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CN105671005A - 检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法 - Google Patents

检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法 Download PDF

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CN105671005A CN201610112637.9A CN201610112637A CN105671005A CN 105671005 A CN105671005 A CN 105671005A CN 201610112637 A CN201610112637 A CN 201610112637A CN 105671005 A CN105671005 A CN 105671005A
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Abstract

本发明提供了从组织或细胞来源样品的DNA中检测和分类AAV序列的方法。本发明还提供了用该方法鉴定的AAV序列以及用这些序列构建的载体。

Description

检测和/或鉴定腺伴随病毒(AAV)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法
本申请是中国专利申请201310326869.0的分案申请。
技术领域
本发明提供了从组织或细胞来源样品的DNA中检测和分类AAV序列的方法。本发明还提供了用该方法鉴定的AAV序列以及用这些序列构建的载体。
背景技术
腺伴随病毒(AVV)是细小病毒家族的一个成员，是一个小的无包膜的二十面体，其基因组为4.7kb-6kb的单链线性DNA分子。AVV开始时被归为依赖病毒，因为这个病毒是作为纯化的腺病毒株中的污染物而被发现的。AVV的生命周期包括潜伏期和感染期，在潜伏期内，AVV基因组在感染后以位点特异性的方式整合到宿主染色体内，在感染期内，伴随着腺病毒或单纯疱疹病毒的感染，整合的病毒基因组随后恢复、复制并包装成具有感染性的病毒颗粒。AVV因其具有非致病性、广泛的宿主范围包括非分裂细胞以及位点特异性整合等特征而成为一个极具吸引力的基因转移工具。
最近的研究表明，AVV载体是一个优选的基因治疗工具。到目前为止，已经有6个不同血清型的AVV被从人或非人灵长类动物(NHP)体内分离出来并被鉴定。其中，人血清2型首先被开发为基因转移工具，现已被广泛用于在不同靶组织和动物模型中进行基因转移试验。利用AVV2来源的载体治疗某些人类疾病的临床试验也在进行之中，其中包括囊性纤维化和血友病B。我们所想要的是用于基因转移的AAV来源的载体。
发明内容
本发明的一个方面涉及根据在缺少辅助病毒共感染的情况下AVV的潜伏和整合特性，利用生物信息学分析、PCR扩增以及克隆技术从各种人源及非人灵长类动物(NHP)组织的细胞DNA中检测和鉴定AVV序列的新方法。
本发明的另外一个方面涉及利用本发明的上述方法所检测到的AVV序列的分离方法。本发明还包括利用这些新的AVV血清型制备载体的方法，仅仅根据衣壳的基因序列和rep/cap基因连接处的结构就可以用这些载体进行血清学和基因转移的研究。
本发明的另外一个方面涉及利用本发明所描述的试剂，如通用引物对/探针和定量实时PCR进行血清学、流行病学、生物分布及传播模式的研究。
本发明的另外一个方面涉及利用RACE和其他分子技术从不同来源的细胞DNA中分离新AVV血清型的完整且有感染性的基因组的方法。
本发明还涉及利用不同来源的辅助腺病毒从人或NHP细胞系中恢复新的AVV血清型基因组的方法。
本发明的另一个方面涉及新的AVV血清型、含该血清型的载体及利用该血清型的方法。
从下面对发明的详细描述中可以很容易地理解本发明的这些方面及其他方面。
附图说明
图1A到1AAAR描述的是至少编码AAVcap蛋白的核酸序列的比对。这些图列出了包含ITR、rep区和衣壳区的如下新型AAV血清型的全长序列：新型AAV血清型7[SEQIDNO:1]，以及以前报道的AAV1[SEQINNO:6]，AAV2[SEQIDNO:7]和AAV3[SEQIDNO:8]。新型AAV血清型AAV8[SEQIDNO:4]和AAV9[SEQIDNO:5]是该共同提交的申请的主题。这个比对中所涉及的本发明的其他新型克隆包括42-2[SEQIDNO:9]，42-8[SEQIDNO:27]，42-15[SEQIDNO:28]，42-5b[SEQIDNO:29]，42-1b[SEQIDNO:30]；42-13[SEQIDNO:31]，42-3a[SEQIDNO:32]，42-4[SEQIDNO:33]，42-5a[SEQIDNO:34]，42-10[SEQIDNO:35]，42-3b[SEQIDNO:36]，42-11[SEQIDNO:37]，42-6b[SEQIDNO:38]，43-1[SEQIDNO:39]，43-5[SEQIDNO:40]，43-12[SEQIDNO:41]，43-20[SEQIDNO:42]，43-21[SEQIDNO:43]，43-23[SEQIDNO:44]，43-25[SEQIDNO:45]，44.1[SEQIDNO:47]，44.5[SEQIDNO:47]，223.10[SEQIDNO:48]，223.2[SEQIDNO:49]，223.4[SEQIDNO:50]，223.5[SEQIDNO:51]，223.6[SEQIDNO:52]，223.7[SEQIDNO:53]，A3.4[SEQIDNO:54]，A3.5[SEQIDNO:55]，A3.7[SEQIDNO:56]，A3.3[SEQIDNO:57]，42.12[SEQIDNO:58]，44.2[SEQIDNO:59]。AAV10[SEQIDNO:117]，AAV11[SEQIDNO:118]和AAV12[SEQIDNO:119]的特征区域序列也列在图中。AAV基因组结构中的关键标记也在图中标识出来。断裂的空间用黑点表示。AAV1[SEQIDNO:6]的3'ITR用与以前报道的序列同样的结构表示。TRS代表末端进化位点。要注意的是AAV7是所报道的唯一利用GTG作为VP3起始密码子的AAV。
图2A到2F显示的是以前所报道的AAV血清型1[SEQIDNO:64]，AAV2[SEQIDNO:70]，AAV3[SEQIDNO:71]，AAV4[SEQIDNO:63]，AAV5[SEQIDNO:114]，和AAV6[SEQIDNO:65]以及本发明的新型AAV序列的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列的比对，本发明的新型AAV序列包括:C1[SEQIDNO:60]，C2[SEQIDNO:61]，C5[SEQIDNO:62]，A3-3[SEQIDNO:66]，A3-7[SEQIDNO:67]，A3-4[SEQIDNO:68]，A3-5[SEQIDNO:69]，3.3b[SEQIDNO:62]，223.4[SEQIDNO:73]，223-5[SEQIDNO:74]，223-10[SEQIDNO:75]，223-2[SEQIDNO:76]，223-7[SEQIDNO:77]，223-6[SEQIDNO:78]，44-1[SEQIDNO:79]，44-5[SEQIDNO:80]，44-2[SEQIDNO:81]，42-15[SEQIDNO:84]，42-8[SEQIDNO:85]，42-13[SEQIDNO:86]，42-3A[SEQIDNO:87]，42-4[SEQIDNO:88]，42-5A[SEQIDNO:89]，42-1B[SEQIDNO:90]，42-5B[SEQIDNO:91]，43-1[SEQIDNO:92]，43-12[SEQIDNO:93]，43-5[SEQIDNO:94]，43-21[SEQIDNO:96]，43-25[SEQIDNO:97]，43-20[SEQIDNO:99]，24.1[SEQIDNO:101]，42.2[SEQIDNO:102]，7.2[SEQIDNO:103]，27.3[SEQIDNO:104]，16.3[SEQIDNO:105]，42.10[SEQIDNO:106]，42-3B[SEQIDNO:107]，42-11[SEQIDNO:108]，F1[SEQIDNO:109]，F5[SEQIDNO:110]，F3[SEQIDNO:111]，42-6B[SEQIDNO:112]，42-12[SEQIDNO:113]。新血清型AAV8[SEQIDNO:95]和AAV9[SEQIDNO:100]是此共同提交的专利申请的主题。
图3A到3C显示的是AAV7rep蛋白[SEQIDNO:3]的氨基酸序列。
具体实施方式
在本发明中，发明者发现了一种方法可以利用腺伴随病毒(AVV)在缺少辅助病毒共感染的情况下具有穿过细胞核整合到细胞DNA并达到潜伏感染的能力。该方法利用聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术可以从人和非人灵长类动物来源的或其他来源的组织DNA内检测、鉴定和/或分离AVV序列。另外，该方法还适于检测、鉴定和/或分离如下所描述的其他整合的病毒及非病毒序列。
本发明还涉及利用本发明的方法所鉴定的核酸序列。其中一种腺伴随病毒是一个新的血清型，本文中被称为血清型7(AVV7)。本文所涉及的其他新型腺伴随病毒血清型包括AAV10、AVV11和AVV12。其他利用本发明的方法所鉴定的新型AVV血清型也包括在本说明书中。参见附图和所列的序列，本文已纳入作为参考。
本发明还涉及这些AAV序列的片段。其中特别有意义的AAV片段是cap蛋白，包括vp1、vp2、vp3和超变区，rep蛋白，其中包括rep78、rep68、rep52和rep40，以及编码这些蛋白的序列。这些片段都可被用于各种载体系统和宿主细胞中。这种片段可以单独使用，也可以和其他AAV序列或片段、或者其他AAV或非AAV病毒序列的元件联合使用。在一个特别优选的实施方式中，载体含有本发明的AAVcap和/或rep序列。
如本文所描述，核酸序列是用任何一种公用的或商业的多序列比对程序如“ClustalW”来比对的，这些程序可从互联网的服务器上下载。另外，还使用了VectorNTI程序。还可以使用本领域所熟知的许多算法来测算核苷酸序列的同一性，其中包括那些上面所描述的程序中的序列。另外，多聚核苷酸序列还可用Fasta进行比较，这是GCG6.1版本中的一个程序。Fasta能将所查询的序列与所检索到的序列之间最佳重叠区域进行比对并计算出其序列同一性的百分率。例如，两个核酸序列之间同一性的百分率可以利用Fasta软件，参考GCG6.1版本中所提供的默认参数(字号为6，评分矩阵采用NOPAM因子)来确定，本文已纳入作为参考。氨基酸序列也可用相似的程序来处理，如“ClustalX”程序。一般来说，这些程序的设置都是默认的，但是如果有必要本领域的技术人员也可以改变这些设置。另外，本领域的技术人员也可以使用其他的算法或计算机程序，只要这些程序能如参考算法和程序一样测算序列的同一性或比对核酸序列。
术语“基本同源”或“基本一致”用于核酸或核酸片段时是指在一个核酸序列中适当插入或删除一些核苷酸后与另一个核酸序列比较，其核苷酸序列同一性至少占到所比较序列的95％到99％。当称两个序列同源时必须比较其全长序列、其开放阅读框架或至少含15个核苷酸的适宜核酸片段。适宜核酸片段的例子在本文中有描述。
术语“基本同源”或“基本一致”用于氨基酸或其片段时是指在一个氨基酸片段中适当插入或删除一些氨基酸后与另一个氨基酸片段比较，其氨基酸序列同一性至少占到所比较序列的95％到99％。当称两个序列同源时必须比较其全长序列、其蛋白质如cap蛋白、rep蛋白，或至少含8个氨基酸的适宜片段，较好的是含15个氨基酸的片段。适宜片段的例子在本文中有描述。
术语“高度保守的”是指至少80％的序列同一性，优选的为至少90％的序列同一性，更优选的为超过97％的序列同一性。本领域的技术人员可以很容易地通过本领域所熟知的算法和计算机程序来确定序列的同一性。
术语“序列同一性百分率”或“一致的”用于核酸序列时是指当将两个序列一起比对时其核苷酸残基是一样的。序列同一性比较的长度可以超过基因组的全长，基因编码序列的全长，或至少约含500-5000个核苷酸的片段。但是，也可以比较小片段之间的同一性，如约含9个核苷酸的片段，通常含至少约20-24个核苷酸、至少约28-32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸。同样，“序列同一性百分率”也可以用于确定氨基酸序列，确定全长蛋白质或其片段的同一性。适宜的片段至少约含8个氨基酸，也可以最多达700个氨基酸。适宜片段的例子在本文中也有描述。
AAV序列及其片段可用于制备rAAV，也可作为反义转移载体、基因治疗载体或疫苗载体。本发明还涉及核酸分子、基因转移载体以及含本发明的AAV序列的宿主细胞。
如本文所描述，含本发明所述的AAV衣壳蛋白的本发明的载体特别适用于利用中和抗体消除AAV血清型来源载体以及其他病毒载体的效应。本发明的rAAV载体特别适合rAAV再注射和重复的基因治疗。
本发明的这些和其他实施方式以及优点下面有更详细的描述。如本说明书和权利要求书中所描述的，术语“含有”和“包括”以及其他类似的词语是指还可以包含其他的部分、元件、整体、步骤等。相反的，术语“由…组成”及其类似的词语是指不包含其他的部分、元件、整体、步骤等。
I.本发明的方法
A.通过分子克隆技术检测序列
本发明的一个方面涉及检测和/或鉴定样品中靶核酸序列的方法。该方法特别适于检测整合到细胞染色体上的病毒序列，如腺伴随病毒(AAV)和逆转录病毒等。本说明书以AAV为参照，以它为例子进行说明。但是，根据本说明书，本领域的技术人员也可以很容易地利用逆转录病毒(如猫白血病病毒((FeLV)，HTLVI和HTLVII)和慢病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马感染性贫血病毒、以及泡沫病毒)等来实施本发明。另外，本发明的方法还可用于检测整合到宿主细胞染色体内或未整合到宿主细胞染色体内的其他病毒或非病毒序列。
本文所描述的样品可以是任何含核酸的样品，如组织、组织培养物、细胞、细胞培养物、以及生物液体，其中包括而不限于尿液和血液。这些核酸序列可以是质粒来源的DNA或RNA、任何来源的天然DNA或RNA，其中包括细菌、酵母、病毒、以及较高等的生物如植物或动物。DNA或RNA的提取可以使用本领域技术人员所熟知的任何方法，如Sambrook编写的“分子克隆:实验室手册”(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(纽约:冷泉港实验室)所描述的方法。样品的来源以及提取核酸的方法并不是对本发明所作出的限制。另外，本发明的方法可以直接用于含DNA的样品或从该样品中得到(或提取)的核酸。
本发明的方法包括利用聚合酶链式反应(PCR)扩增含DNA的样品，所用的第一组引物是双链核酸序列第一区特异性的，因此可以得到扩增序列。
如本文所描述，每个区域都是基于至少两个血清型(即AAV)或病毒株(即慢病毒)的核酸序列的比对而确定的，其中所述每个区所含有的序列5'末端高度保守，中间部分优选可变的但不是必须的，3'末端也是高度保守的，这些序列保守或可变是相对于至少两个比对的AAV血清型的序列而言的。5'和/或3'高度保守的核苷酸至少约有9个，较好的是至少有18个碱基对。对于可变区来说，不需要有保守的序列，这些序列可以是相对保守的，即比对的血清型或病毒株之间具有小于90％、80％或70％的同一性。
每个区可以跨越约100bp到10kb碱基对的长度，但是特别优选的是其中一个被称为特征区域的，即该区具有足够的独特性，能用来鉴定靶组织来源的扩增序列。例如，在一个实施方式中，第一区是一个约250bp的片段，与任何已知的AAV序列都能区别开，该序列是AAV来源的经正性鉴定的扩增区。而且，该区内的各种序列都具有足够的独特性，可用于鉴定扩增序列所来源的血清型。一旦被扩增(及被检测)后，序列可用常规的限制性酶切技术鉴定，通过与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5或AAV6或AAV7、AAV10、AAV11、AAV12或其他任何经本发明鉴定的新血清型内该区的限制性酶切图谱比较就可以鉴定该序列。上述血清型都是本发明所鉴定和涉及的。
根据本文所描述的方法，本领域的技术人员可以很容易地鉴定其他整合病毒上的这种区，并且易于检测和鉴定这些序列。因此，一对理想的通用引物应被设计在高度保守的末端，这组引物可用于扩增样品中所选择的区。本发明的这一方面可用于设计检测靶序列(如AAV)是否存在以及鉴定AAV血清型的诊断试剂盒，所用的判断标准可以包括本文所描述的或利用本文所描述的技术分离出的血清型的限制性酶切图谱。例如，PCR产物的快速鉴定或分子血清型的确定可以通过酶切PCR产物并与限制性酶切图谱比较来完成。
因此，在一个实施方式中，AAV的“特征区域”可能跨越AAV1[SEQIDNO:6]的约2800到3200区域，以及AAV2、AAV3、AAV4、AAV5和AAV6上的相应区域。优选的区域约为250bp，位于AAV1[SEQIDNO:6]的2886到3143区，以及AAV2[SEQIDNO:7]，AAV3[SEQIDNO:8]以及其他AAV血清型上的相应区域。见图1。为了快速检测样品中的AAV，所用的引物为该特征区域特异性的。但是，本发明并不仅限于那些与本文所鉴定的AAV特征区域完全相配的序列，本领域的技术人员可以对这个区加以改动，使之成为比特征区域短点或长点的片段。
PCR引物是用本领域技术人员所熟知的方法合成的。每对PCR引物都由5'引物和3'引物组成，见Sambrook等，本文已引用。术语“引物”指一个寡核苷酸片段，在适当的条件下，与核酸链互补的引物延伸产物在该点开始合成。但是，也可以使用双链引物，只要在制备延伸产物前将其处理使之分开就可以了。引物含有约15到25个或更多个核苷酸，优选至少18个核苷酸。但是在某些情况下较短的如7到15个核苷酸也可以使用。
引物要选择与所要扩增的特定序列的不同链足够互补的序列，并且还能与其各自的链杂交。因此，引物序列并不需要是所要扩增区域的精确序列。例如，可以将一段非互补的核苷酸片段连接到引物的5'末端，但是剩余的引物部分要与该链完全互补。另外，非互补碱基或较长的序列可以分散在引物内，只要引物序列与所要扩增的序列足够互补，能与之杂交，该链可以作为模板来合成引物的延伸产物就可以了。
根据本发明，特征区域的PCR引物是基于两个或多个比对序列(即两个或多个AAV血清型)的高度保守区而设计的。引物的序列在5'末端或中间可以加以改动，并不一定要和两个或多个比对的AAV血清型完全互补。但是，引物的3'末端至少要有5个以上的核苷酸是与两个或多个比对的AAV血清型完全互补的，优选9个以上的碱基对完全互补，更优选的是18个碱基对完全互补。这样，引物的3'末端由至少5个与比对序列100％一致的核苷酸组成。但是，也可以在引物的3'末端加上1、2、或多个变性的核苷酸。
例如，AAV特征区域的引物对是基于AAV衣壳内的如下特异区而设计的。5'引物是基于AAV2[SEQIDNO:7]的nt2867-2891，5'-GGTAATTCCTCCGGAAATTGGCATT3'，见图1。3'引物是基于AAV2[SEQIDNO:7]的nt2867-2891，5'-GACTCATCAACAACAACTGGGGATTC-3'。但是，本领域的技术人员可以基于AAV1，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6的相应区域，或基于AAV7，AAV10，AAV11，AAV12或本发明的其他AAV所提供的信息来设计引物对。另外，还可以利用本领域技术人员所熟知的方法设计其他的引物对来扩增这个特征区域。
B.靶序列的分离
如本文所描述，本发明的第一引物对用于特异性地扩增靶序列即AAV血清型的特征区域，以便于检测该靶序列。如果还需要检测其他的序列，即，如果需要鉴定一个新的血清型，那么特征区域需要延伸，这样，本发明还需要一个或多个附加的引物对。这些引物对适宜设计成包含第一引物对的5'引物或3'引物和该引物对独特的第二引物，这样，该引物对可以扩增出特征区域的5'区或3'区，该序列与特征区域的5'末端或3'末端互补。例如，第一引物对由5'引物P1和3'引物P2组成以扩增特征区域。为了延伸特征区域的3'末端，第二引物对应由引物P1和3'引物P4组成，该引物对可以扩增特征区域及其下游的序列。为了延伸特征区域的5'末端，第三引物对应由5'引物P5和引物P2组成，该引物对可以扩增特征区域及其上游的序列。如果需要，这些延伸步骤可以重复(或同时进行)。因此，从这些扩增步骤中得到的产物与常规步骤所得到的产物接合就得到了所需要长度的独立序列。
第二和第三引物对与特征区域的引物对一起用于扩增比对序列上的高度保守区。本文所用的术语“第二”或“第三”引物对只是为了便于描述，并不表示这些引物添加到反应混合物中或用于扩增的顺序。第二引物对所扩增的区域是经过选择的，这样一旦扩增出来后其5'末端就可以与特征区域的3'末端互补杂交。同样，第三引物对所扩增的区域也是经过选择的，这样一旦扩增出来后其3'末端就可以与特征区域的5'末端互补杂交。还可以设计出其他的引物对，这些引物对所扩增的区域可以与第二或第三引物对以及下面的引物对扩增产物的5'末端或3'末端互补杂交。
例如，如果以AAV为靶序列，第一引物对(P1和P2)用于从样品中扩增特征区域。在一个优选实施方式中，特征区域位于AAV衣壳之内。第二引物对(P1和P4)用于将特征区域的3'末端延伸到AAV序列3'ITR之前的区域，即以特征区域为锚扩增出含AAV衣壳整个3'末端的产物。在一个实施方式中，P4引物位于AAV2[SEQIDNO:7]的nt4435-4462，以及其他AAV血清型的相应序列上。结果得到一个约1.6kb的产物，该产物含有0.25kb的特征区域。第三引物对(P3和P2)用于将特征区域的5'末端延伸到AAV序列rep基因的3'末端，即以特征区域为锚扩增出含AAV衣壳整个5'末端的产物。在一个实施方式中，P3引物位于AAV2[SEQIDNO:7]的nt1384-1409，以及其他AAV血清型的相应序列上。结果得到一个约1.7kb的产物，该产物含有0.25kb的特征区域。另外，第四引物对用于将含AAV衣壳整个5'末端的延伸产物进一步延长到包含rep序列。在一个实施方式中，P5引物位于AAV2[SEQIDNO:7]的nt108-133，以及其他AAV血清型的相应序列上，与P2引物合用。
完成了所希望数量的延伸步骤之后，利用特征区域为锚或标记将各种延伸产物连接起来就得到了一个完整的序列。在本文所描述的一个实施例中，至少含有一个完整的AAVcap基因的AAV序列被扩增出来，当然也可以扩增出更大的序列，这要根据所进行的扩增步骤的多少。
将延伸产物组装成一个完整的AAV序列所用的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，用DraIII消化扩增产物，可以在特征区域的DraIII位点上将其裂解，得到一个限制性酶切片段，将此片段与含完整AAVcap基因分产物从新连接起来。但是也可以利用其他合适的技术将延伸产物组装成一个完整的序列，见Sambrook等，本文已引用。
除了上面所描述的多步骤延伸方法，本发明的另外一个实施方式是直接扩增出一个3.1kb的片段，该片段含有全长的cap序列。为了从NHP组织或血液DNA中直接扩增3.1kb的全长cap片段，需要鉴定AAV基因组中其他两个高度保守区以便于用PCR方法扩增这个大片段。保守区内的一个引物位于rep基因的中间(AV1ns:5'GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC3'，SEQIDNO:6的nt)，另一个引物位于cap基因下游的另一个保守区内(AV2cas:5'CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA3'，SEQIDNO:7)，而这结合可以扩增出含全长cap基因的AAV序列。一般来说，扩增完成以后，产物经克隆和测序其准确率都可以达到99.9以上。利用该方法，发明者至少分离出50个衣壳克隆并随之进行了鉴定。其中37个克隆来源于猕猴(rh.1-rh.37)，6个克隆来源于短尾猴(cy.1-cy.6)，2个克隆来源于狒狒(bb.1和bb.2)，5个克隆来源于黑猩猩(ch.1-ch.5)。这些克隆在说明书的其他地方也作了鉴定，连同其来源的物种以及存在新型序列的动物组织。
C.分离新型AAV的其他方法
本发明的另外一个方面涉及从细胞中分离新型AAV的其他方法。该方法包括用具有AAV辅助病毒功能的载体感染细胞；分离含AAV的感染克隆；分离AAV的测序；以及将分离的AAV序列与已知的AAV血清型进行比较，如果分离的AAV与已知的AAV血清型序列有区别就说明存在新型AAV。
在一个实施方式中，具有辅助功能的载体提供了腺病毒的基本功能，包括如E1a，E1b，E2a，E4ORF6。在一个实施方式中，辅助功能是由腺病毒提供。腺病毒可以是野生型的，可以是人源的也可以是非人源的，最好是非人灵长类动物(NHP)来源的。各种腺病毒的DNA序列可以从Genbank上找到，包括Ad5型[Genbank登录号M73260]。腺病毒序列可从已知的任何类型的腺病毒中获得，如血清型2，3，4，7，12和40，还包括任何本发明已经鉴定的人源类型[见Horwitz，上面已引用]。同样，已知可以感染非人动物(如黑猩猩)的腺病毒也可用于构建本发明的载体。见美国专利No.6,083,716。除了野生型腺病毒之外，具有必须辅助功能的重组病毒或非病毒载体(如质粒、游离体等)也可使用。这些重组病毒是本领域所熟知的，可以通过已发表的方法制备。见美国专利No.5,871,982和6,251,677，其中描述了一种杂合的Ad/AAV病毒。对腺病毒类型的选择并不预示着对下列发明的限制。从美国模式培养物保藏所(AmericanTypeCultureCollection，Manassas，Virginia)可以得到各种腺病毒株，另外也可以从各种商业机构或研究机构获得。而且，许多这种病毒株的序列都可以从各种数据库中查询到，如PubMed和GenBank。
另外，感染性AAV可以用基因组步行技术(Siebert等，1995，NucleicAcidResearch，23:1087-1088，Friezner-Degen等，1986，J.Biol.Chem.261:6972-6985，BDBiosciencesClontech，PaloAlto，CA)分离。基因组步行技术特别适于鉴定和分离与本发明方法所鉴定的新型序列相邻的序列。例如，这个技术可用于分离新型AAV血清型的反向末端重复序列(ITR)，其根据就是用本发明的方法鉴定的新型AAV的衣壳和/或rep序列。该技术也可用于分离与本发明所鉴定和分离的其他AAV或非AAV序列相邻的序列。见实施例3和4。
本发明的方法可用于各种流行病学研究，生物分布研究、通过AAV载体或其他整合病毒来源的载体进行基因治疗的检测。因此，这些方法可用于制备预包装的试剂盒便于临床医生、研究人员和流行病学家使用。
II.诊断试剂盒
本发明的另外一个方面涉及检测样品中是否已知的或未知的腺伴随病毒(AAV)。这种试剂盒包括AAV核酸序列特征区域特异性的第一对5'和3'PCR引物。另外，该试剂盒还可以包含3.1kb片段特异性的第一对5'和3'PCR引物，该片段含有本文所鉴定的全长AAV衣壳核酸序列(即AV1ns和AV2cas引物)。试剂盒还可以任选添加本文所描述的两对或多对5'和3'引物，以及PCR探针。这些引物和探针按照本发明可用于扩增每种AAV血清型的特征区域，如用定量PCR方法。
本发明还涉及用于鉴定用本发明的方法检测到的AAV血清型，和/或将新的血清型与已知的血清型区别开来。这种试剂盒还包含一种或多种限制性内切酶，AAV血清型的标准以用于“标记的限制性酶切分析”，和/或其他确定所检测到的AAV血清型的试剂。
另外，本发明的试剂盒还包含说明书、阴性和/或阳性对照、容器、样品的稀释液和缓冲液、标记比较的对照表、一次性手套、防污染说明、加样棒或容器、样品制备试管、以及其他任何需要的试剂，如介质、洗涤试剂和浓缩试剂。这些试剂可从本文所描述的试剂中选择，液可以从常规的试剂中选择。在一个优选实施方式中，洗涤试剂是等渗盐溶液，可用于缓冲生理pH，如磷酸缓冲盐(PBS)；洗脱试剂是含0.4MNaCl的PBS，以及浓缩试剂和设备。例如，本发明的技术人员都知道可以使用试剂如聚乙烯甘油(PEG)或NH4SO4，设备如过滤装置。例如，含有100K膜的过滤装置可以浓缩rAAV。
本发明的试剂盒可用于实现本文所描述的方法，也可用于生物分布、流行病学、新型AAV病毒在人和NHP传播模式的研究。
因此，本发明的方法和试剂盒可用于靶病毒序列的检测、鉴定和分离。该方法和试剂盒特别适用于检测、鉴定和分离AAV序列，其中包括新的AAV血清型。
在一个值得注意的实施例中，发明者利用本发明的方法促进了对克隆AAV序列的分析，结果显示不同动物来源的克隆片段之间的原病毒序列具有异质性，所有的序列都与已知的6个AAV血清型不同，其变异区主要集中在衣壳蛋白的超变区。令人吃惊的是AAV序列的分散性在从一个短尾猴的单一组织如淋巴结中分离出来的克隆中特别明显。这种异质性的最好解释是动物个体内AAV序列存在明显的进化，部分可能是由于有限数目的共感染亲本病毒之间发生同源重组。这些研究说明天然AAV感染过程中广泛传播病毒的序列进化可能导致了一群准种的形成，这种准种在衣壳超变区的比对上是互不相同的。这是第一个DNA病毒发生快速分子进化的例子，这种方式以前被认为只发生于RNA病毒。
本文描述了几种用本发明的方法鉴定的新型AAV血清型及其特征。
III.新型AAV血清型
A.核酸序列
本文描述了用本发明的方法所鉴定的新型AAV血清型的核酸序列。见SEQIDNO:1，9-59，以及117-120，本文已纳入作为参考。也可参见图1和表中所列的序列。
新血清型AAV7的全长序列，包括AAV5'ITR，衣壳，rep，和AAV3'ITR显示在SEQIDNO:1中。
对于本发明的其他新的AAV血清型，本文描述了按照本发明的方法分离的约3.1kb的片段。该片段含有编码全长衣壳蛋白的序列和编码rep蛋白的全部或部分序列。这些序列包括下面所鉴定的克隆。
对于其他的新AAV血清型来说，本文描述了编码衣壳蛋白的特征区域。例如，本发明的AAV10核酸序列包含了图1所显示的序列[见SEQIDNO:117，255bp长]。本发明的AAV11核酸序列包含了图1所显示的序列[见SEQIDNO:118，258bp长]。本发明的AAV12核酸序列包含了图1所显示的序列[见SEQIDNO:119，255bp长]。利用本文所描述的方法，AAV10、AAV11和AAV12序列可以很容易地被鉴定，并用于各种目的，如AAV7和本文所描述的其他新血清型所用的各种目的。
图1显示的是本发明的非人灵长类(NHP)AAV核酸序列，以前文献所报道的AAV血清型AAV1[SEQIDNO:6]、AAV2[SEQIDNO:7]和AAV3[SEQIDNO:8]与其一起比对。这些新型NHP序列包括下面表1中所列的序列，该序列是通过克隆数目来鉴定的。
表1
将两个黑猩猩腺病毒的衣壳片段插入到AAVrep载体中得到了一个新型NHP克隆。这个新型克隆A3.1也被称为Ch.5[SEQIDNO:20]。另外，本发明还包括两个人AAV序列，分别被称为H6[SEQIDNO:25]和H2[SEQIDNO:26]。
本发明的AAV核酸序列还包括与图1中所列序列、序列[SEQIDNO:1，9-59，117–120]互补的链以及图1所列序列、序列[SEQIDNO:1，9-59，117-120]及其互补链相应的RNA和cDNA。本发明的核酸序列还包括图1所列序列、序列[SEQIDNO:1，9-59，117-120]及其互补链的天然突变株以及经基因工程修饰的序列。这些修饰包括本领域所熟知的标记、甲基化、以及用变性核苷酸替代一个或多个天然核苷酸。
本发明的核酸序列还包括与图1所列序列、序列[SEQIDNO:1，9-59，117-120]具有大于85％的同一性或同源性的序列，较好的是至少约90％，更好的是至少约95％，最好的是至少约98％-99％的同一性或同源性。这些术语已在本文定义。
本发明还包括用本文所描述的方法鉴定的新型AAV序列的片段。适宜的片段至少要有15个核苷酸的长度，并且包含功能片段，即该片段具有生物学意义。在一个实施方式中，这些片段是图1所列新型序列、序列[SEQIDNO:1，9-59，117-120]、其互补链及其互补的cDNA和RNA的片段。
适宜的片段是那些位于AAV1、AAV2或AAV7上的片段。但是，利用本文所描述的比对方法(用ClustalW程序比对，默认设置)，或与其他新血清型比对的相似方法，本领域的技术人员可以很容易地确定目的片段的起始密码子和终止密码子。
适宜的片段包括编码AAV衣壳三个可变蛋白(vp)的序列，它们具有不同的剪接突变：vp1[即AAV7的nt825to3049，SEQIDNO:1]；vp2[即AAV7的nt1234-3049，SEQIDNO:1]；以及vp3[即AAV7的nt1434-3049，SEQIDNO:1]。值得注意的是AAV7具有不同寻常的起始密码子。除了几个看家基因以外，以前很少报道DNA病毒具有这种起始密码子。其他AAV血清型vp1、vp2和vp3的起始密码子相信也是如此，该特点使其在细胞内产生vp1、vp2和vp3蛋白的比例分别为10％:10％:80％，从而能有效地装配成病毒颗粒。但是，研究表明即使有这个稀有的GTG起始密码子AAV7病毒颗粒也能有效装配。这样，发明者设想是否能改变其他AAV血清型vp3的起始密码子使其含有这个稀有GTG起始密码子，从而提高包装效率，改变病毒颗粒的结构和/或改变其他AAV血清型表面抗原表位(即中和抗体表位)的位置。起始密码子可以通过常规的方法改变，如直接位点突变法。因此，本发明包括经改造的任何所选择的血清型AAV病毒颗粒，其中含有起始密码子变为GTG的vp3和/或再加上vp1和/或vp2。
AAV的其他适宜片段包括含AAV衣壳蛋白起始密码子的片段[即AAV7的nt468-3090，SEQIDNO:1；AAV7的nt725to3090，SEQIDNO:1，以及其他AAV血清型的相应区域]。AAV7和用本文所描述的方法鉴定的其他新型AAV血清型的其他片段包括那些编码rep蛋白的序列，其中包括rep78[即图1中AAV7的起始密码子334]、rep68[图1中AAV7的起始密码子nt334]、rep52[图1中AAV7的起始密码子1006]以及rep40[图1中AAV7的起始密码子1006]。其他感兴趣的片段还有AAV的5'末端反向重复序列ITR[图1中AAV7的nt1-107]；AAV3'ITR[图1中AAV7的nt4704-4721]，P19序列，AAVP40序列，rep结合位点以及末端分辨位点(TRS)。其他适宜的片段对于本领域的技术人员来说是显而易见的。本发明其他新血清型上的相应区域通过参考图1或利用常规的比对方法与本文所描述的序列对照后就可以很容易地确定。
除了包括图中及序列表中所列的核酸序列以外，本发明还包括用于表达本发明AAV血清型的氨基酸序列、蛋白质和多肽的核酸分子和序列。因此，本发明包括编码下列新型AAV氨基酸序列的核酸序列：C1[SEQIDNO:60]，C2[SEQIDNO:61]，C5[SEQIDNO:62]，A3-3[SEQIDNO:66]，A3-7[SEQIDNO:67]，A3-4[SEQIDNO:68]，A3-5[SEQIDNO:69]，3.3b[SEQIDNO:62]，223.4[SEQIDNO:73]，223-5[SEQIDNO:74]，223-10[SEQIDNO:75]，223-2[SEQIDNO:76]，223-7[SEQIDNO:77]，223-6[SEQIDNO:78]，44-1[SEQIDNO:79]，44-5[SEQIDNO:80]，44-2[SEQIDNO:81]，42-15[SEQIDNO:84]，42-8[SEQIDNO:85]，42-13[SEQIDNO:86]，42-3A[SEQIDNO:87]，42-4[SEQIDNO:88]，42-5A[SEQIDNO:89]，42-1B[SEQIDNO:90]，42-5B[SEQIDNO:91]，43-1[SEQIDNO:92]，43-12[SEQIDNO:93]，43-5[SEQIDNO:94]，43-21[SEQIDNO:96]，43-25[SEQIDNO:97]，43-20[SEQIDNO:99]，24.1[SEQIDNO:101]，42.2[SEQIDNO:102]，7.2[SEQIDNO:103]，27.3[SEQIDNO:104]，16.3[SEQIDNO:105]，42.10[SEQIDNO:106]，42-3B[SEQIDNO:107]，42-11[SEQIDNO:108]，F1[SEQIDNO:109]，F5[SEQIDNO:110]，F3[SEQIDNO:111]，42-6B[SEQIDNO:112]，和/或42-12[SEQIDNO:113]，以及利用这些序列和/或其独特片段准备的人工AAV血清型。
如本文所描述，人工AAV血清型包括而不限于具有非天然衣壳蛋白的AAV。这种人工衣壳可以用任何适宜的方法制备，利用本发明的新型AAV序列(即vp1衣壳蛋白的片段)加上异源序列，这些异源序列可以来自其他AAV血清型(已知的或新的)、同一AAV血清型的不连续部分、非AAV病毒、或非病毒序列。人工AAV血清型可能而不限于具有嵌合的AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人工”AAV衣壳。
B.AAV氨基酸序列、蛋白质和多肽。
本发明涉及本文所鉴定的新型AAV血清型核酸序列所编码的蛋白质及其片段，其中包括AAV7[AAV7的nt825-3049，SEQIDNO:1]和本文所描述的其他新血清型。因此，本发明的新血清型的衣壳蛋白包括：H6[SEQIDNO:25]，H2[SEQIDNO:26]，42-2[SEQIDNO:9]，42-8[SEQIDNO:27]，42-15[SEQIDNO:28]，42-5b[SEQIDNO:29]，42-1b[SEQIDNO:30]；42-13[SEQIDNO:31]，42-3a[SEQIDNO:32]，42-4[SEQIDNO:33]，42-5a[SEQIDNO:34]，42-10[SEQIDNO:35]，42-3b[SEQIDNO:36]，42-11[SEQIDNO:37]，42-6b[SEQIDNO:38]，43-1[SEQIDNO:39]，43-5[SEQIDNO:40]，43-12[SEQIDNO:41]，43-20[SEQIDNO:42]，43-21[SEQIDNO:43]，43-23[SEQIDNO:44]，43-25[SEQIDNO:45]，44.1[SEQIDNO:47]，44.5[SEQIDNO:47]，223.10[SEQIDNO:48]，223.2[SEQIDNO:49]，223.4[SEQIDNO:50]，223.5[SEQIDNO:51]，223.6[SEQIDNO:52]，223.7[SEQIDNO:53]，A3.4[SEQIDNO:54]，A3.5[SEQIDNO:55]，A3.7[SEQIDNO:56]，A3.3[SEQIDNO:57]，42.12[SEQIDNO:58]，和44.2[SEQIDNO:59]，可以利用常规的技术从上述列表的克隆中的开放阅读框架来制备。
本发明还包括利用本发明的新型AAV血清型的序列制备的AAV血清型，制备方法包括本领域技术人员所熟知的合成技术、重组技术以及其他技术。本发明并不限于本发明的新型AAV核酸序列所表达的新型AAV氨基酸序列、多肽和蛋白质，也包括用本领域所熟知的其他方法制备的氨基酸序列、多肽和蛋白质，如化学合成技术、其他合成技术或其他方法。例如，下列序列中的任何一个：C1[SEQIDNO:60]，C2[SEQIDNO:61]，C5[SEQIDNO:62]，A3-3[SEQIDNO:66]，A3-7[SEQIDNO:67]，A3-4[SEQIDNO:68]，A3-5[SEQIDNO:69]，3.3b[SEQIDNO:62]，223.4[SEQIDNO:73]，223-5[SEQIDNO:74]，223-10[SEQIDNO:75]，223-2[SEQIDNO:76]，223-7[SEQIDNO:77]，223-6[SEQIDNO:78]，44-1[SEQIDNO:79]，44-5[SEQIDNO:80]，44-2[SEQIDNO:81]，42-15[SEQIDNO:84]，42-8[SEQIDNO:85]，42-13[SEQIDNO:86]，42-3A[SEQIDNO:87]，42-4[SEQIDNO:88]，42-5A[SEQIDNO:89]，42-1B[SEQIDNO:90]，42-5B[SEQIDNO:91]，43-1[SEQIDNO:92]，43-12[SEQIDNO:93]，43-5[SEQIDNO:94]，43-21[SEQIDNO:96]，43-25[SEQIDNO:97]，43-20[SEQIDNO:99]，24.1[SEQIDNO:101]，42.2[SEQIDNO:102]，7.2[SEQIDNO:103]，27.3[SEQIDNO:104]，16.3[SEQIDNO:105]，42.10[SEQIDNO:106]，42-3B[SEQIDNO:107]，42-11[SEQIDNO:108]，F1[SEQIDNO:109]，F5[SEQIDNO:110]，F3[SEQIDNO:111]，42-6B[SEQIDNO:112]，和/或42-12[SEQIDNO:113]，利用各种技术可以很容易地制备。
适宜的制备技术是本领域技术人员所熟知的。见Sambrook等，分子克隆:实验室手册，冷泉港出版社(冷泉港，NY)。另外，多肽也可以用大家所熟知的固相多肽合成方法合成(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85:2149(1962)；Stewart和Young，固相肽合成(SolidPhasePeptideSynthesis)(Freeman，旧金山，1969)，27-62页)。这些方法和其他适宜的制备方法是本领域技术人员所熟知的，并不是对本发明的限制。
特别优选的蛋白质包括由上述方法鉴定的核苷酸序列编码的AAV衣壳蛋白。本发明的许多衣壳蛋白的序列列在图2和/或序列表的SEQIDNO:2和60-115中，本文已纳入作为参考。AAV衣壳由三种蛋白质组成，vp1、vp2和vp3，它们是选择性的剪接突变株。这些图中所列的全长序列是vp1的序列。基于AAV7衣壳[SEQIDNO:2]的编号，vp2的序列跨越AAV7的氨基酸138-737，vp3的序列跨越AAV7的氨基酸203-737。根据这一信息，本领域的技术人员可以很容易地确定vp2和vp3在本发明的其他新型血清型上的位置。
衣壳蛋白的其他优选蛋白和片段包括位于两个超变区(HPV)之间的恒定区和可变区以及HPV区本身的序列。利用一种分析AAV2上序列分散区域的算法检测出了12个超变区(HVR)，其中5个与以前所描述的可变区有重叠或是其一部分[Chiorini等，J.Virol，73:1309-19(1999)；Rutledge等，J.Virol.，72:309-319]。利用这种算法和/或本文所描述的比对方法，可以确定新型AAV血清型的HVR。例如，对于AAV2的vp1[SEQIDNO:70]来说，HVR的位置如下：HVR1，aa146-152；HVR2，aa182-186；HVR3，aa262-264；HVR4，aa381-383；HVR5，aa450-474；HVR6，aa490-495；HVR7，aa500-504；HVR8，aa514-522；HVR9，aa534-555；HVR10，aa581-594；HVR11，aa658-667；以及HVR12，aa705-719。根据由传统方法推算出的比对方法和本文所描述的新型序列[见图2]，可以很容易地确定HVR在本发明的新型AAV血清型上的位置。例如，根据图2，可以很容易地确定HVR在AAV7上的位置，HVR1位于aa146-152；HVR2位于aa182-187；HVR3位于aa263-266，HVR4位于aa383-385，HVR5位于aa451-475；HVR6位于aa491-496；HVR7位于aa501-505；HVR8位于aa513-521；HVR9位于aa533-554；HVR10位于aa583-596；HVR11位于aa660-669；HVR12位于aa707-721。根据本文所提供的信息，其他新型AAV血清型的HVR也很容易确定。
另外，在衣壳内也鉴定出了具有同一性的氨基酸表达盒。这些表达盒很有意义，因为可以利用它们构建人工血清型，比如用一种血清型的HVR1表达盒替代另一种血清型的HVR1表达盒。这些表达盒的同一性在图1的HVR2中有显示。见图2。如果用ClustalX比对方法，则该方法有一个位于序列下的标尺，起始于第一个残基，并标识为1。标尺上的线用于标记高度保守的区域。使用了三种字符(*、:、.)，“*”代表单一的完全保守的位置；“:”代表完全保守的一个“强”组，“.”代表完全保守的一个“弱”组。在GonnetPam250矩阵中有全部的正分组。强组的分数大于0.5，弱组的分数小于0.5。
另外，AAV衣壳其他适宜的片段包括AAV2[SEQIDNO:70]上的aa24-42，aa25-28；aa81-85；aa133-165；aa134-165；aa137-143；aa154-156；aa194-208；aa261-274；aa262-274；aa171-173；aa413-417；aa449-478；aa494-525；aa534-571；aa581-601；aa660-671；aa709-723。其他的优选片段包括AAV7上的aa1-184，aa199-259；aa274-446；aa603-659；aa670-706；aa724-736；aa185-198；aa260-273；aa447-477；aa495-602；aa660-669；以及aa707-723。根据AAV7[SEQIDNO:2]的编号，其他优选的区域还可以旋子含有如下片段的一组：aa185-198；aa260-273；aa447-477；aa495-602；aa660-669；以及aa707-723。利用默认设置的ClustalX程序或默认设置的其他商业的或公共的比对软件，根据本文所比对的序列，可以很容易地确定本发明的新型AAV衣壳中的相应片段。
其他优选的蛋白质是AAVrep蛋白[AAV7SEQIDNO:3的aa1-623]及其功能片段，包括SEQIDNO:3的aa1-171，aa172-372，aa373-444，aa445-623。优选的这种片段是具有至少8个氨基酸长度的。见图3。利用本文所描述的技术和本领域所熟知的技术，可以确定本发明的其他新型AAV蛋白上的类似区域。另外，也可以使用其他所需要长度的片段。这些片段可以通过重组方法或其他适宜的方法如化学合成方法制备。
本发明的序列、蛋白或片段可以通过任何适宜的方法制备，包括重组方法、化学合成方法或其他合成方法。这些制备方法都是本领域技术人员所熟知的，并不代表对本发明的限制。
IV.具有新型AAV衣壳的rAAV的制备
本发明包括通过本发明的方法鉴定的新的野生型的AAV血清型，这些野生型AAV血清型的序列不含有天然病毒所具有的DNA和/或细胞组分。本发明的另一个方面涉及利用本发明的新型AAV序列，包括其片段制备用于将异源基因或其他核酸序列导入到靶细胞内的分子。
本发明的分子含有本发明的新型AAV血清型序列，其中包括任何能被导入到宿主细胞内的基因元件(载体)，如裸DNA、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、游离体、非病毒转移载体内的蛋白(即脂质载体)、病毒等，这些分子可以转移其所携带的序列。载体可通过任何适宜的方法转导，包括转染、电穿孔、脂质体转移、膜融合、高电压的DNA包被颗粒、病毒感染和原生质融合。用于实施本发明的任何实施方式的方法都是核酸操作技术领域的技术人员所熟知的，包括基因工程技术、重组工程技术及合成技术，Sambrook等，分子克隆:实验室手册，冷泉港出版社，冷泉港，NY。
在一个实施方式中，本发明的载体含有编码本发明新型AAV衣壳的序列(即衣壳的AAV7衣壳，AAV44-2(rh.10)，AAV10衣壳，AAV11衣壳，AAV12衣壳)，或一种或多种这些AAV衣壳的片段。另外，载体还可以含有衣壳蛋白及其片段。
本发明的载体还可以含有编码AAVrep蛋白的序列。这种rep序列可以来自于具有rep序列的同一AAV血清型。另外，本发明的载体所含有的rep序列与cap序列还可以来自于不同的AAV血清型。在一个实施方式中，rep和cap序列是不同表达来源的(即不同的载体，或一个宿主细胞和一个载体)。在另外一个实施方式中，这些rep序列和cap序列的表达来源相同。在这种实施方式中，rep序列可以和不同AAV血清型的cap序列在一个框架内熔合形成一个嵌合的AAV载体。另外，本发明的载体还可以含有一个小基因，这个小基因包含一个筛选基因，AAV5'ITR和AAV3'ITR位于其两侧。
因此，在一个实施方式中，本文所描述的载体含有编码完整AAV衣壳的核酸序列，该衣壳可以来自单一的AAV血清型(即AAV7或其他的新型AAV)。另外，这些载体还可以含有编码人工衣壳的序列，这种衣壳是由AAV7(或其他新型AAV)衣壳的一个或多个片段与异源AAV或非AAV衣壳蛋白(或片段)熔合而成的。这些人工的衣壳蛋白选自AAV7(或其他新型AAV)衣壳的不连续部分或其他AAV血清型的衣壳。例如，我们可能希望修饰一个或多个AAVvp1上的编码区，即一个或多个超变区上的编码区(HPV1-12)，或vp2，和/或vp3。在另外一个实施方式中，我们可能希望将vp3的起始密码子改变成GTG。这些修饰可能能够增加表达量，产出量，和/或改善蛋白在选择性表达系统中的纯化，或者其他目的(如改变包涵体或改变中和抗体表位)。
本文所描述的载体即质粒可用于各种目的，但是特别适用于制备含衣壳的rAAV，该衣壳具有AAV序列或其片段。这些载体，包括rAAV、其元件、构建体及其应用，在本文中都有详细描述。
本发明的一个方面涉及制备具有AAV血清型7(或其他新型AAV)衣壳或其片段的重组腺伴随病毒(AAV)。这种方法包括培养宿主细胞，该细胞含有编码如本文所定义的腺伴随病毒(AAV)血清型7(或其他新型AAV)衣壳蛋白或其片段的核酸序列；具有功能的rep基因；至少含有AAV末端反向重复序列(ITR)和转基因的小基因；以及足够的辅助功能以便于将小基因包装导AAV7(或其他新型AAV)的衣壳蛋白内。
需要在宿主细胞内培养并将AAV小基因包装到AAV衣壳内的组分可用转导的方式提供给宿主细胞。另外，所需组分的任何一种或多种(即小基因，rep序列，cap序列，和/或辅助功能)也可以通过一种稳定的宿主细胞提供，该细胞经基因改造后含有一种或多种所需要的组分，改造方法是本领域技术人员所熟知的。最好的这种稳定宿主细胞所含有的所需组分应该位于可诱导的启动子控制之下。但是，所需组分也可以位于其自身组成启动子控制之下。适宜的可诱导启动子和自身组成启动子在本文的转基因适宜调节元件的讨论部分有描述。另外，选择性稳定的宿主细胞还可以含有自身组成启动子控制下的可选组分以及一个或多个可诱导启动子控制下的其他可选组分。例如，稳定的宿主细胞可以来源于293细胞(该细胞含有E1辅助功能，位于自身组成启动子控制之下)，但是它也含有可诱导启动子控制之下的rep和/或cap蛋白。其他稳定的宿主细胞本领域的技术人员也可以制备。
制备本发明rAAV所需要的小基因、rep序列、cap序列以及辅助功能可以任何基因元件的形式导入到包装细胞内，这些元件可以将所携带的序列导入到细胞内。这些选择性的基因元件可以通过任何适宜的方法导入，包括本文所描述的方法。用于实施本发明的任何实施方式的方法都是核酸操作技术领域的技术人员所熟知的，包括基因工程技术、重组工程技术及合成技术，见Sambrook等，分子克隆:实验室手册，冷泉港出版社，冷泉港，NY。同样，制备rAAV病毒颗粒的方法也是本领域所熟知的，选择何种适宜的方法不代表对本发明的限制。见K.Fisher等，J.Virol.，70:520-532(1993)和美国专利5,478,745号。
A.小基因
小基因至少由转基因及其调节序列、AAV5'和3'末端反向重复序列(ITR)组成。正是这个小基因被包装到衣壳蛋白中并被导入到选择性的宿主细胞内。
1.转基因
转基因是一种核酸序列，与其两侧的载体序列不同源，编码目的多肽、蛋白或其他产物。核酸编码序列通过人工方式连接上调节元件，这些调节元件可以使转基因在宿主细胞内转录、翻译和/或表达。
转基因的组成根据其载体用途的不同而不同。例如，一种类型的转基因序列包含一个报告基因序列，其表达后可以产生一个可检测信号。这种报告基因包括而不限于编码下列蛋白的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸腺激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、膜结合蛋白如CD2、CD4、CD8、流感血凝素蛋白以及本领域所熟知的直接存在的或通过常规方法制备的高亲和力抗体可以结合的其他蛋白，含有膜结合蛋白与血凝素或Myc来源的抗原标签区适当熔合而形成的融合蛋白。
这些编码序列与控制其表达的调节序列结合后就可以提供能用常规方法检测的信号，包括酶催化分析方法、放射性同位素测定方法、比色法、荧光或其他化学发光法、荧光活化细胞分类分析方法、免疫分析方法如酶联免疫分析方法(ELISA)、放射免疫分析方法(RIA)和免疫组化分析方法。例如，当标记序列是LacZ基因时，带有这个信号的载体可以通过分析β半乳糖苷酶的活性来检测。当转基因是绿色荧光蛋白或荧光素酶时，携带该信号的载体发出的颜色或光信号可在显微镜下观察到。
但是，转基因也可以是非标记序列，编码用于生物学或药学的产物，如蛋白、多肽、RNA、酶或催化RNA。优选的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNAs，和反义RNAs。一个有用的RNA序列的例子是能灭活被处理动物体内靶核酸序列的表达的RNA。
转基因可用于矫正或改善基因缺陷，其中包括正常基因表达水平低于正常值的基因缺陷或功能基因产物不表达的基因缺陷。一种优选的转基因序列编码治疗性蛋白或多肽，该蛋白或多肽在宿主细胞内表达。本发明还涉及使用多个基因以矫正或改善由多亚单位蛋白引起的基因缺陷。在某些情况下，不同的转基因用于编码蛋白的不同亚单位，或编码不同的多肽或蛋白。比较理想的是编码蛋白亚单位的DNA较大，如免疫球蛋白、血小板来源的生长因子或营养障碍蛋白。为了使细胞产生多亚单位的蛋白质，需要用能同时表达不同亚单位的重组病毒转染细胞。另外，蛋白的不同亚单位也可以用同一转基因编码。在这种情况下，这一个转基因包含了编码不同亚单位的DNA，编码每个亚单位的DNA用内部核糖体结合位点(IRES)分隔开。我们也希望编码每个亚单位的DNA是较小的，如编码亚单位的DNA和IRES的总大小在5kb以内。除了IRES外，DNA也可以用编码2A多肽的序列分隔开，这个多肽在翻译后可以自身裂解。见M.L.Donnelly等，J.Gen.Virol.，78(第一部分):13-21(1997.1)；Furler，S等，GeneTher.，8(11):864-873(2001.6)；KlumpH等，GeneTher.，8(10):811-817(2001.5)。这个2A多肽比IRES小很多，因此很适于片段大小成为限制因素的时候。但是，选择性转基因可以编码任何具有生物活性的产物或其他产物，如用于研究的产物。
本领域的技术人员可以很容易地选择适宜的转基因。转基因的选择不意味着对本发明的限制。
2.调节元件
除了上述小基因的主要元件以外，载体还可以含有一些必须的常规控制元件，这些元件人工连接到转基因上，控制其在转染质粒载体或感染本发明的病毒的细胞内的转录、翻译和/或表达。如本文所述，人工连接的序列包括与转基因相邻的表达控制序列和反式作用的表达控制序列或在远端调节转基因的表达控制序列。
表达控制序列包含适当的转录起始点、终止点、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号如剪接位点和多聚腺苷酸(polyA)信号；稳定胞浆mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；提高蛋白稳定性的序列；如果需要还可以含有增加编码产物分泌的序列。有许多表达控制序列，包括本领域所熟知的天然的、自身组成的、可诱导的和/或组织特异性的启动子都可以使用。
自身组成启动子的例子包括而不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(还可以加上增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(还可以加上增强子)[见Boshart等，Cell，41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、以及EF1α启动子[Invitrogen]。
可诱导启动子能够调节基因的表达，并且其本身也可以被外源添加的化合物、环境中的因子所调节，这些因素包括温度、或特异性的生理状态如急性期、细胞的分化阶段或只有在复制的细胞内。可诱导启动子和可诱导系统可从许多公司获得，其中有Invitrogen、Clontech和Ariad。其他许多系统也有报道，本领域的技术人员很容易选择。能被外源添加启动子调节的可诱导启动子包括锌诱导的绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导的鼠乳腺致癌因子(MMTV)启动子、T7多聚酶启动子系统[WO98/10088]、昆虫蜕皮激素启动子[No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:3346-3351(1996)]、四环素可抑制系统[Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:5547-5551(1992)]、四环素可诱导系统[Gossen等，Science，268:1766-1769(1995)，也参见Harvey等，Curr.Opin.Chem.Biol.，2:512-518(1998)]、RU486可诱导系统[Wang等，Nat.Biotech.，15:239-243(1997)和Wang等，GeneTher.，4:432-441(1997)]以及雷怕霉素可诱导系统[Magari等，J.Clin.Invest.，100:2865-2872(1997)]。其他可用于本发明的可诱导启动子是那些由特异性的生理状态所调节的启动子，如稳定、急性期、细胞的特定分化状态或复制状态。
在另外一个实施方式中所使用的是转基因本身的天然启动子。如果只是想要使转基因达到天然的表达水平，那么天然启动子是优选的。如果转基因的表达必须受暂时的调节、发育的调节、或以组织特异的方式调节、或者受某种特异性的转录刺激信号的调节，那么也可以用天然的启动子。在另外一个实施方式中，也可以用其他的天然表达控制元件如增强子、多聚腺苷酸位点或Kozak共有序列来模拟天然表达。
转基因的另外一个实施方式是将转基因与组织特异性启动子相连接。例如，如果希望在骨骼肌内表达，应该使用在肌肉组织内有活性的启动子。这些启动子包括编码下列蛋白质的基因的启动子：骨骼肌β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、营养不良素、肌肉肌酸激酶、以及比天然启动子活性高的合成的肌肉启动子(见Li等，Nat.Biotech.，17:241-245(1999))。已知的组织特异性启动子是肝组织特异性的(白蛋白，Miyatake等，J.Virol.，71:5124-32(1997)；乙型肝炎核启动子，Sandig等，GeneTher.，3:1002-9(1996)；α-甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等，Hum.GeneTher.，7:1503-14(1996))，骨钙素(Stein等，Mol.Biol.Rep.，24:185-96(1997))；骨唾液蛋白(Chen等，J.BoneMiner.Res.，11:654-64(1996))，淋巴细胞特异性的(CD2，Hansal等，J.Immunol.，161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体α链)，神经元特异性的如神经元特异性的烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等，Cell.Mol.Neurobiol.，13:503-15(1993))，神经丝轻链基因(Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88:5611-5(1991))，以及神经元特异性的vgf基因(Piccioli等，Neuron，15:373-84(1995))。
另外，携带治疗性转基因的质粒也可以包含选择标记基因或报告基因，如编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素(purimycin)耐药的序列。这种选择报告基因或标记基因(优选位于基因组的外面以便于用本发明的方法恢复)可用于显示细菌细胞内是否存在质粒，如氨苄青霉素耐药基因。质粒的其他元件还可以包括复制起点。这些元件和其他的启动子以及载体元件的选择是常规的，有许多可以供选择[见Sambrook等，本文已引用作为参考]。
转基因、启动子/增强子、以及5'和3'ITR一起被称为“小基因”以便于本文参考。根据本发明的提示，通过常规的技术可以设计出这种小基因。
3.将小基因导入包装宿主细胞内
小基因可以插入到任何适宜的载体内，如质粒内，然后被导入到宿主细胞内。用于本发明的质粒可以经基因工程改造以使其能在原核细胞、或哺乳动物细胞、或者在两者内复制并整合。这些质粒(或携带5'AAVITR-异源分子-3'ITR)含有能使小基因在真核细胞和/或原核细胞内复制的序列以及这些系统的筛选标记。筛选标记或报告基因可以包括编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素耐药的序列。质粒还可以含有可用于显示细菌细胞内是否存在质粒的某种选择报告基因或标记基因，如氨苄青霉素耐药基因。质粒的其他元件包括复制起点和扩增子，如EpsteinBarr病毒核抗原的扩增子系统。这种扩增子系统或其他类似的扩增子元件使载体在细胞内以游离体形式高拷贝复制。携带小基因的分子优选转染到细胞内，其在细胞内可以是瞬时存在的。另外，小基因(携带5'AAVITR-源分子-3'ITR)可以稳定整合到宿主细胞的基因组内，或者是整合到染色体上，或者以游离体的形式存在。在某些实施方式中，小基因以多拷贝的形式存在，形成头-头相连、头-尾相连或尾-尾相连的串联体。适宜的转染技术是大家所熟知的，都可用于将小基因转染到宿主细胞内。
当以转染的方式转导含小基因的载体时，EpsteinBarr载体一般的量为约5μg到100μgDNA，优选约10到50μgDNA，细胞数约为1×104到1×1013，优选约105个细胞。但是，载体DNA与宿主细胞的相对量可以调整，这主要考虑所选择的载体、转导方法、所选择的宿主细胞等因素。
B.rep和cap序列
除了小基因以外，宿主细胞还含有驱动新型AAV衣壳蛋白(如AAV7或其他新型AAV衣壳，或含有一个或多个这种衣壳的片段的人工衣壳蛋白)宿主细胞内表达的序列以及与小基因内AAVITR的血清型来源相同的rep序列。AAV的cap序列和rep序列可以各自独立地从一个AAV来源中获得，然后用上面所描述的本领域技术人员所熟知的任何方法导入到宿主细胞内。另外，当假设一类本发明的新型AAV衣壳时，编码每一rep蛋白的序列可以来源于同一AAV血清型，也可以来源于不同的血清型(如AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6或本文所鉴定的一个新血清型)。例如，rep78/68序列可以来自AAV2，而rep52/40序列可以来自AAV1。
在一个实施方式中，宿主细胞稳定地表达适宜启动子控制下的衣壳蛋白，如上面所描述的。在这个实施方式中，衣壳蛋白最好位于可诱导启动子的控制之下。在另一个实施方式中，衣壳蛋白以反式方式提供给宿主细胞。当以反式方式导入到宿主细胞内时，衣壳蛋白可以通过质粒导入，该质粒含有调节衣壳蛋白在宿主细胞内表达的必须序列。当以反式方式导入到细胞内时，携带衣壳蛋白的质粒最好也携带rAAV包装所必须的其他序列，如rep序列。
在另外一个实施方式中，宿主细胞稳定地包含适宜启动子控制下的rep序列，如上面所描述的。在这个实施方式中，rep蛋白最好位于可诱导启动子的控制之下。在另一个实施方式中，rep蛋白以反式方式提供给宿主细胞。当以反式方式导入到宿主细胞内时，rep蛋白可以通过质粒导入，该质粒含有调节rep蛋白在宿主细胞内表达所必须的序列。当以反式方式导入到细胞内时，携带衣壳蛋白的质粒最好也携带rAAV包装所必须的其他序列，如rep序列和cap序列。
因此，在一个实施方式中，rep和cap序列位于同一条核酸分子上被转染到宿主细胞内，并且以游离体的形式稳定地存在。在另外一个实施方式中，rep和cap序列稳定地整合到宿主细胞的基因组内。还有一个实施方式，rep和cap序列在宿主细胞内的表达是瞬时的。例如，一种经这种方式转染的核酸分子含有一个5'到3'的启动子，选择地添加一个插入片段，该片段位于启动子和rep基因、AAVrep基因和AAVcap基因的起始位点之间。
另外，含有rep和/或cap序列的载体还可以含有其他需要被导入到宿主细胞内的序列。例如，载体可以包括带有小基因的rAAV构建体。载体可以含有一个或多个编码辅助功能的基因，如腺病毒蛋白E1，E2a，和E4ORF6，以及VAIRNA基因。
用于这个构建体中的启动子可以是本领域技术人员所熟知的或上面所描述的任何组成启动子、可诱导启动子或天然启动子。在一个实施方式中使用的是AAVP5启动子。选择那种AAV来提供这些序列不是对本发明的限制。
在另外一个优选实施方式中，rep的启动子是一种可诱导启动子，如上面所描述的那样与转基因调节元件相连接。控制rep表达的一个优选启动子是T7启动子。含有cap基因和T7启动子控制的rep基因的载体转染或转化到细胞内可以表达T7多聚酶。见WO98/10088，出版日1998年3月12日。
插入片段在载体的设计中是一个可选择的元件。插入片段是一个插在启动子和rep基因ATG起始位点之间的DNA序列。可以按照需要任意设计，就是说它可以是随机序列的核苷酸，也可以是编码基因产物如标记基因的序列。插入片段可以含有带起始/终止位点和polyA位点的基因。插入片段可以是来源于原核细胞或真核细胞的非编码DNA序列、重复的非编码序列、无转录控制的编码序列或有转录控制的编码序列。插入片段来源的两个例子是λ噬菌体梯级序列和酵母梯级序列，这两个插入片段可以买到，如从Gibco或Invitrogen等公司购买。插入片段可以是任何长度的，只要它能够足以降低rep78和rep68基因的表达，使rep52、rep40和cap基因达到正常表达水平。因此，插入片段的长度范围可以从约10bp到约10.0kb，优选约100bp到约8.0kb。为了降低重组的可能性，插入片段最好小于2kb，但是，本发明并不对此作限制。
尽管rep和cap的分子可以瞬时存在于宿主细胞内(如通过转染)，但是最好是rep蛋白和cap蛋白中的一个或两个以及控制其表达的启动子能在宿主细胞内稳定表达，即作为游离体存在于宿主细胞内或整合到宿主细胞染色体内。构建本发明的该实施方式的方法是常规的基因工程技术或重组工程技术，如上面参考文献所描述的那些技术。虽然本说明书举例说明了一些特异的构建体，但是本领域的技术人员根据本文所描述的内容，选择插入片段、P5启动子以及其他元件，至少包括一个翻译起始信号和一个终止信号以及任选添加多聚腺苷酸位点，就可以选择和设计其他适宜的构建体。
在本发明的另外一个实施方式中，宿主细胞可以稳定地提供rep或cap蛋白。
C.辅助功能
包装宿主细胞还需要辅助功能才能包装本发明的rAAV。这些功能还可以由疱疹病毒提供。必须的辅助功能最好是人或非人灵长类动物腺病毒来源的，如上面所描述的那些和/或其他来源，包括美国模式培养物保藏所(ATCC)，Manassas，VA(US)。在当前的一个优选实施方式中，宿主细胞提供和/或含有E1a、E1b、E2a和/或E4ORF6基因产物。宿主细胞可以含有其他的腺病毒基因，如VAIRNA，但这些基因不是必须的。在一个优选实施方式中，宿主细胞没有其他的腺病毒基因或基因功能。
表达E1a基因产物的腺病毒DNA是指任何编码E1a或任何功能性E1a蛋白的腺病毒序列。表达E2a基因产物的腺病毒DNA和表达E4ORF6基因产物的腺病毒DNA的定义也是一样的。另外还包括腺病毒基因或其功能片段的任何等位基因或其他修饰序列。这种修饰可以通过常规的基因工程技术或突变技术故意引入以便于以某些方式增强腺病毒的功能，也可是是天然发生的等位基因突变。这种修饰的DNA及其修饰方法是本领域技术人员所熟知的。
腺病毒E1a，E1b，E2a和/或E4ORF6基因产物以及其他任何希望的辅助功能可以通过使其在细胞内表达的任何方式提供。编码这些产物的每个序列可以是在不同的载体上，也可以是在同一个载体上的一个或多个基因。载体可以是本领域所熟知的或本文所描述的任何载体，包括质粒、粘粒和病毒。载体导入到宿主细胞可以通过本领域所熟知的或本文所描述的任何方法实现，如转染、感染、电穿孔、脂质体转导、膜融合技术、高压DNA包被颗粒、病毒感染和原生质融合等。一个或多个腺病毒基因可以稳定地整合到宿主细胞基因组内，以游离体的形式稳定表达或瞬时表达。基因产物可能全部是瞬时表达的，也可能全部是在游离体内表达的或稳定整合的，还可能是一部分基因产物稳定表达而另一部分基因产物瞬时表达。而且，每个腺病毒基因的启动子都是独立选择的，可以是组成启动子、可诱导启动子或天然腺病毒启动子。启动子可以被生物体或细胞的特殊生理状态调节(如分化状态或复制和静止状态)，或者被外源添加的因子所调节。
D.宿主细胞和包装细胞系
宿主细胞本身可以来源于任何生物体，包括原核细胞(如细菌)、真核细胞，如昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。特别优选的宿主细胞选自任何哺乳动物，包括而不限于A549，WEHI，3T3，10T1/2，BHK，MDCK，COS1，COS7，BSC1，BSC40，BMT10，VERO，WI38，HeLa，293细胞(可以表达功能性的腺病毒E1)，Saos，C2C12，L细胞，HT1080，HepG2以及来源于哺乳动物包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。提供宿主细胞的哺乳动物物种不是对本发明的限制，哺乳动物细胞的类型也不是对本发明的限制，如成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞等。宿主细胞最好不含除E1、E2a和/或E4ORF6之外的任何腺病毒基因，也不含在rAAV产生过程中能与污染病毒发生同源重组的任何其他病毒的基因；宿主细胞能感染或转染DNA并能使转染的DNA表达。在一个优选实施方式中，宿主细胞是稳定转染rep和cap的细胞。
一种用于本发明的细胞是稳定转化编码rep和cap序列的宿主细胞，该细胞转染了E1、E2a和/或E4ORF6以及携带上述小基因的构建体。稳定表达rep和/或cap的细胞系，如B-50(PCT/US98/19463)或那些美国专利No.5,658,785所描述的细胞也同样适用。另外一个优选的宿主细胞含有最少的腺病毒DNA，这种DNA足以表达E4ORF6。利用本发明的新型AAVrep和cap序列还可以构建出其他的细胞系。
本发明的宿主细胞的制备方法包括选择性DNA序列的装配。这种装配可以利用常规技术。包括cDNA和基因组克隆技术，这是大家所熟知的，在Sambrook等中也有描述，利用了腺病毒和AAV基因组的重叠寡核苷酸序列，结合使用聚合酶链式反应、合成方法以及能提供所需核苷酸序列的任何其他适宜方法。
分子(质粒或病毒)导入宿主细胞也可以用熟练技术人员所熟知的以及整个说明书中所讨论的技术进行。在一个优选实施方式中使用的是标准转染技术，如CaPO4转染或电穿孔方法，和/或通过腺病毒/AAV载体杂合体感染细胞系如人胚胎肾细胞系HEK293(一种含功能性腺病毒E1基因的人肾细胞系，该基因编码顺式作用的E1蛋白)。
这些本领域技术人员制备的新型AAV来源的载体有益于将基因导入到所选择的细胞内并用于病人的基因治疗，因为在人群中还没有发现AAV7的中和抗体。而且，早期的研究表明在短尾猴和黑猩猩中也没有中和抗体，猕猴中AAV7的交叉反应性低于15％，这个血清型是从该物种中分离出来的。本领域的技术人员利用其熟知的技术可以很容易地制备含本文所描述的AAV7衣壳蛋白的其他rAAV病毒载体。用本发明的其他新型AAV制备的载体也具有同样的优点。
因此，本领域的技术人员很容易理解本发明的AAV7序列适于制备这些载体及其他病毒载体，用于体外和体内的基因转移。同样，本领域的技术人员也容易选择本发明新型AAV基因组的其他片段用于各种rAAV及非rAAV载体系统。这些载体包括慢病毒、逆转录病毒、痘病毒、痘苗病毒等。选择何种病毒系统不是对本发明的限制。
因此，本发明还涉及利用本发明的新型AAV的核酸和氨基酸序列制备的载体。这种载体有各种用途，包括转移治疗分子和用于制备疫苗。转移治疗分子优选含本发明新型AAV衣壳的重组AAV。这些载体或其他含本发明的新型AAV序列的载体也可用于疫苗治疗方案，如和细胞因子共转染或转染免疫原自身。
V.重组病毒及其应用
利用本文所描述的方法，本领域的技术人员可以制备含本发明的新型血清型衣壳或带有用本发明的方法鉴定的AAV血清型的一个或多个新型片段的新型衣壳的rAAV。在一个实施方式中，所用的全长衣壳来自一个血清型即AAV7[SEQIDNO:2]。在另一个实施方式中，全长的衣壳是通过将本发明的一种新型血清型的一个或多个片段与其他AAV血清型的序列融合在一个框架内而制备的。例如，一种rAAV可以含有本发明的一种AAV血清型的一个或多个新型超变区。另外，本发明的独特AAV血清型也可用于含其他病毒或非病毒序列的载体中。
本领域的技术人员很容易理解包含本发明的某种特定血清型的实施方式特别适用于某种特定的目的。例如，本发明AAV7衣壳来源的载体特别适用于肌肉中，而本发明的rh.10(44-2)衣壳来源的载体特别适用于肺。这种载体的使用没有如此的限制，本领域的技术人员也可将这些载体用于其他类型的细胞、组织或器官中。而且，本发明的其他衣壳来源的载体也可用于转染这些及其他细胞、组织或器官。
A.转基因的传递
本发明的另外一个方面涉及向宿主传递转基因的方法，包括用本发明的AAV序列制备的载体转染或感染所选择的宿主细胞。基因转移方法是本领域技术人员所熟知的，并不代表对本发明的限制。
在一个优选实施方式中，本发明提供了一种用AAV介导的转移方法将转基因导入到宿主中的方法。该方法包括用重组病毒载体转染或感染所选择的宿主细胞，该载体含有控制序列控制下的选择转基因，控制序列可以调节转基因和AAV衣壳蛋白的表达。
宿主来源的样品还可以选择地分析其是否存在所选AAV血清型的抗体。各种检测中和抗体方法是本领域技术人员所熟知的。分析方法的选择不意味着对本发明的限制。见Fisher等，NatureMed.，3(3):306-312(1997.3)和W.C.Manning等，HumanGeneTherapy，9:477-485(1998.3.1)。分析结果可用于确定含一种特定血清型衣壳蛋白的AAV载体是否适于基因转移，即是否不存在该血清型衣壳特异性的抗体。
在本方法的一个方面，具有所选AAV衣壳蛋白的载体的转移可以在通过含不同AAV血清型衣壳蛋白的载体转移一个基因之前或之后进行。因此，通过rAAV载体转移基因的方法可以向一个宿主细胞中重复转移基因。后转移的rAAV载体可以携带与第一个rAAV载体相同的基因，但其所含有的衣壳蛋白和第一个载体的衣壳蛋白可以具有不同的血清型来源。例如，如果第一个载体具有AAV7衣壳蛋白[SEQIDNO:2]，后转移的载体所含有的衣壳蛋白可以选自其他血清型，如AAV1，AAV2，AAV3A，AAV3B，AAV4，AAV6，AAV10，AAV11，和AAV12，以及本文所鉴定的任何其他新型AAV衣壳，包括而不限于A3.1，H2，H6，C1，C2，C5，A3-3，A3-7，A3-4，A3-5，3.3b，223.4，223-5，223-10，223-2，223-7，223-6，44-1，44-5，44-2，42-15，42-8，42-13，42-3A，42-4，42-5A，42-1B，42-5B，43-1，43-12，43-5，43-21，43-25，43-20，24.1，42.2，7.2，27.3，16.3，42.10，42-3B，42-11，F1，F5，F3，42-6B，和/或42-12。
上述重组载体可用文献报道的方法导入到宿主细胞内。RAAV最好凝胶、悬浮于生理相容性的介质中，然后注射给患病的人或非人哺乳动物。本领域的技术人员可以根据转移的病毒来选择适宜的介质。例如，适宜的介质包括盐溶液，可以用各种缓冲液(如磷酸盐缓冲液)混和制成制剂。其他的介质包括无菌盐溶液、乳糖溶液、蔗糖溶液、磷酸钙溶液、葡萄糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油、以及水。介质的选择不意味着对本发明的限制。
除了rAAV和介质外，本发明的组合物还可以含有其他常规的药用组分，如防腐剂或化学稳定剂。适宜的防腐剂包括三氯叔丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚以及对氯酚。适宜的化学稳定剂包括凝胶和白蛋白。
病毒载体应以足够的量转染细胞才能得到足够高的转染效率和表达水平，这样才能获得无意外副作用的治疗效果，或达到可预期的生理效应，医学领域的技术人员可以确定这些效果。常规的和药用的给药途径包括而不限于直接注射到所选器官(如静脉灌注到肝脏)、口服、吸入(包括鼻内吸入和气管内吸入)、滴眼、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、真皮内注射以及其他系统给药途径。如果需要也可以联合使用几种给药途径。
病毒载体的剂量主要根据所患疾病的种类、病人的年龄、体重和健康状况等因素确定，不同的病人剂量也不同。例如，病毒载体治疗人的有效剂量一般约在1ml到100ml溶液之间，所含有的病毒数约为1×109-1×1016。优选的人体剂量约为1013-1×1016AAV基因组。根据治疗效果及副作用的平衡可以调整剂量，这种剂量根据重组病毒所要达到的治疗目的不同而不同。可以监测转基因的表达水平来确定给药的频率，优选含有小基因的AAV载体。也可以用与治疗方案相同的剂量方案进行免疫。
本发明的含AAV的载体转染进行治疗或免疫的例子在下面有描述。这些载体可用于各种治疗方案或疫苗免疫方案，如本文所描述。另外，这些载体还可以和所需治疗和/或疫苗方案中的一种或多种其他载体或活性组分一起给药。
B.治疗性转基因
转基因编码的治疗产物包括激素和生长因子及分化因子，其中包括而不限于胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GFR)、促性腺激素(FSH)、黄体化激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、促进血管生成素、血管抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子I和I(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子β超家族的任一成员、包括TGFβ、苯丙酸诺龙、抑制素、骨形态发生蛋白(BMP)BMPs1-15的任意一个、生长因子的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族的任意一个、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、neurturin、集聚蛋白、脑信号蛋白/瓦解蛋白家族的任意一员、导蛋白-1和导蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、sonichedgehog和酪氨酸水解酶。
其他有用的转基因产物包括能调节免疫系统的蛋白质，其中包括而不限于细胞因子和淋巴因子，如血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL)IL-1到IL-25(包括IL-2，IL-4，IL-12，和IL-18)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、Fas配基、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配基。免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。其中包括而不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合的免疫球蛋白、人源化的抗体、单链抗体、T细胞抗体、I类和II类MHC分子、以及基因工程改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物还包括补体调节蛋白，如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、加速衰变因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。
其他有用的基因产物还包括激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白及免疫系统蛋白的任一受体。本发明包括胆固醇调节素的受体，包括低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL)受体、以及清道夫受体。本发明包括的基因产物还有类固醇激素受体超家族的成员，包括糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其他核受体。另外，有用的基因产物还包括转录因子，如jun、fos、max、mad、血清反应因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD和肌细胞生成蛋白、ETS-盒包含蛋白、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT-盒结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)，肾母细胞瘤蛋白、ETS-结合蛋白、STAT、GATA-盒结合蛋白、即GATA-3、以及翼状螺旋蛋白的forkhead家族。
其他有用的基因产物包括氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、精氨酸琥珀酰合成酶、精氨酸琥珀酰裂解酶、精氨酸酶、延胡索酸乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸水解酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨基酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β合成酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-、蛋白、囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)序列、以及营养不良素cDNA序列。其他有用的基因产物还包括酶如用于替代治疗的酶，可用于各种酶活性缺乏所导致的疾病。例如，含甘露糖-6-磷酸盐的酶可用于治疗溶酶体贮积病(如编码β-葡萄糖醛酸酶(GUSB))。
其他有用的基因产物包括非天然的多肽，如具有非天然氨基酸序列的嵌合多肽或杂合多肽，其中有氨基酸的插入、删除或替代。例如，人工单链免疫球蛋白可用于治疗某些免疫缺陷病人。其他类型的非天然基因序列包括反义分子和催化核酸，如核酶，可用于降低靶基因的过量表达。
降低和/或改变基因的表达特别适于治疗过度增殖的疾病，这些疾病的特征是细胞的过度增殖，如肿瘤和鳞癣。靶多肽包括那些过度表达或高水平表达的多肽，这些多肽在过度增殖的细胞内比正常细胞内表达水平高许多。靶抗原包括编码癌基因的多肽，如myb，myc，fyn，和易位基因bcr/abl，ras，src，P53，neu，trk以及EGRF。除了作为靶抗原的癌基因产物以外，用于抗肿瘤基因治疗和保护性治疗措施的靶多肽还有B细胞淋巴瘤产生的各种抗体的可变区以及T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在某些实施方式中，这些可变区也可作为靶抗原用于治疗自身免疫疾病。其他一些肿瘤相关多肽也可以作为靶多肽，如在肿瘤细胞内高水平表达的多肽，其中包括可被单克隆抗体17-A识别的多肽和叶酸结合多肽。
其他适宜的治疗多肽和蛋白还包括那些可用于治疗自身免疫病患者和患有由抗靶位的广泛的保护性免疫反应而引起的疾病患者的多肽和蛋白，这种保护性免疫反应与细胞受体的自身免疫及产生自身免疫抗体的细胞有关。T细胞介导的自身免疫疾病包括类风湿关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、综合征、结节病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、鳞癣、脉管炎、Wegener肉芽肿病、节段性肠炎、以及溃疡性结肠炎、每种疾病的特征都是T细胞受体与内源性的抗原结合从而激活与自身免疫疾病有关的炎症级联反应。
C.免疫原性转基因
另外，本发明的载体还含有本发明的AAV序列和编码肽、多肽和蛋白质的转基因，这些肽、多肽和蛋白质能够诱导对靶免疫原的免疫反应。例如，免疫原可以选择各种病毒家族。其中包括细小核糖核酸病毒家族，如鼻病毒类，占感冒致病因素的50％；肠道病毒类，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、以及人肠道病毒如甲型肝炎病毒；以及apthovirus属，它是引起非人动物口蹄疫的主要病毒。细小核糖核酸病毒家族成员内的靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4和VPG。另外一个病毒家族是calcivirus家族，包括Norwalk族病毒，是流行性肠胃炎的主要致病病毒。诱导人和非人动物体内免疫反应的靶抗原所针对的病毒家族还有披膜病毒家族，包括甲病毒类，如辛德毕斯病毒、RossRiver病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒及风疹病毒属的风疹病毒。黄病毒家族包括登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、圣-路易斯脑炎病毒和蜱脑炎病毒。其他的靶抗原可以从乙型肝炎病毒和冠状病毒家族中制备，其中包括多种非人源病毒，如感染性支气管炎病毒(家禽)、猪传播性胃肠道病毒(猪)、猪凝血性脑脊髓炎病毒(猪)、猫感染性腹膜炎病毒(猫)、犬冠状病毒(狗)以及人呼吸道冠状病毒，该病毒可以引起普通感冒和/和非甲、非乙非丙型肝炎。冠状病毒家族来源的靶抗原包括E1(也称M或基质蛋白)、E2(也称S或Spike蛋白)、E3(也称HE或hemagglutin-elterose)糖蛋白(不是所有的冠状病毒都存在)或N(核壳体)。其他的抗原可能是弹状病毒家族的靶位，其中包括水泡性病毒属(如水泡口炎病毒)和普通的狂犬病病毒(如狂犬病)。在弹状病毒家族内适宜的抗原可能来自G蛋白或N蛋白。线状病毒科包括出血热病毒如Marburg和Ebola病毒，也是适宜的抗原来源。副黏液病毒家族包括1型副流感病毒、3型副流感病毒、牛3型副流感病毒、rubulavirus(流行性腮腺炎病毒、2型副流感病毒、4型副流感病毒)、新城疫病毒(鸡)、牛疫病毒、麻疹病毒，包括麻疹和犬瘟热、肺病毒，包括呼吸道合胞体病毒。流感病毒属于正粘病毒类，也是合适的抗原来源(如HA蛋白、N1蛋白)。布尼亚病毒家族包括布尼亚病毒属(加利福尼亚脑炎病毒，LaCrosse)、白蛉病毒属(立夫特山谷热)、汉他病毒属(puremala是一种hemahaginfever病毒)、内罗病毒属(内罗毕羊病)以及各种未分类的bungaviruses。沙粒病毒家族的LCM和拉萨热病毒也是抗原的来源之一。呼肠孤病毒家族包括呼肠孤病毒属、轮状病毒(引起儿童的急性胃肠炎)、环状病毒、cultivirus(科罗拉多蜱热，Lebombo(人)，马脑炎，bluetongue)。
逆转录病毒家族包括oncorivirinal亚科，其中有引起人或兽疾病的猫白血病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒亚科(其中包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马感染性贫血病毒以及泡沫病毒亚科)。HIV和SIV中有许多适宜的抗原，本文已描述可供选择。适宜的HIV和SIV抗原包括而布限于gag，pol，Vif，Vpx，VPR，Env，Tat和Rev蛋白，及其各种片段。另外，本文也描述了对这些抗原的各种修饰。为此目的的适宜抗原是本领域技术人员所熟知的。例如，可以选择编码gag，pol，Vif，和Vpr，Env，Tat和Rev以及其他蛋白的一个序列。见美国专利5,972,596所描述的经修饰的gag蛋白。也可参见D.H.Barouch等，J.Virol.，75(5):2462-2467(2001.3)，和R.R.Amara等，Science，292:69-74(2001.4.6)所描述的HIV和SIV蛋白。这些蛋白及其亚单位可以单独转导，也可以通过不同载体或单一载体联合转导。
乳头多瘤空泡病毒家族包括多瘤病毒亚科(BKU和JCU病毒)和乳头状瘤病毒亚科(与肿瘤或乳头状瘤的恶性变有关)。腺病毒家族包括病毒(EX，AD7，ARD，O.B.)，主要引起呼吸道疾病和/或肠炎。细小病毒家族包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫panleucopeniavirus、犬细小病毒和猪细小病毒。疱疹病毒家族包括甲型疱疹病毒亚科，其中有单纯病毒属(HSVI，HSVII)、水痘病毒属(伪狂犬病、水痘、带状疱疹)和β疱疹病毒亚属，其中包括巨细胞病毒属(HCMV、鼠巨细胞病毒)，以及丙型疱疹病毒亚科，其中包括淋巴滤泡病毒亚科、EBV(伯基特淋巴瘤)、感染性鼻气管炎、Marek病病毒以及rhadinovirus。痘病毒家族包括chordopoxvirinae亚属，其中有正痘病毒属(天花和牛痘)、副痘病毒、禽痘病毒、羊痘病毒、兔痘病毒、猪痘病毒以及昆虫痘病毒亚科。肝DNA病毒家族包括乙型肝炎病毒。一种未分类的可作为抗原来源的病毒是δ肝炎病毒。其他的病毒包括禽感染性粘液囊病病毒和猪呼吸及生殖综合征病毒。甲病毒家族包括马的动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
本发明还包括免疫原，这些免疫原用于免疫人或非人动物以抵抗病原如细菌、真菌、寄生的微生物或寄生虫，这些病原可感染人或非人脊椎动物，或者来自与癌症或肿瘤细胞。细菌病原包括致病性革兰氏阳性球菌如肺炎球菌、葡萄球菌和链球菌；致病性的肠革兰氏阴性球菌如肠内菌科(enterobacteriaceae)；脑膜炎球菌、淋球菌。致病性的肠革兰氏阴性杆菌如假单胞菌；acinetobacteria；艾肯氏菌；类鼻疽；沙门氏菌；志贺氏菌；嗜血杆菌；莫拉杆菌；杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi)(引起软下疳)；布鲁氏菌；Franisellatularensis(兔热病)；耶尔森菌(巴斯德菌)；链杆菌属的念球棘球菌和螺旋菌；革兰氏阳性杆菌包括单核细胞增多性李斯特杆菌；猪红斑丹毒丝菌；白喉棒状杆菌(白喉)；霍乱；炭疽杆菌(炭疽)；腹股沟肉芽肿(腹股沟肉芽肿)；以及杆菌状巴尔通体。由致病性厌氧菌引起的疾病包括破伤风；肉毒中毒；其他梭菌引起的疾病；结核杆菌；麻风；以及其他分枝杆菌。致病性螺旋菌引起的疾病包括梅毒；treponematoses；印度痘；南美锥虫病和地方性梅毒；以及钩端螺旋体病。其他由高等致病性细菌和致病性真菌引起的感染包括放线菌病；诺卡放线菌病；隐球菌病；酿母菌病；荚膜组织胞浆菌病；球孢子菌病；念珠菌病；曲霉病；毛霉菌病；孢子丝菌病；paracoccidiodomycosis，petriellidiosis，torulopsosis，足分枝菌病和着色真菌病；以及脚气。立克次体感染包括斑疹伤寒、落基山斑疹热、Q热和立克次体热。支原体和衣原体感染包括支原体肺炎；性病淋巴肉芽肿；鹦鹉热；以及围产期的衣原体感染。致病性真核生物包括致病性的寄生虫和蠕虫及其引起的感染，如阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥形虫病；弓形体病；卡氏肺孢子虫病；Trichans；刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)；巴贝西虫病；梨形鞭毛虫病；毛线虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫病；吸虫病或吸虫；以及绦虫感染。
这些生物中的许多及其产生的毒素已被疾病控制中心[(CDC)，健康和人类服务部(DepartmentofHeathandHumanServices)，USA]所鉴定，其中有些有可能用作生物攻击的试剂。例如，其中包括炭疽杆菌(炭疽)、肉毒梭菌及其毒素(肉毒中毒)、鼠疫杆菌(鼠疫)、重型天花(天花)、土拉热弗朗西丝菌(土热病)、以及病毒性出血热，所有这些现在都被归为A类因子；伯氏考克斯氏体(Q热)、布鲁氏菌属(布鲁氏菌病)、鼻疽假单胞菌(鼻疽)、蓖麻及其毒素(蓖麻蛋白)、产气荚膜梭菌及其毒素(ε毒素)、葡萄球菌属及其毒素(肠毒素B)，所有这些现在都被归为B类因子；Nipan病毒和汉他病毒现在被归为C类因子。另外，其他如此分类或未如此分类的其他微生物将来也可能被鉴定并被用于此目的。很容易理解病毒载体和本文所描述的其他构建体可用于转移这些生物体、病毒、其毒素或其他副产物的抗原，预防和/或治疗由这些生物因子所引起的感染或其他副作用。
通过本发明的载体转运抗T细胞可变区的免疫原可以激发包括CTL在内的免疫反应以清除这些T细胞。在类风湿关节炎(RA)中发挥作用的T细胞受体(TCRs)上的几个特异性可变区已被鉴定，这些TCRs包含V-3，V-14，V-17和Vα-17。因此，转导编码至少一个这种多肽的核酸序列可以激发针对RA中T细胞的免疫反应。在多发性硬化症(MS)中发挥作用的T细胞受体(TCRs)上的几个特异性可变区已被鉴定，这些TCRs包含V-7和Vα-10。因此，转导编码至少一个这种多肽的核酸序列可以激发针对MS中T细胞的免疫反应。在硬皮病中发挥作用的T细胞受体(TCRs)上的几个特异性可变区已被鉴定，这些TCRs包含V-6，V-8，V-14，Vα-16，Vα-3C，Vα-7，Vα-14，Vα-15，Vα-16，Vα-28和Vα-12。因此，转导编码至少一个这种多肽的核酸序列可以激发针对硬皮病中T细胞的免疫反应。
另外，本发明含AAV序列的载体还可用基础-加强方案(prime-boostregimen)转移。本领域已报道了许多这样的方案，很容易选择。见WO00/11140，出版日2000年3月2日，本文已纳入作为参考。
这种基础-加强方案一般包括先给予DNA(如质粒)载体以初步激发免疫系统，然后通过给予传统的抗原如蛋白质或携带编码该抗原的序列的重组病毒来加强这种免疫反应。在一个实施方式中，本发明提供了一种基础-加强免疫方案激发针对所选择抗原的免疫反应，该方案先转移携带所述抗原的一个质粒DNA载体，然后进行加强，就是在转移含本发明AAV序列的载体。
在一个实施方式中，基础-加强方案包括基础和/或加强载体内多蛋白的表达。见R.R.Amara，Science，292:69-74(6April2001)，其中描述了表达蛋白亚单位的多蛋白方案用于激发抗HIV和SIV的免疫反应。例如，一个DNA基础载体可以用一个转录子转移Gag，Pol，Vif，VPX和Vpr和Env，Tat，和Rev。另外，SIV的Gag，Pol和HIV-1的Env也被转移。
但是，基础-加强方案并不限于HIV的免疫或转移这些抗原。例如，基础免疫是转移本发明的第一黑猩猩载体，然后用第二黑猩猩载体或含蛋白形式的抗原的组合物进行加强免疫。在一个实施例中，基础-加强免疫方案可以提供对抗原所来源的病毒、细菌或其他微生物的保护性免疫反应。在另一个优选实施方式中，基础-加强免疫方案可以达到治疗效果，利用常规的分析方法可以检测到这种效果。
基础疫苗可以剂量依赖的方式注射到身体的各种部位，主要根据所要激发的免疫反应的靶抗原。本发明不限制注射的量或位点以及药用载体。基础免疫步骤的治疗方案可以是单一剂量，也可以是每小时、每天、每周、每月或每年的剂量。例如，哺乳动物可以接受1-2次注射，注射剂量为约含10μg到50μg质粒的载体。优选的基础免疫量或基础DNA疫苗组合物的剂量约为1μg到10,000μgDNA疫苗。剂量也可以为每公斤体重约1μg到1000μgDNA。注射的量或位点的选择要根据免疫动物的同一性和身体状况。
本文描述了适于将抗原转移到哺乳动物体内所需DNA疫苗的剂量单位。用于注射的DNA疫苗应悬到或溶解到药用介质或生理介质中，如等渗盐、等渗盐溶液或其他制剂，这些都是药物注射人员所熟知的。本领域的技术人员很清楚哪些是合适的介质，这主要是根据注射的途径来选择。本发明的组合物可以通过上述的途径注射，用生物降解的生物相容性聚合物制成的缓释制剂的形式，或用微胶粒、凝胶和脂质体制成的在位注射制剂的形式注射。
另外，本发明的初级免疫步骤还包括注射初级DNA疫苗组合物、适宜量的佐剂，如本文所定义的。
对于哺乳动物来说，加强免疫最好在注射初级DNA疫苗后约2到27周进行。加强免疫组合物的折射是用有效量的加强疫苗组合物，该组合物含有或能够转移基础DNA疫苗所给予的同一抗原。加强免疫组合物由来源于同一病毒或不同病毒的重组病毒载体组成。另外，“加强免疫组合物”可以含有与基础DNA疫苗所编码抗原相同的抗原，只是该抗原是以蛋白或肽的形式存在，该组合物可以诱导宿主的免疫反应。在另外一个实施方式中，加强免疫组合物所包含的一个组合物含有一种DNA序列，该序列编码调节序列控制下的抗原，调节序列可以控制其在哺乳动物细胞内的表达，及载体如已知的细菌或病毒载体。加强免疫组合物的一个基本要求是疫苗组合物中的抗原要与DNA疫苗所编码的抗原相同或是交叉反应抗原。
本发明的载体也适用于含非AAV载体或蛋白、肽或其他生物治疗或免疫化合物的免疫方案中。这些方案特别适于通过基因转移进行治疗和免疫，包括诱导保护性免疫。这些应用是本领域技术人员所熟知的。
本发明的载体还是有效的基因治疗工具，它可以在体内或体外将所选择的转基因导入到所选择的宿主细胞中，即使生物体内含有一种或多种AAV血清型的中和抗体。在一个实施方式中，载体(即rAAV)和细胞可以在体外混合；用常规方法培养感染的细胞；然后再将转导的细胞注入病人体内。而且，本发明的载体还可用于在体外制备所需要的基因产物。对于体外制备来说，先用含编码目的产物的分子的rAAV转染宿主细胞，在合适其表达的条件下培养细胞，然后就可以从细胞培养物中得到所需要的产物(如蛋白质)。然后将表达产物纯化分离。适宜的转染、细胞培养、纯化和分离技术都是本领域技术人员所熟知的。
下面的实施例解释了本发明的几个方面和实施方式。
实施例
实施例1：新型AAV序列的PCR扩增、克隆和特征鉴定
基于已知AAV高度保守区的寡核苷酸设计引物用PCR方法筛选非人灵长类动物组织内的AAV序列。跨越AAV1[SEQIDNO:6]2886-3143bp的一段AAV序列作为PCR扩增子，其中衣壳蛋白(Cap)上的超变区与其他所有已知的AAV血清型都不同，本文命名为“特征区域”，其两侧是保守序列。经过后来的分析发现这个特征区域位于超变区3的保守残基之间。
通过对一组非人灵长类动物外周血样品的初步筛查发现能检测到AAV的灵长类亚类是猕猴、短尾猴、黑猩猩和狒狒。但是，在检测的某些其他亚类的动物中没有发现AAV，其中包括日本猿、猪尾猴和松鼠猴。通过对宾夕发尼亚大学所饲养的猕猴的组织进行了载体分布的集中分析，并对动物尸体进行解刨发现了AAV序列在组织内的整体分布状况。
A.AAV特征区域的扩增
AAV1-6以及从鹅和鸭体内分离的AAV的DNA序列用“ClustalW”以默认设置彼此比对。图1显示的是AAV1-6的比对序列及AAV7的信息。AAV序列的相似性作了比较。
在一组研究中，一个跨越AAV1[SEQIDNO:6]2886bp-3143bp的257bp的区域以及AAV2-6基因组上相应区域[见图1]被发明者鉴定。该区域位于AAV衣壳基因上，其5'末端和3'末端都是高度保守的，中间区域是相对可变的。另外，该区域含有一个DraIII限制性酶切位点(CACCACGTC，SEQIDNO:15)。发明者发现该区域可以作为已知的所有类型AAVDNA的特异特征区域。换言之，经过PCR反应、已知血清型特异性的内切酶消化和凝胶电泳，这个区域可用于将扩增的DNA定义为血清型1，2，3，4，5，6或其他血清型。
以AAV1、2和5DNA为对照设计、确证引物和优化PCR条件。引物的设计基于AAV2的序列：5'引物，1S:bpAAV2(SEQIDNO:7)的2867-2891和3'primer，18as，AAV2(SEQIDNO:7)的bp3095-3121。
不同猕猴的不同组织如血液、脑、肝、肺、睾丸等来源的细胞DNA用上述方法分析，结果显示从这些猴子不同组织的DNA中都可以得到很强的PCR扩增产物。PCR产物的限制性酶切分析表明这些产物是从AAV序列中扩增出来的，与已发表的所有AAV序列都不同。
将各种猴组织DNA中扩增出的PCR产物(约255bp长)克隆和测序。对这些新型AAV序列进行生物信息学分析发现它们是新型AAV序列的衣壳基因，并且彼此不同。图1显示的AAV10-12的新型AAV特征区域[SEQIDNO:117，118和119]。利用ClustalW(1.81)程序进行多序列比对分析。AAV1-7和AAV10-12基因组的特征区域之间的序列同一性百分率见下。
表1.所分析的序列
序列号 AAV血清型 片段大小(bp)
1 AAV1 258
2 AAV2 255
3 AAV3 255
4 AAV4 246
5 AAV5 258
6 AAV6 258
7 AAV7 258
10 AAV10 255
11 AAV11 258
12 AAV12 255
表3.配对比对(同一性的百分率)
AAV2 AAV3 AAV4 AAV5 AAV6 AAV7 AAV10 AAV11 AAV12
AAV1 90 90 81 76 97 91 93 94 93
AAV2 93 79 78 90 90 93 93 92
AAV3 80 76 90 92 92 92 92
AAV4 76 81 84 82 81 79
AAV5 75 78 79 79 76
AAV6 91 92 94 94
AAV7 94 92 92
AAV10 95 93
AAV11 94
一共分离和测序了300多个含新型AAV血清型的克隆，这些血清型都有所选择的257bp的区域。通过对这300多个克隆的生物信息学分析发现这个257bp的区域可以作为一个优越的标记序列用于新型AAV血清型的分离和鉴定
B.利用特征区域进行PCR扩增
257bp的特征区域可以作为PCR锚将PCR扩增子延伸到基因组的5'末端覆盖住rep基因和cap基因(1398bp-3143bp，SEQIDNO:6)的连接区，还可以延伸到基因组的3'末端得到完整的cap基因序列(2866bp-4600bp，SEQIDNO:6)。利用标准方法进行PCR扩增，95℃变性0.5-1min，60-65℃退火0.5-1min，72℃延伸1min/kb，28-42个循环。
利用”A”中所描述的比对序列，在两个序列中又发现了其他两个相对保守的区域，其中一个序列位于rep基因的3'末端，其5'末端指向257bp序列，另一个序列位于257bp片段的下游但是位于AAV3'ITR之前。为了扩增出新型AAV血清型的完整衣壳序列和部分rep序列，设计出两对新引物并优化了PCR条件。为了提高特异性，5'末端扩增引物：5'引物为AV1Ns，GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC[AAV1的nt1398-1423，SEQIDNO:6]，3'引物为上述的18as。3'扩增引物：5'引物为上述的1s，3'引物为AV2Las，TCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCTGCG[AAV2的nt4435-4462，SEQIDNO:7]。
对于这些PCR扩增来说，257bp区作为PCR锚和登陆标记制备重叠片段以构建完整的衣壳基因，如本文所描述的那样扩增出5'延伸片段和3'延伸片段后通过特征区域内DraIII位点融合。为了较特异地扩增出完整的AAV7cap基因，按照说明书分别将三个扩增产物(a)特征区域序列；(b)5'延伸序列；(c)3'延伸序列克隆到pCR4-Topo[Invitrogen]质粒中。然后用DraIII消化质粒并重组形成完整的cap基因。
在本组实验中，分离和分析了AAV7和AAV8约80％的衣壳序列。另外一个新血清型，AAV9在猴子#2也被发现。
利用上述PCR条件，分离和克隆了AAVrep基因的剩余部分，所用的引物可以扩增出AAV基因组的108bp到1461bp的区域(基于AAV2的编号SEQIDNO:7计算出的)。该克隆经测序后用于构建无ITR的完整AAV7基因组。
C.直接扩增3.1kb的Cap片段
为了从NHP组织和血液DNA中直接扩增3.1kb的全长Cap片段，在AAV基因组中鉴定出两段其他的高度保守区用于大片段的PCR扩增。选择了一个位于rep基因中间保守区内引物(AV1ns:5'GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC3'，SEQIDNO:6的nt1398-1423)和位于Cap基因下游另一保守区内的3'引物(AV2cas:5'CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA3'，SEQIDNO:7)扩增全长的cap片段。按照厂家的说明书(Invitrogen)将PCR产物克隆到Topo中，用Qiagengenomics(Qiagengenomics，Seattle，WA)进行序列分析，结果显示精确率大于99.9％。总共分离和鉴定了50个衣壳序列克隆，其中37个克隆来源于猕猴(rh.1-rh.37)，6个克隆来源于短尾猴(cy.1-cy.6)，2个克隆来源于狒狒(bb.1和bb.2)，5个克隆来源于黑猩猩(ch.1-ch.5)。
为了排除新型AAV家族内序列多样性是由于PCR错误引起的可能性，如通过DNA模板不同部分与同源序列之间重叠延伸而导致的PCR介导的基因剪接，或者细菌内重组而导致的结果，在同样的条件下又进行了一系列VP1扩增实验，所用的模板为细胞总DNA。首先，将完整AAV7和AAV8等比例混和后进行系列稀释，系列稀释的混合物作为模板PCR扩增3.1kb的VP1片段，所用的引物和扩增条件与DNA扩增相同，观察是否出现任何杂合的PCR产物。将混合物转化到细菌中，分离出转化子，观察杂合克隆是否可能来自于细菌内的重组过程。在不同的试验中，我们用MspI，AvaI和HaeI限制性酶切AAV7和AAV8，所有的酶都可以在基因组的不同位置切多次，将不同组合的消化产物混和并用其作为模板PCR扩增VP1片段，所用的条件相同，观察是否会因为部分AAV序列的重叠延伸而产生任何的PCR产物。在另一个试验中，将凝胶纯化的与特征区域重叠的1.5kbAAV7VP15'片段和1.7kbAAV8VP13'片段混和，进行系列稀释后用于PCR扩增，体系中加入或不加200ng来源于猴细胞系的细胞DNA，该DNA经TaqMan分析确定不含有AAV序列。在基因组DNACap扩增的条件下所有这些试验都没有发现PCR介导的重叠序列产生(数据未列出)。为了进一步确证，设计了3组引物，分别位于不同的HVR上，并且是猕猴F953的克隆42特异性的，用不同的引物组合从F953的肠系膜淋巴结(MLN)中扩增较短的片段，克隆42就是从F953中分离的。在全长Cap克隆中鉴定出的所有序列突变株都存在于这些短片段中(数据未列出)。
实施例2：在自然感染过程中腺伴随病毒在灵长类动物体内经历了实质进化
将分离的AAV进行序列分析发现整个基因组的分散性主要集中在衣壳蛋白的可变区。流行病学调查结果发现所有已知的血清型都是灵长类动物部位特异性的，尽管临床分离株只限于从婴儿的肛拭子和咽拭子中分离AAV2和AAV3，从人的湿疣中分离AAV5。还没有发现有临床并发症与AAV感染有关。
为了更好地了解AAV的生物学特性，用非人灵长类动物为模型以观察自然感染的并发症。基于已知AAV高度保守区设计寡核苷酸引物(见实施例1)，用本发明的PCR方法从非人灵长类动物的组织中筛选AAV序列。跨越AAV1[SEQIDNO:6]2886-3143bp的一段AAV序列作为PCR扩增子，其中保守序列位于超变区的两侧，这个超变区与其他所有已知的AAV血清型都不同，本文命名为“特征区域”。
通过对一组非人灵长类动物外周血样品的初步筛查发现能检测到AAV的灵长类亚类是猕猴、短尾猴、黑猩猩和狒狒。通过对宾夕发尼亚大学所饲养的猕猴的组织进行了载体分布的集中分析，并对动物尸体进行解刨发现了AAV序列在组织内的整体分布状况。
扩增的特征区域序列亚克隆到质粒中，每个转化子都进行测序。结果显示不同动物来源的克隆的核苷酸序列都有实质的变化。特征区域序列的变化在一个动物的不同克隆内也很明显。从两个具有不同标记序列的动物中取下组织进行进一步分析，利用高度保守区的寡核苷酸作为引物通过PCR方法扩增出延伸的片段。利用这个方法从新构建了两种组织来源的病毒基因组。这些原病毒与已知的其他AAV在cap基因的序列分散性上有明显不同
下一步的试验用于确证非人类人猿动物组织内的AAV序列代表了感染病毒的原病毒基因组，并且这些原病毒基因组可以被恢复形成病毒颗粒。动物98E056肝组织的基因组DNA可以检测到AAV8特征区域序列，用一种AAV序列内不含其位点的内切酶消化该基因组DNA，并将其和一种质粒一起转染到293细胞内，该质粒含有E1缺失的人腺病毒血清型5基因组，作为辅助功能的来源。将得到的裂解产物在293细胞上传代一次，回收裂解物，利用具有多价反应性的Cap蛋白的多克隆抗体检测是否存在AAVCap蛋白以及利用PCR方法扩增AAV8来源的AAV原病毒以检测DNA序列的丰度。通过Western印迹方法检测Cap蛋白可以证明限制性内切酶消化的心脏DNA和腺病毒辅助质粒共转染可以产生高滴度的AAV8病毒，每个293细胞中含有104AAV8载体基因组。大规模地制备细胞裂解物并通过氯化铯离心沉淀技术从中纯化。纯化的产物中含有26nm二十面体(icosohedral)结构，看起来与AAV血清型2一致。单独用腺病毒辅助载体转染不产生AAV蛋白或基因组，这就排除了恢复的AAV作为污染源的可能性。
为了进一步确定动物种内及种间AAV标记序列的变异情况，挑选组织进行延伸PCR以扩增整个Cap蛋白的开放阅读框架。
将所得到的片段克隆到细菌质粒中，分离单个转化子并测序。所取的组织包括3个猕猴的肠系膜淋巴结(Tulane/V223-6克隆；Tulane/T612-7克隆；Tulane/F953-14克隆)、2个猕猴的肝脏(Tulane/V251-3克隆；Penn/00E033-3克隆)、1个猕猴的脾脏(Penn/97E043-3克隆)、1个猕猴的心脏(IHGT/98E046-1克隆)、1个黑猩猩(NewIberia/X133-5克隆)、6个短尾猴(CharlesRiver/A1378，A3099，A3388，A3442，A2821，A3242-6克隆)和1个狒狒(SFRB/8644-2克隆)的血液。15个动物来源的50个克隆中，30个被认为是非多余的，因为发现其中至少有7个氨基酸是彼此不同的。非重复的VP1克隆以其被分离的顺序作为编号，前缀表示其来源的非人灵长类动物的种类。利用SplitsTree程序[Huson，D.H.SplitsTree:analyzingandvisualizingevolutionarydata.Bioinformatics14，68-73(1998)]加上分裂分解方法分析了这30个非重度的克隆与以前所描述的8个AAV血清型之间的结构关系。分析结果显示树状网络而不是分枝树状网络中的一组序列之间存在相似性。其优点在于能检测会聚而形成的分组及显示其系统发生关系，即使这种关系可能被平行发生的事件所逆转。因此还需要大量的系统发生研究以说明AAV的进化，本发明只是对不同克隆进行了分组以显示其序列相似性。
为了确定新型VP1序列是感染病毒基因组来源的，从具有高丰度病毒基因组的组织中提取细胞DNA，用在AAV内无酶切位点的限制性内切酶消化并转染293细胞，然后用腺病毒感染293细胞。这样就可以从两种不同动物来源的组织DNA中恢复和扩增AAV基因组(数据未列出)。
进一步分析新型AAV的VP1序列以确定氨基酸变异的性质和位置。将彼此氨基酸序列差异大于1％的所有30个VP1克隆比对在一起评价每个残基上变异的分数。根据一种分析序列分散区域的算法得到了12个超变区(HVR)，其中5个与以前所描述的可变区重叠或是其一部分[Kotin，上面已引用；Rutledge，上面已引用]。三叠近端峰(three-fold-proximalpeaks)包含了变异性的大部分(HVR5-10).令人感兴趣的是2倍轴和8倍轴上的袢也是变异较多的区域。衣壳蛋白N端有HVR1和2，X射线衍射并不能发现这两个区域，说明VP1蛋白的N端暴露在病毒颗粒表面。
用实时PCR从21只猕猴的组织中定量检测AAV序列，所用的引物和探针是针对已知AAVRep(1对)和Cap(2对)的高度保守区的。每个数据点代表从一个动物的一种组织中扩增的数据。结果发现AAV序列具有广泛的分布，虽然不同动物之间所含有的AAV的量不同。动物的来源及其背景和所受的处理并不影响AAV序列在猕猴内的分布。AAV表达水平最高的是在肠系膜淋巴结中，13个阳性动物中平均每个二倍体基因中含0.01个拷贝。肝和脾也含有高丰度的病毒DNA。有些组织中含有非常高拷贝的AAV，如猕猴98E056的心脏组织、猕猴97E043的脾组织以及猕猴RQ4407的肝组织，它们中每个二倍体基因组分别含有1.5，3和20拷贝的AAV序列。外周血单核细胞中病毒DNA的水平相对较低，说明组织中数据不是由于组织中残存的血液引起的(数据未列出)。应当注意的是这种方法并不能检测出非灵长类动物体内的所有AAV，因为检测出的序列需要与寡核苷酸和实时PCR探针具有高度的同源性。通过DNA杂交技术进一步分析具有高丰度AAVDNA的动物组织以确定DNA的状态，通过原位杂交来分析其在细胞内的分布情况。
不同动物间及同一动物不同组织间AAV原病毒片段存在序列变异使人联想到许多RNA病毒在流行过程中，甚至在感染一个个体时会发生进化。在许多情况下都可以发现野生型病毒被一群所代替，这些准种在选择压力存在的情况下通过快速复制和突变而发生了进化。其中一个例子是HIV感染，这个病毒会因免疫压力或药物压力而发生进化。RNA病毒突变的高发生率有几种机制，其中包括逆转录酶的低保真度和缺乏纠错能力，以及非同源重组和同源重组。
在本研究中可以通过多个原病毒片段克隆的系统测序来说明AAV准种形成的原因。实际上，从不同动物或同一动物内分离的任何延伸克隆中都找不到完全一致的序列。这种序列进化的机制可能是亲本病毒之间高频率的同源重组。结果导致Cap蛋白的超变区频繁交换，从而形成了一组嵌合体，这种嵌合体具有不同的小趋向性和不同的血清型特异性(即获得了逃避免疫反应的能力，特别是中和抗体的攻击)。同源重组发生的机制还不清楚。一种可能是不同单链AAV基因组的+链和-链在复制时杂交，如以前所报道的在有许多AAV重组子感染时。还不清楚是否存在其他机制导致了AAV感染时发生序列进化。AAV复制时发生的突变总频率相对较低，试验数据也不支持出现高频率的复制错误。但是，已有报道证实在裂解性感染过程中AAV基因组的重排可以导致干扰缺损颗粒的形成。不论导致序列变异的机制如何，无一例外的是准种的vp1结构还是保持完整的，没有发生移码突变和无义突变，这说明由于种群动力学的原因竞争选择使病毒具有了最佳的结构及形态组合。
这些研究可用于生物学及医学的几个领域。快速病毒进化的概念以前被认为只是RNA病毒的特性，现在发现DNA病毒也可能发生，这一点已被血清学分析所证明。对于细小病毒来说，发展一种新方法来描述病毒分离株是十分重要的，这种描述应该能够涵盖其结构和生物特征的复杂性，如HIV，就被分类为具有相同结构和功能的一个通用家族，被称为Clades。现在正在寻找其他的策略通过血清型特异性对分离株进行分类，并提出描述血清学组群内变异的标准。
实施例3：利用含AAV2rep基因和新型AAVcap基因的嵌合质粒构建携带AAV2ITR的重组AAV基因组载体用于不同动物模型的血清学和基因转移研究
将AAV2rep与新型AAV血清型的cap序列融合构建嵌合的包装载体。这些嵌合包装载体最初被用于携带AAV2ITR的假型(pseudotyping)重组AAV基因组，所用的方法是利用Ad5辅助质粒三重转染293细胞。在分离出这些新型血清型的完整的有感染性的病毒之前，这些假型载体被用于评价以转导为基础的血清学研究方法的可行性及新型AAV血清型在不同动物模型包括NHP和啮齿类动物中的基因转移效率。
A.pAAV2GFP
AAV2质粒含有AAV2ITR和组成启动子控制下的绿色荧光蛋白。这个质粒包含如下元件：AAV2ITR、CMV启动子和GFP编码序列。
B.反式质粒的克隆
为了构建嵌合的反式质粒来制备重组的假型AAV7载体，p5E18质粒(Xiao等，1999，J.Virol73:3994-4003)用XhoI部分消化以使质粒线性化，该质粒只在3169bp处有一个XhoI位点。然后将XhoI酶切末端补平然后从新连接起来。这种经改造的p5E18质粒用XbaI和XhoI完全酶切以去除AAV2cap基因序列，并用一个含AAV7cap基因的2267bpSpeI/XhoI片段代替，该片段是从pCRAAV76-5+15-4质粒上切下的。
所得到的质粒含有AAV2P5启动子控制下的AAV2rep序列Rep78/68和AAV2P19启动子控制下的AAV2rep序列Rep52/40。AAV7衣壳序列位于AAV2P40启动子控制之下，该序列位于Rep序列内。这个质粒还含有插入片段5'repORF。
C.假型rAAV的制备
rAAV颗粒(含AAV7衣壳的AAV2载体)是用无腺病毒的方法制备的。主要步骤为，将顺式质粒(含AAV2ITR的pAAV2.1lacZ质粒)、反式质粒pCRAAV76-5+15-4(含AAV2rep和AAV7cap)以及辅助质粒同时转染293细胞，其比例为1:1:2，转染方法为磷酸钙沉淀法。
为了构建pAd辅助质粒，从Microbix(Canada)购买了质粒pBG10。从pBHG10中切下一个含L2和L3的RsrII片段得到第一辅助质粒pAdΔF13。从pBHG10中切下一个含PmeI/Sgfl缺失的Asp700/SalI片段克隆到Bluescript中获得质粒AdΔF1。从pAdΔF1中删除MLP，L2，L2和L3。然后分别删除一个2.3kbNruI片段和一个0.5kbRsrII/NruI片段得到辅助质粒pAdΔF5和pAdΔF6。被命名为pΔF6的辅助质粒具有E2a和E4ORF6所必须的辅助功能，这是E1表达辅助细胞所不具有的，但是这个质粒不含有腺病毒衣壳蛋白和功能性的E1区。
通常将50μgDNA(顺式质粒:反式质粒:辅助质粒)转染到一个150mm组织培养皿中。转染后72小时收获293细胞，超声破碎并用0.5％去氧胆酸纳处理(10min.)。细胞裂解物经两次CsCl离心沉淀。收集含rAAV载体的峰值部分，置于容器中用PBS透析。
实施例4：制备携带完整新型AAV血清型的感染性克隆在人和NHP来源的细胞系中研究其基本的病毒学特性，并在NHP和其他动物模型中评价新型AAV血清型的致病性。
为达到此目的，用基因组步行系统获取5'和3'末端序列(ITR)并完成含完整新型AAV血清型基因组的克隆的构建。
简言之，利用商业化的UniversalGenomeWalkerKit[Clontech]，将猴组织和细胞系来源的基因组DNA用DraI，EcoRV，PvuII和StuI限制性内切酶消化并连接到GenomeWalkerAdaptor上得到4个个体的GenomeWalkerLibraries(GWLs)，这些基因组DNA中已被证实含有AAV7序列。已GWLs的DNA为模板，PCR扩增出AAV7及其相邻的基因组序列，所用的引物为衔接子引物1(AP1，试剂盒提供)和AAV7特异性引物1，然后再用衔接子引物2(AP2)和另一个AAV7特异性引物2进行嵌套PCR，这两个引物都在第一组引物内。将嵌套PCR所得到的主要产物克隆并进行序列分析。
在这个试验中，涵盖257bp片段或AAV基因组其他标记片段的引物被用于PCR扩增从人和NHP细胞系中提取的细胞DNA以鉴定和鉴别是否存在AAV序列。利用不同物种和不同株的辅助腺病毒可以从阳性细胞系中恢复这种潜伏的AAV基因组。
为了从NHP来源的细胞系内分类具有感染性的AAV克隆，从ATCC获得所需的细胞系，然后用PCR方法筛选以鉴定257bp的扩增子，即本发明的特征区域。将257bp的PCR产物克隆并通过测序分析其血清型。这些含AAV7序列的细胞系用从ATCC购买的猿猴腺病毒SV-15、人Ad5感染，或者用含人Ad基因的质粒转染，这个Ad基因编码AAV辅助功能。感染或转染48小时猴，收获细胞，按照Xiao等，1999，J.Virol，73:3994-4003的描述制备HirtDNA用于AAV7基因组的克隆。
实施例5：AAV载体的构建
利用与实施例3中AAV1/7所采取的同样的假型策略构建包装有AAV1，AAV5和AAV8衣壳蛋白的AAV2载体。简要叙述如下，通过顺式质粒、腺病毒辅助质粒和嵌合包装载体三重转染293细胞包装携带AAV2ITR的重组AAV基因组，其中AAV2rep基因与新型AAV血清型的cap基因融合在一起。为了构建嵌合的包装载体，去除质粒p5E18上3169bp处的XhoI位点，修饰的质粒再用XbaI和XhoI完全酶切以去除AAV2cap基因，并用一个含AAV8cap基因的2267bpSpeI/XhoI片段代替[Xiao，W.等，(1999)JVirol73，3994-4003]。用同样的策略构建AAV2/1和AAV2/5的嵌合包装质粒。除了AAV2/2外，所有的重组载体都用标准CsCl2沉降法纯化，AAV2/2是用肝素色谱柱通过一步纯化的。
AAV载体在基因组中的拷贝(GC)滴度是用AV40polyA区特异性的探针和引物通过TaqMan分析来确定的，如以前文献所报道的[Gao，G.等，(2000)HumGeneTher11，2079-91]。
每种血清型都构建载体以便于体内和体外实验。将8个不同转基因表达盒插入到载体中，然后制备每种血清型的重组病毒颗粒。根据其基因组拷贝数，恢复的病毒计数列在下面的表4中。每种血清型的载体产量都很高，但血清型之间的差异不同。表中所列的数据是多批50个平板(150mm)转染的基因组拷贝数的平均值加减标准差×1013。
表4.重组病毒的制备
实施例6：假型载体的血清学分析
给C57BL/6小鼠肌肉注射AAVCBA1AT载体的不同血清型(5×1011GC)，34天后收集样品。为了检测血清中是否存在每种AAV血清型的中和抗体和交叉中和抗体，用以转导为基础的中和抗体分析方法分析血清[Gao，G.P.等，(1996)JVirol70，8934-43]。为了提高特异性，通过评价血清抑制不同血清型的报告病毒(AAVCMVEGFP)转导84-31细胞的能力来确定中和抗体的存在。每种血清型的报告病毒AAVCMVEGFP[感染多重性(multiplicityofinfection)(MOI)能使90％的指示细胞感染]与接受不同AAV血清型的动物或对照鼠来源的热灭活血清共孵育。37℃孵育1小时后，将病毒加到含84-31细胞的96孔板中，根据不同的病毒血清型，孵育48或72小时。用FluoroImagin(MolecularDynamics)测定GFP的表达并用ImageQuantSoftware定量。中和抗体的滴度定义为能将转导抑制到50％以下的最高血清稀释度。
GFP表达载体的应用简化了中和抗体的分析方法，该方法是基于对允许细胞系(即稳定表达Ad5的E4的293细胞)转导的抑制。AAV血清型的抗血清是通过给动物肌肉注射重组病毒而制备的。1:20和1:80稀释度的抗血清对AAV转导的中和作用进行了分析(见下面的表5)。AAV1，AAV2，AAV5和AAV8的抗血清可以抑制该抗血清来源的血清型的转导(AAV5和AAV8的抑制作用比AAV1和AAV2弱)，但是不能抑制其他血清型的转导(即没有迹象表明存在交叉中和作用，说明AAV8是真正的独特血清型)。
表5.新型AAV血清型的血清学分析
从52个正常人的血清中筛选能中和所选血清型的样本。结果没有找到能中和AAV2/7和AAV2/8血清样本，而20％和10％的血清分别可以中和AAV2/2和AAV2/1载体。一种混合IgG代表了所收集的60000人的血清样本，该混合物不能中和AAV2/7和AAV2/8，但是AAV2/2和AAV2/1载体分别被滴度为1/1280和1/640样品所中和。
实施例7：AAV载体不同血清型的体内评价
本试验中，7种重组AAV基因组，AAV2CBhA1AT，AAV2AlbhA1AT，AAV2CMVrhCG，AAV2TBGrhCG，AAV2TBGcFIX，AAV2CMVLacZ和AAV2TBGLacZ包装有不同血清型的衣壳蛋白。在所有7中载体中，小基因表达盒的两侧都是AAV2ITR。人α-抗胰蛋白酶(A1AT)[Xiao，W.等，(1999)JVirol73，3994-4003]、猕猴绒毛膜促性腺激素(CG)β-亚单位[Zoltick，P.W.&Wilson，J.M.(2000)MolTher2，657-9]、犬因子IX[Wang，L.等，(1997)ProcNatlAcadSciUSA94，11563-6]和细菌β-半乳糖苷酶(即LacZ)基因的cDNA作为报告基因。对于直接的肝基因转移来说，用鼠白蛋白基因启动子(Alb)[Xiao，W.(1999)，上面已引用]或人甲状腺激素结合球蛋白基因启动子(TBG)[Wang(1997)，上面已引用]驱动报告基因在肝脏内的组织特异性表达。对直接的肌肉基因转移来说，用巨细胞病毒早期启动子(CMV)或鸡β-肌动蛋白启动子加上CMV增强子(CB)来控制报告基因的表达。
如果通过直接的肌肉注射进行基因转移，就是将载体注射到4-6周龄NCR裸鼠或C57BL/6小鼠(Taconic，Germantown，NY)的右侧胫前腓肌内。如果是直接的肝基因转移，就是将载体通过门静脉注射到到7-9周龄NCR裸鼠或C57BL/6小鼠(Taconic，Germantown，NY)的肝脏内。载体注射后在不同的时间点收集血清样本。在不同的时间点采集注射LacZ载体的小鼠肌肉和肝组织制作冷冻切片并进行Xgal组织化学染色。在重复给药的试验中，C56BL/6小鼠首先被肌肉注射AAV2/1，2/2，2/5，2/7和2/8CBA1AT载体，检测A1AT基因的表达7周。然后门静脉内注射AAV2/8TBGcFIX并检测cFIX基因的表达。
ELISA分析用于定量检测上述hA1AT，rhCG和cFIX蛋白的血清水平[Gao，G.P.等，(1996)JVirol70，8934-43；Zoltick，P.W.&Wilson，J.M.(2000)MolTher2，657-9；Wang，L.等，ProcNatlAcadSciUSA94，11563-6]。试验结束时处死动物，采集肌肉和肝组织，从中提取DNA，利用与测定制备载体的滴度一样的一组引物和探针通过TaqMan方法定量分析靶组织基因组内存在的本发明的载体拷贝数[Zhang，Y.等，(2001)MolTher3，697-707]。
新型血清型来源的载体在直接的肌肉和肝基因转移的鼠模型中进行评价，并与已知的血清型AAV1、AAV2和AAV5来源的载体进行比较。表达分泌蛋白的载体(α-抗胰蛋白酶(A1AT)和绒毛膜促性腺激素(CG))用作指标通过血清的ELISA分析来定量测定不同血清型之间的相对转导效率。靶器官内转导载体在细胞内的分布用LacZ表达载体和X-gal组织化学方法进行评价。
AAV载体在骨骼肌中的作用通过将载体直接注射到小鼠的胫前腓肌内进行分析。载体含有相同的AAV2基因组和CMV的早期即刻基因，该基因的表达受AMC增强的β-肌动蛋白启动子控制。以前的研究表明当AAV载体表达人A1AT蛋白时，具有完全免疫能力的C57BL/6小鼠体内能激发针对该蛋白的有限的体液免疫反应[Xiao，W.等，(1999)JVirol73，3994-4003]。
在各种载体中，AAV2/1载体产生的A1AT水平最高，AAV2/2载体最低，AAV2/7和AAV2/8载体处于二者之间。nu/nuNCR小鼠注射载体28天后CG的表达水平达到峰值，其中AAV2/7最高，AAV2/2最低，AAV2/8和AAV2/1位于二者之间。注射AAV2/1和AAV2/7lacZ载体后可以在注射部位的所有肌纤维中产生基因表达，而注射AAV2/2和AAV2/8载体后能观察到的lacZ阳性肌纤维要低的多。这些数据表明AAV2/7载体在骨骼肌中的转导效率和AAV2/1是一样的，并且是以前所报道的血清型中骨骼肌转导效率最高的[Xiao，W.(1999)，上文引用；Chao，H.等，(2001)MolTher4，217-22；Chao，H.等，(2000)MolTher2，619-23]。
用同样的鼠模型来评价直接的肝基因转移。同样剂量的基因组拷贝来源的载体注射到小鼠的门静脉。，然后分析转基因的表达。每种载体都含有AAV2基因组，用上述的肝特异性启动子(即白蛋白或甲状腺激素结合球蛋白的启动子)来驱动转基因的表达。更特殊的是直接的肌肉和肝基因转移分别用CMVCG和TBGCG小基因表达盒。RhCG的表达水平用相对单位(RUs×103)来表示。数据来自于载体注射后28天的血清样品(每组4只动物)。如表3所示，衣壳蛋白对A1AT载体在nu/nu和C57BL/6小鼠体内的转导效率以及CG载体在C57BL/6小鼠体内的转导效率的影响是一致的(见表6)。
表6.猕猴绒毛膜促性腺激素(rhCG)β-亚单位的表达
*本试验中未检测
在所有的例子中，AAV2/8载体产生的转基因表达水平最高，为16-110，高于AAV2/2载体；AAV2/5和AAV2/7载体介于二者之间，但AAV2/7又高于AAV2/5。注射相应的lacZ载体的动物的肝组织切片经X-gal染色后发现转导细胞的数目与转基因的表达总水平之间存在相关关系。利用实时PCR技术分析接受A1AT载体的C57BL/6小鼠肝组织内提取的DNA中载体DNA的丰度。
注射后56天肝组织内载体DNA的量与转基因的表达水平成相关关系(见表7)。这个试验中，设计了一组载体基因组SV40polyA区特异性的探针和引物用于TaqManPCR。所表示的数值是三只动物的平均值加减标准差。注射后56天杀死动物，采集肝组织提取其DNA。这些试验表明AAV8是直接的肝基因转移最有效的载体，因为其转导的肝细胞数目最多。
表7—注射1x1011基因组拷贝的载体后用实时PCR分析nu/nu小鼠肝组织内AAV载体的丰度
上面的血清学数据表明用其他血清型免疫后体内的AAV2/8载体不能被中和。C57BL/6小鼠肌肉注射不同血清型的A1AT载体56天后门静脉注射表达犬因子IX(1011基因组拷贝)的AAV2/8载体。因子IX表达的最高水平出现在AAV2/8载体(17±2μg/ml，n＝4)注射空白动物后14天，与注射AAV2/1(31±23μg/ml，n＝4)、AAV2/2(16μg/ml，n＝2)和AAV2/7(12μg/ml，n＝2)的动物无显著性差异。这结果与AAV2/8因子IX载体注射的AAV2/8免疫动物中所观察到的结果相反，其中没有检测到因子IX(<0.1μg/ml，n＝4)。
利用cap基因保守区特异性的寡核苷酸确实可以从猕猴中扩增出代表独特AAV的序列。至少两个不同克隆的猕猴的多种组织内可以检测到一致的cap特征区域序列。从一个来源中分离全长的rep和cap开放阅读框架并测序。只需要评价新型AAV的cap开放阅读框架作为载体的能力，因为含AAV7或AAV8衣壳的载体是用AAV2的ITR和rep制备的。这也可以简化不同载体的比较，因为不同载体血清型的实际载体基因组是一致的。实际上，利用这种方法制备的重组载体的产生在不同的血清型之间无差异。
AAV7和AAV8载体具有独特的免疫学特征(即它们不能被抗其他血清型的抗体所中和)。而且，人血清不能中和AAV7和AAV8载体的转导，因此它们比现在正在研究的人源[Chirmule，N.等，(1999)GeneTher6，1574-83]。
每种新型载体的趋向性都适于体内应用。AAV2/7载体转导骨骼肌的效率与AAV2/1相似，后者是到目前为止所检测到的灵长类动物AAV在骨骼肌中转导效率最高的[Xiao，W.，上面已引用；Chou(2001)，上面已引用，以及Chou(2000)，上面已引用]。但值得注意的是，在肝的基因转移中，AA2/8的效率要比其他血清型高，到目前为止，还没有找到能稳定转染肝细胞的令人满意的载体。与其他载体相比，AAV2/8的基因转移效率可以提高10到100倍。AAV2/8的高转导效率的机制还不清楚，尽管有人推测可能是由于其摄取所依赖的受体与其他的载体不同，该受体在肝细胞的基侧表面具有较高的活性。这种高效率的载体对于直接的肝基因转移相当有用，因为在治疗尿素循环障碍和家族性高胆固醇血症时转导细胞的数目是很关键的。
因此，本发明提供了一种新型方法通过PCR检索基因组序列来分离新型AAV。扩增出的序列易于克隆到载体中并在动物体内检测。由于人体内不存在对AAV7的免疫并且该载体的趋向性适于转染肌肉组织，因此AAV7很适于作为载体用于人体的基因治疗以及其他的体内应用。同样，由于缺乏对本发明AAV血清型的免疫及其趋向性，使这些AAV可用于转移治疗分子或其他有用的分子。
实施例9—组织趋向性研究
在设计高通量功能性筛选方案构建新型AAV载体时，选择非组织特异性的及高活性的启动子，CB启动子(CMV增强的鸡β肌动蛋白启动子)来驱动一个易于检测的并且可以定量检测的报告基因-人α抗胰蛋白酶基因。每个新型AAV克隆只需要构建一个载体来进行基因转移的研究，检测特定AAV载体对三种不同靶组织，肝、肺和肌肉的趋向性。下表概括了4种新型AAV载体在组织趋向性研究(AAVCBA1AT)中所得到的数据。发现其中新型AAV衣壳克隆44.2在所有3种组织中都是极好的基因转移工具，特别是在肺组织中。表8报告了试验第14天的数据(μgA1AT/mL血清)。
表8
另外还进行了另外的试验来进一步确证AAV44.2在肺组织中的超级趋向性。首先，将携带肺组织特异性表达的CC10hA1AT小基因的AAV载体与新型AAV的衣壳假型，然后注射给免疫缺陷动物(NCR裸鼠)，如下表所示，通过气管灌注等量的载体(每个动物50μl原液，不稀释)。在表9中，每只NCR裸鼠50μl原液，检测下限为0.033μg/ml，检测时间为第28天。
表9
也将载体注射给具有完全免疫能力的动物(C57BL/6)，所用的基因拷贝数相同(1x1011GC)，如表10所示。(每只动物1x1011GC，C57BL/6，14天，检测下限为0.033μg/ml)。
表10
两个试验的数据都确证了克隆44.2在直接的肺基因转移中的超级趋向性。
令人感兴趣的是，克隆44.2在直接的肝和肌肉基因转移中的表现也是十分突出的，接近最佳的肝转导载体AAV8和最佳的肌肉转导载体AAV1所达到的水平，说明这个新型AAV具有极其引人的生物意义。
为了研究这些新型血清型的血清学特性，制备了假型AAVGFP载体免疫兔，并且在存在或缺少不同衣壳抗血清的情况下体外转导84-31细胞。数据概述如下。
表11a.8431细胞内的交叉-NAB分析及Adv共感染
8431细胞感染下列载体(与Adv共感染)：
表11b.8431细胞内的交叉-NAB分析及Adv共感染
8431细胞感染下列载体(与Adv共感染)：
表12
表13a.用GFP载体感染8431细胞(Adv共感染)
表13b.用GFP载体感染8431细胞(共感染Adv)
实施例10—家族性高胆固醇血症的鼠模型
下面的试验用于证明本发明的AAV2/7载体能转移LDL受体并可以表达有效量的LDL受体以降低家族性高胆固醇血症动物模型体内的血浆胆固醇水平和甘油三脂的水平。
A.载体的构建
带有AAV7或AAV8衣壳蛋白的AAV载体利用假型策略构建[HildingerM等，J.Virol2001；75:6199-6203]。携带AAV2末端反向重复序列(ITR)的重组AAV基因组是通过用顺式质粒、腺病毒辅助质粒和一个嵌合的包装载体三重转染293细胞而包装成的，嵌合的包装载体是由新型AAV血清型的衣壳和AAV2的rep基因融合而成。嵌合的包装质粒是通过以前所描述的方法构建的[Hildinger等，上面已引用]。重组载体用标准的CsCl2沉淀方法纯化。为了确定病毒的产生量，利用载体SV40polyA区特异性的探针和引物进行TaqMan(AppliedBiosystems)分析[GaoGP等，HumGeneTher.2000Oct10；11(15):2079-91]。得到的载体表达人甲状腺激素结合球蛋白基因启动子(TBG)控制下的转基因。
B.动物
C57Bl/6来源的LDL受体缺陷小鼠是从Jackson实验室(BarHarbor，ME，USA)购买的，作为生殖克隆来饲养。不限制小鼠饮水，载体注射前3周开始喂养高脂WesternDiet(胆固醇百分含量高)。通过眶后取血在0天和7天采集血液样品，测定血脂含量。小鼠随机分为7组。如前所述通过门静脉注射载体[ChenSJ等，MolTherapy2000；2(3)，256-261]。简言之，小鼠用氯胺酮和赛拉嗪麻醉，用一个30g的注射器吸取适当剂量的用100ulPBS稀释的载体直接注射到门静脉中。按压注射部位以止血。缝合皮肤伤口，在接下来的时间内仔细检测小鼠。从直接肝基因转移后14天开始每周采血以测定血脂含量。在注射后6周和12周时每组处死2只动物，测定粥样动脉硬化的大小和受体的表达情况。其余的小鼠在20周时处死并测定粥样动脉硬化的大小和受体的表达情况。
表14
载体 剂量 n
组1 AAV2/7-TBG-hLDLr 1x 1012gc 12
组2 AAV2/7-TBG-hLDLr 3x 1011gc 12
组3 AAV2/7-TBG-hLDLr 1x 1011gc 12
组4 AAV2/8-TBG-hLDLr 1x 1012gc 12
组5 AAV2/8-TBG-hLDLr 3x 1011gc 12
组6 AAV2/8-TBG-hLDLr 1x 1011gc 12
组7 AAV2/7-TBG-LacZ 1x 1011gc 16
C.血清脂蛋白和肝功能分析
禁食6小时后从眶后血管丛采集血液样品。通过离心从血浆中制备血清。用临床生化自动分析仪(ACE，SchiapparelliBiosystems，AlphaWassermann)测定血清中脂蛋白和肝转氨酶的血浆含量。
D.转基因表达的检测
通过免疫荧光染色和Western印迹分析LDL受体的表达情况。用裂解缓冲液(20mMTris，pH7.4，130mMNaCl，1％TritonX100，蛋白酶抑制剂(完全的，无EDTA，Roche，Mannheim，Germany))将冷冻的肝组织匀浆用于Western印迹分析。利用MicroBCAProteinAssayReagentKit(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白浓度。40μg蛋白溶于4-15％Tris-HClReadyGels(Biorad，Hercules，CA)中，然后转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen，)上。为了制备抗-hLDL受体的抗体，给兔静脉注射AdhLDLrprep(1x1013GC)。4周后采集兔血清用于Western印迹。用1:100稀释的血清作为一抗，以连接HRP的抗兔IgG，然后进行ECL化学发光检测(ECLWestern印迹检测试剂盒，Amersham，ArlingtonHeights，IL)。
E.免疫组织化学
用免疫组织化学染色方法分析冷冻肝组织切片中LDL受体的表达。10um冷冻切片或者用丙酮固定5分钟，或者不固定。与10％的山羊血清共孵育1小时进行。然后切片与一抗在室温下共孵育1小时，按照厂家的说明稀释兔抗人LDL多克隆抗体(BiomedicalTechnologiesInc.，Stoughton，MA)，然后加到切片上。用PBS洗涤切片，然后与1:100稀释的荧光标记羊抗兔IgG(Sigma，StLouis，MO)共孵育。最后在荧光显微镜NikonMicrophot-FXA观察切片。在所有的例子中，每一步孵育结束后都要用PBS彻底洗涤。阴性对照预孵育用PBS，用同型相配的非免疫对照抗体来代替一抗。每个试验在同一天设置上面提到的三种类型的对照。
F.基因转移效率
在预定的时间点处死动物后取其肝组织，组织在液氮中迅速冷冻，然后储存在-80℃备用。用QIAampDNAMiniKit(QIAGENGmbH，Germany)按照说明书从肝组织中提取DNA。利用上述的AV40poly(A)尾巴特异性的引物和探针通过Taqman分析来测定肝组织中AAV载体的基因组拷贝数。
G.动脉粥样硬化斑块的测量
为了测量鼠动脉内粥样斑块的大小，浆小鼠麻醉(10％氯胺酮和赛拉嗪，静脉注射)，打开胸腔，从左心室向动脉系统中灌注冰冻的磷酸缓冲盐。然后小心地将动脉切下，从主动脉弓到股动脉延腹侧中线切开，然后用甲醛固定。富含脂质的动脉粥样硬化斑块用SudanIV(Sigma，Germany)染色，动脉用大头针钉在黑色石蜡表面，用SonyDXC-960MD彩色摄像机照相。粥样斑块的面积及其在整个动脉表面所占的比例用Phase3ImagingSystems(MediaCybernetics)分析。
H.I125LDL的清除率
每组检测两只动物。每隔30秒通过尾静脉将I125–标记的LDL(一般由DanRader，UPenn提供)缓慢注入到小鼠体内(每只动物注射用100μl无菌PBS稀释的1,000,000计数的[I125]-LDL)。分别在注射后3min，30min，1.5hr，3hr，6hr从眶后动脉丛采集血液样品。从全血中分离血浆，取10μl血浆在γ计数仪上计数。最终的分数代谢率从脂蛋白清除数据中计算。
I.肝脂质蓄积的评价
将肝切片用油红染色以测定脂质蓄积程度。冷冻肝切片先用蒸馏水漂洗，然后在无水丙二醇中孵育2分钟。将切片放入到油红溶液(0.5％，溶于丙二醇中)染色16小时，然后用Mayer苏木精溶液复染30秒，固定在加热的甘油胶溶液中。
为了确定肝组织中胆固醇和甘油三脂的含量，将肝组织切片匀浆，然后在氯仿/甲醇(2:1)中孵育过夜。加入0.05％H2SO4后离心10分钟，收集每个样品的下层，分为两管，在液氮中冻干。为了测定胆固醇含量，将第一管中冻干的脂质溶于用氯仿溶解的1％TritonX-100中。溶解后用液氮冻干。将脂质溶于双氧水中后在37℃孵育30分钟，然后用TotalCholesterolKit(WakoDiagnostics)测定总胆固醇的浓度。将第二管冻干的脂质溶于乙醇KOH中，在60℃孵育30分钟。然后加入1MMgCl2，置于冰上孵育10分钟，然后14,000rpm离心30分钟。测定上清液中的甘油三脂含量(WakoDiagnostics)。
与对照组相比，假型inAAV2/8或AAV2/7的所有载体都能降低总胆固醇、LDL和甘油三脂的含量。这些被检测的载体能以剂量依赖的方式矫正高胆固醇血症的表型、AAV2/8和AAV2/7小鼠内的粥样斑块面积在第一个试验中也可以观察到缩小(2个月)，并且这种效果可以持续到整个试验(6个月)。
实施例—功能因子IX的表达和血友病的矫正
A.基因敲除小鼠
对血友病B小鼠体内功能性犬因子IX(FIX)的表达情况作了检测。构建携带AAV1，AAV2，AAV5，AAV7或AAV8衣壳序列的载体，该载体的结构为AAV25'ITR-肝组织特异性启动子[LSP]-犬FIX–北美土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)-AAV23'ITR。如Wang等，2000，MolecularTherapy2:154-158)所描述利用适当的衣壳构建这种载体。
基因敲除小鼠的制备方法见Wang等，1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:11563-11566的描述。这个模型最接近人血友病B的表型。
不同血清型(AAV1，AAV2，AAV5，AAV7和AAV8)的载体一次通过门静脉注射到成年血友病C57Bl/6小鼠体内，其中5种不同血清型的注射剂量为1x1011GC/鼠，AAV8载体组注射较低的剂量，1x1010GC/鼠。对照组注射1x1011GC的AAV2/8TBGLacZ3。每组动物含5-10只雄性和雌性小鼠。载体注射后每两周采集一次血样。
1.ELISA
鼠血浆种的犬FIX浓度通过犬因子IX特异性的ELISA分析方法来检测，如Axelrod等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:5173-5177所描述，本发明稍加改动。山羊抗犬因子IX抗体(EnzymeResearchLaboratories)作为一抗，兔抗犬因子IX抗体(EnzymeResearchLaboratories)作为二抗。注射后两周开始测定所有试验载体组的cFIX血浆水平。结果发现其血浆水平增高，在整个试验过程中，即到12周时，能维持在治疗水平。治疗水平被认为是正常水平的5％，即约250ng/mL。
最高的表达水平出现在AAV2/8(1011)和AAV2/7载体组，达到超生理的cFIX浓度(比正常水平高10倍)。AAV2/8(1011)的表达水平大约比AAV2/2和AAV2/8(1010)组高10倍。最低的表达水平出现在AAV2/5组，虽然也在治疗水平范围内。
2.体外活化部分凝血激酶时间(aPTT)的检测
FIX基因敲除小鼠血浆中功能性因子IX的活性通过体外活化部分凝血激酶时间(aPTT)分析方法来确定-从眶后动脉丛采集小鼠的血液样品加入到1/10体积的柠檬酸盐缓冲液中。aPTT试验方法如Wang等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:11563-11566所描述。
通过aPTT分析发现，在注射后2周时所有载体注射鼠血浆样品的凝血时间都在正常范围内(约60秒)，正常的凝血时间和稍短于正常凝血时间能持续整个试验周期(12周)。
持续最短的凝血时间出现在接受AAV2/8(1011)和AAV2/7的小鼠中。到12周时，AAV2/2也能诱导出与AAV2/8和AAV2/7组相同的凝血时间。但是，这种较短的凝血时间知道12周时也没在AAV2/2组观察到，而在2周时开始就可以在AAV2/8和AAV2/7组观察到较短的凝血时间(25-40秒之间)。
从某些治疗小鼠中采集肝组织进行免疫组化染色。注射AAV2/8.cFIX载体的小鼠肝组织中约有70-80％的肝细胞是犬FIX阳性的。
B.血友病B犬
通过模型研究发现，犬F.IX基因催化区的点突变可以使该基因表达的蛋白不稳定，导致血友病B[Evans等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86:10095-10099]。在UniversityofNorthCarolina，ChapelHill有一群这种犬已经饲养了20年以上。这些犬的自我平衡参数已经有了详细的描述，其中包括缺乏血浆F.IX抗原、全血凝血时间超过60分钟(正常犬为6-8分钟)以及活化部分凝血激酶时间延长至50-80秒(正常犬为13-28秒)。这些犬会反复出现自发性出血。一般来说，出现自发性出血时一次静脉注射10ml/kg正常犬血浆就可以制止；偶尔需要反复输注才能止血。
按照下面的方案给4只犬通过门静脉注射AAV.cFIX。第一只犬一次注射剂量为3.7x1011基因组拷贝(GC)/kg的AAV2/2.cFIX。第二只犬先注射AAV2/2.cFIX(2.8x1011GC/kg)，然后在第1180天第二次注射AAV2/7.cFIX(2.3x1013GC/kg)。第三只犬一次注射剂量为4.6x1012GC/kg的AAV2/2.cFIX。第四只犬先注射AAV2/2.cFIX(2.8x1012GC/kg)，在第995天再注射AAV2/7.cFIX(5x1012GC/kg)。
.血友病犬全身麻醉后剪掉腹部的毛，手术切开腹部，一次将载体注射到门静脉内。为了防止手术期间出血，动物预先注射正常的犬血浆。将犬镇静后，插管诱导全身麻醉，腹部剃毛备皮。切开腹部后将脾移到手术视野内，找到脾静脉的位置，将一条缝合线松弛地记在近端，在静脉的远端切开一个小的切口，将针头快速插入静脉中，然后将缝合线松开，将一根5F套管栓到门静脉分叉处附近的静脉上。止血完毕后导管气囊内充气，在5分钟内将约5.0ml用PBS稀释的载体注入到门静脉内。然后将气囊放气，去除导管，完成静脉止血。然后将脾复位，烧灼出血的血管，缝合伤口。动物完全耐受手术后取下插管。血样的分析如前所述[Wang等，2000，MolecularTherapy2:154-158]。
结果表明如预期的那样AAV2/7可以矫正和部分矫正血友病的症状。
本说明书引用的所有文献都已纳入本文作为参考。在参考特别优选实施方式对本发明进行描述的同时，只要不背离本发明的精神对本发明作出修改也是值得赞赏的。这种修改应该包括在本发明权利要求的范围内。

Claims (15)

1.一种重组腺伴随病毒(即重组AAV)，包含至少一种功能性AAVrh.8衣壳，所述衣壳由vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白构成，其中，所述vp1衣壳蛋白由SEQIDNO:97中第1至736位氨基酸构成，所述重组AAV还包含小基因，所述小基因具有3’和5’AAV反向末端重复序列和与调节序列操作性相连的转基因编码序列，所述调节序列指导所述转基因编码序列在宿主细胞中的表达。
2.如权利要求1所述的重组AAV，其中，所述vp2蛋白由SEQIDNO:97中第138至736氨基酸构成。
3.如权利要求1所述的重组AAV，其中，所述vp3蛋白由SEQIDNO:97中第203至736氨基酸构成。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组AAV，其中，所述反向末端重复序列来自相对于AAVrh.8而言的异源AAV。
5.一种组合物，包含权利要求1至4中任一项所述重组AAV和生理相容性载体。
6.一种分离的AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白选自：由SEQIDNO:97中第1至736位氨基酸构成的vp1衣壳蛋白；由SEQIDNO:97中第138至736位氨基酸构成的vp2衣壳蛋白；和由SEQIDNO:97中第203至736位氨基酸构成的vp3衣壳蛋白。
7.一种分离或合成的编码权利要求6所述蛋白的核酸分子。
8.如权利要求7所述的核酸分子，所述核酸序列选自：SEQIDNO:45中的vp1、vp2或vp3。
9.权利要求7或8所述的核酸分子，所述核酸分子还包含编码功能性AAVrep蛋白的AAV序列。
10.一种产生重组腺伴随病毒的方法，包括培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞含有(a)权利要求7所述的核酸分子；(b)功能性rep基因；(c)包含AAV反向末端重复序列和转基因的小基因；且具备(d)将小基因包装到AAV衣壳蛋白内所需足够的辅助功能。
11.一种宿主细胞，转染了权利要求7至9中任一项所述的核酸分子，所述转体外进行。
12.一种组合物，包含生理相容性载体和至少一种重组腺伴随病毒(即重组AAV)，所述重组AAV包含功能性AAVrh.8衣壳，所述衣壳由vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白构成，其中，所述vp3衣壳蛋具有SEQIDNO:97中第203至736位氨基酸构成的氨基酸序列，所述重组AAV还包含3’和5’AAV反向末端重复序列和与调节序列操作性相连的转基因编码序列，所述调节序列指导所述转基因编码序列在宿主细胞中的表达。
13.一种组合物，包含生理相容性载体和至少一种重组腺伴随病毒(即重组AAV)，所述重组AAV包含功能性AAVrh.8衣壳，所述衣壳由vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白构成，其中，所述vp1衣壳蛋具有SEQIDNO:97中第1至736位氨基酸构成的氨基酸序列，所述重组AAV还包含3’和5’AAV反向末端重复序列和与调节序列操作性相连的转基因编码序列，所述调节序列指导所述转基因编码序列在宿主细胞中的表达。
14.一种分离或合成的核酸分子，它编码(a)氨基酸序列如SEQIDNO:97中第1至736位氨基酸所示的AAVrh.8vp1衣壳蛋白，(b)功能性rep基于，(c)腺伴随病毒反向末端重复序列和转基因和(d)将腺伴随病毒反向末端重复序列和转基因包装到AAV衣壳蛋白内所需足够的辅助功能。
15.分离的腺伴随病毒(即AAV)，包含具有选自以下所述氨基酸序列的AAV衣壳：AAV7,SEQIDNO:2的氨基酸1至737；C1，SEQIDNO:60；C2，SEQIDNO:61；C5，SEQIDNO:62；A3-3，SEQIDNO:66；A3-7，SEQIDNO:67；A3-4，SEQIDNO:68；A3-5，SEQIDNO:69；3.3b，SEQIDNO:62；223.4，SEQIDNO:73；223-5，SEQIDNO:74；223-10，SEQIDNO:75；223-2，SEQIDNO:76；223-7，SEQIDNO:77；223-6，SEQIDNO:78；44-1，SEQIDNO:79；44-5，SEQIDNO:80；44-2，SEQIDNO:81；42-15，SEQIDNO:84；42-8，SEQIDNO:85；42-13，SEQIDNO:86；42-3A，SEQIDNO:87；42-4，SEQIDNO:88；42-5A，SEQIDNO:89；42-1B，SEQIDNO:90；42-5B，SEQIDNO:91；43-1，SEQIDNO:92；43-12，SEQIDNO:93；43-5，SEQIDNO:94；43-21，SEQIDNO:96；43-25，SEQIDNO:97；43-20，SEQIDNO:99；24.1，SEQIDNO:101；42.2，SEQIDNO:102；7.2，SEQIDNO:103；27.3，SEQIDNO:104；16.3，SEQIDNO:105；42.10，SEQIDNO:106；42-3B，SEQIDNO:107；42-11，SEQIDNO:108；F1，SEQIDNO:109；F5，SEQIDNO:110；F3，SEQIDNO:111；42-6B，SEQIDNO:112；和42-12，SEQIDNO:113。
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