HU228382B1

HU228382B1 - Vaccine composition

Info

Publication number: HU228382B1
Application number: HU0302117A
Authority: HU
Inventors: Joerg Fritz; Frank Mattner; Wolfgang Zauner; Eszter Nagy; Michael Buschle
Original assignee: Intercell Ag
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2001-10-18
Publication date: 2013-03-28
Also published as: HK1055899A1; RU2007146372A; ES2263668T3; NO20031595D0; SK5752003A3; BRPI0114994B1; CA2426490C; CZ20031299A3; AU1232602A; DE60119145D1; CA2426490A1; KR20030043993A; BRPI0114994B8; JP4227407B2; JP2008222721A; CN1468109A; US8361476B2; WO2002032451A1; EP1326634B1; ATA17892000A

Description

ZGHÜLÖ VÁLTOZAT

Vakcina kompozíció találmány olyan vakcinákra vonatkozik, amely antigént és legalább egy immunstimuláló anyaA jelen legalább egy got tartalmas.

A. gazdaszervezet betolakodó patogénefcfeei szembeni védelme celluláris és humorális effaktorokat egyaránt magában, foglal, és a ne® adaptív (természetes;, valamint az adaptív (szerzett; immunitás összehangolt tevékenységéből ered. Az utóbbi, amelynek alapját receptorok által közvetített spe10 cifíkus ixtmunoiögiaí felismerés képezi, amely az immunrendszernek nemrég megszerzett sajátsága, és amely csak a gézi esésekben van jelen. Az előbbi., amely még a szerzett immunitás kifejlődése előtt kialakult, az egész szervezetet behálózó különböző sejtekből és molekulákból áll, azzal a feladattal, hogy a potenciális patogéneket kontroll alatt tartsa (Somán «. <2000), áanetti M, (1997)).

A B~ és T~Iimfooiták mediátorok a szerzett antigénspecifikus adaptív immunitáshoz, beleértve az immunológiai memória kifejlődését, amely egy sikeres vakcina létrehozá20' s-ának. fő célpontja (Schíjxrs V. (2000) ? . A.z antigén prezentáló (bemutató) sejtek (APC) nagyon, specializált sejtek, amelyek képesek az antigéneket processzálni, és ezek processzált fragmenseit a sejt felületre kijuttatni más molekulákkal együtt, amelyek a límfociták aktiválásáért szüksé25 gesek. Ez azt jelenti, hogy az APC-k nagyon fontosak a specifikus immunreakciók elindításához, A T~limfoc.ita aktiválásának fő APC-jei a dendrites sejtek (DC), a makrofágok és a B~sejtek, míg a B—sejtek fő APC-jei a foilikuláris dendrites sejtek. Általában a DC-k a leghatékonyabb APC-k az immunválaszok kiváltásának szempontjából, amelyek stimulálják a nyugvó naiv és a memória B- és T-Iimfocitákat.

Az APC-k természetes feladata a periférián (pl. DC-k •b vagy Langerhans-sejt-ek esetén) az antigének befogása és processzálása,· ami által aktiválódnak, és elkezdenek liafoodta ko·—s timuiáló molekulákat -expresszálni, a limfoid szervek felé migrální, cltokineket szekretáini és antigéné5 két bemutatni a límfocíták különböző populációinak, így antigén-specifikus immunválaszokat megindítani. A limfocikákát nem csak aktiváljak, hanem bizonyos körülmények között a T-sejteket toleránssá teszik as antigénekre (Sanchereau .1. (19SS)).

Az antigének T-límfociták által történő felismerését a hisztokompatibliitási komplex (MHC} korlátozza. Egy adott T~limfoc.ita csak akkor fog felismerni egy antigént, ha a peptíd egy bizonyos MHC molekulához van kötve. Általában a T-limfocíták csak a saját MHC molekuláik jelenlétében stílé muláiódnak, és as antigéneket úgy ismeri fel, mint a saját MHC molekuláihoz kötött peptideket. Az MHC-koriátozás meghatározza a T-limfocita spécifitást a felismert antigén szempontjából és azt az MHC molekulát tekintve, amely az antigén peptid-fragmensét megköti,

Az intraceiluiáris és extraceliuláris antigének meglehetősen különböző kihívást jelentenek az immunrendszer számára mind a. felismerés, mind a megfelelő válasz szempontjából, Az antigének T-sejteknek történő bemutatását két különböző molekulacsoport közvetíti: az MHC 1. (MHC-I) és az

MHC 11, csoport (MHC-II}., amelyek különböző antigén processzáló útvonalakat hasznosítanak. A két fő antigén processzáló útvonal között egy lényeges különbség van, ami az evolúcióval alakult ki. Az intraceiluiáris antigénekből származó peptidek az MH.C-I molekulák által a CDSe T-sej30 teknek prezentálódnak, amelyek gyakorlatilag az összes sejten expresszálódnak, míg az extraceliuláris antigénekbe· 1 származó peptidek az MHC-II. molekulák által a. Cu4i T-sejteknek prezentálódnak [Monaco J. (1392); Harding C.

♦ φφ φφφ

ΦΚΦΦ φφφ

XX Φ

Í1S95)]. Azonban vannak bizonyos kivételek e kettősség alól. Számos tanulmányban bemutatták, hogy a bekebelezett részecskékből vagy oldható proteinekből származó peptidek az MHC---1 molekulákon prezentálődnak makrofágokban, valamint dendrites sejtekben (Harding C. (1996) ; Brossért £'. {1997)1. Ezért a periférián elhelyezkedő APC~k, mint pl. a dendrites sejtek, amelyek nagy hatásúak abból a szempontból, hogy az extracellnláris antigéneket befogják, proceszszólják és az MHC-I molekulákon a T-lőmfocitáknak bemutat10 ják, érdekesek célpontok, hogy antigénekkel extraceiiuiáris impulzust adjunk nekik in vitro és in vivő.

Az APC-k fontos és egyedülálló szerepe, amely magában foglalja a különböző típusú leukoci iákra. kifejtett stimuláló hatásukat, rávilágít központi helyzetükre, amennyiben

IS sikeres vakcinák kifejlesztésének megfelelő stratégiában célpontnak tekinthetők. Elizáiét Heg ennek egyik módja, hogy a természetes feladatukat, az antigének felvételét, fokozzuk és stimuláljuk. Ha egyszer az APC-k a megfelelő antigéntől, amely ellen a vakcina irányul, impulzust kapnak, el '20 kell kezdeniük a felvett antigének processzálását, ezáltal aktiválódnak, limfocita ko~stimuláló molekulákat expreszszálnak, timföld szervekhez migrálnak, citokíneket szekretálnak és antigéneket prezentálnak a limíociták különböző populációinak, ezáltal elindítják ez immunválaszt,

Az aktíváit T-sejtek általában számos effektor eltekint szekretáinak, erősen szabályozott módon, ilyenek például az interleukin 2 (iL-2j, IL-4, IL--S, IL-10 és a γ-interferoniΤΕΝ-γΐ . A specifikus antigénekre (pl. tumor antigénekre, általában vakcinában beadott antigénekre) adott cítotoxikus T-limfocita válasz funkcionális detektálása általában ELlSpot vizsgalati módszerrel (enzim-kapcsőit immunospot assayj követhető, azaz olyan technikával, amely a citokin termelést az egyedi sejtek szintjén anali φφφ «»«

Λ φ *ΑΦ **φ » φ < X ♦ X Φ* ΦΦ* zálja. A jelen találmányban a sejtes immunitást elősegítő citokin I'NF-y^ra irányuló EtlSpot assay-t alkalmazzuk sikeres peptíd-specifíkus T-sejt. aktivácid követésére.

Korábban már kimutatták, hogy a políkationok hatéko5 nyan elősegítik a MHC-I molekulák által kapcsolt peptídek tumor sejtekbe történő felvételét, amely egy pepiid vagy protein segítségével impulzust adó folyamatot? amelyet „TEAESlcadíng-nak neveztek el (Buschle M. (1997)). Ezenkívül kimutattuk, hogy a poiikationok képesek a peptídeket vagy proteineket antigén prezentáló sejtekbe „TRAdSioadölni in vivő és ín vítro (Snschle M. (1998)). Ezen túlmenően, egér modellekben polí-L-arginin vagy poii-L-lízin és egy megfelelő pepti.d elegyének vakcinaként történő ko~ injektálása megvédi az állatokat a tumor növekedésétől (Schmidt kt> (1997)).. Ez a kémiailag meghatározott vakcina nagy számú antígén/peptid-specifikus T-sejtet képes indukálni. Kimutatták, hogy ez legalább részben a peptídek APC-be történő fokozott felvételének tulajdonítható, amelyet pciikatíon médiái (Buschle M. (1999)), ami arra utal, hogy az AEC-k in vivő antigénekkel pui.zálva képes a beadott antigénnel szemben T-sejt által közvetített immunitást kiváltani .

Az adaptív immunitással szemben, amelyet nagy specificitásű, de viszonylagosan lassú válasz jellemez, a. veleszü25 letett immunitás alapját olyan eífektor mechanizmusok képezik, amelyeket a gazdaszervezethez képest a mikrobáéiis komponensek szerkezetében lévő különbségek indítanak be. Ezek a mechanizmusok olyan viszonylag gyors kezdeti választ képesek kiváltani, amely főként a károsító tényezők semle30 geszté séhez vezet. A kisebb fertőzésekkel (phyia) szemben, a veleszületett immunitás reakciója az egyetlen védekezési stratégia, és megmaradt a gerincesekben a gazdaszervezet első vonalbeli védelmeként az adaptív immunrendszer mohiéi-

záiódása előtt.

A magasabb rendű gerincesekben a veleszületett immun!-- tás effektor sejtjei a neutrofilek, iaa.kro.fágok és természetes ölősejtek és valószínűleg a dendrites sejtek Is (Mlzukawa N. (1993) ) , míg ezen az útvonalon a huraor-áiis komponens a komplement kaszkádrendszer és különböző kötőfehérjék (B'osian H. (2000))-.

A veleszületett immunitás gyors és hatékony komponensét a sokfajta, általában, kb. 12 és kb. löO aminosavmaradék hosszúságú mikrohaölő psptld. termelése képezi. Több száz különböző mikrobáéilenes pepiidet Izoláltak különféle szervezetekből, így a szivacsoktól, rovaroktól kezdődően az állatokig és emberig, ami rámutat ezen molekulák széleskörű elterjedtségére. Mikrobáéilenes peptideket baktériumok is termeinek antagonista anyagokként a versengő szervezetekkel szemben.

Az EP 0 905 141 Al közzétételi iratban egy vírusellenes hatású limulus anti-LPS faktor (LALF) peptid fragmensét ismertetik, őz a LA1F peptid specifikusan, nem segíti elő az immunválaszt, de a mononukleáris sejtek nem. specifikus védelmét fokozza, és profilaktikus úton is alkalmazható, vagy pedig a peptid egy sebbe helyileg beadható, hogy stimulál j a és fokozza a seb hegesedését és gyógyulását,

A mikrobserienes péptidek fő forrása a iégutakban, gasztrolntesztinális és húgy- és ivarszervi traktusban elhelyezkedő neotrofil- és hámsejtek granulumai. Általában a mikroba invázióknak leginkább kitett anatómiai területeken találhatók meg, belső testnedvekbe szekretálődnak vagy fagoclták citoplazmatiküs granulumaiban tárolódnak (Ganz (1997); Ganz ?. (1998); Ganz Ti (1999) ; Somán H. (2000);

Gudmundsson GH, (1999)).

A közelmúltban kimutatták (A 1416/2000 ausztriai szabadalmi bejelentés), hogy a természetesen előforduló catheJf ♦ ♦ ♦** » »44-« * « *♦4-4 ·** »9 »x* icidinből származó mikrobáéilenes peptidek vagy .ezek származékai immunválasz stimuláló hatással rendelkeznek., és ezért nagy hatékonyságú adj·.·vánsok,

A jelen találmány célja, hogy olyan adjuvánst/hordozö 5 pepiidet bocsásson rendelkezésre, amely képes egy specifikus együtt-adagolt antigénre adott immunválaszt jelentősen fokozni/ és ezért nagy hatékonyságú adjuvánsként hat.

A találmány ezen célja olyan vakcinával érhető el, amely legalább egy antigént és egy Rí~XZX2mXZX-R₂ szekvenoi10 át tartalmazó pepiidet tartalmaz., ahol

- N jelentése egészszám, értéke 3~7, előnyösen. 5;

- X jelentése egy pozitív töltésű természetes és/vagy nemtermészet es amino s avmar adék;

- Z jelentése egy aminosavma.r adék a következők közül; L, 15 V, 1, F és/vagy W; és

- Rx és R_;: jelentése egymástól függetlenül ~B, -NK_?,

-CÖCHs, -CöH képletö csoport, legfeljebb 20 aminosavmaradékot tartalmazó peptid vagy reaktív pepiiá-csoport vagy peptid-kapcsolö pepiiddel vagy peptid nélkül; X~R₂ jelentése lehet továbbá a C-termináiis amínosavmaradék amidja, észtere vagy tioésztere.

A természetesen előforduló mikrobaellexies peptidek mellett, szintetikus mikrobaellenes peptideket is előállítottak és vizsgáltak. A KLKLLLLLKLK-NHz képletö szintetikus mikrobáéi lenes peptid jelentős kemoterápiás hatást mutatott a Staphylococcuff aareus-szaí fertőzött egérben; míg a humán neutrofílek aktiválódtak, és peroxid aniont (O₂j termeltek a sejtfelszíni calretlculinon keresztül. A K és L pontos számát és pozícióját kritikusnak találták a szintetikus peptid mikrobáéi lenes aktivitásának szempontjából (Nafcajims Y. (1997); Cho J-H. (1999)).

A jelen találmány kidolgozása során meglepően úgy találtuk, hogy a találmány szerinti, R’.-X2XZ^XZX-R_2: szekvenoi* «

át tartalmazó peptidek, ahol a képletben

- H jelentése 3 és 7 közötti egészszám, előnyösen 5;

- X jelentése egy pozitív töltésű természetes és/vagy nemt érmé s zetes ami no savmaradék;

- Z jelentése egy amixrosavmaradék a következők közül: L,

V, I, F és/vagy W; és

- .Rí és te jelentése egymástól függetlenül -H, -NBA -COOH;, -CGK képlete. csoport, legfeljebb 20 aminosavmaradékot fca.rtalMa.z6· peptid vagy egy reaktív peptidlö csoport vagy egy peptid-kapesoló pepiiddel vagy peptid nélkül; X-R;· jelentése lehet a C-terminélis aminosavmaradék amidja, észtere vagy tioésztere, (az alábbiakban, mint ,A peptid· antigenikns peptideket vagy proteineket az APC-kbe sokkal hatékonyabban TRANFioad15 ólnak, mint az ismert adjuvánsok, beleértve a természetesen előforduló mikrobaelieses peptideket is. Továbbá erős immunválasz-stimuláiö hatással rendelkeznek, és ezért nagy haté kon ys ágű adj u vánso k.

A C-terminális előnyösen nem módosított (COOH vagy

COC), mivel ez a forma még jobb, mint a peptid amidéit formái a.

A jelen találmány szerinti szekvencia karboxíi~ vége amidéit lehet, vagy pedig egy további aminosav szekvenciát hordozhat, azonban a karboxil-vég előnyösen szabad.

Továbbá a jelen találmány szerinti aifa-peptiöskhen jelenlévő összes X azonos amínosavmaradékot jelenthet, Előnyösen azonban az egyik alfa-peptidben. az X jelentése csak egy bizonyos aminosavmaradék, pl, vagy K, vagy r stb. Ugyanez vonatkozik a 2-re is: az aifa-peptidekben az összes

Z egyetlen aminosav vagy különböző aminosavak, pl. vagy L, vagy V stb. Különösen igaz ez a képlet közepén elhelyezkedő A csoport esetében, amely pl. L_s vagy Ls, valamint LVIFU, LXL-FLLIW, WIF, és ezen motívum összes többi kombináeit V * **% rt ója lehet, amely 3-7 aminosavmaradók hosszúságú, előnyösen 4-8 amínosavmaradék, meg előnyösebben S aminosavxnaradék hosszúságú, Ezek a maradékok az Rí és R₂. részek esetében is előnyösek {pl. az R< és/vagy R₂ több, mint 50%~a, előnyösen több, mint 80%-a, még előnyösebben több, mint '90%-a L, I, F, V és/vagy W, ha Rj. és/vagy R₂ peptidet képviselő . Előnyösen Rí és R;· azoxxos, még előnyösebben mindkettő jelentése H (azaz szabad ami no- vagy karboxi ,1.-végek) .

A jelen találmány értelmében a „nem-természetes kitelő jezés bármely olyan aminosavmaradékra utal, amely nem fordul elő természetesen, illetve természetes proteinekben nem fordul, elő.

A Rr-KLKLsKLK-Rí képletű pepiid különösen előnyös, azonban Ri-KIKLjKlK-Rí, R, -KVKL₅KVK~R₂, E, ~KFKL₅KVK-R₂,

R:~KlKL_sKLK~?b, R_;-XhK/hKLK-Ib, R: -KWKWL₃WKWK-R₂, R·.-RLFLaKLKRí képletű peptlelek vagy a I, F, V, W és L csoportra vonatkozó sorrendváltoztatással kialakuló pcptídek szintén előnyösek.

Természetesen a vakcina a kívánt immunválasztól függőül) en két vagy több antigént tartalmazhat. Az antigén lek) módosíthatok is úgy, hogy tovább fokozzák az immunválaszt.

Előnyösen virális vagy bakteriális kórokozóból, gombákból vagy parazitákból származó proteineket vagy pepfcideket, valamint tumor antigéneket (rák vakcinák) vagy az autoimmun betegségekben feltételezett szereppel rendelkező antigéneket alkalmazunk antigénként {beleértve a származtatott antigéneket, mint pl. glikozílált, iipldált, glikoiípidált vagy hidroxi!ált antigéneket}. Továbbá antigénként szénhidrátokat, iípideket vagy giikolipideket alkalmazta30 tünk önmagukban. A módosító eljárás magában foglalhatja egy specifikus protein vagy peptíd kórokozóból történő tisztítását, a korokozó inaktiválását, valamint egy ilyen protein vagy peptíd proteolltikus vagy kémiai átalakítását vagy * * < - * V $ χ * Κ *ν·« * * Λ * * ν stabilizálását. Eljárhatunk úgy is, hogy a ko-rokozót önmagában alkalmazzuk antigénként. Az antigének előnyösen peptidek vagy proteinek, szénhidrátok, lípidek, glikoiipidek vagy esek keverékei.

Egy előnyös kiviteli módban T-sejt epitőpokat alkalmazunk antigénekként, azonban a T-sejt epitcpok és B-sejt epitopok kombinációja is előnyös lehet.

A jelen kompozícióban alkalmazható antigének nem kritikusak. A jelen találmány érteimében különböző antigének keverékei is alkalmazhatók. Előnyösen vírusosból, baktériumokból, gombákból vagy parazitákból származó proteineket vagy péptidekét alkalmazhatunk ilyen antigénekként (beleértve az átalakított antigéneket vagy glikozilált vagy iípidált antigéneket vagy poliszacharinokat vagy iipideket

IS is) . További előnyös antigénforrások a tumor antigének. Előnyösen a következő kórokozókból származó antigéneket alkalmazunk; humán ímmunodefíciens vírus (HÍV), hepatitis-A vírus és hepatitis-B vírus, hepatífis-C vírus ÍHCV), Rous sarcoma vírus (RSV), Epsfein-Barr vírus (SBV) , influenza vírus, Rotavirus, Staphylococcus aureus, Chiamydía pneumoni-as, Chlamydia trachomatis, Mycobacteríum tuberculosis, Streptococcus pneumonías, Bacíllus anthracis, Vitrin cholerae, Plasmodium sp. (Pl. falciparum, Pl. vívax stb,}, Aspergillus sp. vagy Candida albicans. Antigének lehetnek a rák sejtek által expresszált molekulák is (tumor antigének} . Módosító eljárás lehet, például a kórokozóból/ráksejtökből származó specifikus protein tisztítása, a kórokozó inaktiválása, valamint egy ilyen protein proteoiitíkas vagy kémiai átalakítása vagy stabilizálása. Hasonló módon a találmány szerinti gyógyszer kompozíciókban tumor antigének (rák vakcinák) vagy autoimmun, antigének alkalmazhatók. Egy ilyen kompozícióval tumor vakoinálás vagy autoimmun betegségek kezelése kivitelezhető.

*·*$*

¢. fc ·**

A peptid antigének esetében a jelen találmány értelmében peptid mimotőpoka t/agonistákat/ szuperagonist ákat /anta ~ gonistákat vagy az immunológiai tulajdonságokat na befolyásold foísouyos csoportokban változtatott peptideket vagy nem-pep t i d mimo t opo ka t/a goxx i s t á k a t / s z up e r a gon istákat/antagonistákat is alkalmazhatunk. A peptid antigének tartalmazhatnak meghosszabbításokat a. peptid antigén, karboxi.l- vagy aaxino-terxsinálísán, ami megkönnyíti a kölcsönhatást a polikationos vegyületekkei vagy az imraunstímulálő vegyületek10 kel. Az autoimmun betegségek kezelésére peptid antagoniskákát alkalmazhatunk.

Az antigének oly xuődon is átalakíthatok, hogy antigén bemutatást fokozó molekulákat tartalmazzanak. és az antigéneket az antigén prezentáló- sejtek felé irányítsák.

A találmány egyik kiviteli módjában a gyógyszer kompozíció arra szolgál, hogy az autoimmun betegségben résztvevő proteinekkel vagy protein-fragmensekkel és peptidekkel szemben toleranciát biztosítson. Ebben a kiviteli módban alkalmazott antigének, arra szolgáinak, hogy az autoimmun folyamatokban résztvevő epitopokkal, .szemben as imm.unr-e.rsd™ szert toleránssá tegyék vagy az immunválaszt alulszabályozzák (down-regulácíó).

Előnyösen az antigén egy 5-60, még előnyösebben 6-30, különösen előnyösen 8-11 .aminosavmaradékot tartalmazó peptid. Az ilyen hosszúságú antigénekről bebizonyították, hogy különösen alkalmasak a T-sejtek aktiválására. Az antigénekhez továbbá egy farokrész kapcsolható, pl. amint az A. 657/2080,· US 5726232 vagy a WO 98/O155B számú iratokban ismertették .

Az antigén a jelen találmány szerinti peptidekkel elegyíthető, vagy pedig specifikusan formulaiható, pl.

.liposzó-ma vagy retard készítmény stb. formájában. Az antigén továbbá kovalensen vagy nem kovalensen köthető a jelen χ

# * φ ♦ ♦ χ ♦ φ * « « XX ♦ X * »*’» ·· <· »« V..

találmány szerinti pepiidhez. Az antigéneket előnyösen R_;vagy maradékként kovalensen a pepiidhez vagy a pepiid aRti.nosaxmiaradékainak oldaliáncalhoz, különösen a K és R oldali án.choz kötjük.

A. jelen kompozíció összetevőinek relatív mennyisége nagy mértékben az egyes kompozíciók szükségleteitől függ. Előnyösen 10 ng és 1 g közötti antigén és alfa-pepiid menynyíségei alkalmazunk. Az an.tigén/alfa-peptid előnyös menynyisége Q, 1-1000 pg antigén és 0,1-1000 pg pepiid vakcinániö ként, A jelen találmány szerinti kompozíció továbbá segédanyagokat, mint pl. puffereket, sókat, stabilizáló szereket, immunstimu ián sokat, antloxidánsokat stb. vagy más hatékony anyagokat, mint pl. gynil.adásgátló vagy fájdalomcsillapító hatóanyagokat tartalmazhat.

A jelen kompozíciókat egy betegnek, pl. egy védőoltást kapó jelöltnek hatékony mennyiségekben adagolhatjuk hetes, kéthetes vagy hónapos időszakokban. A jelen kompozícióval kezeit betegek vakcináihatók ismételten vagy csak egyszer. A jelen találmány előnyős alkalmazása az aktív immunizálás., különösen az adott antigénnel szemben védelemmel nem rendelkező emberek vagy állatok esetében.

A jelen kompozíció szubkután, intraxauszkulárisan, rektáiísan,, intravénásán, íntradermáiisa, intraspináíisan, transzdemálisan, valamint orális adagolással, alkalmazható.

Természetesen a jelen találmány szerinti vakcina bármilyen további anyagot tartalmazhat, mint például bármely gyógyszerészetileg elfogadható hordozó-anyagot stb. A találmány szerinti vakcina ismert eljárások szerint formuláiható, pl. mint i.v. vakcinák, DdS vakcinák, transzdermáiis vakcinák, helyi vakolnék, intranazális vakcinák és kombinációs vakcinák formájában. A dózisokat a vakcináknál alkalmazott standard eljárásokkal választhatjuk ki, amelyet az Ismert vakcináknál igazoltak, azonban alacsonyabb dózis is

X * ♦ lehetséges, mint az issiert vakcinák esetében azonos védelem eléréséhez és ezért előnyös.

Előnyösen a vakcinát tároiásbiztcs formában bocsátjuk rendelkezésre, pl. liofilízált formában, adott esetben egy alkalmas helyreállító írekonstitúeiős} oldattal kombinálva.

A jelen találmány szerinti amínosavmaradékok D~ vagy

L-aminosavak lehetnek. Előnyösen az összes vagy a maradékok több, mint 30%-a az egyik fajtához (D vagy L) tartozik. Legelőnyösebben a jelen találmány szerinti pepiidben az összes aminosav azonos fajtához tartozik (D vagy ti . Néhány formában a jelen találmány szerinti peptid további aminosavmaradótokat tartalmazhat, amelyek az alfa-peptid szekvenciájába vannak beillesztve, azonban a peptid hidroföb része C Z, In) A, G és T maradékokat nem tartalmazhat.

Előnyösen a peptid szekvenciában X az alábbiak közül, kerül kiválasztásra: K, R, orn.it in és/vagy homo ar gi ni n. Sgy alfa-peptidben X jelentése különböző aminosavmaradék lehet a fent megadottak közül, azonban előnyös, ha egy alfa-pepiidben X jelentése X vagy R vagy ornitin vagy homoargínin.

A taiáimány egyik előnyös kiviteli módjában a peptid szekvenciában X jelentése K. X-ként ezt az aminosavat tartalmazó alfa-pepiidről kimutattuk, hogy különösen erős immunválaszt vált ki.

Előnyösen a peptid szekvenciában X az alábbiak közül kerül kiválasztásra: L, V I, F és/vagy W. Amint X esetében ismertettük, egy alfa-pepiidben 2 különböző aminosavmaradékokat jelenthet. Azonban előnyös, ha egy alfa-peptidben 2. jelentése egy fajta aminosavmaradék, pl. f vagy V vagy 1 vagy F vagy W, ahol a legelőnyösebb L és I, ezt követi F, ezt követi V és ezt követi. W ÍL>1>F>V>W) ,

Az is előnyös, ha az alfa-peptid szekvenciában X jelentése L (vagy 1, különösen. L? . így az a.l.fa-peptíd egy különösen erős Immunválaszt kiváltására képes, « * *

9»*

A legelőnyösebb alfa-peptid szekvenciája;

H-KLELLLLiALK-H, Természetesen ennek a pepiidnek a fiziológiás formája is (pl. egy protonéit N-terminálissal és egy deprotonált C~terminállssai (COO)] bele tartozik ebbe a formába (mint a jelen találmány szerinti összes pepiid esetében),

Egy további előnyös kiviteli módban a peptid szekvenciában R? és/vagy R₂ jelentése 10-20 aminosavmaradék, így egy olyan alfa—pepiidet kapunk, amely hosszúsága révén kü10 lenesen erős immunválaszt vált ki vagy fejleszt.

A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában az R;. és/vagy R< aminosavmaradékai nem negatívan töltött aminosavmaradékok.

Az aminosavmaradékok természetes és/vagy nem-terme15 szetes aminosavmaradékok lehetnek. Az alfa-peptid egyik vagy mindkét végéhez egy nem-negativ töltésű amin.os.axmaradákot csatolva ez a peptid erős immunválasz fejlesztésére vagy kiváltására való képességet mutat..

Előnyösen R_x és/vagy R_:í az A-peptid hidrofob farkát 20 alkotja. Ezért az Rj és/vagy R₂ axainosavmaradékok előnyösen az alábbiak közöl kerülnek kiválasztásra: L, V, Tj F és/vagy ál Szintén előnyös, ha az Ρο és/vagy R_:: ami nos a vmaradékal az alábbiak közöl kerülnek kiválasztásra: L, I, és/vagy F, Legelőnyösebben a további aminosavmaradékok je~ ientése L. Ezek az ai fa-pepii.dek különösen nagy képességgel rendelkeznek erősebb immunválasz kiváltására.

A jelen találmány egyik kiviteli módjában az R_rés/vagy r₂ aminosavmaradékai pozitív töltésű természetes és/vagy nem-természetes aminosavmaradékok. Előnyösen a to— vábbi aminosavmaradékok az alábbiak közül kerülnek kiválasztásra: K, E, ornitín és/vagy homoarginín. Még előnyösebben az Ft és/vagy r₂ aminosavmaradéka K. Ezek az aifapeptidek is különösen jő képességgel rendelkeznek az immun.14 * ««φφ φ* ♦>** * φφφ» * «φφ «φ*

Φ * « * válasz fejlesztésére.

Előnyös_s ha az P.₃. és/vagy R₂ aminosavmaradékai az első csoportból (L, V, 1,· F és/vagy Ws vagy a második csoportból (amely pozitív töltésű aminosavmaradékokat tartalmas} ke§ tűinek kiválasztásra. Azonban az is lehetséges, hogy egyetlen al..fa-pept.idhe.z az P,₃. és/vagy R₂ aminosavmaradékaí mindkét csoportból kerülnek kiválasztásra.

A peptid a jelen találmány szerinti alfa-peptid magjához normál peptid kötésekkel vagy reaktív peptid csoporton vagy peptid kapcsolókon keresztül csatolható. A reaktív peptid csoportok peptidek vagy proteinek kötésére alkalmas kémiai, csoportok. Ezért a jelen alfa-peptid íl- vagy C-terminálísa kémiailag módosítható úgy, hogy olyan, kémiai módosítást (pl. imínotioan, 3-merkat.o-propionil-csoportot s'tb.) tartalmazzon, ami lehetővé teszi egy peptid, valamint egy antigén kovalens összekapcsolódását. Vagylagosan az alfapeptid egy alkalmas peptid kapcsolót tartalmazhat, azaz egy kapcsoló molekulát, amely képes kapcsolatot létesíteni az alfa-peptid mag (pl. Rj. és/vagy nélküli peptid) és pl.

egy hozzákapcsolt vagy kapcsolható antigén között. A találmány szerinti peptid előfordulhat a peptid reaktív csoporthoz és/vagy a peptid kapcsolóhoz kötődő peptid/antigénnel együtt vagy nélküle. Ilyen kémiai módosítások és alkalmas peptid kapcsolok a területen jártas szakember számára hoz25 záférnetök.

Előnyösen a vakcina legalább egy további, immunválaszt stimuláló anyagot tartalmaz. Immunválaszt stimuláló anyagként bármely anyag vagy molekula alkalmazható, amelyről ismert, hogy adjuvánsként WO 93/19763 számú irat.

hatásos, ilyen anyagokat ismertet a További anyagok lehetnek például a polikationok, mint pl. poiillzin vagy poliarginin, Más adjuváns összetevők lehetnek részecskék formájában, pl. szilikagél vagy dextrán gyöngyök, amelyek megfelelően ki30 *** * csínyek ahhoz, hogy a sejtekbe behatoljanak. Ilyen további immunválaszt stimalálő anyagoknak a hozzáadása a vakcinát még hatékonyabbá teszi.

Előnyösen a jelen találmány szerinti gyógyszer kompo5 zíció, különösen egy vakcina formájában, további polikationos polimereket, előnyösen egy polikationos pepiidet, még előnyösebben poiiarginint, polil.iz.int vagy egy mikrobáéi lenes pepiidet tartalmaz.

A jelen találmányban alkalmazott polikationos vegyüle10 tek bármely polikationos vegyület lehetnek, amelyek a WO 97/30721 számú iratban ismertetett jellemző hatást mutatják. Előnyös polikationos vegyüietek a bázikus polipeptidek, szerves poiikatienok, bázikus poliam.inosa.vak vagy ezek keverékei közül kerülnek kiválasztásra. Ezek a poli15 amínosavak legalább 4 aaíaosawaradék lánchosszúsággal rendelkezhetnek. Különösen előnyösek azon anyagok, amelyek peptidkötéseket tartalmaznak, mint a polilízin, poliarginin, valamint az olyan polipeptidek, amelyek több mint 20%, előnyösen több mint 50% bázikus amínosavat tartalmaznak, a több mint 8, előnyösen több mint 20 aminosavmaradékból. További előnyös poiikationokat és ezek gyógyszer kompozícióit ismerteti a W0 98/30721 (pl. poli éti lén-Imin}' és WO 09/38528 számú irat. Előnyösen ezek a polipeptidek 20-500 aminosavmaradékot, különösen 30-200 maradékot tar25 taimaznak.

Ezek a polikationos vegyüietek kémiai vagy rekömbináns: úton állíthatók elő, vagy pedig természetes forrásokból nyerhetők.

A kationos (poli(peptidek polikationos antibakteriális 30 mikrobiálls peptidek is lehetnek. Ezek a (poli?peptídek prokaríóta vagy eükariőta eredetűek lehetnek, vagy pedig kémiai vagy rekömbináns: ütőn állíthatok elő. A peptidek a természetesen előforduló mikrobáéilenes peptidek osztályába is tartozhatnak. A-z ilyen gazdaszervezetet védd peptidek vagy védőanyagok is előnyös formái a találmány szerinti po.l.ikat.ionos polimernek. Általában poiikationos polimerként olyan vegyületet alkalmazunk, amely az adaptív immunrend~ .5 szer végtermék-aktivációsát (vagy down-reguláciőgát) lehetővé teszi, előnyösen AFC-k által közvetítve (beleértve a dendrites sejteket},

A jeleli találmányban különösen előnyös po Ilkát ionos anyagok a catheiíciáinből kinyert mikrobaellenes peptidek vagy ezek származékéi (lásd: A 1416/2000), különösen emlős, előnyösen hurrán, szarvasmarha vagy egér c a th el lei dinből nyert mikrobáéilenes peptidek.

Még továbbá neuroakfciv vegyűietek, mint pl. (humán) növekedési hormon (lásd: WO 01/24322) alkalmazható immun15 s t i mu 1 á n s k. é n t..

A természetes forrásokból kinyert polikátionos vegyületekre példaként szolgál a üIV-REV vagy HIV-ϊΑϊ (származtatott kationos peptidek, antennapedia peptidek, chitosan vagy a chítin más származékai) vagy ezekből a peptídekhői.

vagy proteinekből biokémiai vagy rekombináns termeléssel nyert más peptidek. További előnyös poli.kationos vegyűietek a oathelin vagy oathelicidinnei, különösen egér, szarvasmarha vagy előnyösen humán oathelicidinnei rokon vagy abból származtatott anyagok. A rokon vagy származék oathelicidin anyagok a legalább 15-20 aminosavra rádékből álló cathelíoidin szekvenciát egészben vagy részben tartalmazzák. A származékok olyan .aminosavakkal szubsztituáít vagy módosított természetes aminosavakat tartalmazhatnak, .amelyek nem tartoznak a 20 standard aminosav közé. Ezen túlmenően to30 vábbí kationos maradékok vonhatók be ezekbe a oathelicidin molekulákba. Ezek a oathelicidin molekulák előnyösen a jelen találmány szerinti antigén/vakcina kompozícióval kombinálhatok. Azonban ezekről a oathelicidin molekulákról meg*«## «*♦

1?

lépőén kiderült, hogy adjuvánsként is hatékonyak egy antigén mellett további adjavánsok hozzáadása nélkül, Ezért ezeket a cathelicidin molekulákat lehetséges hatékony adjuvánsként alkalmazni vakcina készítményekben, további immunaktiv anyagokkal vagy azok nélkül.

Előnyösen az immunválasz stimuláló anyag egy citokin,

A citokinek fontos szerepet játszanak a B~sejtek, T-sejtek és NK-sejtek, raakrofágok, dendrites sejtek és az immunválasz kiváltásában résztvevő más sejtek aktiválásában. BárW mely citokin alkalmazható, amely tovább fokozza az antigén (ek)re adott immunválaszt.

Előnyösen a jelen találmány szerinti vakcina továbbá tartalmaz egy immunstímuláiő/immnnogén nukleinsavat, előnyösen egy oligodezoxlnnkleotid. tartalmú dezoxiinozint, egy oligodezoxinukleotid tartalmú dezoxiurídint, egy oiigodezoxínukieotíd tartalmú metiiált vagy nem-metilélt CG motívumot vagy egy inozín és citidín tartalmú nukleinsav molekulát ,

A jelen találmányban alkalmazott immunogén nukleárisa20 vak szintetikus, prokariőta és eukáríóta eredetűek lehetnek. Az eukarióta-eredet esetében a DN'S-fc a törzsfejlődési fa alapján kevésbé fejlett fajokból kellene kinyerni (pl, rovarok, de más fajok is), A találmány egyik előnyös kiviteli módjában az ímmnnogén oíigodezoxínukleotid ÍOQN) egy szintetikusan előállított DNS molekula vagy ilyen molekulák keveréke, A találmány körébe tartoznak az ODU-ek származékai vagy módosításai is, mint pl., a tiofoszfát~szubs2ti~ tuált analógok ta foszfátot helyettesítő tiofosz.fát maradékok) , amit például az US 5723335 és US 5563153 számú íratok ismertetnek, valamint más származékok és módosítások is, amelyek előnyösen stabilizáljak az ímmunstemuláló kompozíciót, de az immunológiai tulajdonságait nem változtatják meg. Egy előnyös szekvencia motívum a két 5 purinnal és

két 3' pirímidínne! szegélyezett (metí hálátlan) CpG dinukleotidot (5* -P'n~P’u.r~'C~G-'Pyr-Pyr~3'^,r) tartalmazó hat bázisos DRS motívum. A jelen, találmány szerinti ODN-ekben. jelenlévő CpG motívumok sokkal gyakoribbak a míkrobiális DWS~ben, mint a magasabb rendű gerincesek DNS~ében, és a metíiáeíó mintázatában különbségeket mutatnak. Meglepően az egér ARCkét stimuláló szekvenciák nem nagyon hatékonyak a humán sejtekben. A jelen találmányban alkalmazott előnyös visszatérő és nem-visszatérő OPN-eket pl. a A 1373/2000, A lö 805/200.1 számú ausztriai szabadalmi bejelentés, az

EP-0468520-A2, WO 96/02553, WO 98/16247, WO 98/18810,

WO 90/37919, WO 93/40100, WO .98/52581, WO 93/52962,

WO 99/51259 és WO 99/50755 számú iratok ismertetik. Az im~ nmnrendszer stimuláiásán kívül bizonyos ODN-ek. néhány Írnia munválaszfc semlegesítenek. Ezek a szekvenciák is beletartoznak a jelen találmány körébe, például az autoimmun betegségek kezelésében alkalmazva. Az ODN/DNS-ek kémiai vagy rekomhináns úton állíthatók elő vagy természetes forrásokból nyerhetők. Előnyös természetes források a rovarok.

Eljárhatunk úgy is, hogy inozin és citidin alapú nuk~ leinsavakat (amint pl. a RCT/ERÖ1/06437 számú iratban ismertetik; vagy dezoxiinozín és/vagy dezoxiuridin maradékokat tartalmazó dezoxinukieínsavakst (az A 1973/2000 és A 805/2001 számú ausztriai szabadalmi bejelentésben ismerte25 tett? alkalmazunk immunétimuláiö nukleínsavakként a jelen találmányban.

Természetesen a különböző ímmunogén nukleinsavak keverékei is alkalmazhatók a jelen, találmányban.

A találmány tárgya továbbá a fent megadott R_;30 X2X2úX2x~r₂ szekvenciát tartalmazó pepiid alkalmazása egy adjuváns előállítására, legalább egy antigénnel szembeni immunválasz fokozására.

A találmány egy előnyös kiviteli módjában az adjuvánst a vakclizahoz adjuk. Természetesen az adjuváns közvetlenül az emlősnek is adagolható, pl. előnyösen a vakcinálást megelőzően. Azonban a beadás szempontjából egyszerűbb, ha az sdjuvánsr a vakcinához adjak, amelyet aztán az emlősnek egyszerre adagolunk.

A találmány szerinti vakcinák emlősök, beleértve az embert, vakcinálására alkalmazhatók egy speci.fikus antigénnel vagy specifikus antigének egy csoportjával szemben, axae.lv magába foglalja a találmány szerinti vakcina hatékony mennyiségének beadását az említett emlősnek, beleértve az embert. Az eljárás magába foglalhatja továbbá a fent ismertetett alfa-peptidet tartalmazó adjuváns hatékony mennyíségéxxek beadását, amit egy vakcina beadása követ.

A. találmányt még részletesebben az alábbi példákban és ábrákon ismertetjük, de a találmány nem korlátozódik ezekre .

Az 1. ábra a (szintetikus míkrobasilenes} KLKLLLLLKLK peptid (SSQ ID. bo. 1; TRAKSloading képességét mutatja különböző, korábban ismertetett hordozó peptidekkei összead hasoxxlitva,

A 2, ábra a találmány szerinti peptid variánsok hatékonyságát mutatja más peptidekkei összehasonlítva..

A 3. ábra az IFN-y-termelő sejtek mennyiségét mutatja egy antigén pepiiddel és (szintetikus xuikrobael lenes)

KLKLLLLLKLK pepiiddel vakcináit egérben.

PÉLDÁK 1. példa

Rágcsáló eredetű makrofágok ^TRAMSloadíng-ja egy „hordozó pepfcid^-ként alkalmazott szintetikus mikrobáéilenes pepiiddel

Annak vizsgálatára, hogy a (szintetikus mikrobaellenes; KLKLLLLLKLK pepiid képes-e az antigének szamára hordozó pepiidként működni, TRANSload-oiní az AFC-ket in *ν»» XX *♦*.

* * * · * . η . % “ί ”· ♦ ·# «Ν$ V ** vitro, ami az AFC-kbe történő antigén-felvétel fokozását jelenti, egy fluoreszcenciásan jelzett pepiidet alkalmaztunk antigén pepiidként. Ezt különböze·: koncentrációjú KDKLLLLLKLK és más előzőleg leirt ''hordozó pepiiddel ele5 gyítettük, amint megadjuk.

Ezen különböző: hordozó peptidek peptíd szállítási hatékonyságának az összehasonlítására az ARC-kbe történő peptid-feivételt az alábbiak szerint xsonitoroztuk; a F388D1 sejteket (rágcsáló eredetű monocita-makrofág antigén pre~ zentáiő sejtvonal; beszerezve ATCC-töl (ΪΙ3-63)) 1 órán át 37°C~on ínkubáituk vagy csak állandó mennyiségű fluoreszcelnnel-jeizett pepiiddel, vagy különböző hordozó peptidekksi kombinálva a megadott koncentrációkban. A. sejteket alaposan kimostuk a szabad peptidek eltávolításához, majd a.

sejteket átfolyási citcnetriával (fiom cytometry) analizáltuk. A sejtek által felvett fluoreszcein-jelzett pepiid relatív mennyiségét átfolyási citometriávai mértük.

Az alkalmazott antigén peptíd egy influenza-haemagglutinin-származék MHC-I csoportba, tartozó (Kdí kötő pepiid.

(Suschle M. {1997}}. Ennek az antigén pepiidnek (FL-LFFAIEGFl? 2 gg-jáf mindegyik tesztelt hordozó peptíd 3 különböző mennyiségével elegyítettük olyan koncentrációban, ami 101,7, 50,9 és 5,09 nmol pozitív töltést jelent (1. ábra mutatja, hogy hányszorosára növekedik a fokozott peptidfelvétel az önmagában alkalmazott pepiidhez viszonyítva} :

FL-LFEAIEGF1 pepiidet elegyítettük as alábbiakkal:

(1) v poli-L-arginin (pR 60; 60 mer) (2) a rágcsáló catheiicidin-szármasék mikrobaeiienes peptíd (mCEÁM?) ; SEy 10. No.2 (3) 4- LL-37; SEQ ID No, 3 (4) 4· L-índoiicídin; SEQ ID. No. 4 (5) a KLKLLLLbKLK (szabad C-termínálís); SEQ ID. No.1 ♦ * Λ »*« ¢6} + lineáris szarvasmarha dodekapeptid; SEQ 1D. No. 5 (7i + cíkiizált szarvasmarha dodekapeptid

Ismert, hogy a csak pepiiddel kezelt sejtekben a fluoreszcencia gyér {amint a közelmúltban kimutatták!, a

T.hANS.ioad-oI.t sejtek intenzív fluoreszcenciáját találtuk azokban az olyan sejtekben, amelyeket a (szintetikus mikrobaellenes} KLNLLLLLKirK pepiiddel, mint hordozó pepiiddel TRANSload-oitunk, ami azt jelzi, hogy ez a pepiid az ARCket nagyon hatékony impulzussal képes ellátni egy antigén pepiid segítségével.

2. példa

Rágcsáló eredetű makrofágok TRANSloading-ja „hordozó pepiid-ként alkalmazott különböző szintetikus mikrobáéi1enes peptrdekkel

Ri-XkXkxíXkX-Rx szekvenciát tartalmazó különböző szintetikus mikrobaellen.es peptídeket vizsgáltunk, hogy képesek-e az antigének számára hordozó péptiáként működni,

TRANSload-olni az ARC-ket in vitro, ami az ARC-kbe történő antigén-felvétel fokozását jelenti. Ehhez a vizsgálathoz

2Ö egy fiuoreszcenciásan jelzett pepiidet alkalmaztunk antigén pepiidként. Ezt különböző koncentrációjú R;-XZX2_NXkX-R_Eszekvenciát tartalmazó psptídekkel és más előzőleg leírt ''hordozó pepiiddel elegyítettük, amint megadjuk.

Ezen különböző hordozó péptidek pepiid szállítási hatékonyságának az összehasonlítására az ARC-kbe történő pepiid-felvételt az alábbiak szerint monitoroztűk: a P383D1 sejteket (rágcsáló eredetű, monocita-mmkrofág antigén prezentáló sejtvonal; beszerezve ATCC-től (TTB-Sőj] 1 órán át 37’C-on inkubáltuk vagy csak állandó mennyiségű fluo30 reszceinnel-jelzett pepiiddel, vagy különböző hordozó peptldekkel kombinálva a megadott koncentrációkban. A sejteket alaposan kimostuk a szabad pepiidet eltávolításához, majd a sejteket átfolyási cl tometriával (flow cytometry)

X 4> « lő analizáltuk. A sejtek által felvett fluoreszcein-jelzett peptid relatív mennyiségét átfolyási citometriával mértük,

Az alkalmazott antigén peptid egy influenza-haemaggiutinin-származék NHC-I csoportba tartozó (Kd) kötő peptid (Busehle N. (1997)), Ennek az antigén pepiidnek _:(FL~ LFEA1EGF1) 3 ug-ját mindegyik tesztelt hordozó peptid 3 különböző mennyiségével elegyítettük olyan koncentrációban, ami 101,7, 50,9 és 5,09 nmei pozitív töltést jelent (2. ábra mutatja, hogy hányszorosára növekedik a fokozott peptidfelvétel, az önmagában alkalmazott pepiidhez viszonyítva) ; FL-LFEAIEGFI pepiidet elegyítettük az alábbiakkal:

(1) poii-n-arginln (60 mer) (2) Hp(2~20}, egy cecropin-szerű antibakteriális peptid, amely a Helicebacter pyiori riboszemáiis protein Ll-böi származik; SEQ ID. No : 6 (3) EALF-peptid; SEQ ID ho:7 (4) rágcsáló cathelicidinbői származó mikrcbaeilen.es

(5)	peptid; SEQ ID, KAFAAAAAKAK-hü₂ ;	No: 2: SEQ	ID.	No: 8
(6)	KGKGGGGGKGK~NH_S ;	SEQ	ID,	No: 9
(7)	KTKTTTTTRTK-NH_£;	SEQ	ID.	No:10
(5)	KLKbVI Fún-ii ;	SEQ	ID.	No: 11
M)	KGRVVVV vEVH-NH_£ ;	SEQ	ID.	No; 12
(10)	ÍOTWWK-NH2;	SEQ	ID.	No: 13
(11)	KFKFFFFFRFK-NH₂;	SEQ	ID.	No: 14
(12)	RLKLIihLLHLB-NH_£;	SEC	ID.	No: 15
(13)	RLRLLLI,LRDR-NH₂;	SEQ	ID.	No: 16
(14)	KLXLLI_>LLKnK~NH_£;	SEQ	ID,	No: 17
(15)	KLKLllLLKbK-COOH	(szabad	C-termínálís);

Ismert, hogy a csak pepiiddel kezelt sejtekben a fluoreszcencia gyér (amint a közelmúltban kimutatták), a ''TRANSioaded sejtek intenzív fluoreszcenciáját találtuk azokban az olyan sejtekben, amelyeket a R_;,~X2XZ_NXZX-R.₂ szék30 νφ φφ** ***Φ *·* *♦# > Φ * φ * φ X

Φ * ♦ *** ΧΦΦ φ * ♦ * * « φφφΟί Φφ Φ* Φ* ♦** véneiét tartalmazó pepiiddel, mint hordozó pepiiddel TRANSicad-oltünk, érni azt jelzi, hogy a találmány szerinti peptidek az APC-ket nagyon hatékony impulzussal képesek ellátni egy antigén pepiid segítségévei.

3. példa

A peptid-specifikus T-sejfc válaszok indukciójának fokozására való képesség tesztelése in vivő

A {szintetikus mikrobáéilenes) KLKLLLLLKLK pepiid azon képességének tesztelésére, hogy a pepiid a specifikus ϊ-sejt-váiass indukcióját fokozza in vivő, 4 egérből áldó csoportoknak szubkután 3 alka lommal (0., 28. és 56. napon) az alábbiakat injektáltuk a csípőbe: TRP-2-ből (egér tirozináz rokon protein-2) származó antigén jaelanoraa pepid (100 pg) önmagában vagy polí-b-argíninnei, illetve (szinte15 tikus mikrobaellenes) KLKLLnlnRLK pepiiddel mint hordozó pepiiddel kombinálva. Az alkalmazott (szintetikus mikrobaeilenes) KLKLLLLLKLK pepiidet négy különböző mennyiségben adagoltuk az alábbi koncentrációkban; azonos mennyiségű poli-L-argindn (100 pg), azonos (168 ug) vagy kétszeres (336 pg) vagy háromszoros mennyiségű (504 pg) polí-Larginin a pozitív töltésekre vonatkoztatva. Az egér csoportokat az alábbiak szerint injektáltuk (jelzett mennyisé g/e gér) .

	(1)	100 pg pepiid
25	(2)	100 pg pepiid + 100 ug polí-L-arginin (pR 60)
	(3)	100 pg pepiid e 100 ug KLKLLLLLKLK
	(4)	100 ug pepiid e 168 pg KLKLLLLLKLK
	(5)	100 uo pepiid e 336 μα KLKLLLLLKLK
	(6)	100 pg pepiid + 504 ug KLKLLLLLKLK
30		A 3. vakcinálás után 12 nappal, lágyéki nyirokcsomókat

távolítottunk el, és a nyirokcsomó sejteket ex vivő LHP-2eredetű (egér tirozináz rokon protein-2) pepiiddel aktiváltuk az IFK-γ-termelő specifikus sejtek meghatározásához egy t *♦·;

**·>

Λ 99

BLTSpot asay-ben (az IFN-y-ELISpotok száma/miiiió nyirokcsomó sejt).

A 3. ábra azt mutatja, hogy az egerek pepiiddel és növekvő mennyiségű KLKLLLLLKLK-val történő injektálása sokkal több lEN-y-termelő specifikus sejtet eredményezett, mint az egér csak pepiiddel vagy peptid + poli-L-arginin kombinációval történő injektálása. Az Is beigazolódott, hogy a KLKLLLLLKrK peptid nem aktiválja az IFN-y-termeló peptidspecifikus T-sejteket {amit az ELlSpot-assay megerősített) azaz hogy csak a nem. KLKLLLLLKLK specifikus T-sejteket kaptunk a jelen kísérletekben.

Sz a példa világosan igazolja, hogy a (szintetikus rn.ikroba.ei lenes) KLKnLLLLKLK peptid fokozza a peptidspecifikus T-sejt válasz kiváltását in vivő.

Összefoglalva a (szintetikus míkrobaeilenes) KLKLLLLKK peptid nagy TRANSioadíng és immunstimuláló hatékonyságot mutat, ama arra enged következtetni, hogy az aifa-peptidek az APC-ket nagyon hatékony impulzussal képesek ellátni antigén peptidekkel in vit.ro és in vívó, és jó adjuván20 sai/'diordozö peptídjei' az antigén peptídeknek az adaptív immunválasz indukálásában.

ΦΦ ♦ >»«

I ί .* ’*ϊ. ··*„ »**♦ Íí*»

Irodalmi hivatkozások:

Bancbereau et al. : Dendritre ceils and. the control of immunliy jVature, 392(6673), 245-52 (1398).

Somán: ''rnnate izsuunrty and the norma! microf lóra íeüfloi. Rév., 173, 5-16 (2000) .

Srossart ec el.: Présén tat ion of -exogenous protein antigéné on major histocompatibility complex eláss 1 molecules by dendritre ceils: pathway of presentation. and re-gulation by cytokines Slood, 91(4), 1594-9 (1997) .

IQ Snschle et ai . : Chemioally defined, ceil-free cancer vaociaes: ase of tumor antigen-deríved peptides or polyepitope proteiné fór vacoinatioit' Geno Iherapy and mleedár Biology, 1, 303-21 (1998) ,

Snschle et a!.: Transloadíng of tumor antigén-dér ived

Í5 peptides intő artigen-presenting ceils Proo. háti. Arad. Sói. 95A, 94(7), 3256-61 (1997).

Cho st al, : Activation of humán neutrophils by a synthefic arti-microbial pepti.de, KLKLLLLLKLK-NH?, via ce.ll surface calreticoiin Por. S, Sioche®., 266, 873-85 (1399) .

Ganz et ad'.: Antimicroblai peptides of ieukocytes

Cízrr, Spin. dómatcl., 4(1), 5.3-8 (1997).

Ganz T.: Antimiorobíal peptides of vertebrates Curr.

öp í π. .r-mu n o.1., lö (1) , 41-4 (1933),

Ganz et ai. : Antiblotic peptides eukaryotes: foioiogy and applications Mól 5(7), 292-7 (1993).

írom hígher Med. Today,

Gudmundsson et ad

Neatrophil antifoacteriai peptides, multifunct.tónál effector moleoules in the mammalian immuné system <7. immunoi, foföthodc, 232(1-2), 4554 (1939).

Harding: Phagocytic Processing of antigéné fór presentation by MHC molecui.es Trsnds in Cél! Bioiogy, 5(3), 105-09 (1995) .

♦ «vj «««J

X « «0«

0X0 » * «« j«9 «« *

Hardíng: Cla-ss I MHC presentatíon of exogenous antigens J. Cl in. Immunoi. , 16(2), 90-6 (1996).

Mizukaw-a st ai. : ''Pressnce of defensin in epitheliai La.ngerha.ns cella adj-acenf fco órai carciaoinas and precancsro-us lesions A?jticanos.r Kés., 19(4B), 2669-71 (1999).

Monaco: A moiecuiar módéi of MHC class-I-restricted antigén processing Immunoi, Today, 13(5), 1.73-9 (1992).

Nakajíms et si.: Chemotherapeutic activíty of synthetic antíxaicrcbiai peptídes: correlation fcetween ohemötherapeufio actívity and neutrophii-aetivatíng activíty F.ASH Lett., 415, 64-66 (1997).

Schijns: Immnnological concepts of vaccine adjuvant activíty Curr. öpín. immunoi,, 12.(4), 456-63: (2000).

Schmidt st ai. ; 'Cell-free tumor antigén peptíde-fcased oancer vaccines Proc. Háti. Acad. Sci. HSA, 94(7), 3262-7 (1997),

ZanettI et ai,: The eathelicídin family of antimicrobial péptide precursors: a component of the oxygen-in-dep-endent defense mechanisms of neutrophils Ann. M. xi Acad. 6c. , 832, 147-62 (1937).

SZEKVENCIÁI, ISTA

A szekvencialistáfoan szereplő kötetlen szövegrészek (223~as köd) -fordításai

(210)	1
(22.3)	Mesterséges szekvencia leírása: peptid.
(210)	2
30 (223)	Mesterséges szekvencia leírása: peptid
(210)
(223)	Mesterséges szekvencia leírása; peptid

♦**;

*

	(210)	4
	(220)	Mesterséges szekvencia leírása; peptíd
	(223)	Amidálás
	(210)	f?
5	(223)	Mesterséges szekvencia leírása: peptid
	(210)	6
	(223)	Mesterséges szekvencia leírása; peptíd
	(210)	7
	(223)	Mesterséges szekvencia leírása; peptid
10	(210)	3
	(223)	Mesterséges szekvencia leírása: peptid
	(223)	Amidáiás
	(210)	9
	(223)	Mesterséges szekvencia leírása: peptíd
15	(2235	Amidálás
	(210)	10
	(223)	Mesterséges szekvencia leírása: peptíd
	(223)	Amidálás
	(210)	11
20	(223)	Mesterséges szekvencia leírása: peptid
	(223)	AmídáXás
	(210)	12
	(223)	Mesterséges szekvencia leírása: peptid
	(223)	AmidáXás
25	(210)	1.3
	(2235	Mesterséges szekvencia leírása: pepiid
	(22 35	Amidáiás
	(2105	14
	(223)	Mesterséges szekvencia leírása: peptíd
30	(223)	Amidálás
	(2101	15
	(223)	Mesterséges szekvencia leírása; peptid
	(2235	Amidéiás

>· Λ * v-vy (210ί 16 (223) Mesterséges szekvencia leírása (223) Amidéiás peptid.

; c c 3 (223)

Mesterséges szekvencia leírása: peptid Amidálás

Claims

Szabadalmi igénypontok ΐ, Vakcina, amely legalább egy antigént és egy R: ~XZX2mX'2'X-R2 szekvenciát magában foglaló pepiidet tartalmaz, ahol

5 - X jelentése 3 és 7 közötti egész szám, előnyösen 5;

~ X jelentése egy pozitív töltésű természetes és/vagy nemte rmá s zetes ami nos avasa?adók;

- Z jelentése egy L, V, I, F és/vagy d amínosavmaradék, és

- Rí és R? jelentése egymástól függetlenül -Η, -1¾,

10 “-COCíb, ~COH képletű csoport, legfeljebb 20 aminosavmaradékot tartalmazó pepiid vagy egy reaktív peptidosoport vagy egy peptid-kapcsoló pepiiddel vagy peptid nélkül; X-R? jelentése ezenkívül lehet a C-termínális aminosavmaradók amidja, észtere vagy tioésztere.

15
2. Az x. igénypont szerinti vakcina, ahoi a peptid szekvenciában X jelentése K, R, omlóin és/vagy homoarginin amínosavmaradék.
'3. A 2. igénypont szerinti vakcina, ahol a peptid szekvenciában X jelentése K.

20
4. A 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, ahol a peptid szekvenciában 2 jelentése h, I és/vagy F.

5. A 4. igénypont szerinti vakcina, ahol a peptid szekvenciában Z jelentése L.

0, Az 1. igénypont szerinti vakcina, ahol a peptid

25 szekvencia H-XLKLLLLLKLK-H.

A 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, ahoi a peptid szekvenciában. Rí. és/vagy R? jelentése 10-20 amínosavmaradék.

8. A 7. igénypont szerinti vakcina, ahol Rí. és/vagy R₂

3ü aminosavmaradékainak jelentése nem-negatív töltésű amínosavmaradékok.

9. A 8. igénypont szerinti vakcina, ahoi Rí. és/vagy R₂ * « ♦ # » * amlnosavmaradékainak jelentése L, V, X, F és/vagy W.

10. A 9. Igénypont szerinti vakcina, ahol R;. és/vagy R₂ aminosavmaradékainak jelentése- b, 1 es/vagy F.

11. A 10. igénypont szerinti vakcina, ahol R_;. és/vagy R, amínosavmaradékainak jelentése L.

12. A 7-11. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, és/vagy amínosavmaradékainak jelentése poritív természetes és/vagy nem--természetes aminosavahol R;. töltésü maradék

10 13. A. 12. igénypont szerinti vakcina, ahol FA és/vagy

R_s aminosavmaradékainak jelentése Kj R, ornitin és/vagy homoargínin.

14. A. 12. igénypont szerinti vakcina, ahol R·. és/vagy Fa aminosavmaradókéinak jelentése X.

IS 15. A 1-14. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, amely legalább egy további immunválasz stimuláló anyagot tartalmaz.

16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, amely továbbá egy ímiaunstiiauláló nukleinsavat, előnyösen

20 egy dezoxiinozín-tartalmű oiigodezoxinnkleotidot, dezoxíuriom·--tartalmú olígodezoxi-nukleotldot, egy CS motívumot tartalmazó oligodezoxí-nukleotidot vagy egy ínozin- és eitídin-tartalmú nukleinsav molekulát tartalmaz.

17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti vakcina,

25 amely immunválasz stimuláló anyagként továbbá egy eltekint tartalmaz.

18. Az 1-1?. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, amely tartalmaz továbbá sgy políkationos pepiidet, sgy neuroaktiv vegyületet vagy egy növekedési, faktor aktivitású

2G> hormont.

19. Az 1-18. igénypontok bármelyikében definiált, Rg-XXXZ;;XZX“R? szekvenciát tartalmazó peptid alkalmazása egy adjuváus vagy hordozd protein előállítására legalább egy *♦ * · antigénnel szembeni imiaunválasz fokozására.

20. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az adjuváns vagy hordozó protein növeli legalább egy antigén felvételét az antigén prezentáló sejtekbe (APC).
5 21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az adjnvánst vagy hordozó proteint a vakcinához adjuk.