CA2907799A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
CN105579465B (zh) 2013-07-22 2019-09-10 费城儿童医院 用于基因转移到细胞、器官和组织中的变异aav和组合物、方法及用途
PT3099333T (pt) * 2014-01-31 2020-12-24 Univ Temple Bag3 como alvo para terapia de insuficiência cardíaca
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
US10072251B2 (en) 2014-02-19 2018-09-11 University Of Massachusetts Recombinant AAVS having useful transcytosis properties
DK3116900T3 (da) * 2014-03-09 2020-09-28 Univ Pennsylvania Sammensætninger som kan anvendes til behandling af ornithintranscarbamylase (otc) defekt
AU2015231439B2 (en) 2014-03-17 2019-11-14 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
US10280418B2 (en) 2014-03-18 2019-05-07 Univeristy Of Massachusetts RAAV-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
SG11201607005UA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Genzyme Corp Gene therapy for retinitis pigmentosa
EP2933335A1 (en) 2014-04-18 2015-10-21 Genethon A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases
US10780182B2 (en) 2014-04-25 2020-09-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
ES2876409T3 (es) 2014-04-25 2021-11-12 Univ Pennsylvania Variantes del RLBD y su uso en composiciones para reducir los niveles de colesterol
EP3134522B1 (en) 2014-04-25 2021-10-06 University of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products
PL3142750T3 (pl) 2014-05-13 2021-03-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Kompozycje zawierające aav eksprymujące konstrukty podwójnych przeciwciał i ich zastosowania
WO2015187825A2 (en) 2014-06-03 2015-12-10 University Of Massachusetts Compositions and methods for modulating dysferlin expression
EP3151866B1 (en) 2014-06-09 2023-03-08 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
EP2960336A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Genethon Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
BR112016030730B1 (pt) 2014-07-03 2023-05-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Composto
EP4012035B1 (en) 2014-09-16 2024-11-06 Genzyme Corporation Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma
PT4012035T (pt) 2014-09-16 2025-02-11 Genzyme Corp Vetores virais adenoassociados para tratar o glaucoma de miocilina (mioc)
US10370432B2 (en) 2014-10-03 2019-08-06 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted AAVS
JP6842410B2 (ja) 2014-10-03 2021-03-17 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 新規の高効率ライブラリーにより同定されるａａｖベクター
EP3209311B1 (en) 2014-10-21 2024-03-06 University of Massachusetts Recombinant aav variants and uses thereof
CN107106689A (zh) 2014-11-05 2017-08-29 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森病的aadc多核苷酸
MX2017006217A (es) 2014-11-14 2018-05-02 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos moduladores.
IL292999A (en) 2014-11-14 2022-07-01 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
US11033638B2 (en) 2015-01-07 2021-06-15 Universität Autonoma De Barcelona Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes
HK1246815A1 (zh) 2015-01-16 2018-09-14 Voyager Therapeutics, Inc. 针对多核苷酸的中枢神经系统
IL310375B2 (en) 2015-01-20 2025-05-01 Genzyme Corp Analytical ultracentrifugation for characterization of recombinant viral particles
WO2016126857A1 (en) * 2015-02-03 2016-08-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant aav1, aav5, and aav6 capsid mutants and uses thereof
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
SG11201706445SA (en) 2015-02-10 2017-09-28 Genzyme Corp Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex
TN2017000354A1 (en) 2015-02-10 2019-01-16 Genzyme Corp VARIANT RNAi
EP3256170B1 (en) 2015-02-13 2020-09-23 University of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
AU2016226289B2 (en) 2015-03-02 2021-04-29 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
JP2018509164A (ja) 2015-03-10 2018-04-05 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 組換えＧｌｕｔ１アデノ随伴ウイルスベクターコンストラクトおよびＧｌｕｔ１発現を回復させる方法
WO2016154344A1 (en) 2015-03-24 2016-09-29 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
US11020443B2 (en) 2015-04-23 2021-06-01 University Of Massachusetts Modulation of AAV vector transgene expression
CA3021949C (en) 2015-04-24 2023-10-17 University Of Massachusetts Modified aav constructs and uses thereof
JP6851319B2 (ja) 2015-04-27 2021-03-31 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア ヒト疾患のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性の修正のためのデュアルＡＡＶベクター系
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
EP3307310A2 (en) 2015-05-13 2018-04-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof
RU2759335C2 (ru) 2015-05-16 2021-11-12 Джензим Корпорейшн Генное редактирование глубоких интронных мутаций
PL3313991T3 (pl) 2015-06-23 2024-11-04 The Children's Hospital Of Philadelphia Modyfikowany czynnik ix oraz kompozycje, sposoby i zastosowania do transferu genów do komórek, narządów i tkanek
ES3009026T3 (en) 2015-07-22 2025-03-25 Univ Duke High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
WO2017024198A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glp-1 and use thereof in compositions for treating metabolic diseases
ES2929110T3 (es) 2015-08-25 2022-11-24 Univ Duke Composiciones y métodos para mejorar la especificidad en ingeniería genética usando endonucleasas guiadas por ARN
CN108137664B (zh) 2015-08-31 2021-11-26 宾夕法尼亚州大学信托人 用于治疗伴侣动物的aav-epo
IL258024B2 (en) 2015-09-24 2023-03-01 Univ Pennsylvania A preparation and method for the treatment of a complement-mediated disease
JP7064214B2 (ja) 2015-09-28 2022-05-10 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 抗体回避性ウイルスベクターのための方法および組成物
WO2017062750A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful in treating stargardt's disease and other ocular disorders
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
CA3002980A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
ES2978086T3 (es) 2015-10-22 2024-09-05 Univ Massachusetts Terapia génica con aspartoacilasa en el tratamiento de enfermedad de Canavan
HK1257801A1 (zh) 2015-10-28 2019-11-01 宾夕法尼亚州大学信托人 用於基因治疗的腺伴随病毒载体的鞘内给药
US20180230489A1 (en) 2015-10-28 2018-08-16 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
JP2019502363A (ja) 2015-10-30 2019-01-31 エヌビーイー セラピューティクス アクチェン ゲゼルシャフト 抗ｒｏｒ１抗体
WO2017096162A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of aav neutralizing antibodies
FR3044926B1 (fr) 2015-12-09 2020-01-31 Genethon Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine
ES2921450T3 (es) 2015-12-11 2022-08-25 Univ Pennsylvania Terapia génica para el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar
ES2934848T3 (es) 2015-12-11 2023-02-27 Univ Pennsylvania Método de purificación escalable para AAV8
WO2017100674A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav1
US11098286B2 (en) 2015-12-11 2021-08-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for AAV9
ES2918998T3 (es) 2015-12-11 2022-07-21 Univ Pennsylvania Método de purificación escalable para AAVrh10
AU2016370590B2 (en) 2015-12-14 2023-11-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composition for treatment of Crigler-Najjar syndrome
WO2017106202A2 (en) 2015-12-14 2017-06-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for ocular disorders
WO2017106313A1 (en) 2015-12-15 2017-06-22 Genzyme Corporation Adeno-associated viral vectors for treating mucolipidosis type ii
SG11201804664XA (en) 2015-12-22 2018-07-30 Univ Texas Salt forms and polymorphs of (r)-1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorocyclobutoxy)-6-methylpyridin-2-yl) acetamido) pyridazin-3-yl)-2-fluorobutyl)-n-methyl-1h-1,2,3-triazole-4-carboxamide
UA125718C2 (uk) 2016-01-20 2022-05-25 Зе Скріппс Ресеарч Інстітьют Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи
SG10201913278PA (en) 2016-02-01 2020-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc Optimized factor viii genes
CA3011939A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-10 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system
JP7360241B2 (ja) 2016-02-03 2023-10-12 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア ムコ多糖症ｉ型を治療するための遺伝子治療
CA3012344A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 University Of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
WO2017151717A1 (en) * 2016-03-01 2017-09-08 French Brent A Compositions and methods for adeno-associated virus mediated gene expression in myofibroblast-like cells
US11207426B2 (en) 2016-04-05 2021-12-28 University Of Massachusetts Compositions and methods for selective inhibition of grainyhead-like protein expression
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
WO2017180915A2 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
WO2017180861A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsulvania Gene therapy for treating hemophilia b
IL298604A (en) * 2016-04-15 2023-01-01 Univ Pennsylvania Novel aav8 mutant capsids and compositions containing same
SG10201912761UA (en) 2016-04-15 2020-02-27 The Trustees Of The Univ Of Pennsyvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
PE20181922A1 (es) 2016-04-15 2018-12-11 Univ Pennsylvania Terapia genica para tratar la hemofilia a
WO2017181105A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance
EP3452103A1 (en) 2016-04-15 2019-03-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for treatment of wet age-related macular degeneration
US11401527B2 (en) 2016-04-17 2022-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful for prophylaxis of organophosphates
US11326182B2 (en) 2016-04-29 2022-05-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
GB201608046D0 (en) * 2016-05-09 2016-06-22 Cambridge Entpr Ltd And Syndey Children S Hospitals Network Randwick And Westmead Incorporating The Treatment of complement-mediated disorders
CR20180589A (es) 2016-05-13 2019-02-27 4D Molecular Therapeutics Inc Cápsulas variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de estas
EP3458589A4 (en) 2016-05-18 2020-01-01 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING MORBUS HUNTINGTON
MX2018014154A (es) 2016-05-18 2019-05-06 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos moduladores.
CN109313018B (zh) * 2016-06-08 2021-12-10 索尼公司 成像控制装置和方法、以及车辆
WO2017218852A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 University Of Massachusetts Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells
CN110177577A (zh) 2016-07-05 2019-08-27 马萨诸塞大学 Sfasl的aav2介导的基因递送作为青光眼的神经保护疗法
EP3481958A4 (en) 2016-07-08 2019-12-25 The Trustees of The University of Pennsylvania METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING DISTURBANCES AND DISEASES WITH RDH12
WO2018017754A1 (en) 2016-07-19 2018-01-25 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
WO2018022511A1 (en) 2016-07-25 2018-02-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions comprising a lecithin cholesterol acyltransferase variant and uses thereof
EP3491008A2 (en) * 2016-07-26 2019-06-05 BioMarin Pharmaceutical Inc. Novel adeno-associated virus capsid proteins
KR102511979B1 (ko) 2016-07-29 2023-03-20 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 변이체 캡시드를 갖는 아데노-관련된 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법
SG10201913002QA (en) 2016-08-15 2020-03-30 Genzyme Corp Methods for detecting aav
JP2019524162A (ja) 2016-08-18 2019-09-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア モジュラーＡＡＶ送達システムによるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集
JP2019531787A (ja) 2016-08-30 2019-11-07 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 生物医学的ターゲティング及びデリバリーの方法並びにそれを実行するための装置及びシステム
US10457940B2 (en) 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
WO2018064624A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aavrh.10 variants with host antibody escape capabilities and altered tissue targeting properties
KR20190075964A (ko) 2016-10-13 2019-07-01 유니버시티 오브 매사추세츠 Aav 캡시드 설계
AU2017345470B2 (en) 2016-10-19 2023-08-03 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified AAV capsids and uses thereof
ES2931960T3 (es) 2016-12-01 2023-01-05 Inst Nat Sante Rech Med Composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades degenerativas retinianas
US11584931B2 (en) 2016-12-14 2023-02-21 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for generating a deletion library and for identifying a defective interfering particle (DIP)
WO2018126112A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating phenylketonuria
AU2018210326B9 (en) 2017-01-20 2024-04-04 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Treatment of krabbe disease with umbilical cord blood transplantion (UCBT) and increased galactocerebrosidase (GALC) expression
KR20190118163A (ko) 2017-02-20 2019-10-17 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 유전자 요법
JP2020510430A (ja) 2017-02-28 2020-04-09 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖベクターに基づくインフルエンザワクチン
AU2018227440B2 (en) 2017-02-28 2024-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clade f vector and uses therefor
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
KR102545070B1 (ko) 2017-03-01 2023-06-19 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 안구 장애에 대한 유전자 치료
WO2018158397A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 Genethon Method for removing anti-aav antibodies from a blood-derived composition
CN118360335A (zh) 2017-04-05 2024-07-19 马萨诸塞大学 小基因治疗
US11499154B2 (en) 2017-04-10 2022-11-15 Genethon Antisense targeting dynamin 2 and use for the treatment of centronuclear myopathies and neuropathies
TW202532642A (zh) 2017-04-14 2025-08-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 使用由人類神經或膠細胞產生的重組人類艾杜糖醛酸鹽 (iduronate)-2-硫酸酯酶 (ids) 之黏多醣病ii之治療
EP3634986A4 (en) 2017-04-24 2021-09-08 The Trustees of The University of Pennsylvania GENE THERAPY FOR EYE DISORDERS
EP3618839A4 (en) 2017-05-05 2021-06-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN119491003A (zh) 2017-05-05 2025-02-21 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿病的组合物和方法
AU2018264996A1 (en) 2017-05-09 2019-12-05 University Of Massachusetts Methods of treating Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)
SG11201910015SA (en) 2017-05-11 2019-11-28 Univ Pennsylvania Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
WO2018209216A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 University Of Massachusetts Viral vector production
CN108103058A (zh) * 2017-05-12 2018-06-01 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种i型糖尿病的基因治疗药物
CA3098592A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating peroxisomal disorders
MX2019014760A (es) 2017-06-06 2020-08-03 Univ Massachusetts Vectores de aav autoregulables para la expresión segura de mecp2 en el síndrome de rett.
JP7766393B2 (ja) 2017-06-14 2025-11-10 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 眼疾患のための遺伝子療法
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
EP4302768A3 (en) * 2017-06-22 2024-05-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing regulatory immune cells and uses thereof
AU2018290954B2 (en) 2017-06-30 2023-07-13 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsids and methods of use thereof
KR20240063170A (ko) 2017-07-06 2024-05-09 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 I형 점액다당류증을 치료하기 위한 유전자 요법
JP7141417B2 (ja) 2017-07-07 2022-09-22 ジェネトン ヒトｆｋｒｐタンパク質をコードする新規ポリヌクレオチド
CA3070087A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
EP3662060A2 (en) 2017-08-03 2020-06-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
WO2019030240A1 (en) 2017-08-07 2019-02-14 Nbe-Therapeutics Ag ANTIBODIES BINDING TO A LINEAR HUMAN CS1 EPITOPE
US11680249B2 (en) * 2017-08-28 2023-06-20 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus capsid variants and methods of use thereof
KR20200052333A (ko) 2017-09-20 2020-05-14 4디 몰레큘러 테라퓨틱스 아이엔씨. 아데노-관련 바이러스 변이체 캡시드 및 그 용도
AU2018335752B2 (en) 2017-09-22 2025-04-10 Christian HINDERER Gene therapy for treating Mucopolysaccharidosis type ii
AU2018338188B2 (en) 2017-09-22 2025-02-20 University Of Massachusetts SOD1 dual expression vectors and uses thereof
IL273394B2 (en) 2017-09-22 2025-04-01 Genzyme Corp RNAI variant
EP3687582A4 (en) 2017-09-29 2021-07-14 Voyager Therapeutics, Inc. RESCUE OF CENTRAL AND PERIPHERAL NEUROLOGICAL PHENOTYPE OF FRIEDREICH ATAXIA BY INTRAVENOUS ADMINISTRATION
BR112020006671A2 (pt) * 2017-10-03 2020-12-01 Prevail Therapeutics, Inc. terapias genéticas para distúrbios lisossômicos
WO2019075320A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York INCARN OF SLC2A1 AS BIOLOGICAL SUBSTANCE, TREATMENTS AND ASSOCIATED METHODS
EP4454654A3 (en) 2017-10-16 2025-02-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN111479924B (zh) 2017-10-16 2024-06-14 沃雅戈治疗公司 肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗
JP2021501196A (ja) 2017-10-18 2021-01-14 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 完全ヒト翻訳後修飾抗体による治療剤
JP7361687B2 (ja) 2017-10-18 2023-10-16 ボード オブ レジェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム グルタミナーゼ阻害薬療法
CA3079565A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Regenxbio Inc. Treatment of ocular diseases and metastatic colon cancer with human post-translationally modified vegf-trap
WO2019104279A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
EP3717653A4 (en) 2017-11-30 2021-12-01 The Trustees of The University of Pennsylvania GENE THERAPY FOR MUCOPOLY SACCHARIDOSIS IIIA
KR20200104864A (ko) 2017-11-30 2020-09-04 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 뮤코다당류증 iiib형에 대한 유전자 요법
IL319982A (en) 2017-12-19 2025-05-01 Akouos Inc AAV virus-mediated delivery of therapeutic antibodies to the inner ear
JP2021512871A (ja) 2018-02-01 2021-05-20 ホモロジー・メディシンズ・インコーポレイテッド Ｐａｈ遺伝子機能を回復させるためのアデノ随伴ウイルス組成物及びそれらの使用方法
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
EP3755795A4 (en) 2018-02-19 2022-07-20 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for restoring f8 gene function and methods of use thereof
MX2020008932A (es) 2018-02-27 2020-10-01 Univ Pennsylvania Novedosos vectores de virus adenoasociado (aav), vectores de aav que tienen una desamidacion reducida de la capside y usos de estos.
WO2019173434A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
CA3094217A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 University Of Massachusetts Gene therapeutics for treating bone disorders
MX2020010464A (es) 2018-04-03 2021-01-29 Vectores de virus que evitan anticuerpos.
WO2019195444A1 (en) 2018-04-03 2019-10-10 Stridebio, Inc. Antibody-evading virus vectors
SG11202009450SA (en) 2018-04-03 2020-10-29 Stridebio Inc Virus vectors for targeting ophthalmic tissues
WO2019200016A1 (en) 2018-04-10 2019-10-17 President And Fellows Of Harvard College Aav vectors encoding clarin-1 or gjb2 and uses thereof
WO2019204226A1 (en) 2018-04-16 2019-10-24 University Of Massachusetts Compositions and methods for improved gene editing
JP7575273B2 (ja) 2018-04-16 2024-10-29 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための組成物及び方法
CN112368390B (zh) 2018-04-27 2024-12-06 火箭制药有限公司 Cns变性的基因疗法
EP3784290A4 (en) 2018-04-27 2022-03-23 University of Massachusetts AAV CAPSIDS IDENTIFIED BY IN VIVO LIBRARY SELECTION
WO2019212921A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Regenxbio Inc. Scalable clarification process for recombinant aav production
EP3788165A1 (en) 2018-04-29 2021-03-10 REGENXBIO Inc. Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome content, capsid content and full/empty ratios of adeno-associated virus particles
CA3098871A1 (en) 2018-05-08 2019-11-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Aav-compatible laminin-linker polymerization proteins
AU2019265560A1 (en) 2018-05-09 2020-11-26 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods of treating phenylketonuria
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
US20210230632A1 (en) 2018-05-15 2021-07-29 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
JP2021523914A (ja) 2018-05-15 2021-09-09 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． パーキンソン病を治療するための組成物および方法
WO2019222444A2 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
US20210207167A1 (en) 2018-05-16 2021-07-08 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
US12163129B2 (en) 2018-06-08 2024-12-10 University Of Massachusetts Antisense oligonucleotides to restore dysferlin protein expression in dysferlinopathy patient cells
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
US12060567B2 (en) 2018-06-13 2024-08-13 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered untranslated regions (UTR) for AAV production
AU2019285186B2 (en) 2018-06-14 2025-05-29 Regenxbio Inc. Anion exchange chromatography for recombinant AAV production
WO2020010042A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
GB201811368D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Ucb Biopharma Sprl Antibody
MX2021000443A (es) 2018-07-12 2021-05-28 Spacecraft Seven Llc Vectores de terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de danon.
AU2019304569B2 (en) 2018-07-17 2023-07-06 Helixmith Co., Ltd Treatment of neuropathy with DNA constructs expressing IGF-1 isoforms
AU2019310459A1 (en) 2018-07-24 2021-02-18 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
EP3831949A4 (en) * 2018-07-30 2022-05-04 Gene Therapy Research Institution Co., Ltd. METHODS OF INCREASING GENE EXPRESSION BY AN AAV VECTOR
AR114540A1 (es) 2018-08-03 2020-09-16 Genzyme Corp VARIANTE DE ARNi CONTRA a-SINUCLEÍNA
EP3833745A1 (en) 2018-08-10 2021-06-16 REGENXBIO Inc. Scalable method for recombinant aav production
SG11202102058UA (en) 2018-08-30 2021-03-30 Tenaya Therapeutics Inc Cardiac cell reprogramming with myocardin and ascl1
JP7528066B2 (ja) 2018-09-28 2024-08-05 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 操作されたプロモータを有するフラタキシン発現コンストラクトおよびその使用方法
WO2020069339A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 President And Fellows Of Harvard College Mutant reverse tetracycline transactivators for expression of genes
CA3113472A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 President And Fellows Of Harvard College Cellular reprogramming to reverse aging and promote organ and tissue regeneration
US12274733B2 (en) 2018-09-28 2025-04-15 President And Fellows Of Harvard College Cellular reprogramming to reverse aging and promote organ and tissue regeneration
MX2021003869A (es) 2018-10-01 2021-09-08 Univ Pennsylvania Composiciones útiles para tratar la gangliosidosis gm1.
AR116569A1 (es) 2018-10-01 2021-05-19 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Terapia génica para tratar la acidemia propiónica
US20210348242A1 (en) 2018-10-04 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
CA3115248A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins
US20210371470A1 (en) 2018-10-12 2021-12-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
JP2022504740A (ja) 2018-10-12 2022-01-13 ジェンザイム・コーポレーション 肝臓に向けられた遺伝子補充療法によって重度のｐｋｕを処置するための改善されたヒトｐａｈの生成
UY38407A (es) 2018-10-15 2020-05-29 Novartis Ag Anticuerpos estabilizadores de trem2
CN113166781A (zh) 2018-10-15 2021-07-23 沃雅戈治疗公司 在杆状病毒/Sf9系统中大规模生产rAAV的表达载体
US20210324483A1 (en) 2018-10-15 2021-10-21 Regenxbio Inc. Method for measuring the infectivity of replication defective viral vectors and viruses
MX2021004602A (es) 2018-10-22 2021-09-08 Univ Rochester Edición del genoma por inserción no homóloga de adn dirigida utilizando una proteína de fusión retroviral integrasacas9.
WO2020086742A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
EP3880823A4 (en) * 2018-11-16 2022-08-17 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus for treating pompe disease
SG11202105030VA (en) 2018-11-16 2021-06-29 Astellas Pharma Inc Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
EP3887522A1 (en) 2018-11-29 2021-10-06 University of Massachusetts Modulation of sptlc1 via recombinant adeno-associated vectors
WO2020140007A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 University Of Rochester Gene therapy for best1 dominant mutations
HRP20231750T1 (hr) 2019-01-04 2024-05-24 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Konstrukti genske terapije za liječenje wilsonove bolesti
CA3126481A1 (en) 2019-01-14 2020-07-23 University Of Rochester Targeted nuclear rna cleavage and polyadenylation with crispr-cas
SG11202107645RA (en) 2019-01-18 2021-08-30 Voyager Therapeutics Inc Methods and systems for producing aav particles
US20230193315A1 (en) 2019-01-31 2023-06-22 Oregon Health & Science University Methods for using transcription-dependent directed evolution of aav capsids
EP3927380A1 (en) 2019-02-22 2021-12-29 University of Massachusetts Oxr1 gene therapy
CA3129672A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant adeno-associated virus for treatment of grn-associated adult-onset neurodegeneration
WO2020174369A2 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
CN113710693B (zh) 2019-02-25 2025-07-15 马萨诸塞大学 Dna结合结构域反式激活因子及其用途
JP2022521025A (ja) 2019-02-25 2022-04-04 ノバルティス アーゲー Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症を治療するための組成物及び方法
TW202045728A (zh) 2019-02-26 2020-12-16 賓州大學委員會 用於治療克拉培氏病之組成物
US20220047618A1 (en) 2019-02-28 2022-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Adeno-associated virus vectors for the delivery of therapeutics
SG11202109554XA (en) 2019-03-04 2021-09-29 Univ Pennsylvania Neuroprotective gene therapy targeting the akt pathway
MX2021011468A (es) 2019-03-21 2021-12-15 Vectores de virus adenoasociados recombinantes.
CA3130196A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Isabelle Richard Production of large-sized quasidystrophins using overlapping aav vectors
JP7630176B2 (ja) 2019-04-01 2025-02-17 テナヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド 操作されたカプシドを有するアデノ随伴ウイルス
JP2022521851A (ja) 2019-04-03 2022-04-12 レジェンクスバイオ インコーポレーテッド 眼の病態に対する遺伝子療法
TW202102526A (zh) 2019-04-04 2021-01-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 重組腺相關病毒及其用途
PL3953483T3 (pl) 2019-04-11 2024-04-22 Regenxbio Inc. Sposoby chromatografii wykluczania do charakteryzowania kompozycji rekombinowanych wirusów towarzyszących adenowirusom
MX2021012540A (es) 2019-04-17 2022-01-18 Codiak Biosciences Inc Composiciones de exosomas y virus adenoasociados (aav).
EP3955973A4 (en) 2019-04-19 2023-01-18 University of Massachusetts GENE THERAPIES FOR STARGARDT'S DISEASE (ABCA4)
CN113993552A (zh) 2019-04-19 2022-01-28 再生生物股份有限公司 腺相关病毒载体制剂和方法
US20220195462A1 (en) 2019-04-24 2022-06-23 Regenxbio Inc. Fully-human post-translationally modified antibody therapeutics
US20220315948A1 (en) 2019-04-26 2022-10-06 President And Fellows Of Harvard College Aav vectors encoding mini-pcdh15 and uses thereof
TW202106879A (zh) 2019-04-29 2021-02-16 美商航海家醫療公司 於生物反應器中生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(biic)之系統及方法
US20220249705A1 (en) * 2019-04-29 2022-08-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel aav capsids and compositions containing same
SG11202111867XA (en) 2019-05-03 2021-11-29 Univ Pennsylvania Compositions useful in treatment of metachromatic leukodystrophy
WO2020227515A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
WO2020236815A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 University Of Massachusetts Minigene therapy
JP2022533438A (ja) * 2019-05-24 2022-07-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 改変ウイルス粒子およびその使用
US20220233721A1 (en) 2019-05-28 2022-07-28 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting dmpk gene
WO2020257684A1 (en) 2019-06-20 2020-12-24 University Of Massachusetts Compositions and methods for improved gene editing
CN114616000A (zh) 2019-07-02 2022-06-10 M6P医疗(瑞士)有限责任公司 载体组合物及其用于治疗溶酶体贮积症的方法
WO2021007473A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Masonic Medical Research Institute Vgll4 with ucp-1 cis-regulatory element and method of use thereof
EP3997225A1 (en) 2019-07-10 2022-05-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
US20230137971A1 (en) 2019-07-11 2023-05-04 Tenaya Therapeutics Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
WO2021005210A1 (en) 2019-07-11 2021-01-14 Centre National De La Recherche Scientifique Chemically-modified adeno-associated virus
US10557149B1 (en) * 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
US10653731B1 (en) * 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
WO2021016453A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 University Of Rochester Targeted rna cleavage with crispr-cas
US20220396806A1 (en) 2019-07-26 2022-12-15 Akouos, Inc. Methods of treating hearing loss using a secreted target protein
WO2021021661A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory element and methods of uses thereof
EP4010465A1 (en) 2019-08-09 2022-06-15 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
WO2021030764A1 (en) * 2019-08-14 2021-02-18 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav capsid variants for gene therapy
TW202122582A (zh) 2019-08-26 2021-06-16 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
JP2022545967A (ja) 2019-08-26 2022-11-01 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 完全ヒト翻訳後修飾抗ＶＥＧＦ Ｆａｂを用いる糖尿病性網膜症の処置
CA3152288A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of disorders associated with repetitive dna
WO2021046155A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
US20220348937A1 (en) 2019-09-06 2022-11-03 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
KR20220079857A (ko) 2019-09-13 2022-06-14 루트거스, 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴 저지 Aav-상용성 라미닌-링커 중합 단백질
EP4031673A1 (en) 2019-09-19 2022-07-27 Genethon Gene therapy expression system alleviating cardiac toxicity of fkrp
WO2021062096A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Microrna-based logic gates and uses thereof
WO2021062092A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Trans-activated functional rna by strand displacement and uses thereof
KR20220097891A (ko) 2019-09-30 2022-07-08 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 렌티바이러스 벡터 제형
US20220347298A1 (en) 2019-10-04 2022-11-03 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods for improved therapeutic use of recombinant aav
CA3156984A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Regenxbio Inc. Adeno-associated virus vector pharmaceutical composition and methods
EP4045665A4 (en) 2019-10-15 2023-11-15 University of Massachusetts RNA EDITOR ENHANCED RNA TRANS-SPLICING
CN118221785A (zh) * 2019-10-16 2024-06-21 上海药明康德新药开发有限公司 新的aav变体
EP4045525A1 (en) 2019-10-17 2022-08-24 Stridebio, Inc. Adeno-associated viral vectors for treatment of niemann-pick disease type c
CN114829391A (zh) 2019-11-14 2022-07-29 生物马林药物股份有限公司 用肝特异性基因疗法载体治疗遗传性血管性水肿
WO2021099394A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
CA3159516A1 (en) * 2019-11-28 2021-06-03 Chunping Qiao Microdystrophin gene therapy constructs and uses thereof
CA3164189A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adeno associated virus vectors for the treatment of hunter disease
CN116096904A (zh) 2019-12-31 2023-05-09 天鹅生物疗法有限公司 改进的aav-abcd1构建体和用于治疗或预防肾上腺脑白质营养不良(ald)和/或肾上腺脊髓神经病(amn)的用途
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
CA3167685A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis i with fully-human glycosylated human alpha-l-iduronidase (idua)
JP2023512043A (ja) 2020-01-29 2023-03-23 レジェンクスバイオ インコーポレーテッド ムコ多糖症ｉｖａの治療
WO2021154963A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis ii with recombinant human iduronate-2-sulfatase (ids) produced by human neural or glial cells
CA3165713A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Andrew Scharenberg Bispecific transduction enhancer
CN115867323A (zh) 2020-02-02 2023-03-28 宾夕法尼亚州大学信托人 可用于治疗gm1神经节苷脂症的组成物
EP4100424A2 (en) 2020-02-07 2022-12-14 University of Rochester Targeted translation of rna with crispr-cas13 to enhance protein synthesis
WO2021158964A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 University Of Rochester Ribozyme-mediated rna assembly and expression
US20230054144A1 (en) 2020-02-14 2023-02-23 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating cdkl5 deficiency disorder
WO2021173647A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 University Of Massachusetts Inducible single aav system and uses thereof
BR112022016965A2 (pt) * 2020-02-25 2022-12-06 Childrens Medical Res Institute Polipeptídeos e vetores de capsídeo do vírus adenoassociado
WO2021178246A1 (en) 2020-03-02 2021-09-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene vector control by cardiomyocyte-expressed micrornas
EP4127169A1 (en) 2020-03-27 2023-02-08 University of Rochester Targeted destruction of viral rna by crispr-cas13
JP2023519576A (ja) 2020-03-27 2023-05-11 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル 自律ノブドメインペプチド
JP2023519344A (ja) 2020-03-27 2023-05-10 ユニバーシティ オブ ロチェスター ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ ｃｒＲＮＡアレイ
TW202204377A (zh) 2020-03-31 2022-02-01 麻州大學 蛋白殼變體及其用途
EP4127189A1 (en) 2020-03-31 2023-02-08 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating propionic acidemia
AR122409A1 (es) 2020-04-03 2022-09-07 Biomarin Pharm Inc Tratamiento de la fenilcetonuria con aav y formulaciones terapéuticas
KR20220167324A (ko) 2020-04-10 2022-12-20 솔라 바이오사이언시즈 엘엘씨 단백질 응집 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법
IL297200A (en) 2020-04-15 2022-12-01 Voyager Therapeutics Inc tau binding compounds
CN115836129A (zh) 2020-04-28 2023-03-21 索拉生物科学有限公司 用于治疗tdp-43蛋白病的组合物和方法
BR112022022212A2 (pt) 2020-05-12 2022-12-13 Univ Pennsylvania Composições para redução específica de drg de expressão de transgene
WO2021231443A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of krabbe disease
EP4165194A2 (en) 2020-05-13 2023-04-19 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss
TW202208405A (zh) 2020-05-13 2022-03-01 美商阿科奧斯公司 用於治療ｓｌｃ２６ａ４相關聽力損失之組合物及方法
WO2021230385A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
WO2021247995A2 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating neuropathic pain
CN116096737A (zh) 2020-06-05 2023-05-09 索拉生物科学有限公司 用于治疗突触核蛋白病的组合物和方法
CN115968302A (zh) 2020-06-17 2023-04-14 宾夕法尼亚州大学信托人 用于治疗基因疗法患者的组合物和方法
CA3182313A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Isabelle Richard Gene therapy expression system allowing an adequate expression in the muscles and in the heart of sgcg
BR112022026127A2 (pt) 2020-06-24 2023-01-17 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos para remoção de fator viii livre de preparações de vetores lentivirais modificados para expressar referida proteína
CA3184923A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 William LOSTAL A novel muscle-specific promoter
EP4179091A1 (en) 2020-07-10 2023-05-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale - Inserm Methods and compositions for treating epilepsy
US20230270884A1 (en) 2020-07-13 2023-08-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful for treatment of charcot-marie-tooth disease
US20230348871A1 (en) 2020-07-15 2023-11-02 University Of Rochester Targeted RNA cleavage with dCas13-RNase Fusion Proteins
WO2022017630A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Ucl Business Ltd GENE THERAPY VECTOR FOR eEF1A2 AND USES THEREOF
WO2022026410A2 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Voyager Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease
AU2021315876A1 (en) 2020-07-27 2023-02-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
WO2022032153A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
JP2023538519A (ja) 2020-08-07 2023-09-08 スペースクラフト セブン リミテッド ライアビリティ カンパニー Ａａｖベクターを使用したプラコフィリン－２（ｐｋｐ２）遺伝子治療
AU2021320419A1 (en) 2020-08-07 2023-03-09 Amicus Therapeutics, Inc. Vesicle targeting proteins and uses of same
CN114075610B (zh) * 2020-08-11 2023-11-17 北京荷塘生华医疗科技有限公司 检测野生型腺相关病毒的通用引物及其应用
KR20230051208A (ko) 2020-08-14 2023-04-17 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 신규 aav 캡시드 및 이를 함유하는 조성물
CA3189878A1 (en) 2020-08-19 2022-02-24 Colin O'BANION Adeno-associated virus vectors for treatment of rett syndrome
GB202013194D0 (en) 2020-08-24 2020-10-07 Combigene Ab Gene therapy for lipodystrophy
WO2022046815A1 (en) 2020-08-24 2022-03-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Viral vectors encoding glp-1 receptor agonist fusions and uses thereof in treating metabolic diseases
BR112023002904A2 (pt) 2020-08-26 2023-04-25 Univ Pennsylvania Vírus adenoassociado recombinante para tratar neurodegeneração com início na idade adulta associada a grn
US20220096606A1 (en) 2020-09-09 2022-03-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and Methods for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
CN116323641A (zh) 2020-09-10 2023-06-23 路德维希-马克西米利安慕尼黑大学 工程化的aav载体
US12129287B2 (en) 2020-09-14 2024-10-29 President And Fellows Of Harvard College Recombinant adeno associated virus encoding clarin-1 and uses thereof
EP4213890A1 (en) 2020-09-15 2023-07-26 RegenxBio Inc. Vectorized lanadelumab and administration thereof
EP4214242A1 (en) 2020-09-15 2023-07-26 RegenxBio Inc. Vectorized antibodies for anti-viral therapy
US20230383278A1 (en) 2020-09-18 2023-11-30 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Novel adeno-associated viral (aav) vectors to treat hereditary methylmalonic acidemia (mma) caused by methylmalonyl-coa mutase (mmut) deficiency
US11401531B2 (en) 2020-09-24 2022-08-02 University Of Massachusetts AAV vectors encoding NF1 and uses thereof
TWI900667B (zh) 2020-10-01 2025-10-11 美商健臻公司 藉由肝導向基因替代療法治療pku之人類pah表現匣
MX2023004005A (es) 2020-10-07 2023-06-06 Regenxbio Inc Formulaciones para administración supracoroidea tales como formulaciones de gel.
US20230372538A1 (en) 2020-10-07 2023-11-23 Regenxbio Inc. Formulations for suprachoroidal administration such as formulations with aggregate formation
US20230364206A1 (en) 2020-10-07 2023-11-16 Regenxbio Inc. Gene therapy for ocular manifestations of cln2 disease
WO2022076750A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns or muscle delivery
CA3198372A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Formulations for suprachoroidal administration such as high viscosity formulations
AU2021356667A1 (en) 2020-10-07 2023-06-08 Regenxbio Inc. Adeno-associated viruses for ocular delivery of gene therapy
US11781156B2 (en) 2020-10-09 2023-10-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions
WO2022076803A1 (en) 2020-10-09 2022-04-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of fabry disease
CA3195553A1 (en) 2020-10-18 2022-04-21 Qiang Wang Improved adeno-associated virus (aav) vector and uses therefor
WO2022094078A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of rett syndrome
JP2023547832A (ja) 2020-10-28 2023-11-14 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 眼の適応症に対するベクター化抗ＴＮＦ－α抗体
WO2022094157A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Regenxbio Inc. Vectorized anti-cgrp and anti-cgrpr antibodies and administration thereof
KR20230098176A (ko) 2020-10-29 2023-07-03 리젠엑스바이오 인크. 안구 적응증을 위한 벡터화된 tnf-알파 길항제
WO2022094255A2 (en) 2020-10-29 2022-05-05 Regenxbio Inc. Vectorized factor xii antibodies and administration thereof
US20230414648A1 (en) 2020-11-06 2023-12-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and Methods for Treatment of DM1 with SLUCAS9 and SACAS9
CN112322791B (zh) * 2020-11-27 2023-10-27 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
KR20230117157A (ko) 2020-12-01 2023-08-07 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 조직 특이적 표적화 모티프를 갖는 신규 조성물 및 이를 포함하는 조성물
KR20230128001A (ko) 2020-12-01 2023-09-01 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 엔젤만 증후군의 치료를 위한 조성물 및 이의 용도
CR20230228A (es) 2020-12-01 2023-07-18 Akouos Inc Construcciones de anticuerpos anti-vegf y métodos relacionados para el tratamiento de los síntomas asociados al schwannoma vestibular
KR20230120128A (ko) 2020-12-16 2023-08-16 리젠엑스바이오 인크. 재조합 바이러스 입자의 생산 방법
US20240309076A1 (en) 2020-12-29 2024-09-19 Regenxbio Inc. Tau-specific antibody gene therapy compositions, methods and uses thereof
JP2024500786A (ja) 2020-12-29 2024-01-10 アコーオス インコーポレイテッド Ｃｌｒｎ１関連難聴及び／または視力低下を治療するための組成物及び方法
WO2022155500A1 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Senti Biosciences, Inc. Secretable payload regulation
KR20230133314A (ko) 2021-01-21 2023-09-19 리젠엑스바이오 인크. 재조합 폴리펩티드 및 바이러스의 개선된 생산
WO2022159722A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Massachusetts Use of novel mirna-binding site cassettes for antigen-presenting cell detargeting of transgene expression by raav gene therapy vectors
US20240141375A1 (en) 2021-01-27 2024-05-02 Umoja Biopharma, Inc. Lentivirus for generating cells expressing anti-cd19 chimeric antigen receptor
MX2023008826A (es) 2021-02-01 2023-09-15 Regenxbio Inc Terapia génica para lipofuscinosis neuronal ceroidea.
MX2023009118A (es) 2021-02-10 2023-10-18 Regenxbio Inc Tratamiento de la mucopolisacaridosis ii con iduronato-2-sulfatasa (ids) humana recombinante.
GB202101958D0 (en) 2021-02-12 2021-03-31 Ucl Business Ltd Gene therapy for dopamine transporter deficiency syndrome
WO2022182957A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/sacas9
TW202246510A (zh) 2021-02-26 2022-12-01 美商維泰克斯製藥公司 以crispr/slucas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法
JP2024509792A (ja) 2021-02-26 2024-03-05 武田薬品工業株式会社 ファブリー病の治療のための組成物及び方法
WO2022187473A2 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
US20240141378A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
EP4314303A2 (en) 2021-03-22 2024-02-07 Genzyme Corporation Size exclusion chromatography analysis of empty and full aav capsids
EP4314295A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Nucleotide editing to reframe dmd transcripts by base editing and prime editing
MX2023012052A (es) 2021-04-12 2024-03-15 Univ Pennsylvania Composiciones útiles para tratar la atrofia muscular espinal y bulbar (sbma).
WO2022226263A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel compositions with brain-specific targeting motifs and compositions containing same
AU2022261125A1 (en) 2021-04-23 2023-11-23 University Of Rochester Genome editing by directed non-homologous dna insertion using a retroviral integrase-cas fusion protein and methods of treatment
WO2022229851A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences
KR20240004564A (ko) 2021-04-26 2024-01-11 리젠엑스바이오 인크. 디스트로핀병증의 치료를 위한 마이크로디스트로핀 유전자 치료법 투여
WO2022232041A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 University Of Massachusetts Gene therapies for stargardt disease (abca4)
WO2022235614A2 (en) 2021-05-04 2022-11-10 Regenxbio Inc. Novel aav vectors and methods and uses thereof
WO2022234519A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
WO2022241030A1 (en) 2021-05-11 2022-11-17 Regenxbio Inc. Treatment of duchenne muscular dystrophy and combinations thereof
WO2022272296A2 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus packaging systems
AU2022301302A1 (en) 2021-07-01 2024-01-25 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and related methods
US20240318157A1 (en) 2021-07-01 2024-09-26 Amicus Therapeutics, Inc. Neurotensin Variants And Tagged Proteins Comprising Neurotensin Or Sortilin Propeptide
IL309742A (en) 2021-07-08 2024-02-01 Tenaya Therapeutics Inc Optimal expression cassettes for gene therapy
CA3226452A1 (en) 2021-07-19 2023-01-26 New York University Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease
EP4377460A1 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
CA3227103A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Matthew P. GEMBERLING Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
WO2023018637A1 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene editing of regulatory elements
MX2024001208A (es) 2021-08-11 2024-04-22 Sana Biotechnology Inc Celulas primarias geneticamente modificadas para terapia celular alogenica.
EP4384598A1 (en) 2021-08-11 2024-06-19 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
AU2022325955A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
WO2023019226A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
EP4396237A4 (en) 2021-08-31 2025-11-19 Scout Bio Inc Antigen-binding molecules and their uses
EP4399302A2 (en) 2021-09-08 2024-07-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy
IL311572A (en) 2021-09-30 2024-05-01 Akouos Inc Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss
AR127217A1 (es) 2021-10-01 2023-12-27 Biomarin Pharm Inc Tratamiento de angioedema hereditario con vectores de genoterapia de aav y formulaciones terapéuticas
WO2023056399A1 (en) 2021-10-02 2023-04-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel aav capsids and compositions containing same
WO2023060113A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
CN118202060A (zh) 2021-10-05 2024-06-14 再生生物股份有限公司 用于重组aav生产的组合物和方法
EP4413019A2 (en) 2021-10-07 2024-08-14 RegenxBio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
US20250001006A1 (en) 2021-10-07 2025-01-02 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for targeted delivery
EP4413023A1 (en) 2021-10-08 2024-08-14 SOLA Biosciences LLC Compositions and methods for the treatment of p53-mediated cancers
US20250042958A1 (en) 2021-10-08 2025-02-06 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of proteopathies
WO2023070019A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hypoimmune cells
WO2023077092A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
WO2023087019A2 (en) 2021-11-15 2023-05-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
EP4437113A1 (en) 2021-11-23 2024-10-02 University of Massachusetts Gene therapy for spinal muscular atrophy
US20250064978A1 (en) 2021-11-30 2025-02-27 Jaguar Gene Therapy, Llc Gene therapy methods for treatment of diabetes
WO2023102517A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of fabry disease
WO2023111348A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Centre National De La Recherche Scientifique Peptides and methods for use in treating pain
WO2023125481A1 (zh) 2021-12-28 2023-07-06 成都弘基生物科技有限公司 经过修饰的aav衣壳蛋白及其用途
AR128239A1 (es) 2022-01-10 2024-04-10 Univ Pennsylvania Composiciones y métodos útiles para el tratamiento de trastornos mediados por c9orf72
US20250084129A1 (en) * 2022-01-10 2025-03-13 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav5 capsid variants
TW202338086A (zh) 2022-01-10 2023-10-01 賓州大學委員會 有用於治療異染性白質失養症之組成物
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4215614A1 (en) 2022-01-24 2023-07-26 Dynacure Combination therapy for dystrophin-related diseases
CN119317718A (zh) 2022-01-25 2025-01-14 宾夕法尼亚州大学信托人 用于改善心脏转导和肝脏去靶向的aav衣壳
EP4473011A1 (en) 2022-02-02 2024-12-11 Akouos, Inc. Anti-vegf antibody constructs and related methods for treating vestibular schwannoma associated symptoms
US20250144235A1 (en) 2022-02-02 2025-05-08 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4476241A1 (en) 2022-02-08 2024-12-18 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
WO2023156530A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Lysogene Gene therapy for neurodegenerative diseases
WO2023172926A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy
TW202345911A (zh) 2022-03-08 2023-12-01 美商維泰克斯製藥公司 用於治療杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)之部分外顯子44、50及53之精確切除
US20250101382A1 (en) 2022-03-11 2025-03-27 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells and compositions and uses thereof
US20250207126A1 (en) 2022-03-13 2025-06-26 Regenxbio Inc. Modified muscle-specific promoters
WO2023183623A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Regenxbio Inc. Dominant-negative tumor necrosis factor alpha adeno-associated virus gene therapy
EP4504950A1 (en) 2022-04-01 2025-02-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy for diseases with cns manifestations
KR20250007064A (ko) 2022-04-06 2025-01-13 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 Her2 양성 전이성 유방암 및 기타 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
AU2023248463A1 (en) 2022-04-06 2024-11-28 Genzyme Corporation Targeted gene therapy for dm-1 myotonic dystrophy
JP2025512962A (ja) 2022-04-06 2025-04-22 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 上脈絡膜投与のための導入遺伝子をコードする発現カセットを有する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含む医薬組成物
EP4504258A1 (en) 2022-04-06 2025-02-12 The Trustees of the University of Pennsylvania Passive immunization with anti- aav neutralizing antibodies to prevent off-target transduction of intrathecally delivered aav vectors
TW202345913A (zh) 2022-04-06 2023-12-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如凝膠調配物
TW202404651A (zh) 2022-04-06 2024-02-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如形成聚集體之調配物
WO2023196851A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 President And Fellows Of Harvard College Reversing aging of the central nervous system
TW202404993A (zh) 2022-04-11 2024-02-01 美商特納亞治療股份有限公司 具經工程化蛋白殼之腺相關病毒
US20250332286A1 (en) 2022-04-11 2025-10-30 Centre National De La Recherche Scientifique Chemically-modified adeno-associated viruses
CA3246384A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Fundació Hospital Universitari Vall D'hebron - Institut De Recerca TREATMENT OF NEUROMUSCULAR DISEASES BY GENE THERAPY EXPRESSING THE KLOTHO PROTEIN
WO2023201277A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
WO2023201308A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Regenxbio Inc. Gene therapy for treating an ocular disease
TW202405173A (zh) 2022-04-18 2024-02-01 美商維泰克斯製藥公司 用於增強aav療法及降低aav向肝臟之趨性的組合物及方法
TW202417633A (zh) 2022-05-03 2024-05-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於眼適應症之載體化抗TNF-α抑制劑
TW202400803A (zh) 2022-05-03 2024-01-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 載體化抗補體抗體與補體劑及其投與
WO2023214346A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Novartis Ag Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides
AR129441A1 (es) 2022-05-25 2024-08-28 Tafalgie Therapeutics Péptidos y métodos para el tratamiento del dolor
WO2023239627A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Regenxbio Inc. Methods for recombinant aav production
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders
IL317874A (en) 2022-06-24 2025-02-01 Tune Therapeutics Inc Compounds, systems and methods for reducing low density lipoproteins through targeted gene suppression
WO2024006770A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Astellas Gene Therapies, Inc. Compositions and methods for the treatment of myotonic dystrophies
AR129733A1 (es) 2022-06-28 2024-09-25 Voyager Therapeutics Inc Variantes de cápsides de aav y sus usos
KR20250060188A (ko) 2022-06-30 2025-05-07 인답타 세라뷰틱스 인코포레이티드 조작된 자연 살해(nk) 세포 및 항체 요법의 조합 및 관련 방법
AR129843A1 (es) 2022-07-06 2024-10-02 Voyager Therapeutics Inc Variantes de la cápside de aav y usos de estas
CA3261865A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. TARGETED TRANSCRIPTIONAL ACTIVATION COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS
EP4558634A1 (en) 2022-07-18 2025-05-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing
EP4558149A1 (en) 2022-07-21 2025-05-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders
US20260027145A1 (en) 2022-07-27 2026-01-29 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors
CN115354049A (zh) * 2022-07-29 2022-11-18 中国科学院深圳先进技术研究院 一种基因递送系统在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用
WO2024044725A2 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses and uses thereof
EP4577249A1 (en) 2022-08-25 2025-07-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited Composition for use in the treatment of fabry disease
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2024064863A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of arrhythmogenic cardiomyopathy with aav gene therapy vectors
EP4590839A1 (en) 2022-09-22 2025-07-30 Dinaqor AG Treatment of cardiomyopathy with aav gene therapy vectors
KR20250099772A (ko) 2022-09-30 2025-07-02 리젠엑스바이오 인크. 항-vegf fab를 암호화하는 재조합 바이러스 벡터를 이용한 안구 질환의 치료
JP2025534666A (ja) 2022-10-11 2025-10-17 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 操作された核酸調節エレメントならびにその使用方法
WO2024105638A1 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Recombinant aav vectors and methods for treatment of hunter syndrome
WO2024130070A2 (en) 2022-12-17 2024-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav capsids with cardiac- and skeletal muscle- specific targeting motifs and uses thereof
WO2024130067A2 (en) 2022-12-17 2024-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav mutant vectors with cardiac and skeletal muscle-specific targeting motifs and compositions containing same
IT202200026595A1 (it) 2022-12-22 2024-06-22 Fond Telethon Ets Nuovi inibitori di regolatori epigenetici
CN120752339A (zh) 2023-01-06 2025-10-03 国家医疗保健研究所 静脉内施用用于治疗疼痛的反义寡核苷酸
US12252518B2 (en) 2023-01-06 2025-03-18 Life Biosciences, Inc. Methods of treating non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy
WO2024151541A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Sana Biotechnology, Inc. Type-1 diabetes autoimmune mouse
EP4649160A1 (en) 2023-01-12 2025-11-19 Nantes Université Chemically-modified adeno-associated virus
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
WO2024163012A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
AR131771A1 (es) 2023-02-03 2025-04-30 Janssen Pharmaceutica Nv Vectores de terapia génica para su uso en la enfermedad de parkinson
GB202302480D0 (en) 2023-02-22 2023-04-05 Drishti Discoveries Ltd shRNA for the treatment of disease
CN116286988A (zh) * 2023-03-03 2023-06-23 西咸新区沣厚原创医药科技有限公司 一种稳定表达冠状病毒3cl蛋白酶的腺相关病毒体系、动物模型及构建方法和应用
WO2024192281A2 (en) 2023-03-15 2024-09-19 Regenxbio Inc. Exon skipping gene therapy constructs, vectors and uses thereof
CN120882872A (zh) 2023-03-17 2025-10-31 罗切斯特大学 核酶介导的rna组装和表达
WO2024211780A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2024215655A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective bag3 therapies
WO2024215653A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Guide rnas, vectors, and virions for targeting mutations in the pln gene
CN116622908B (zh) * 2023-04-13 2024-02-06 武汉珈创生物技术股份有限公司 快速检测野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用
WO2024216244A2 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Regenxbio Inc. Targeting aav capsids, methods of manufacturing and using same
US20240392318A1 (en) 2023-04-26 2024-11-28 Sanofi Host cell lines and methods for identifying and using such host cell lines
WO2024228938A1 (en) * 2023-05-01 2024-11-07 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified aav p5 promoter for improved vector titer and purity
AU2024264889A1 (en) 2023-05-03 2025-11-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of dosing and administration of engineered islet cells
WO2024229309A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Manifold Biotechnologies, Inc. Methodsand compositions for high-throughput protein delivery, screening, and detection
WO2024233529A2 (en) 2023-05-07 2024-11-14 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2024233999A2 (en) 2023-05-11 2024-11-14 University Hospitals Cleveland Medical Center Anxiolytic therapy
WO2024233791A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Seelos Therapeutics, Inc. Methods of treating neurodegenerative disorders
WO2024238859A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Vectorized c5 inhibitor agents and administration thereof
WO2024238853A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Adeno-associated viruses for ocular delivery of gene therapy
AU2024271004A1 (en) 2023-05-16 2026-01-15 Regenxbio Inc. Vectorized anti-complement antibodies and administration thereof
WO2024243236A2 (en) 2023-05-22 2024-11-28 Sana Biotechnology, Inc. Methods of delivery of islet cells and related methods
WO2024241176A1 (en) 2023-05-24 2024-11-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Recombinant aav vectors and methods for treatment of diseases with central nervous system disorders
WO2024243563A1 (en) 2023-05-25 2024-11-28 Juno Therapeutics, Inc. Aav purification method
WO2024258961A1 (en) 2023-06-12 2024-12-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav gene therapy for mucopolysaccharidosis iiib
AR133098A1 (es) 2023-06-29 2025-08-27 Univ Pennsylvania Aav mutante con motivos dirigidos al sistema nervioso central y composiciones que lo contienen
WO2025008406A1 (en) 2023-07-04 2025-01-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
WO2025017168A1 (en) 2023-07-19 2025-01-23 Genethon Novel optimized utrophin micro-genes
WO2025017169A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 Genethon Novel mididystrophins
WO2025035143A1 (en) 2023-08-10 2025-02-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of spinal muscular atrophy
WO2025038430A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2025072604A1 (en) 2023-09-28 2025-04-03 University Of Rochester Rna-editing gene therapy approaches for treating myotonic dystrophy type 1 (dm1)
WO2025075963A1 (en) 2023-10-02 2025-04-10 Regenxbio Inc. Methods and formulations for treating mucopolysaccharidosis ii-associated hearing loss with recombinant human iduronate-2-sulfatase
WO2025080780A1 (en) 2023-10-10 2025-04-17 University Of Rochester Delivery and expression of prime editing crispr systems
WO2025090962A1 (en) 2023-10-25 2025-05-01 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2025090858A1 (en) 2023-10-27 2025-05-01 Biogen Ma Inc. Methods for identifying aav capsid variants with desired characteristics
WO2025102034A1 (en) 2023-11-10 2025-05-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for barth syndrome
WO2025106374A1 (en) 2023-11-13 2025-05-22 Juno Therapeutics, Inc. Aav production method
WO2025106661A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions with cardiac and skeletal musclespecific targeting motifs and uses thereof
WO2025108407A2 (en) 2023-11-23 2025-05-30 Neuexcell Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Gene therapy compositions and methods for treating glioma
WO2025113676A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 Neuexcell Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treating stroke in primates
WO2025128817A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting tau
WO2025129157A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treatment of canavan disease
WO2025137219A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
WO2025147436A1 (en) 2024-01-03 2025-07-10 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2025160429A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting snca
WO2025160434A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting huntington's disease
WO2025179007A1 (en) * 2024-02-21 2025-08-28 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus compositions and methods of use thereof for human cells
WO2025188625A1 (en) 2024-03-03 2025-09-12 Passage Bio, Inc. Recombinant adeno-associated virus for treatment of neurodegenerative disorders
WO2025217230A1 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Regenxbio Inc. Vectorized anti-complement antibodies and complement agents and administration thereof
WO2025217214A2 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses and uses thereof
WO2025214477A1 (en) 2024-04-12 2025-10-16 Skyline Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Treatment of genetic cardiomyopathies with aav gene therapy vectors
CN118459608B (zh) * 2024-04-26 2025-01-24 泰州博莱得利生物科技有限公司 犬细小病毒特异性免疫制剂、制备方法和应用
WO2025237990A1 (en) 2024-05-14 2025-11-20 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of pulmonary fibrosis
WO2026006341A1 (en) 2024-06-24 2026-01-02 Regenxbio Inc. Microdystrophin gene therapy administration for treatment of dystrophinopathies
CN118460614B (zh) * 2024-07-05 2025-03-11 凌意(杭州)生物科技有限公司 一种腺相关病毒Cap蛋白的表达框
CN120249230B (zh) * 2025-06-05 2025-11-07 鼐济医药科技(杭州)有限公司 一种用于同时生产多种重组腺相关病毒的方法

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8929110D0 (en) * 1989-12-22 1990-02-28 3I Res Expl Ltd Polypeptides and dna encoding therefor
US5449616A (en) 1990-05-23 1995-09-12 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid encoding dystrophin-associated protein
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
CA2046745A1 (en) 1991-07-10 1993-01-11 Isaac Neuman Article including a container containing at least one precious stone
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US6001650A (en) * 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
EP0850313B8 (en) * 1995-09-08 2009-07-29 Genzyme Corporation Improved aav vectors for gene therapy
EP0870044B1 (en) * 1995-12-01 2004-04-14 Crucell Holland B.V. Regulated protein expression in stably transfected mammalian cells
US20020037867A1 (en) * 1999-02-26 2002-03-28 James M. Wilson Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US5866552A (en) * 1996-09-06 1999-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for expressing a gene in the absence of an immune response
AU723497C (en) 1996-09-06 2001-10-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
AU722624B2 (en) 1996-09-06 2000-08-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase
EP0950111A1 (en) * 1996-09-06 1999-10-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses
US6083716A (en) 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
US20030215422A1 (en) * 1996-09-11 2003-11-20 John A. Chiorini Aav4 vector and uses thereof
ES2215222T3 (es) * 1996-12-05 2004-10-01 Crucell Holland B.V. Modificacion genetica de celulas cepa de repoblacion hematopoyeticas de primates.
US6039942A (en) * 1996-12-20 2000-03-21 Novo Nordick A/S Phytase polypeptides
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6251677B1 (en) * 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
WO1999015677A1 (en) 1997-09-19 1999-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for gene transfer using bcl2 and compositions useful therein
CA2304168A1 (en) * 1997-09-19 1999-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
CA2303768C (en) 1997-09-19 2009-11-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
US6953690B1 (en) 1998-03-20 2005-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
AU3097399A (en) 1998-03-20 1999-10-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
ES2313784T3 (es) 1998-05-28 2009-03-01 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Vector aav5 y usos del mismo.
US6210663B1 (en) 1998-08-20 2001-04-03 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting
AU768729B2 (en) * 1998-11-05 2004-01-08 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
US6759237B1 (en) * 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
US6387368B1 (en) * 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
JP4693244B2 (ja) * 1999-03-18 2011-06-01 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法
EP1183380A1 (en) 1999-06-02 2002-03-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful for production of recombinant viruses which require helper viruses
AU781478B2 (en) * 1999-08-20 2005-05-26 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
US6365394B1 (en) * 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
US6399385B1 (en) * 1999-09-29 2002-06-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for rapid PEG-modification of viral vectors, compositions for enhanced gene transduction, compositions with enhanced physical stability, and uses therefor
EP1234048A2 (en) 1999-12-03 2002-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for increasing packaging and yields of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals
US6821512B1 (en) 1999-12-03 2004-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for increasing packaging and yield of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals
EP1228234A2 (en) * 2000-03-14 2002-08-07 Neurologix, Inc. Production of chimeric capsid vectors
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
US6468524B1 (en) * 2000-03-22 2002-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services AAV4 vector and uses thereof
US7056502B2 (en) * 2000-04-28 2006-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with AAV5 capsids and AAV5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
AU2001289177A1 (en) * 2000-08-30 2002-03-13 Haplogen, Llc Method for determining alleles
US7749492B2 (en) 2001-01-05 2010-07-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. AAV vectors and methods
US20020159978A1 (en) * 2001-02-06 2002-10-31 James Allen Muscle-directed gene transfer by use of recombinant AAV-1 and AAV-6 virions
HU230406B1 (hu) 2001-11-13 2016-04-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására
FI3517134T3 (fi) * 2001-12-17 2024-04-03 Univ Pennsylvania Adeno-assosioituneen viruksen (aav) serotyypin 8 sekvenssejä, niitä sisältäviä vektoreita ja niiden käyttöjä
WO2003052052A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 9 sequences, vectors containing same, and uses therefor
WO2003104392A2 (en) 2001-12-18 2003-12-18 University Of North Carolina At Chapel Hill Improved reagents and methods for producing parvoviruses
US20040002159A1 (en) * 2002-04-05 2004-01-01 Weidong Xiao Methods for the production of chimeric adeno-associated virus (AAV) vectors, compositions of chimeric AAV vectors, and methods of use thereof
EP1359217B1 (en) * 2002-04-29 2006-12-13 The Trustees of The University of Pennsylvania Method for direct rescue and amplification of integrated viruses from cellular DNA of tissues
DK2657247T3 (en) 2003-06-19 2017-07-10 Genzyme Corp AAV virions with reduced immunoreactivity and applications thereof
DK2292779T3 (en) * 2003-09-30 2017-02-27 Univ Pennsylvania ADENOASS-ASSOCIATED VIRUS (AAV) CLADES, SEQUENCES, VECTORS CONTAINING SAME AND APPLICATIONS THEREOF
US20090054823A1 (en) 2004-09-30 2009-02-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Perfusion circuit and use therein in targeted delivery of macromolecules
WO2006110689A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
US7788045B2 (en) 2005-09-01 2010-08-31 Meditasks, Llc Systems and method for homeostatic blood states
JP5268890B2 (ja) 2006-04-28 2013-08-21 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖの規模適応性の製造方法
JP2009102988A (ja) 2007-10-19 2009-05-14 Toyota Motor Corp 内燃機関の燃料噴射装置
CN102027123B (zh) 2008-03-14 2016-03-16 人体酶有限公司 使用人细胞表达系统重组产生可靠的人蛋白质
US20090280103A1 (en) 2008-04-04 2009-11-12 Martin Flueck Regulation of muscle repair
US8729041B2 (en) 2008-12-03 2014-05-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating hepatic neoplasia
EP3514232A1 (en) 2010-04-23 2019-07-24 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
WO2013010571A1 (de) 2011-07-15 2013-01-24 Alfred Kärcher Gmbh & Co. Kg Rotationsbürste und kehrmaschine mit einer rotationsbürste
US9434928B2 (en) 2011-11-23 2016-09-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
AU2013221212B2 (en) 2012-02-17 2018-08-09 The Children's Hospital Of Philadelphia AAV vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues
JP6385920B2 (ja) 2012-05-09 2018-09-05 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー アデノ随伴ウイルスプラスミド及びベクター
US9819463B2 (en) 2016-02-18 2017-11-14 Huawei Technologies Co., Ltd. Method and apparatus for transmitting data in a wireless communication system
AU2018227440B2 (en) 2017-02-28 2024-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clade f vector and uses therefor

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10693918B2 (en) 2017-06-15 2020-06-23 Palo Alto Networks, Inc. Radio access technology based security in service provider networks
US10708306B2 (en) 2017-06-15 2020-07-07 Palo Alto Networks, Inc. Mobile user identity and/or SIM-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks
US11122435B2 (en) 2017-06-15 2021-09-14 Palo Alto Networks, Inc. Radio access technology based security in service provider networks
US11722532B2 (en) 2017-06-15 2023-08-08 Palo Alto Networks, Inc. Security for cellular internet of things in mobile networks based on subscriber identity and application identifier
US11805153B2 (en) 2017-06-15 2023-10-31 Palo Alto Networks, Inc. Location based security in service provider networks
US11838326B2 (en) 2017-06-15 2023-12-05 Palo Alto Networks, Inc. Mobile equipment identity and/or IoT equipment identity and application identity based security enforcement in service provider networks
US11916967B2 (en) 2017-06-15 2024-02-27 Palo Alto Networks, Inc. Mobile user identity and/or sim-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks
US12010148B2 (en) 2017-06-15 2024-06-11 Palo Alto Networks, Inc. Access point name and application identity based security enforcement in service provider networks
US12355819B2 (en) 2017-06-15 2025-07-08 Palo Alto Networks, Inc. Mobile user identity and/or sim-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks

Also Published As

Publication number Publication date
CA2406745C (en) 2006-01-10
PH12014501487B1 (en) 2015-12-07
NO20140988L (no) 2004-07-14
US8524446B2 (en) 2013-09-03
SG10202108118RA (en) 2021-08-30
NO336468B1 (no) 2015-08-31
EP1456419A4 (en) 2005-11-09
CA2756866A1 (en) 2003-05-22
CA3066428A1 (en) 2003-05-22
DE60209193T2 (de) 2006-09-28
WO2003042397A2 (en) 2003-05-22
CN103555678B (zh) 2018-02-09
MXPA04004600A (es) 2004-08-13
CA2406745A1 (en) 2003-05-13
US20130045186A1 (en) 2013-02-21
MX346493B (es) 2017-03-21
PL222683B1 (pl) 2016-08-31
ES2258601T3 (es) 2006-09-01
EP1310571A2 (en) 2003-05-14
CN103589692B (zh) 2018-07-24
EP2338900B1 (en) 2014-01-01
IL270065A (hu) 2019-12-31
US11377669B2 (en) 2022-07-05
HUP0600229A2 (en) 2006-06-28
NZ548094A (en) 2008-07-31
US20110263027A1 (en) 2011-10-27
IL213810A0 (en) 2011-07-31
NZ600121A (en) 2013-12-20
CN105671005B (zh) 2020-09-15
JP2016136953A (ja) 2016-08-04
EP2341068B1 (en) 2013-09-25
US10308958B2 (en) 2019-06-04
CN103555677B (zh) 2018-01-30
BR0214119A (pt) 2005-06-28
JP2005525086A (ja) 2005-08-25
IL221602A (en) 2015-09-24
IL258545A (en) 2018-06-28
KR20050058234A (ko) 2005-06-16
PL220644B1 (pl) 2015-11-30
IL233391A (en) 2016-12-29
KR101015854B1 (ko) 2011-02-23
IL227866A (en) 2015-11-30
ES2439515T3 (es) 2014-01-23
DE60209193D1 (de) 2006-04-20
JP5669795B2 (ja) 2015-02-18
EP1456419A2 (en) 2004-09-15
US11034976B2 (en) 2021-06-15
PL397823A1 (pl) 2012-07-16
US20200087684A1 (en) 2020-03-19
US10508286B2 (en) 2019-12-17
CN103555678A (zh) 2014-02-05
US20160097040A1 (en) 2016-04-07
US9790472B2 (en) 2017-10-17
US20210285012A1 (en) 2021-09-16
US10041090B2 (en) 2018-08-07
US20170240921A1 (en) 2017-08-24
CN103555676A (zh) 2014-02-05
NZ564506A (en) 2009-09-25
IL248724B (en) 2018-04-30
CN105671005A (zh) 2016-06-15
HK1068925A1 (en) 2005-05-06
NO20150196L (no) 2004-07-14
JP3958191B2 (ja) 2007-08-15
BR122016004944B8 (pt) 2021-07-27
CA2915124C (en) 2018-08-14
BR122016004546B1 (pt) 2016-11-29
EP1310571A3 (en) 2003-08-13
US11499167B2 (en) 2022-11-15
US20220025401A1 (en) 2022-01-27
IL270065B1 (en) 2023-06-01
EP2341068A1 (en) 2011-07-06
CN103589692A (zh) 2014-02-19
NZ591012A (en) 2012-06-29
NO334379B1 (no) 2014-02-24
KR20100029134A (ko) 2010-03-15
ATE520707T1 (de) 2011-09-15
US20190024117A1 (en) 2019-01-24
IL221602A0 (en) 2012-10-31
IL213810A (en) 2014-08-31
IL233391A0 (en) 2014-08-31
BR122016004944B1 (pt) 2016-11-22
JP6212142B2 (ja) 2017-10-11
HU229379B1 (en) 2013-11-28
IL270065B2 (en) 2023-10-01
NO20042183L (no) 2004-07-14
US20200080109A1 (en) 2020-03-12
CA3159060A1 (en) 2003-05-22
IL234063A (en) 2017-06-29
NO336801B1 (no) 2015-11-02
CN103555677A (zh) 2014-02-05
JP5140627B2 (ja) 2013-02-06
ZA200403360B (en) 2005-04-26
CN102181480A (zh) 2011-09-14
US20170298388A1 (en) 2017-10-19
KR101014207B1 (ko) 2011-02-14
CA2756866C (en) 2017-06-06
US11041171B2 (en) 2021-06-22
JP2014239680A (ja) 2014-12-25
PL221877B1 (pl) 2016-06-30
IL193525A0 (en) 2009-02-11
CA3066428C (en) 2022-05-24
JP4677187B2 (ja) 2011-04-27
JP2009195237A (ja) 2009-09-03
NZ618298A (en) 2015-04-24
SG168422A1 (en) 2011-02-28
BRPI0214119B8 (pt) 2021-05-25
CA2864537C (en) 2016-11-29
CA3159060C (en) 2023-05-16
PH12014501487A1 (en) 2015-12-07
DK1310571T3 (da) 2006-06-19
CA2945734A1 (en) 2003-05-22
BRPI0214119B1 (pt) 2016-09-27
US20110151434A1 (en) 2011-06-23
BR122016004546B8 (pt) 2021-07-27
US20200131534A1 (en) 2020-04-30
PL404537A1 (pl) 2014-02-17
SG10201912509RA (en) 2020-02-27
ATE317916T1 (de) 2006-03-15
HK1056198A1 (en) 2004-02-06
IL161827A (en) 2009-11-18
PL409838A1 (pl) 2015-07-20
EP1310571B1 (en) 2006-02-15
US10544432B2 (en) 2020-01-28
CN102181480B (zh) 2016-01-27
IL193525A (en) 2014-08-31
NZ532635A (en) 2007-05-31
EP1456419B1 (en) 2011-08-17
HUP0600229A3 (en) 2010-01-28
IL227866A0 (en) 2013-09-30
US11034977B2 (en) 2021-06-15
US10526617B2 (en) 2020-01-07
US20030138772A1 (en) 2003-07-24
PL373864A1 (en) 2005-09-19
CA2915124A1 (en) 2003-05-22
IL258545B (en) 2019-11-28
PL217623B1 (pl) 2014-08-29
SG10201506627PA (en) 2015-10-29
NO338362B1 (no) 2016-08-15
CA2864537A1 (en) 2003-05-22
IL248724A0 (en) 2017-01-31
NO20131359L (no) 2004-07-14
NZ578982A (en) 2011-03-31
US8906675B2 (en) 2014-12-09
AU2002361573B2 (en) 2008-06-12
CN103555676B (zh) 2016-08-31
ES2455126T3 (es) 2014-04-14
IL161827A0 (en) 2005-11-20
JP2003235562A (ja) 2003-08-26
WO2003042397A3 (en) 2004-02-05
PH12016502583A1 (en) 2017-10-18
US20220213501A1 (en) 2022-07-07
MX359371B (es) 2018-09-25
CA2465868A1 (en) 2003-05-22
US20180030479A1 (en) 2018-02-01
CA2465868C (en) 2017-02-28
IL234063A0 (en) 2014-09-30
CA2945734C (en) 2020-02-25
EP2338900A1 (en) 2011-06-29
SG157224A1 (en) 2009-12-29
JP2013013414A (ja) 2013-01-24
JP5969547B2 (ja) 2016-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230406B1 (hu) Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására
CN108137655B (zh) 逃避抗体的病毒载体的方法和组合物
CN102174574B (zh) 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用
JP5649529B2 (ja) アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）血清型８の配列
JP5136766B2 (ja) キメラベクター
CN109661470A (zh) 新型aav8突变衣壳和含有其的组合物
KR20210006357A (ko) 항체-회피 바이러스 벡터
KR20230029616A (ko) 종간 호환가능한 아데노-관련 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법
CN117203222A (zh) 靶向t细胞的aav载体
CN102220376B (zh) 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用
CN101426935A (zh) 检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法
HK40048077B (zh) 合成嗜肝性腺相关病毒衣壳及其用途
HU230093B1 (hu) Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására, és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására