HU220800B1 - Eljárás mikroorganizmusok vagy ezek intracelluláris anyagának kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására - Google Patents
Eljárás mikroorganizmusok vagy ezek intracelluláris anyagának kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására Download PDFInfo
- Publication number
- HU220800B1 HU220800B1 HU9700090A HU9700090A HU220800B1 HU 220800 B1 HU220800 B1 HU 220800B1 HU 9700090 A HU9700090 A HU 9700090A HU 9700090 A HU9700090 A HU 9700090A HU 220800 B1 HU220800 B1 HU 220800B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- adp
- sample
- atp
- beads
- reagent
- Prior art date
Links
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 25
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 65
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 65
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 claims abstract description 62
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 62
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 53
- 102000002281 Adenylate kinase Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108020000543 Adenylate kinase Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 63
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 45
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 45
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 35
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 31
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 25
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- -1 extractant Chemical compound 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 125000004427 diamine group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 239000013077 target material Substances 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 150000004985 diamines Chemical group 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229960001596 famotidine Drugs 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- XMGJGSKRRWXOIF-UHFFFAOYSA-N 2-(azepan-1-yl)ethyl 2-cyclohexyl-2-thiophen-3-ylacetate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.C1CCCCC1C(C1=CSC=C1)C(=O)OCCN1CCCCCC1 XMGJGSKRRWXOIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000582 ATP assay Toxicity 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010029897 Obsessive thoughts Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000002888 zwitterionic surfactant Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Gyroscopes (AREA)
- Cereal-Derived Products (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Water Treatment By Sorption (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgyát eljárás képezi mikroorganizmusok és/vagy ezek intracelluláris anyagának kimutatására és meghatározására; a találmány tárgyához tartoznak továbbá ezen eljáráshoz alkalmazandó reagensek, valamint ezen reagenseket tartalmazó, fenti vizsgálati eljárás elvégzéséhez használatos készlet, és a találmány szerinti eljáráshoz használható berendezés.
Minden élő szervezet kémiai energiaforrásként adenozin-trifoszfátot (ATP) használ. Ismeretes, hogy ezen vegyület meghatározására az ATP által elindított luciferáz/luciferin reakciót alkalmazzák. Ezen enzimatikus reakció során fénykibocsátásra kerül sor, amit luminométer segítségével mérni lehet, a kibocsátott fény mennyisége arányos a jelenlévő ATP mennyiségével. Már az 1960-as évek közepe óta ismeretes, hogy eredményesen alkalmazható az ATP meghatározása a jelenlévő mikroorganizmusok számának jelzésére [lásd ATP Luminescence Rapid Methods in Mícrobiology (1989), szerkesztő Stanley és munkatársai: Blackwell Scientific Publications, London, 1-10. oldal]; e módszer előnye a gyorsaság és a nagyfokú érzékenység. Ezen vizsgálat segítségével egyszerű minták analízise perceken belül elvégezhető, bonyolultabb minták esetében a vizsgálat fél óráig tart. A meghatározás alsó határát 10~12 mol/liter ATP-koncentráció képezi. Szükség van azonban egy még érzékenyebb módszerre is, amely a mikroorganizmusok kimutatására vagy meghatározására volna használható, ahol azonban a módszer megtartaná gyorsaságát és könnyű kivitelezhetőségét.
A találmány szerinti megoldásnál azt találtuk, hogy az ATP meghatározáson alapuló módszerek gyorsasága és érzékenysége lényegesen fokozható, ha a vizsgálatnál a meghatározás célpontjaként ATP helyett egy olyan enzimet választunk, amely adenilát-kinázt gerjeszt. Az adenilát-kináz olyan enzim, amelyet minden mikroorganizmus használ az adenozin-difoszfátnak (ADP), adenozin-trifoszfátnak (ATP) és az adenozinmonofoszfátnak (AMP) egymás közötti átalakításánál. Amennyiben a vizsgálati módszernél az ATP helyett ezen enzimet vesszük célba és a kimutatáshoz, továbbá a meghatározáshoz a találmány szerinti reagenst és készletet használjuk, úgy lehetőség nyílik arra, hogy az adenilát-kináz meghatározásánál egészen a 10-20 mól tartományig lemenjünk.
Ismeretes, hogy a luciferáz/luciferin rendszerrel mód van az adenilát-kináz vizsgálatára [lásd Brolin és munkatársai: Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1,163-169 (1979), továbbá Shutenko és munkatársai: Biotekhnologija, 4. szám, 542-547 (1988)] abból a célból, hogy ezen enzim aktivitását meghatározzák; e módszer segítségével bizonyos emlős szöveteket és növényi szöveteket vizsgáltak [lásd például Rodionova és munkatársai: Fiziologija Rastenii 25, 4, 731-734 (1978)]. Ezen vizsgálati módszernek a használata a mikroorganizmusok kimutatására azonban nem volt ismeretes és ezen enzim tanulmányozásával foglalkozó szakember számára nem volt nyilvánvaló, hogy a módszer fokozott érzékenysége milyen előnyöket jelent.
Annak ellenére, hogy az adenilát-kináz kisebb mennyiségekben van jelen, mint az ADP, ennek biológiai jelzőanyagként való alkalmazása mikroorganizmusok esetében a kimutatás érzékenységét mintegy 400 000-szeresére növeli, amennyiben az adenilát-kináz jelenlétét az általa létrehozott ATP segítségével határozzuk meg: ez azt jelenti, hogy 1 mól jelenlévő enzim hatására 400 000 mól ADP alakult át ATP-vé 10 perces inkubáció alatt. Ily módon az enzim meghatározásánál, amikor is a szubsztrátumot vagy az általa katalizált reakciótermékét mérjük, a kimutatás határa a ÍO-20 mól tartományba csökkenthető le.
A találmány szerinti megoldásnál egy olyan javított módszert dolgoztunk ki, ahol az adenilát-kináz aktivitását a mikroorganizmusok jelzésére használjuk egy mikroorganizmus-befogási vizsgálat során, ahol is mihelyt a mikroorganizmusokat befogtuk és a többi reagenst eltávolítottuk, az így befogott mikroorganizmusok számát oly módon határozhatjuk meg, hogy ezek intracelluláris tartalmát az ADP számára hozzáférhetővé tesszük, majd mérjük a létrehozott ATP mennyiségét, elsősorban mérve a luciferin/luciferáz reakció során képződő fényt, minthogy ez egy gyors mérési módszert biztosít. Az ADP-nek adenilát-kinázzal végbemenő reakciójához a szükséges magnéziumionokat reagens formájában adják az elegyhez, vagy a magnéziumot a jelenlévő baktériumsejtek biztosítják, illetőleg az egyéb reagensekben szennyezésként van jelen. Ezen vizsgálati módszer alkalmazásával a kimutatható sejtek száma mintegy 10 2, megbízhatóbb statisztikus eredményeket kapunk ÍO-3 vagy ennél nagyobb sejtszám esetén, amikor is a lumimetriás mérés eredménye és a sejtszám közötti összefüggés lineárissá válik.
Fentiekből következik, hogy alkalmazhatunk olyan kolorimetriás módszereket, amelyek alkalmasak a vizsgálati mintában a jelenlévő ATP mennyiségének meghatározására, használhatunk például piruvát-kináz meghatározáson alapuló reakciókat; ezen kolorimetriás vizsgálati módszert az adenilát-kináz-módszerrel összekapcsolva kiváló kimutatási érzékenységet érhetünk el.
A mikroorganizmusokat bármilyen ismert befogási módszerrel befoghatjuk, így például erre a célra használhatunk specifikus antitesteket, amelyeket egy szilárd felszínen, mint például mikrotitrálásra szánt lemezen vagy latexgyöngyökön rögzítünk. Az immunológiai vizsgálathoz bármely egyéb megfelelő felület is figyelembe jöhet, amely a szakember számára rendelkezésre áll. Jelen megoldásnál különösen előnyös, ha az antitesteket egy mágneses gyöngyön kötjük meg (immobilizáljuk), amit követően bármely, az antitesthez kapcsolt mikroorganizmus befogható egy mágneses mezőbe, az ebben lévő adenilát-kináz aktivitása meghatározható, majd ennek eleresztésével újabb minta vizsgálatára kerülhet sor. Ezen módszer igen előnyös az állandó áramlásban lévő minták vizsgálatára, például amikor a minta egy folyamatosan áramló forrásból származik egy ciklonmintavevő esetében a levegőben lévő baktériumok számának meghatározásánál.
Az adenilát-kináz-vizsgálatot alkalmazva, különösen ha adenilát-kinázt és ATP reagenseket használunk, a vizsgálati mintában jelenlévő mikroorganizmusok számát folyamatos módszer segítségével meghatározhat2
HU 220 800 Bl juk, ahol is 200 μΐ térfogatú mintában már néhány 10 sejtet kimutathatunk; a sejtek száma és az ATP-ből származó fény közötti kvantitatív összefüggése alapján mód van arra, hogy mindössze 10 sejtet is kimutassunk vagy akár 10-nél kisebb számú sejt jelenlétét észleljük, amennyiben a reakció térfogatát csökkentjük.
A találmány szerinti megoldás egyik aspektusa szerint olyan módszert dolgoztunk ki, amelynek segítségével kimutatható a mikroorganizmusok és/vagy ezek intracelluláris anyagának jelenléte vagy meghatározható ezek mennyisége a vizsgált mintában; a műveletet oly módon végezzük hogy:
a) a vizsgálati mintát szilárd szubsztrátumon immobilizált specifikus megkötőanyag hatásának tesszük ki, ahol a specifikus megkötőanyag képes a mikroorganizmushoz vagy ennek intracelluláris anyagához kapcsolódni és ily módon azt a szilárd anyaghoz kötni;
b) a szilárd szubsztrátumot olyan szerrel hozzuk érintkezésbe, amely képes az a mikroorganizmusban és/vagy ennek intracelluláris anyagában lévő adenilátkinázt a szubsztrátum kezeléséhez alkalmazott oldat számára hozzáférhetővé tenni;
c) a szubsztrátumot adenozin-difoszfát (ADP) tartalmú oldattal kezeljük;
d) meghatározzuk a keletkezett adenozin-trifoszfát (ATP) mennyiségét és ennek alapján megállapítjuk a jelenlévő mikroorganizmus vagy intracelluláris anyag mennyiségét.
A d) lépést bármely, az ATP meghatározására alkalmas módszer segítségével elvégezhetjük. Előnyösen oly módon járunk el, hogy színképző reakciót végzünk, még előnyösebben a széles körben alkalmazott luciferin/luciferáz lumineszcencia reagenst használjuk és meghatározzuk az ATP-nek ADP-vé való átalakulását a szakember számára jól ismert módon. Az ATP mennyiségének a mikroorganizmusokhoz és/vagy az intracelluláris anyag tartalmához viszonyított aránya könnyen meghatározható olyan kalibrációs görbék segítségével, amely kalibrációs görbéket ismert mennyiségű megcélzott mikroorganizmus vagy ennek intracelluláris anyagával veszszük fel, majd az ismeretlen mennyiségű mikroorganizmust ezen görbékhez viszonyítjuk. Előnyösen olyan kalibrációs görbét készítünk, amelyen feltüntetjük a kibocsátott fénynek a mikroorganizmusok számához való viszonyát, majd egy ismeretlen számú mikroorganizmust tartalmazó minta esetében az időegység alatt észlelt fénykibocsátást ennek alapján értékeljük.
Annak érdekében, hogy az átalakított ATP mennyiségét maximális értékre növeljük és így a szilárd szubsztrátumhoz kapcsolódó adenilát-kináz mennyiségét felerősítsük, az ADP-nek ATP-vé való átalakulását célszerűen magnéziumionok jelenlétében végezzük, ahol is az ionok moláris koncentrációja elegendő ahhoz, hogy az ADP-nek ATP-vé való átalakítását maximálissá tegye. A művelethez szükséges magnézium mennyisége előnyösen olyan, hogy 1 mól ADP-re számítva megközelítőleg 1 mól magnézium legyen jelen, ily módon minden ADP-molekula legalább 1 magnéziumionnal kapcsolódhat. A reakció az alábbiak szerint megy végbe: ADP+Mg2+. ADP <+> Mg2+. ATP+AMP, az
1:1 mólarány pontos betartása nem okvetlenül szükséges, de hasznos iránymutatás.
A találmány egyik előnyös megoldása szerint a vizsgálati mintát vizes szuszpenzió vagy oldat formájában állítjuk elő, a vizsgálat tárgyát képező mikroorganizmusok vagy intracelluláris anyagok a mintában vannak megkötve, az ezekhez kapcsolódó adenilát-kináz meghatározását oly módon végezzük, hogy a mintához ADP-t és magnéziumionokat adunk olyan körülmények között, hogy a jelenlévő összes adenilát-kináz az ADP-t ATP-vé alakítsa át, amikor is a mintát egy előre meghatározott időtartamig inkubáljuk, az átalakítás biztosítására luciferáz/luciferin tartalmú szert adunk a mintához, a mintából kisugárzott fényt meghatározva ebből a jelenlévő adenilát-kináz mennyiségére következtetünk.
A befogási lépést előnyösen immobilizált antitestek segítségével végezzük el, e lépéshez olyan antitesteket használunk, amelyek specifikusak egy adott mikroorganizmus fajtára vagy osztályra nézve, vagy használhatunk bizonyos anyagokra specifikus szereket, amelyek a különféle mikroorganizmusok sejtfalán kötődnek, mint például a lecitin. A befogáshoz alkalmas szerként előnyösen antitestek szerepelnek, ezeket a szilárd szubsztrátumhoz kötjük szokásos megkötési módszerek segítségével, így például kovalens kapcsolást vagy sztreptavidin/biotin megkötést végzünk. így például egy specifikus antitestet biotinilezésnek alávetve az antitestet oly módon alakítjuk át, hogy az a sztreptavidinnel bevont felszínre kötődjön.
Egy előnyös megoldás szerint mágneses szilárd anyagot, így például mágneses gyöngyöket alkalmazunk, amelyek például a Dynal UK Ltd. Station House, Grove Street 26, New Ferry, Wirral, Merseyside cégtől szerezhetők be. A specifikus antitesteknek ezen gyöngyökhöz való kötési módszere a szakember számára a szakirodalomból jól ismert.
Ezen gyöngyök alkalmazásával a vizsgálat tárgyát képező mikroorganizmusokat a gyönggyel immobilizált antitestekhez köthetjük egy oldatban, egy csövet ebbe lebocsátunk mint a folyamatos mintavevő készülék használata esetén, majd a kivett mintákat egy vizsgálati helyen összegyűjtjük, ezeket mágneses térrel kezeljük, az adenilát-kinázt hozzáférhetővé tesszük, miközben az ADP és ATP meghatározására szükséges reagenseket beadagoljuk. Előnyösen ADP-magnéziumot és luciferáz/luciferin reagenst adunk a mintákhoz, miközben a gyöngyök immobilizálva vannak, majd mérjük a kibocsátott fényt egy fénydetektor segítségével; erre a feladatra előnyösen a minták mellett elhelyezett luminométer használható. A luciferáz/luciferin reagenst ADP-vel és magnéziummal egyidejűleg vagy ezeket követően adjuk a mintákhoz.
A találmány szerinti megoldást végezhetjük egyetlen lombikban mágneses gyöngyöket adva az edényhez, ahol az antitestek a gyöngyökön immobilizálva vannak; a vizsgálandó mintát oldat vagy szuszpenzió formájában keverés közben adagoljuk be, a gyöngyökön befogott mikroorganizmusokat és/vagy intercelluláris anyagot mágneses teret létesítve immobilizáljuk, ezután a maradék oldatot vagy szuszpenziót eltávolít3
HU 220 800 Bl juk; a gyöngyökhöz ADP-szubsztrátumot és extrakciós oldatot vagy oldatokat adunk, ily módon az adenilátkinázt az ADP-oldat számára hozzáférhetővé tesszük, ezután a mágneses teret megszüntetjük, a gyöngyöket a szubsztrátumoldatban keverjük, a mágneses tér újralétesítésével a gyöngyöket immobilizáljuk; ezután az ADP-tartalmú oldatot, az extrakcióhoz használt szert és a képződött ATP-t eltávolítjuk és az ATP-tartalmat meghatározzuk. Az ATP meghatározást végezhetjük kolorimetriás módszerrel vagy még előnyösebben luminometriával.
Egy további előnyös megoldás szerint a megkötés céljára egy oszlopot használunk, amelyben egy megkötőszer, mint például antitest van, ami egy szilárd szubsztrátumon, mint például gyöngyön van immobilizálva, majd a mintát és a különböző reagenseket egymást követően az oszlopon átengedjük, így ATP-t szintetizálunk, majd ennek a megkötött antitesttel arányos mennyiségét meghatározzuk.
Minden esetben olyan mennyiségű ADP-vel elegyítjük a mintát, amely előnyösen elegendő ahhoz, hogy az ADP-koncentrációja az elegyben legalább 0,005 mmol vagy ennél több legyen, előnyösen ez az érték több mint 0,01 mmol, még előnyösebben ez az érték több mint 0,08 mmol. Különösen előnyös, ha a konverziós lépésben az elegyben az ADP-mennyiség mintegy 0,1 mmol. Ez függ az ADP tisztaságától is: nagyobb mennyiségű ATP-szennyezés esetében nem célszerű magas koncentrációkat képezni. Az az ADP-koncentrációtartomány tekinthető különösen előnyösnek, amely mintegy 10 mmol és mintegy 0,1 pmol között van. Az előnyös ADP-koncentráció beállításánál célszerű, ha az ADP-nek ATP-vé való konverziója alkalmával a szuszpenzió vagy oldat magnéziumkoncentrációja 1 mmol vagy ennél több, előnyösen 5 mmol vagy e fölötti érték, még előnyösebben 10 mmol vagy e fölötti érték. A magnéziumionokat magnéziumsók formájában visszük be az oldatba, előnyösen magnézium-acetátot használunk. A Mg2+ koncentráció tartománya előnyösen mintegy 0,1 mmol és mintegy 25 mmol között van. Az Mg2+ jelenlévő mennyisége függ egyebek között az ADP-koncentrációtól és a jelenlévő kelátképzőszer mennyiségétől (így például EDTA-tói).
A találmány egy előnyös megoldása szerint a luciferin/luciferáz luminometriás reagenst az inkubációs időszak kezdete előtt adjuk a mintához, előnyösen egyetlen reagens formájában az ADP és magnéziumion-forrás beadásával egyidejűleg. E művelethez nagy tisztaságú luciferáz reagenst használunk, ahol a reagens előállítása során az adenilát-kináz teljes mértékben el lett távolítva. A találmány ezen megoldása szerint az összes reagenst az ADP-nek ATP-vé való átalakítása előtt adjuk az elegyhez és/vagy a luminometriás számlálást a luciferin/luciferáz hozzáadását követően is folytatjuk, ahol e reagens hozzáadása egy külön lépésben történik, vagy a magnéziumot a luciferin/luciferáz reagenssel egyidejűleg is beadhatjuk. Tekintettel azonban arra, hogy a magnéziumionokat a luciferáz és EDTA megköti, szükséges, hogy a magnézium szükséges mennyiségét a vizsgálat előtt kísérleti úton vagy számítással határozzuk meg. A szakember számára világos, hogy egy adott ADP-tartalmú minta és luciferin/luciferáz elegy esetében a magnéziumsó optimális mennyiségét rutinkísérlettel határozzuk meg ismert mennyiségű baktériumot, így például E. colit tartalmazó minta segítségével, ahol maximális jeleket kapunk.
A magnéziumionok az ADP instabilitását okozhatják (azon értelemben, hogy a szennyezésként jelenlévő adenilát-kináz idő előtti ATP-vé való átalakulását indítja el). Ezért célszerű a magnéziumionokat a felhasználás előtt nem a többi komponenssel együtt oldatban tartani, hanem előnyös a komponenseket közvetlenül a felhasználás előtt elegyíteni, vagy az ADP konverziólépésében hozzáadni. Minthogy a magnéziumionokra szükség van az adenilát-kináz aktivitásának biztosítására, célszerű e komponenseket a mintával az ADP hozzáadását megelőzően elegyíteni. Abban az esetben, ha a reagenseket együttesen tároljuk, úgy célszerű ezeket fagyasztva szárítva tárolni, így mindennemű destabilizáló hatás elkerülhető.
Mint a fentiekben említettük az adenozin-trifoszfátot (ATP) előnyösen úgy mutathatjuk ki, hogy luciferin/luciferáz rendszert használunk, amikor is fotometriásan jól észlelhető jelet kapunk, ahol a kapott jel a mintában lévő ATP mennyiségével arányos. A luciferin/luciferáz készítmények és ezek alkalmazása az ATP meghatározásánál a szakember számára jól ismert, ezen reagensek a kereskedelemben beszerezhetők (lásd például Brolin és munkatársai fentiekben említett közleményét). Egy szokásos készítmény például 0,1-10 mg/1 luciferázt, 15-1000 pmol/l, előnyösen 15-100 pmol/l (így például mintegy 36 pmol/l) D-luciferint, továbbá olyan komponenseket, mint MgCl2-t (2,5-25 mmol), EDTA-t, BSA-t tartalmaz, az oldat pH-ja 7, ami pufferrel van beállítva (lásd például a 054676 számú európai szabadalmi leírást), a pH célszerűen 7,8.
Amennyiben az adenilát-kináz vizsgálati módszerhez egyetlen reagenst használunk a fentiekben leírtak szerint, célszerű, ha a pH-t a két enzim szempontjából optimális értékre állítjuk, vagyis egy kompromisszumos értéket állítunk be annak érdekében, hogy a számlálást folyamatosan végezhessük, miközben az ADPnek ATP-vé való konverziója folyik. Ezt rutinkísérlettel határozhatjuk meg ismert számú baktériumot tartalmazó mintát használva.
A mintát, ADP-t és a magnéziumion-forrást bármely olyan pufferral elegyíthetjük, amely az adenilátkináz reakcióhoz szükséges pH-t biztosítja, nincs szükség reagensekre. így bármely puffer használható, amely képes 5,5 és 8,5 közé a pH-t beállítani, az optimális pH 6 és 7 között van, előnyösen ez az érték 6,5. A megfelelő pufferek közül példaként említjük meg a trisz- és a foszfátpuffereket. Legelőnyösebb a minta elkészítéséhez és/vagy hígításához azt a puffért használni, amelyet a vizsgálati módszer végzésénél is alkalmazunk.
Mint minden folerősítő vizsgálat esetében a találmány szerinti adenilát-kináz-vizsgálat érzékenysége az alkalmazott reagensek tisztaságától függ. Jelen esetben a legszámottevőbb szennyezést az ATP képezi az ADPszubsztrátumban, valamint az adenilát-kináz a luciferáz
HU 220 800 Β1 készítményben. Minthogy mikroorganizmusok vonatkozásában érzékeny vizsgálati módszert kívánunk nyújtani, különösen az esetben, ahol káros hatású mikroorganizmusokról van szó és alacsony számban kívánjuk ezeket kimutatni, szükséges, hogy minden egyes reagens a lehető legtisztább legyen figyelembe véve elsősorban azt az anyagot, amivel a vizsgálat során a mintát reagáltatni fogjuk.
Előnyösen Econopaq Q erős anioncserélő géltöltetet (BioRad) használunk, amit 20 mmol/1 koncentrációjú kálium-foszfát-oldattal (pH: 4,6) egyensúlyozunk ki és eluálunk, ahol a kálium-foszfát koncentrációja egészen 400 mmol-ig mehet. Azt találtuk, hogy az ADP mint koherens csúcs eluálódik, majd ezt követi az ATP eluálódása. Ily módon olyan ADP-t kapunk, ahol az ATP mol% felső határa 2 χ 108. Ismereteink szerint az irodalomból ismert legtisztább ADP 0,001%-os (lásd Shutenko és munkatársai közleményét fentiek szerint) a találmány szerinti megoldásnál viszont olyan ADP-t alkalmazunk, amely 0,001 mol% ATP-nél kisebb mennyiséget tartalmaz, előnyösen ez az érték 2 χ 10-8 mol% vagy ez alatti érték.
Egy további problémát képez az adenilát-kináz, ami lényegében egy mindenütt jelenlévő enzim, gyakorlatilag minden mikroorganizmusban megtalálható és általában a luciferáz készítményekben is előfordul. Lehet, hogy az adenilát-kináz csak kis mértékű szennyezést képez, de minthogy a találmány szerinti megoldásnál igen csekély adenilát-kináz-szintet kívánunk a mintákban kimutatni, ezen enzimnek a luciferáz készítményben való jelenléte egy korlátozó faktort képez.
A luciferáz és adenilát-kináz móltömege lényegesen eltér egymástól, az egyik 61 kD, a másik 21 kD. A luciferáz ezenkívül membránhoz kötődő protein, így viszonylag hidrofób, ezzel szemben az adenilát-kináz oldható enzimként fordul elő. így mód van arra, hogy a luciferáz készítményekből az adenilát-kinázt eltávolítsuk, például méretkizáró kromatográfia, reverz fázisú kromatográfia vagy mindkettő segítségével. Másik lehetőségként vagy az előbbi megoldásokkal kombinálva a luciferáz készítmény adenilát-kináz szennyeződésének problémáját oly módon küszöbölhetjük ki, hogy a biolumineszcenciás reagenst (luciferáz és luciferin) közvetlenül a meghatározás előtt vagy annak során adjuk a vizsgálandó mintához, így az esetleg jelenlévő szennyező adenilát-kináznak nincs arra ideje, hogy számottevő hatást idézzen elő.
A luciferáz tisztítására alkalmas módszerként végezhetünk oszlopkromatográfiás frakcionálási, amihez alacsony porozitású gélt, így például Sephadex G-25-öt használhatunk [lásd Nielsen és Rasmussen, Acta Chemica Scandinavica 22, 1757-1762 (1968)]; alkalmazhatók a Sephadex és Sepharose oszlopok (például Blue Sepharose) egymás után kötve, végezhető SDS elektroforézis [lásd Devine és munkatársai: Biochimica et Biophysica Acta 1172,121-132. oldal (1993)], vagy bizonyos ideig szobahőmérsékletnél magasabb hőmérsékleten tartjuk a vizsgálati anyagot.
Adenilát-kináztól mentes BSA-t, ami a kereskedelemben beszerezhető luciferáz/luciferin készítmény egy komponense, a Sigma és BDH cégtől szerezhetünk be, ez a készítmény kémiailag kezelt acetilezett BSA. A szakember számára nyilvánvaló, hogy egyéb, kémiailag kezelt BSA reagens is alkalmazható.
Annak érdekében, hogy a vizsgálat tárgyát képező mikroorganizmushoz kapcsolódó összes adenilátkinázt az ADP, magnéziumionok és luciferin/luciferáz tartalmú találmány szerinti vizsgálati reagensek számára hozzáférhetővé tegyük, szükséges, hogy a mikroorganizmusokat olyan mértékben felszakítsuk, hogy a sejten belüli anyag felszabaduljon, vagy más módon váljon a reagens számára hozzáférhetővé. Ezen felszakítást végezhetjük mechanikus úton, így például ultrahang-generátort alkalmazunk, vagy ozmotikus sokkot fejtünk ki, előnyösen egyidejűleg hideg sokkot is végzünk vagy olyan szereket használunk, mint lizozim vagy még egyszerűbben, például felületaktív anyagokat használunk. Ezen felületaktív anyagok a kereskedelemben beszerezhetők, ezekre általában mint extraktánsokra hivatkozunk. Általában extraktánsként szerepelhet valamely kationos detergens, mint például a CTAB (cetil-trimetil-ammónium-bromid) vagy a védett megnevezésű enzimatikus hatású ATP-t felszabadító szer, a Biotrace XM extraktáns (előállító: Biotrace Bridgend UK), a Celsis UK kationos extraktáns, valamint a Lumac NRM (nukleotidot felszabadító szer, előállító: Lumac BV, Hollandia) nevű szer. Abban az esetben, ha CTAB-t alkalmazunk, egy megfelelő készítmény 0,01-1 tömeg% CTAB-t tartalmaz vizes oldatban, így például 0,2 tömeg%-ot, de más koncentrációértékek is jól ismertek a szakember számára.
így mielőtt ADP-t és luciferáz/luciferin reagenst adnánk ahhoz a mintához, amelynél mikroorganizmus jelenlétére gyanakszunk, célszerűen a mikroorganizmust felszakítjuk annak érdekében, hogy a luminometriás reagensek a sejten belüli anyaghoz hozzá tudjanak férni, ebből a célból mikroorganizmus sejteket felszakító szert használunk. Abban az esetben, ha különbséget akarunk tenni a kimutatandó sejtek és az egyéb sejtek között, mint például a gombaspórák között, eljárhatunk úgy is, hogy két egymástól független vizsgálatot végzünk, az egyik esetben a mintát olyan nemionos detergenssel kezeljük, amely csak a spórákat és a többsejtű szomatikus állati sejteket szakítja fel (így például mint a Triton-X-100, előállító: Sigma cég), a másik vizsgálathoz kationos felületaktív anyagot, úgynevezett extraktánst használunk, amely képes az összes sejt felszakítására. Lehetőség van arra is, hogy ezen vizsgálatokat ugyanazon a mintán végezzük el, amennyiben egy ATP-ázt, mint apirázt, majd ezt követően egy proteázt adunk a vizsgálati mintához a detergens/luciferáz/mérés ciklusok között; az egyik ciklusban nemionos, a másik ciklusban kationos felületaktív anyagot használunk a ciklus első lépésében.
Az extraktánsnak a luciferáz/luciferin rendszerre kifejtett hatása ismert módon igen jelentős [lásd például Simpson és munkatársai: J. Biolumin Chemilumin 6(2) 97-106. oldal (1991)], ismeretes, hogy a kationos felületaktív anyagok potencírozzák a reakciót, de ugyanakkor a luciferázt fokozatosan inaktiválják, ismert az is, ί
HU 220 800 Bl hogy az anionos felületaktív anyagok inhibitálják a reakciót, ezzel szemben a nemionos és az ikerionos felületaktív anyagok széles tartományban potencírozó hatást fejtenek ki. 0,15 tömeg%-os kationos felületaktív anyagnak 0,25 tömeg% tercier-diamin típusú felületaktív anyaggal készített elegye (előállító: Celsis, Cambridge, UK) megfelel a találmány szerinti megoldás céljaira, de a szakember számára nem fog nehézséget jelenteni, hogy olyan egyéb extraktánsokat válasszon, amelyek az adenilát-kináz és luciferáz optimális hatását biztosítják, amikor egy oldatban egyidejűleg vannak jelen. Általában a felületaktív anyag koncentrációja mintegy 0,05 és 1,0 tömeg% között lehet.
A lényeges lépések befejezése után a leadott fényt (vagyis amikor az ADP-nek ATP-vé való átalakulása megtörténik és ezt követően a luciferáz a luciferinre kifejti hatását) oly módon mérhetjük meg, hogy a vizsgálati mintát egy luminométer mérőedényébe visszük, fénydetektorral mérjük a kisugárzó fényt közvetlenül a luciferáz/luciferin reagens vagy egyéb szerek hozzáadása után vagy azzal egyidejűleg.
A találmány egy második aspektusát képezi az a vizsgálati készlet, amely tartalmazza a találmány szerinti vizsgálati módszerhez szükséges összes lényeges reagenseket, így például az immobilizált befogószert, adenozin-difoszfátot és célszerűen magnéziumion-forrást, továbbá előnyösen luciferázt és luciferint. Előnyösen a vizsgálati készlet tartalmazza mindezen reagenseket; a luciferázt és luciferint reagens oldat formájában, a felületaktív reagenssel együtt, ahol ez utóbbi a vizsgálandó mikroorganizmus sejtjének felszakítására szolgál. Általában a mikroorganizmusok vizsgálatához elegendő a kationos felületaktív anyagok alkalmazása, ezzel szemben a gombás spórák és a szomatikus sejtek vizsgálatára célszerűen egy további nemionos felületaktív reagenst is használhatunk ezen sejtek számának meghatározására. A vizsgálati készlet előnyösen tartalmaz egy útmutatást is arra vonatkozóan, hogyan kell a találmány szerinti vizsgálatot elvégezni, a reagensek tartóedényben vannak elhelyezve, koncentrációjuk olyan, hogy a reagenseket közvetlenül vagy hígítást követően használhatjuk fel.
A találmány szerinti vizsgálati készlet előnyös kivitelezése szerint a készlet immobilizált (rögzített) antitesteket tartalmaz szabadon mozgó gyöngyök formájában, ezenkívül tartalmazhat gyöngyökkel töltött oszlopot vagy bevont mikrotiter lapot. Tartalmaz továbbá ADP reagenst, amelynek tisztasága 99,999%-nál nagyobb, továbbá luciferáz/luciferin reagenst, valamint olyan BSA-t, amely lényegében adenilát-kináz-hatástól mentes. Ezen túlmenően a luciferáz/luciferin arány (mint az a készletben lévő instrukciókból kitűnik) és ezek koncentrációja olyan, hogy a luciferáz képes legyen a luciferin szubsztrátumon hatását gyorsan kifejteni, így a luciferázhoz kötődő adenilát-kináz csak az első emiszszió befejeződését követően hoz létre ATP-t, így a mikroorganizmusokból származó adenilát-kinázt egy erős fényfelvillanással járó kinetikai reakció jelzi, ezzel szemben a szennyezésként jelenlévő ATP-re csak parázsló fény utal.
A találmány tárgyához tartozik a találmány szerinti vizsgálati módszer véghezvitelére szolgáló berendezés is, amely egy reakciós kamrából áll, amelyben a rögzített befogószer reagál a vizsgálati mintával, a reakciós kamrán egy bevezető és kivezető nyílás van a reagensek egymást követő beadagolására, így a megkötés elvégzésére, az extraktáns és ADP hozzáadást lépések elvégzésére, ezenkívül egy luciferáz/luciferin forrásként szolgáló reagenssel egy luminométer cellával van összekapcsolva úgy, hogy fenti lépések befejezése után a keletkezett ATP-t közvetlenül mérni lehessen az emittált fényt alapján. A találmány szerinti berendezésben a reakciós kamra előnyösen következő részekből áll:
a) egy reakció végbevitelére alkalmas edényből, amely elektromosan működtetett mágnes hatásterében van, ahol az edényben felfüggesztett mágneses gyöngyök a folyékony reakcióelegyben immobilizálhatók, miáltal a reagensek cserélhetők, így például egy szivattyú segítségével; vagy
b) reaktoroszlopból, amely ismert befogószert tartalmaz hordozóanyagon, így például befogószerrel bevont latexgyöngyöket.
A találmány szerinti eljárást, berendezést, reagenseket és vizsgálati készletet az alábbi példák és ábrák szemléltetik, a korlátozás szándéka nélkül. A szakember számára ezek alapján további megoldások is elvégezhetővé válnak.
Ábrák leírása
Az 1. ábra a találmány szerinti vizsgálati módszer kivitelezéséhez alkalmas berendezés diagramját tünteti fel, amely egy automatikus áramló rendszert mutat be, ahol a befogószer mágneses gyöngyökön van rögzítve, és ahol a gyöngyök a kívánság szerint bekapcsolható mágneses tér segítségével elkülöníthetők.
A 2. ábra a találmány szerinti vizsgálati módszer kivitelezésére alkalmas berendezés diagramját szemlélteti, amely egy automatikus áramló rendszert mutat be, ahol a befogószer rögzítése egy reaktoroszlopon történik.
A 3. ábra az igen kis számú E. coli sejtek vizsgálatára használt adenilát-kináz-módszer grafikus szemléltetésére szolgál.
A 4. ábra az E. coli sejtek specifikus vizsgálatát szemlélteti oszlopdiagram segítségével, ahol a befogásra mágneses gyöngyöket és a kimutatáshoz adenilát-kinázt használunk.
1. példa
Az E. coli sejtek kimutatása az 1. ábra szerinti berendezés alkalmazásával
E. coli sejteket tartalmazó folyékony mintát vezetünk egy 1 mintaforrásból egy 2 ötelágazású szelepen és 3 perisztaltikus csövön keresztül egy 4 reverzibilis szivattyú segítségével egy 5 reakciós kamrába, amely kamra E. colira specifikus antitesteket tartalmaz Dynal-féle mágneses gyöngyökön, szokásos kovalens kapcsolási módszerrel rögzítve. A gyöngyöket és a mintát a befogáshoz szükséges ideig keveqük, így például 1-30 per6
HU 220 800 Bl cig, a művelethez 6 keverőt használunk, egy 7 mágnes bekapcsolásával a gyöngyöket immobilizáljuk, majd a folyékony mintát 4 reverzibilis szivattyú és 2 szelep segítségével a 8 elöntésre szánt hulladékhoz vezetjük. A gyöngyöket 9 tartályból származó mosópufferral átmossuk, a 7 mágnest kikapcsoljuk, a 6 keverőt megindítjuk, a 7 mágnest bekapcsoljuk, majd a mosópuffert elöntjük.
ADP-szubsztrátumot (amelynek tisztasága az ATP vonatkozásában 99,999%-nál nagyobb), magnéziumacetátot és extraktáns reagenst (0,15% kationos felületaktív anyagot és 0,25% tercier-diamint tartalmazó reagens a végtérfogatra számítva) a reakciós edénybe adunk egy 10 tartályból (forrásból) elegendő mennyiségben ahhoz, hogy a reakciós kamrában 0,1 mmol ADP és 10 mmol/liter magnéziumion koncentráció alakuljon ki, a mágnest kikapcsoljuk, a keverőt megindítjuk, hagyjuk, hogy az extrakció/ADP konverzió mintegy 1-5 perces időtartam alatt végbemenjen, ezután a keverőt leállítjuk, a mágnest bekapcsoljuk, majd a folyadékot 11 luminométerhez tartozó átfolyócellába vezetjük, ehhez a művelethez 3 perisztaltikus csövet és 4, valamint 12 reverzibilis szivattyúkat használjuk, miközben egyidejűleg a vizsgálati folyadékhoz csökkent adenilát-kináz-tartalmú, hatásos térfogatú luciferáz/luciferin reagenst elegyítünk, ahol a reagenst 13 tartályból szivattyúzzuk be. Abban az esetben, ha adenilát-kinázzal módosított Celsis LDR reagenst használunk, amelyben egyébként a szükséges komponensek standard mennyisége van jelen, a reagens térfogatát úgy választjuk meg, hogy az a vizsgálati minta térfogatának felét tegye ki. A cellából emittált fény arányos a befogott E. coli sejtek számával, a meghatározáshoz standard görbéket használunk, amelyeket ismert számú sejtet tartalmazó vizsgálati mintákkal veszünk fel.
A reakciós edényben (kamrában) lévő mágneses gyöngyök regenerálását oly módon végezzük, hogy az elhasznált gyöngyöket az elöntésre szánt folyadékhoz vezetjük és egy 14 tartályból újabb gyöngyöket vezetünk be; vagy pedig olyan reagenst vagy oldatot vezetünk a gyöngyökhöz, amelynek segítségével a gyöngyökről a rátapadt mintarészek eltávolíthatók és a gyöngyök regenerálhatok; így például, ha a gyöngyöket antitestektől kívánjuk megszabadítani, úgy mintegy 0,1 mol/liter koncentrációjú sósavoldatot használunk.
2. példa
E. coli meghatározása 2. ábra szerinti berendezés alkalmazásával
A vizsgálatot az 1. példában leírtak szerint végezzük, azzal az eltéréssel, hogy az 5 tartályt, 6 mágnest és 7 keverőt egy luminométer átfolyócellájával összekötött reaktoroszloppal helyettesítjük, az oszlopot a fentiekben említett tartályokból származó reagensekkel töltjük meg. A berendezésben két 2 kétirányú szelepet használunk az 1. példánál alkalmazott öt irányban záró egyetlen szelep helyett; a 2. ábrán szereplő berendezéshez használt szivattyúk nem reverzibilisek. A minta forrását közvetlenül egy hidrociklon képezi, amilyet a WO 95/25811 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentés ismertet.
Meg kívánjuk jegyezni, hogy az 1. példában alkalmazott öt irányban nyíló szelep is alkalmazható a 2. példa szerinti reaktoroszlop beiktatásával végzett módszernél; hasonlóképpen a három darab, egymás után között két irányba nyíló szelep szintén használható a 2. példa szerinti megoldásnál; hasonlóképpen a vizsgálat egyes lépései a mágnes kézi működtetésével is elvégezhetők, hasonlóképpen a reagensek kézi adagolása is megvalósítható.
Claims (26)
1. Eljárás mikroorganizmusok és/vagy ezek intracelluláris anyagának kimutatására és/vagy mennyiségének meghatározására mintában, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:
a) a mintát olyan reagenssel érintkeztetjük, amely képes a mikroorganizmusban vagy annak intracelluláris anyagában lévő adenilát-kinázt hozzáférhetővé tenni a szubsztrátum kezeléséhez alkalmazott oldat számára;
b) a mintát adenozin-difoszfátot (ADP-t) tartalmazó oldattal kezeljük;
c) meghatározzuk a keletkezett adenozin-trifoszfát (ATP) mennyiségét, és ezt arányba állítjuk mikroorganizmus vagy intracelluláris anyag jelenlétével és/vagy mennyiségével;
azzal jellemezve, hogy előkészítő lépést hajtunk végre, amely során a mintát érintkeztetjük szilárd szubsztrátumra immobilizált befogószerrel, amely befogószer képes a mikroorganizmust vagy annak intracelluláris anyagát megkötni, miáltal azt a szilárd szubsztrátumhoz kapcsoljuk, és az a) lépésben a reagenst a szubsztrátumhoz adjuk, és a b) lépésben az ADP-oldatot a szubsztrátumhoz adjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés szerinti meghatározást színreakció segítségével végezzük.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés szerinti meghatározást luciferáz/luciferin reagenssel végezzük, ahol az emittált fény arányos a képződő ATP mennyiségével, és ahol az emittált fény mérésére luminométert alkalmazunk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben magnéziumionokat adunk a reakcióhoz.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) és b) lépésekben a mintához extraktánst, ADP-t és magnéziumionokat adunk és az elegyet inkubáljuk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előkészítő lépésben befogószerként mikroorganizmusok nemzetségére, fajára vagy osztályára specifikus immobilizált antitesteket, vagy különféle típusú mikroorganizmusok sejtfalán lévő sajátos anyagokra specifikus kötóreagenst alkalmazunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy befogószerként szilárd szubsztrátumhoz kovalens kötéssel vagy sztreptavidin/biotin kölcsönhatással kapcsolódó antitestet használunk.
HU 220 800 Bl
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mágneses térben rögzíthető szilárd szubsztrátumot alkalmazunk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előkészítő lépést úgy végezzük, hogy antitesteket immobilizálva hordozó mágneses gyöngyöket egy edénybe helyezünk, a vizsgálati mintát oldat vagy szuszpenzió formájában keverés közben a gyöngyökhöz adjuk; a mikroorganizmusokat és/vagy anyagaikat befogott gyöngyöket mágneses térben immobilizáljuk; a felesleges oldatot vagy szuszpenziót eltávolítjuk; ADP-szubsztrátot és extrahálószer-oldatot, vagy az adenilát-kinázt ADP-oldat számára hozzáférhetővé tévő oldatokat adunk a gyöngyökhöz; a mágneses teret megszüntetjük és a gyöngyöket a szubsztrátoldatban kevertetjük; a gyöngyöket a mágneses tér újbóli bekapcsolásával immobilizáljuk; az ADP-t, extrahálószert és képződött ATP-t tartalmazó oldatot eltávolítjuk és ennek ATP-tartalmát meghatározzuk.
10. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befogószert egy oszlopra visszük fel.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befogószert az oszlopban lévő gyöngyökre visszük fel.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizsgálati mintát és a vizsgálathoz alkalmazott reagenseket az oszlopon egymást követően átengedjük, a keletkezett kimenő ATP mennyiségét meghatározzuk, és azt arányba állítjuk a befogószer által célba vett anyag jelenlétével.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megkötött minta kezelésére nagyobb mint 0,005 mM végkoncentrációjú ADP-t alkalmazunk.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy 0,1 mmol/liter végkoncentrációjú ADP-t alkalmazunk.
15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megkötött minta kezelésére legalább 1 mmol/liter koncentrációjú magnéziumiont alkalmazunk.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább 10 mmol/liter koncentrációjú magnéziumiont alkalmazunk.
17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépést kationos detergenst tartalmazó reagens hozzáadásával hajtjuk végre.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kationos detergensként tercier-diamin-tartalmú reagenst alkalmazunk.
19. Vizsgálati készlet 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás végrehajtására, amely mikroorganizmust vagy intracelluláris anyagát megkötni képes immobilizált befogószert és adenozin-difoszfát-reagenst tartalmaz.
20. A19. igénypont szerinti vizsgálati készlet, amely magnéziumion-forrást és/vagy luciferázt és luciferint is tartalmaz.
21. A 20. igénypont szerinti vizsgálati készlet, amely különálló gyöngyök, gyöngyökkel töltött oszlop vagy mikrotiter lemez formájában szilárd szubsztrátumon immobilizált antitestet; 99,999%-nál nagyobb tisztaságú ADP-reagenst; továbbá lényegében adenilát-kináz-aktivitástól mentes BSA-t tartalmazó luciferáz/luciferin reagenst tartalmaz.
22. A 19-21. igénypontok bármelyike szerinti vizsgálati készlet, amelyben a befogószer mikroorganizmusok nemzetségére, fajára vagy osztályára specifikus antitest, vagy különféle típusú mikroorganizmusok sejtfalán lévő sajátos anyagokra specifikus reagens.
23. A 3-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás kivitelezésére szolgáló berendezés, azzal jellemezve, hogy immobilizált befogószer és vizsgálati minta reagáltatására szolgáló reakciókamrát (5); a reakciókamrát (5) az előkészítő lépéshez, majd az a) és b) lépéshez szükséges reagensekkel egymást követő módon ellátó eszközt; a reakciókamrához (5) kapcsolódó luminométer átfolyócellát (11); és ahhoz kapcsolódó luciferáz/luciferin forrást (13) tartalmaz, ahol a b) lépés elvégzése nyomán keletkezett ATP-t közvetlenül meghatározzuk a kisugárzott fény mennyisége alapján.
24. A 23. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy elektromosan működtethető mágnest (7) oly módon elhelyezve, hogy az képes a reakciókamrában (5) felszuszpendált mágneses gyöngyöket immobilizálni.
25. A 23. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a reakciókamra (5) reakciós oszlopot tartalmaz.
26. A 25. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy az oszlop mikroorganizmust vagy annak intracelluláris anyagát megkötni képes befogószerrel bevont hordozóanyagot tartalmaz.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9414096A GB9414096D0 (en) | 1994-07-13 | 1994-07-13 | Labelled capture assay |
| PCT/GB1995/001643 WO1996002666A1 (en) | 1994-07-13 | 1995-07-12 | Capture assays |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT76447A HUT76447A (en) | 1997-09-29 |
| HU220800B1 true HU220800B1 (hu) | 2002-05-28 |
Family
ID=10758240
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9700090A HU220800B1 (hu) | 1994-07-13 | 1995-07-12 | Eljárás mikroorganizmusok vagy ezek intracelluláris anyagának kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5798214A (hu) |
| EP (1) | EP0774011B1 (hu) |
| JP (1) | JP3589465B2 (hu) |
| CN (1) | CN1090677C (hu) |
| AT (1) | ATE184054T1 (hu) |
| AU (1) | AU691940B2 (hu) |
| BR (2) | BRPI9508392B8 (hu) |
| CA (1) | CA2194458C (hu) |
| DE (1) | DE69511876T2 (hu) |
| DK (1) | DK0774011T3 (hu) |
| ES (1) | ES2136866T3 (hu) |
| GB (2) | GB9414096D0 (hu) |
| GR (1) | GR3031877T3 (hu) |
| HU (1) | HU220800B1 (hu) |
| IN (1) | IN188668B (hu) |
| NO (1) | NO316227B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ289464A (hu) |
| WO (1) | WO1996002666A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA955846B (hu) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9308411D0 (en) * | 1993-04-23 | 1993-06-09 | Celsis Ltd | Detection of biological material |
| WO1998048044A1 (fr) * | 1997-04-18 | 1998-10-29 | Kikkoman Corporation | Reactifs de diagnostic pour troubles des fonctions renales et methode d'analyse d'echantillons d'urine |
| GB9801126D0 (en) * | 1998-01-21 | 1998-03-18 | Secr Defence | Antibiotic sensitivity testing |
| GB2348702B (en) * | 1998-01-21 | 2003-04-02 | Secr Defence | Antibiotic sensitivity testing |
| GB9803156D0 (en) * | 1998-02-13 | 1998-04-08 | Celsis Int Plc | Assay |
| WO2000039577A1 (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-06 | Abb Instrumentation Limited | Contaminant detection |
| GB9902659D0 (en) * | 1999-02-05 | 1999-03-31 | Microbiological Res Authority | Assay with reduced background |
| GB9911095D0 (en) | 1999-05-13 | 1999-07-14 | Secr Defence | Microbiological test method and reagents |
| GB9923208D0 (en) * | 1999-10-01 | 1999-12-08 | Cambridge Drug Discovery Ltd | Assay |
| GB0010910D0 (en) * | 2000-05-05 | 2000-06-28 | Jones Osborn | Analytical method and apparatus |
| GB0122790D0 (en) * | 2001-09-21 | 2001-11-14 | Secr Defence | Method of determining the presence of target bacteria |
| US6750006B2 (en) * | 2002-01-22 | 2004-06-15 | Microbiosystems, Limited Partnership | Method for detecting the presence of microbes and determining their physiological status |
| EP1348757A1 (de) * | 2002-03-27 | 2003-10-01 | Micronas GmbH | Vorrichtung und Verfahren zur Detektion von zellulären Vorgängen mittels Lumineszenzmessungen |
| WO2003100086A1 (fr) * | 2002-05-23 | 2003-12-04 | Fuji Electric Holdings Co., Ltd. | Procede et dispositif de comptage de cellules vivantes |
| US20110136131A1 (en) * | 2004-06-01 | 2011-06-09 | Sysmex Corporation | Method for measuring enzyme activity and column for use in measuring enzyme activity |
| CA2572608A1 (en) * | 2004-07-02 | 2006-08-17 | Promega Corporation | Microbial atp extraction and detection system |
| US7338775B1 (en) | 2005-02-09 | 2008-03-04 | Myriad Genetics, Inc. | Enzyme assay and use thereof |
| GB0606822D0 (en) * | 2006-04-05 | 2006-05-17 | Alaska Food Diagnostics | Assay System |
| US20080044880A1 (en) * | 2006-08-21 | 2008-02-21 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of and apparatus for separating microorganisms from sample using electrodialysis and microorganism capturing means |
| WO2009067595A1 (en) * | 2007-11-20 | 2009-05-28 | 3M Innovative Properties Company | Method of analyzing a sample for a bacterium using diacetylene-containing polymer sensor |
| EP2238432B1 (en) * | 2008-01-17 | 2020-02-19 | Neogen Corporation | Co2 optical sensor for detection and enumeration of microorganisms |
| GB0900151D0 (en) | 2009-01-07 | 2009-02-11 | Health Prot Agency | rapid bioluminescence detection system |
| US8518658B1 (en) * | 2009-04-27 | 2013-08-27 | University Of South Florida | ATP-bioluminescence immunoassay |
| US9932620B2 (en) | 2012-05-21 | 2018-04-03 | Celsis Ltd. | Methods, devices, and systems of detecting microorganisms |
| US20230131011A1 (en) * | 2020-05-25 | 2023-04-27 | Yokogawa Electric Corporation | Detection method of target molecule in specimen and detection kit for target molecule |
| CN118703320A (zh) * | 2024-06-07 | 2024-09-27 | 西原环保(上海)股份有限公司 | 菌种丰度监测系统和方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3933592A (en) * | 1965-02-17 | 1976-01-20 | Hazleton Laboratories, Incorporated | Method of detecting living microorganisms |
| IT1172385B (it) * | 1983-12-21 | 1987-06-18 | Miles Italiana | Composizione e metodo per la determinazione enzimatica di atp ed fmn |
| US4794076A (en) * | 1985-09-23 | 1988-12-27 | Vxr, Inc. | Simultaneous extraction of a ligand from a sample and capture by anti-ligands therefor in ligand/anti-ligand assays |
| AU6847890A (en) * | 1990-01-19 | 1991-07-25 | Promega Corporation | Immunospecific and bioluminescent assay of cellular atp |
| JP2856339B2 (ja) * | 1991-02-21 | 1999-02-10 | キッコーマン株式会社 | 酵素免疫測定法 |
| GB9301118D0 (en) * | 1993-01-21 | 1993-03-10 | Secr Defence | Enzyme linked assays |
| US5648232A (en) * | 1993-01-21 | 1997-07-15 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Microbiological best method and reagents |
-
1994
- 1994-07-13 GB GB9414096A patent/GB9414096D0/en active Pending
-
1995
- 1995-07-12 NZ NZ289464A patent/NZ289464A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 AT AT95925048T patent/ATE184054T1/de active
- 1995-07-12 GB GB9700603A patent/GB2304892B/en not_active Revoked
- 1995-07-12 ES ES95925048T patent/ES2136866T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-12 CN CN95194994A patent/CN1090677C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-12 JP JP50479696A patent/JP3589465B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-12 CA CA002194458A patent/CA2194458C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-12 HU HU9700090A patent/HU220800B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 US US08/765,063 patent/US5798214A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-12 BR BRPI9508392A patent/BRPI9508392B8/pt unknown
- 1995-07-12 DK DK95925048T patent/DK0774011T3/da active
- 1995-07-12 BR BR9508392A patent/BR9508392A/pt active IP Right Grant
- 1995-07-12 AU AU29319/95A patent/AU691940B2/en not_active Ceased
- 1995-07-12 DE DE69511876T patent/DE69511876T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-12 WO PCT/GB1995/001643 patent/WO1996002666A1/en not_active Ceased
- 1995-07-12 EP EP95925048A patent/EP0774011B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-13 ZA ZA955846A patent/ZA955846B/xx unknown
- 1995-07-13 IN IN1315DE1995 patent/IN188668B/en unknown
-
1997
- 1997-01-10 NO NO19970106A patent/NO316227B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-11-18 GR GR990402967T patent/GR3031877T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0774011T3 (da) | 2000-03-20 |
| DE69511876D1 (de) | 1999-10-07 |
| HUT76447A (en) | 1997-09-29 |
| WO1996002666A1 (en) | 1996-02-01 |
| GB9700603D0 (en) | 1997-03-05 |
| BR9508392A (pt) | 1998-05-26 |
| AU691940B2 (en) | 1998-05-28 |
| GR3031877T3 (en) | 2000-02-29 |
| CN1090677C (zh) | 2002-09-11 |
| CA2194458C (en) | 2007-09-11 |
| NO316227B1 (no) | 2003-12-29 |
| NZ289464A (en) | 1998-07-28 |
| AU2931995A (en) | 1996-02-16 |
| JP3589465B2 (ja) | 2004-11-17 |
| GB9414096D0 (en) | 1994-08-31 |
| US5798214A (en) | 1998-08-25 |
| CA2194458A1 (en) | 1996-02-01 |
| NO970106D0 (no) | 1997-01-10 |
| ES2136866T3 (es) | 1999-12-01 |
| ZA955846B (en) | 1996-02-19 |
| GB2304892A (en) | 1997-03-26 |
| BRPI9508392B8 (pt) | 2019-11-05 |
| EP0774011A1 (en) | 1997-05-21 |
| DE69511876T2 (de) | 2000-05-31 |
| EP0774011B1 (en) | 1999-09-01 |
| ATE184054T1 (de) | 1999-09-15 |
| CN1157638A (zh) | 1997-08-20 |
| NO970106L (no) | 1997-03-13 |
| JPH10502815A (ja) | 1998-03-17 |
| IN188668B (hu) | 2002-10-26 |
| GB2304892B (en) | 1998-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU220800B1 (hu) | Eljárás mikroorganizmusok vagy ezek intracelluláris anyagának kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására | |
| Lundin | Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites | |
| EP1049798B1 (en) | Antibiotic sensitivity testing | |
| WO1994017202A1 (en) | Microbiological test method and reagents | |
| EP0756637B1 (en) | Methods for calibrating chemical assays | |
| US20050112601A1 (en) | Methods for cellular or microorganism capture and quantification using bioluminescence regenerative cycle (BRC) assays | |
| EP1177315B1 (en) | Cell assay, method and reagents | |
| US5998128A (en) | Use of porphyrins in instrumental detection methods | |
| AU6508294A (en) | Detection of biological material | |
| NO318646B1 (no) | Fremgangsmate for a detektere og analysere mikroorganismer samt testkit og reagens derfor | |
| CA2460771A1 (en) | Method for determining the presence of bacteria resistant to cell lysing antibiotics | |
| EP0441469A1 (en) | Immunospecific and bioluminescent assay of cellular ATP | |
| CA2328684A1 (en) | Photon-triggered luminescent assay | |
| WO1999041408A1 (en) | Microbial assay | |
| Lau et al. | Controlled kinetics of non-enzymatic chemiluminescence reactions for simple imaging of DNA and protein | |
| GB2289334A (en) | Eneyme linked chemiluminescent assay utilising acridinium compounds or analogues thereof involving photon detection | |
| JP2837414B2 (ja) | 細胞内の物質測定方法 | |
| SU1290170A1 (ru) | Способ количественного определени микроорганизмов | |
| EP1071954A1 (en) | Comb-like solid phase for measuring analytes | |
| JPH03112496A (ja) | 物質の定量分析用標識剤 | |
| JPH09262095A (ja) | 微生物数の計測方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HC9A | Change of name, address |
Owner name: THE SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE IN HER BRIT, GB Free format text: FORMER OWNER(S): THE SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE, GB |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |