HU227823B1 - Pharmaceutical compositions comprising 2-hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolane and further antiviral agent - Google Patents

Description

A találmány tárgy át biológiailag aktív míkleozidok képezik, főleg azok az. antivirális készítmények, amelyek tartaímazzák a <-HM Μ 2~hídröxjmetti-S-(5fluor'etío2Ín-l-ii)-l,3-oxotio;áu (FTC”·), Illetve érmék fiziológiailag elfogadható sója és egy más aoiivirálís szar kombinációját, i9SÍ-ben azonosítottak a szerzett ímmtinfeiánycs tünet együttest (AIDS) mist egy olyan betegséget, amely súlyosan károsítja a honián immunrendszert, és szinte kivetet nélkül halállal végződik. 1983-ban meghatároztak az AIDS károkozóját,, a barnán immandeltefenciát okozó vírust (HÍV), 1990, decemberében a World Health örganizattan (WHÖ) becslése szerint a világban S-lö millió entber volt HlV-vei fertőzve, és ebből I 0090ÖÖ-1 48GÖÖ8 az Amerikai Egyesült Államokba® él.

19S5~beo közölték, hogy a o'-azidö-a'-dezoxítímidin .(AZT) gátolja a humán immundeíiciencís vírus replikádöjáí. Azóta számos más szintetikus rtukleozsdrot, beleértve a 2',3'-didezoxíinozntt (DDI), a 2)3didezoxicítidirst (DDC), a S’-íluor-S’-dezoxítimidím (FLT) és a 2',3^,-dide20XÍ-2B'-didebidrotimidint (D4T), hebizonyosodott, hogy hatásos .AIDS ellen. Számos más S^'-dldezexinukleozidral igazolták, hogy gátolja számos különböző vírus szaporodását ín viiro körülmények között Úgy ttmfk, hogy az 5'~írí (osztat eellaíáris kinázok által történő eellaíáris foszforilezése után ezek a szintetikus nakfeeziáok beépülnek a viráiis DNS növekvő szálába, ezzel iáneteítmnáeiöt okoznak, a 3-hídroxií csoport hiánya miatt.

A különböző 2)3Wild«zöxmakleozidök sikere a. HÍV ín vívó és ín vítro repíikáoíójának gátlásában számos kutatót ana vezetett, hogy olyan nakleezjdokst tervezzenek és: vizsgáljanak meg, amelyekben a nukleozid 3' pozíciójában levő szénatomot egy heteroíttorn helyettesit. Norbeck és munkatársai leírják, hogy a (χ)-ϊ-((28,411)-2(bldroxit5tetíl)-4-dioxolaní(j-tímln (a továbbiakban (fej-dioxolán-T néven hivatkozunk rá) közepes aktivitással rendelkezik HíV-vei szemben (az ECj SO I- érték 20 amoVl ÁTfcfö sejtekben), és nem toxikus fertőzetlen kn sejtekkel szemben 2ÖÖ umok'l koncenfeáeiöban (Tetrahedron Lettére, j 3t)j .(46), 6246 (1989)) , Á 8 337 713 számú Európai Szabadalmi Bejelentés, és a 5,041,449 számú Amerikai Egyesült Államok-beli Szabadalmi Bejelentés, az 1AF Biochemicai International: részéről latija. a 2-belyettesített-44ielyetiesiietí-Í,3 díoxoíánokat, amelyek anti viráiis aktivitással rendelkeznek.

Az 5,047,407 számú Amerikai Egyesüli Államok-beli Szabadalmi Bejelentésben és a 8 382 526 számú Európai Szabadalmi Bejelentésben, szintén az 1AE Biochem íotematiomé, Inc. részéről szintét; leírnak számos 2heíyettesíteii~5-heiyett«riíett~l,3-oxadölá« liukleoziáoí, amelyek antiviráiss aktivitással rendelkeznek, és azt külösröser; kiemelik, hogy a 2-í;idroximetií~5-(eitozí«-Í-il)-í,3-oxatio.láK rácén; keverékének (a C4’ pozícióban) a. Ci'-lí isömetje (a továbbiakban mint (i)-BCH-l 89-et említjük) körüíbeiül ugyanolyan aktív a HiV-vel szemben mint az: AZT, és nincs, ee'dulárls toxioltása a vizsgáit szintekem A (Aj-BCH-189-ről az is kiderült, hogy in vítro gátolja az AZT-rezísztens HÍV izolátumok replikáéi óját, amely izoláíurook olyan betegekből származnak, akiket 36 hétnél hosszabb ideig kezeitek AZT-vel..

Egy másik vírus, amely súlyos egészségügyi problémákat okoz az embereknek, a hepatitisz. 8 vírus (a továbbiakban ”HBV” néven említjük), A HÉV 3 dohány «Ián a második az emberi rák okozói közül. A?. a mechanizmus nem ismeri, amellyel a HBV rákot okoz, jóllehet azt állítják, hogy közvetlenül beindíthatja a tumor fejlődését, illetve közvetve indítja ke a tumor fejlődését krónikus a fertőzéssel kapcsolatos gyulladáson, elrrozreoa és sejíregenerálódásoo keresztül.

Kettő-hat hetes inkubációs periódus után, amely alatt a beteg nincs tudatában· & fertőzésnek, a HBV fertőzés akut hepatitiszhez és. tnájkárosedáshoz vezethet, amely hasi fejtlaímat, sárgaságot, és bizonyos enzimek megnövekedőn vérszsntjéí okozza, A HBV okozhat heveny hepatitiszt, egy gyorsan kifejlődő, gyakran halálos formáját a betegségnek, amelybe» a máj nagy része elpusztul.

A betegek rendszerint kigyógyulnak az akut hepatitiszből. Néhány betegben azonban a vírus antigén magas szinten megmarad a vérbe», egy hosszabb, vagy meghatározatlan ideig, és ezzel krónikus fertőzést okoz. A krónikus fertőzések krónikusan fennmaradó hepatitiszt okozhatnak. A. krónikusan nutgynaradó HSV-vel fertőzött betegek általánosan előfordulnak a fejlődő országokban. 1991. közepén körülbelül 225 millió krónikus HB'V hordozó található csak Ázsiában, az egész világban majdnem 300· millió hordozó található. A krónikusan megmaradó hepatitisz fáradtságot, májeirrozist és hepatocellulárís karcbómK egy primer májrákot okozhat.

A fejlett nyagats országokban a HBV fertőzés veszélyének erősen kitett csoportba azok tartoznak, akik HBV hordozókkal, vagy azok vérmintájával kerülnek kapcsolatba. A HBV járványtana nagyon hasonló a szerzett inimrsnhiányos szindróma járványtanához, ásni megmagyarázza, hogy a HBV-ysl fertőzés miért elterjedt az. A.IDS-es vagy AlDS-hez kapcsolódó komplex tünetekben szenvedő betegek között. A HSV azonban sokkal fertőzőbb, mint a HÍV.

Egy humán szérum eredetű vakcinái, fejlesztettek ki, amellyel a betegeket HBV ellen immunizálnak. Jóllehet ért hatásosnak találták, a vakcina termelése gondokat őkoz, mivel a krónikus hordozókból származó humá» szórom ellátás korlátozott, valamint a tisztítási eljárás is hosszú és. drága. Emellett mindegyik, eltérő szérumból készítés vakcina sarasét meg kell vizsgálni csimpánzokon, hogy biztosítsuk a biztonságot. Vakcinákat génsebészeti módszerekkel is előállítanak. Az íx-interléronnal.. egy génsebészeti óton előállított fehérjével végzett napi kezelések is ígéretesnek mutatkoznak. Azonban a mai napig nem ismert olyan gyógyászati hatóanyag, amely hatásosan gátolja a vj'ms replikáeiójáí.

Ahhoz, hegy egy nuhfeozsdot gyógyászati célokra áruljanak, ahhoz az kell, hogy ne csak hatékony és alacsony toxlcítású legyen, hanem az is, hogy· gyártása gazdaságos legyen. Intenzív kutatás és fejlesztés folyik abban az irányban, hogy új, alacsony költségű eljárásokat fejlesszenek ki nagymennyiségű nukieozid termelésére. A 2',3’didéz:t»:iníjkíSőziáokaf jelenleg két különböző óton állítják elő: egy intakt nukieoztdböi képeznek származékot, vagy egy cukorszármazékot kondenzáltatnak egy heterociklusos bázissal, jóllehet annak számos hátránya van, hogy új nukieozid analógokat intakt nukleozidok módosításával állítsunk elő, mégis rsagy előnye ennek a megközelítésnek, hogy a megfelelő abszolút sztereokémiát a természet tttár beállította. Ezt a megközelítést azonban nem lehet alksirtrazni olyan nukleozídok előállításában, amelyek vagy a természetben elő nem forduló bázisokat, vagy a természetben elő nem forduló szénhidrát egységeket tartalmaznak (és amelyek ennél fogva nem készülnek intakt ftukioőzldekbóí}, ilyenek például az 1,3-oxatiolán mskteözidok és az 1,3-dioxoláts nukleozídok.

Ha egy szénhidrát vagy szénhidrát-szerű egységet egy heterociklusos bázissal kondenzálíaíunk szintetikus uoklőoad előállítása céljából, akkor egy olyan nukieozid keletkezik, amely két királss centrummal rendelkezik (a Cl' és C4‘ pozíciókban), és enné! fogva diaszíereomer pár formájában létezik. Mindegyik díasztereemer pár enantsomerck csoportja formájában létezik. Ennél fogva a termék négy emmsfomer keveréke, * · ♦ » *♦

Az· gyakran kidéről, hogy a Cl' vagy C4’ pozíciókban a temtészetben eló nem forduló sztereokémiát tartót mázó fiukieozídok kevésbé aktívak mini azok a uukleozidok, amelyek a természetes sztereokémiái kortHgarációval rendelkeznek. Carter és munkatársai például: leírták, hogy a carbovír (2^:,3'-dídehidro~2^f,3 díáezoKigysRozin) {->enaniíomerjének az a koncentrációsa, ami ahhoz kell, hogy 50%-kaI csökkentsük a reverz tr&uszkriptáz aktivitását (ECr Sör) 0,8 gmol/1, míg a cttrbovír <V)-enasifenerjénsk az EC i Sö f· értéke 68 simol/'lnél magasabb [Antimicrobial Ágents and Cbemotherapy, -J 34j (ö), 1:297-1 308 (1990 június)),

A WO 91/11186 számú PCT International Püblicathtn-ban leírják, hogy az I ,3-oxatíoián nukleozidokat nagy diasztereo-szelektívhással lehet előállítani (a Cl-szénatom és a heterociklusos bázis közötti kötés a: nukleozid molekulák nagy százalékában β konltguréckSjús, ha a kondenzációs folyamatban alkalmazott Lewis .savat nagy körídlekíníésssi választják meg. Felfedezték, hogy egy 1,3-oxatiolán nukleozid kondenzációja egy bázissal majdnem kizárólag S-szíereospeeiilíással játszódik le, ha ónklorídot használnak a kondenzáció katalizátoraként. Más Lewis savak alacsony (vagy noha) szelektivitást biztosítanak, vagy egyszerűen netn képesek katalizálni a reakciót.

Annak a ténynek a fényében, hogy a szerzett immundeheierícia szindróma, az AIDS-rokott komplex és a hepatitisz B vírus járványos szintet ért el a világban, és tragikus hatások van a fertőzött betegre, nagyon erős igény marad fenn öj hatékony farmakológiai ágensekre, amelyekkel ezeket a betegségeket lehet kezelni, és alacsony toxieitásnk van a gazdaszervezetre.

Igény van még gazdaságos, üzletileg életképes módszerre, hogy feitstakológiatíag fontos nukleozldokat állítsunk elő, és specifikusan elérjük a ll-szíereospeci irtást a szintetikus nukleozldok C4^! pozíciójában, amelyeket úgy állítunk elő, hogy egy szénhidrát-szerű egységet egy bázissal kondenzáltatartk,

Talábnány tárgya készítmény emberek és más gazdaszervezetek HÍV és HBV' fertőzéseinek kezelésére, amely (-)-8-L-2-bidroxirí5eti:l-5-(5-rtuor-cifozíri-l-il)--L3-oxatioiáí3, illetve annak gyógyászatslag elfogadható sója és egy más aatívrráils szer kombinációját tartalmazza gyógyászatilag elfogatató hordozóban.

Kirlerök, hogy a 2-hidrísxímetil-5-(S-fiuor-citozin-l-ii)-í,3-oxatioi:án ('TTC) meglepőét; nagy aktivitást mutat a humán tmmsmdeíieieneia vírussal szemben, és nagy on alacsony a íoxieíiása a gazdasejtekre, Az is kiderült, hogy az FTC nagyon jelentős aktivitást mutat HBV ellen, és ennél fogva használható olyan betegek: kezelésére, akiknek a HBV fertőzéshez kapcsolódó különböző betegségük van.

A toxieitási és a farmakokinetikal vizsgálatok megerősítik az FTC használhatóságát antlvirális ágensként gyógyászati célra. Az FTC és enantiomesje: nem toxíkusak a perifériális humán csontvelő sejtekre egészen 50 gmol.ő könoentráclóig, valamint egyéb sej ivón alakban egészen 200 gmol/l koncentrációig, Az FPC-TP egy fő inímceiluláris metabolit a PBMC és a HepG2 sejtekben. Az FTC-TP kompsíítíven gátolja a HíV-l reverz transzkríptázát (RT) Kj-I b =“ 0,2 pmol/l értékkel, egy pöiiíljoitgcfdC) iemplát-mdítő molekula alkalmazásával, Szekvencia -elemzés alkalmazásával az PTC-TP-ről ki leltet motatnt, hogy egy hatékony DNS kmcsertninátor, ha HíV-RT-t használunk (C-stopök).

Az F'TC-vel végzett krónikus kezelés nem toxikus rágcsálókra, még 85 mg/kg per nap orális dózisban sem, legalább két hónapig. Az PTC iarmakokmeíikája rhesns majmokban- azt mutatja, hogy nagyon magas az orális bíoavaiíabiiity értéke (körülbelül 73Aő%) és a plazma temrináiís felezési ideje körülbelül l,34iÖ,i:k (sz orális és az

Le, beadási mód átlaga).

A nukleozid c«antiomerek elegyének rezolválásl eljárását, beleértve az FTC racém elegyét is, leírjuk, ameiy magában fogiaga azt a lépést, amelynek során a racém elegyet egy olyan enzim hatásának tesszük kí, ameiy az egyik enandomerfet végzett reakció katalizáfását előnyben részesíti a. másik enantiomer ksializálásával szentben. Az eljárás használható számos különböző nokleozid rezőlválására, beleértve a. pínmidis és parin nufeleozídokat, amelyek adott esetben a szénhidrát. egységben vagy a bázis egységben vannak, szubszdíuálva. Az eljárás- használható olyan nukleozíd származékok rezolválására is, amelyek további heteroatomokat tart^maznak a szénhidrát egységben, például ilyen a (*)-FTC és a Í^)-BCH1S9, A ítakleozidok tezob’álását nagy méretben lehet végezni alacsony költségekkel.

Az alábbiakban ismertetett módszerek alkalmazásával sz FTC-í (+-)-) I>j ás («>8«j íz: enantiomerekre lehet elválasztani, A (-)-8-j kj esnantlomer sokkal hatásosabbnak taoik, mint a (-:)-8-1 Di enantiomer HÍV, HBV és S1V elleti. Az FTC {+) enaotíomerje szintén aktív HÍV, HBV és SíV ellen.

Áz alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

Az 1, ábrán a 2-hiároximefíl-5-(S-flnor-díozín--!-íl)-l,3-oxat!Olán (FTC) kémiai szerkezete látható.

A 2. ábrán a 2“biáreximefíI-5-(5-líbpr-cifozlí5~ 1-11)-1,3-oxatloiás egy előállítási eljárása, látható,

A 3. ábra egy folyamatábra, amely az alkalikus tbszíadz és a kígyóméreg Ibszlbdíészteraz spéci fítását mutatja az FTC ·<+) és (-) ensniíomerslveí szemben,

A 4. ábrán egy graőkoo látható, amely az FTC 5'-bmiril-észíerések lipázzal katalizált hidrolízise időbeli lefolyását mutatja Amsno PS-8ŐÖ (üres négyzet) és PI..E (üres kör, benne pont) enzimekkel.

Az 5. ábra egy grafikon, amely a racém és a sztereokéroiaríag dúsított FTC (a 4. példa szerint előállítva) koncensráclójának (^rool/l) hatását a HIV-l-gyeí fertőzött humán PBM sejtek százalékos gátlásának függvényében, (fekete kör: i»-FFC; üres kör, (~)-FTC; fekete négyzet: (-H-FTC).

A 6, ábra egy grafikon, amely a amely & racém és a szíoreokémiail&g dúsított FTC (a 4. példa szerint előállítva) koncentrációjának (pmobl) hatását a HIV-l-gyel fertőzött barnán PBM sejtek százalékos gátlásának függvényében. (fekete kor: íá)~F?C; üres kör: (-)-FTC; fekete -négyzet (-ί-)-Π'Ο.

A 7. ábra egy grafikon, ameiy a tricíált (ii-FTC felvételét: mutatja humán PBM sejtekben (kél. meghatározás átlaga) az idő (óra) függvényében -p mohi öt őt sejttel szemben.

A 8, ábra egy grafikon, a radioakttvan jelzett íi)-FTC kiszabadrsiását mutatja humán PBM sejtekből, órában mérve pmoblöi őt sejten mérve,

A 9. ábrán a (t 3j Hj-(i)-FTC és feszforiiezett származékai jelenlétének időbeli lefutása látható humán HepG-2 sejtekben (két meghatározás átlaga), olyan táptalajban Inkubálvu, amely lö amol/l (1 31 j-(x)-FI'C-t tartalmaz, pmoVlöt ót sej ten mérve.

A lő. ábra a radioaktlvan jelzett (*)-FTC kiszabadulását mutatja humán Hep<32. sejtekbe!, órában mérve pmol/10T ót sejten mérve, mintán a sejteket impaizasszKracn megjeieztSk lő amol [; 3t H]-(A)-FTC-vei (7(10 DPM/pmolj 24 őrs hosszat, majd mértük a vegyület kooeeatráciöját as eltávolítás után 24 őrávsl.

A 11. ábráit a (f 3Í ]-{±)-FTC és (oszferíiezett származékai kombinált koncentrációjának időbeli lefutása látható humán HcpG2 sejtekben iö gmobl (t 3Í 1-(i)-F'TC-vel (70(5 OFM/moi) ínkubáíva 24 óra hosszát, pmol/löj ót sejten mérve.

4r X

A 32. ábra egy grafikon, amely sz FTC enattícsnogeinek hatását mutatja a grsnuloeita-makrefág prekurzor sejtek telepképzésére, amint azt a túlélés százalékával lehet mérni a koficeníráctóval szerűben pmoi/i-hen (üres kör: {-}·-FTC; sötét kör: {-Cj-FTC; sittét négyzet: AZT).

A továbbiakban az egyik enwfomerre nézve dásitott nukleozid'' szakkifejezés olyan nukleozid készítményre vonatkozik, amely az adott nukleozid egyetlen enantiomerjéből legalább 95%-ot tartalmaz,

A továbbiakban az FTC szakkifejezés a 2-hídrQximetil-5~(5-fiuor-citozín-Lis)-L3-oxatíohín-ra vonatkozik (az enantíomerek racém formájára), amelyet 2'-dezoxl-5-íluor-3'-tiaciftilin néven is említünk.

A továbbiakban a (±)-FTC szakkifejezés jelentése (±)-S-D,L-2-hidroxímetil~5-(5-Sner-eitozín-l-ii)-I,3oxatiolán.

A továbbiakban a (-)-F'FC szakkifejezés jelentése (-^S-L-S-hidroxtreietíVS-CS-fluor-cítozSn-1-11)-1,3oxístioián,

A továbbiakban a (+)-Fj'C szakkifejezés jelentése (Á)-S-D’24iíöroximetil-.5-(5-í)uor-eiíoz.ín·-1-11)-1,3oxatioián.

A továbbiakba·! az FTC-MP, FTC-ΟΡ és FTC-TP szakkifejezések az FTC monofaszfáíj.ára, difoszfáljára iilelve írifeszfátjára vonatkoznak,

A továbbiakban a BCH-189 szakkifejezés jelentése Z-hidroxímstíl-S-'ícitozín-l-ilj-Ld-oxaíioián.

A továbbiakban a preferenciáit» enzim katalízis szakkifejezés olyan enzimes katalízisre vonatkozik, amely során az enzim az egyik sznbszírátot előnyben részesíti a másikkal szemben.

A továbbiakban a lehasadó csoport egy olyast funkciós csoportot jelent, amely egy kezdődő szaturácíót képez, amikor ishasad arról a molekuláról, amelyhez hozzá van kötve.

Az ismertetek eljárás és készítmény HÍV és HBV fertőzések kezelésére, illetve más, hasonlóképpen replikálódő vírusok kezelésére emberekben vagy egyéb állati gazdaszervezetekben abban áll, begy hatásos mennyiséget adunk be a 2-hidröximetil5-{5-flimr-eito2Ü!-í-5l)-l,3-őxatioián (aj-S-j D,1.4 , 8 (-)-8-1 Lj vagy a (+-)β-j. Dj enantiomerjéboL annak gyógyászatílag (fzioióglailag”) elfogadható .származékából, beleértve az 5' vagy Ní 4t -alkilezett vagy acilezeít származékot, illetve gyógyászatilag (fiziológiailag”) elfogadható sójából, egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban. Amint .azt az alábbiakban bemutatjuk, a jelen találmány szerinti vegyületek vagy anti-retroviráiís aktivitással rendelkeznek, azaz anti-ISV-l, anti-HlY-2 és aníi-majom immundeflcíencia virus (anti-SIV) aktivitással önmagukban, illetve olyan vegyületté metabolizálva, amely anti-retroviráiís aktivitással rendelkezik.

Az FTC és gyógyászatílag elfogadható származékai vagy az ezeket a vegyüieteket tartalmazó, gyógyászatíl-ag elfogadható készitRiérsyek használhatok HÍV fertőzések megelőzésében é.s kezelésében, valamint egyéb körülmények közök, ilyen például az A.íDS-bez kapcsolódó komplex (ARC), a. megmaradó generalizált liroíbadenopátia (POL), az AIDS-bez kapcsolódó neurológiai állapotok, az anti-HIY antitest pozitív és a RlY-pozitiv állapotok, a K.aposi szarkám, a irömboeitöpéara purpnrea és az opportunista fertőzések. Emellett ezek a vegyületek vagy készítmények profiaktíkusarí is használhatók, hogy megelőzzük vagy lelassítsuk a klinikai tünetek kialakulását olyan betegekben, akik HlV-aufttest vagy FUV-arstsgén pozitívak, illetve akik kapcsolatba kerültek a HlV-vel.

*» * Μ*. .« ΦΦΦ φ φ • « X ♦ ♦ φ φ « φ # φ φ * « · ** * φχ φφ '“ϊ

Az FTC és .gyógyászatílag elfogadható- származékai' illetve sót, vagy az ezeket a vegyűleteket tartalmazó gyógyászatilag elfogadhat készítntények is használhatók HBV fertőzések megelőzésé ben és kezelésében, valamint egy rofeoa állapotokban, ilyen például az aoti-íffiV antitest pozitív és a HBV-poziílv állapot, a HBV által okozott, •krónikus májgyulladás, eirroás, akut hepatitisz, heveny hepatitisz, krónikus perzisztáíó hepatitisz és fáradtság; Ezek a vegyületek. vagy készítmények profi laki ikusan Is használhatok arra, hogy megelőzzük vagy késleltessük a kihiikíű törtetek kialakulását olyan egyedekhen, akik aníi-HBV-antlfest vagy 'HSV-antígén pozitívak, illetve akik HBV-veí kerültek érintkezésbe.

Összefoglalva, az alábbiak kerülnek ismertetésre;

(a) (i)-8-D,L-2-hidroxim.etiÍ-S-(5-;nuor-cítozm-1-11)- há-oxsfooíán és gyógyászatilag elfogadható származékai yalwiat sói;

fc) f-)-b-L-2~hidroxi!r!eíil-5-(5-íluot-clíozin-l-íl)-l,3Oxstioián és gyógyászatiig ..elfogadható származékai valamint sói;

(e) (-v)-8-0-2-hidroximetil-5-í5-fíuor-c!tozin!-Ml)~ 1,3-osatioíás és gyógyászatilag elfogadható származékai valamint sói;

(d) (i)-D~D,L-2-hidroximetii“5-i5-flv.or-ch<?ziö-l-ií)-l,3-oxatíolán, {-} és (+) esaulíomerjei és gyógyászatílag elfogadható származékai valamint sói a gyógyászatban való alkalmazás céljára, például a HÍV llletva HBV fertőzés kezelésében vagy megelőzésében;

(e) fi)-S-0,L-2-h!droxirnetil-5-(5-íIuor-eitozít5-l'ii)-l,3-ox;siioiáii, {-) és (+) enantiomeijeí és gyógyászatiéig elfogadható származékai valamint sót a HÍV vagy HBV fertőzés kezelésére alkalmas gyógyszer készítésében;

(fi (T)-S-D,L-2-hidroximetil-5-(5-íluor-clíozírt-l-íl)~í J-oxatioíánt, (-) és (+) enanfiomerjeit és .gyógyászatilag elfogadható származékait valamint sóit gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt tartalmazó gyógyászati készítmények;

(g) eljárás 2-hidTo>;imetík5-(5-fluor-í;itozin-l-ti)-'.i,3“i>xstíöián előállítására, azzal jellemezve, hogy a kővetkező lépéseket alkalmazzuk:

(I) adóit esetben védett, 5-fiuor-cltomt reagáitatunk | általános képletü 1,3-oxaöoíánnal, amelyben Rj lat jelentésg hidrogénatom vagy hidroxi védőesopűrt, beleértve egy auílosoportot, L jelentése lehasadó csoport; adott esetben eltávolítjuk bármelyik hidroxi védócsoportöt.

(il) a H általános képletü vegyüíetet (amelyben Rt la;- jeíetftése ugyanaz, mint amit az előzőkben meghatároztunk, és Rt íbt jelentése amino védöcsoport) reagáitatunk egy fiuorozó ágenssel, amelynek az a feladata, hogy egy fiuoratomot vigyen be a c-itozmgyörö 5-ös pozíciójába; vagy (ifi) egy III általános képiéin vegyüíetet reagátíaiurtk (amelyben Rr iah jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben meghatározfenk) egy olyan reagenssel, amely az macii gyűrő 4-es pozíciójában: levő oxocsoportot amlxjoeseporttá alakítja; bármelyik tnegmaradö véd'Scsopvrtot eitávoiitva kapjuk a keresett terméket (It) eljárás a 2-fcsdroxímesil-5-{5-foior-eííözis~ 1-11)-1,3-oxatioláa egy (-) vagy <+) enantiomcrje előállítására, azzal jellemezve, hogy _a vegyüíetet vagy egy származékát (például S’-éssterét) egy (-} és (+) enantfomerekbal álló keverék formájában olyan körülményeknek vetjük alá, illetve olyan reagensekkel reagáitatjuk, amelyekkel az «*·♦♦ .·«*.< «« V

emmtiomerekef el lehet választani, és ha szükséges, akkor a keletkező származékokat a kiindulási vegyületóé alakítjuk.

Ami a g) pánt 5) eljárását illeti, a hidroxi vevőcsoport lehet valamely, az alábbiakban részletesen ismertetett védőcsoport, beleértve aeil- (például aeeíii), arílacíi- (például benzoíl vagy helyettesített benzoíl), tritil- vagy monoinetoxltritih, benzii- vagy helyettesített benzii-, triszabszttttiált szüli-, beleértve a trialkll-szíiilt (például dlmetii-t-feutliszilíl) vagy áifenHmetíl-sxilil csoport. A fluor-eitozin védöcsoportot adott esetben triszabsztítuáit szállt csoporttal lehet védeni. A védőcsoportókat .szokványos módos lehet eltávolítani. A lehasadó L csoport egy olyan lehasadö csoport, amely tipikusa» olyan, mint amilyenek a nukleozíd kémia területén ismertek, azaz· például halogénatom, űgymioí klór- vagy .brőmatom, alkoxi-esoport, őgymiut metoxi- vagy «toki-csoport, vagy aciicsoport, ágyjnmt-aeetít- vagy 'benzoil-csoport.

A g) pont i) reakcióját szerves oldószerben lehet végrehajtani (például 1,2-dikióretáaban vagy acetonknlfcen) Lewis sav, előnyösen önklorid vagy trimeríi-szilil-tríflát jelenlétében.

Á 1 általános képletű vegyületeket (amelyekben t jelentése aciicsoport, azaz például egy .acetíl-csoport) úgy állíthatjuk elő, hogy a IV általános képleté vegyületet (amelyben Rr laí jelerttáse ugyanaz, mint amit az előzőkben meghatároztunk (egy redukáló ágenssel reagáltatjuk, például litium-aiamínium-hldrírktel, majd a megfelelő szokványos reagenssel kezeljük a kívánt intermedier előállítása céljából, azaz például ecetsav-anhidríddd áz íícüezéshez, klórozó vagy brőmoző reagenssel a halogénezéshez, vagy alkilező reagensekkel.

A IV általános képletű vegyületet úgy állíthatjuk elő, hogy a V áltslános képletű vegyületet HSCHI 2| COr 2( ΙΊ-vaI reagáltatjuk magas hőmérsékleten.

A V általános képletű vegyületet úgy állíthatjuk, elő, hogy egy CH( 2( ~CH~C.H( 2 ( -OR általános képtető alütéter vagy aililészíer vagy a 2-btrtén-‘,3-diol diéier vagy diészíer (általános képlete ROCHf 2 r-CH~CB~ CB( 21 OR, amelyben R jelentése védőcsoport, azaz például alkil-, sziki-· vagy acilcsop©r0 ozonollzisnek vetjük alá.

Ami a g) ü) eljárását illeti, -az 5-tioor szubsztltueusí a szakterületen jártas szakember -számára ismert módszerekkel juííaíhaijnk be a molekulába [M.J. Rofeins et ah, in Ktecleíc Acids Chemistry, Part 2, L.B. Townseaá and R..&. Tlpson, editora, 3. Wiley und Sons, New York, S95-9ÜÖ (19/8), valamint az ebben idézett források}, A lluorozó ágens lehet például ttimetil-hipofíuorit fioor-triklór-metánban.

Ami a g> Ili) eljárást Illeti, a Hí általános képletű vegyület kezelhető 1,2,4-fcréazoHal, 4-kíórfetűl-diklőrfeszfáttaí együtt, így hozva léire a. megfelelő 4-( l,2,4-triazei 11) vegyületet, amelyet azután a kívánt 4-amino (citldín) vegyületté alakítsak például metanollal reagáltatva.

A II és III általános képletű vegyületek kiindulási anyagait például úgy állíthatjuk elő, hogy egy megfelelő (adott esetben védett) bázist egy 1 általános képíetö· vegyűíettel reagáltatunk azzal analóg módon, amit a g) i) eljárásban leírtunk. Áz S-tiuor-uracil és az 5-tluor-eitozin kereskedelmi forgalomban levő vegyszer (Álddeh Chemical Co., Milwaukee, W1 532.33, USA).

A (é)-enantfonKfek reaolváiását az alábbi, III. szekcióban adjuk meg részletesen.

Az FTC gyógyászatilag elfogadható észterré alakítható egy megfelelő észíerezŐ ágenssel, például egy savba!ogenidáel vagy anhldnddel. Az FTC vagy gyógyászatilag elfogadható származéka annak gyógyászatilag «♦ eltbgadhste sójává alakítható szokványos módon, például egy alkalmas 'bázissal való kezeléssel. Az FTC észtere vagy sója FFC-vé alakítható, például hidrolízissel.

Az alábbítíkban ismertetett vímsetienes hatású vegyük* a 2-bkkox!mtlk5<5-.ffuor<ttoz»«A-.iíM-,3~ oxatíölán (lásd 1. ábra) racém formában, illetve izolált enaníionter formájában.

A hatóanyagot bármely olyan származék formájában feesdhaljuk, amely a betegnek való beadás során közvetve vagy közvetlenül a kiindulást FTC vegyöletet szolgáltatja, illetve önmagának is van aktivitása. A nemkorlátozó példák közé számítottak a gyógyászatilag elfogadható: sók (másképpen elnevezve {‘'fiziológiailag elfogadható sók), valamint az aktív anyag: 5’ és 4Í acifezett vagy’ alkilezett származékai (ezeket másképpen fiziológiailag vagy íarmakológísríag elfogadható származékok“-nak «evezzük). Az egyik tnegvalőshási mód szerint az aeilesoport egy karbonsav-észter, amelyben az észtercsoport nem-karboníl részét egyenes, elágazó vagy ciklikus alkil-, alkoxí-slkil csoportok közöl választjuk, beleértve a tneteximetíl-, aralkll csoportokat, beleértve a benziícsoportot, ariloxialkil csoportokat, beleértve a. fenoxtínsííl csoportos, az arilcsoportohnt, beleértve a fenilcsoportot, amelyet adott esetben hal «gémű ómmal, 1-4 szénstomszámö alkílcsoporttal vagy 1-4 szénatomszámú slkoxicsoporiíal, szol fonál-észterrel, azaz például alkll vagy aralkíi-sznifontl csoporttal, beleértve a metánszulfoníi csoportos, a mono-, át- vagy triíoszfát-észlerrei, a triói- vagy ntonomeíoxí-íritil-csoporttal, helyettesített benzilesopoídtal, tríaikilsziltl (például dínretíl-t-hutdszílsí) vagy dímerilszilíl csoporttal lehet helyettesíteni. As észterekben levő arilesoportok adott esetben egy ienílesoportoí tartalmaznak. Az aikilesoport lehet egyenes, elágazó vagy ciklikus széniáneü, optimális esetben egy C:{ 1 j -C{ ISy csoport,

A gyógyászatilag elfogadható FTC származékok közé tartozó specifikus példák, anélkül, begy ezekre korlátoznánk magunkat, a VI általános képiéit! vegyület, amelyben Riir és Rr 2:F egymástól függetlenül lehet alkil- illetve aeilesoport, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a metil-, etil:-, propíl-, borii-, pentil, bexil-, izopropü-, izofentil-, szek-hutil-, t-buíd-, ízopenrií-, ami!-, t-pentíl-, 4-merii-buriril-, hülrogérí-szukcmáj-, 3kiór-benzoáí-, eikloperttíl-, ciklohexíl-, bensőt!-, acetil-, pivaloií-, mezilát-, prcpiortil-, boririí-, valeríl-, kaproll-, kapríi-, kapni-, laurife, rtrirtszrii-, palmitil-, sztearii- és olajssv csoportok, az aminosavak, beleértve, de nem korlátozva magunkat az alaníl-, valinií-, Iencinii-, izoleucíníl-, prolmti-, fonílaíanil-, íriptof'anü-, meiioníi-, giieil-, szerű-, treontl-, ciszteisíl-, tírozíi-, aszparagil-, glUamíl-, sszpartil-, giutamí!-, tizíl-, argóul- és hisztidd csoportokra, amelyekben R Γ I r és R l· 2 f közül az egyik lehet hidrogénatom.

Az FíC-t és származékait gyógyászatilag elfogadható sók formájában állíthatjuk eió. A továbbiakban a gyógyászatilag elfogadható sók vagy komplexek szakkifejezés az FTC olyan sóira illetve komplexeire vonatkozik, amelyek megtartják a kiindulást vegyidet kívánt biológiai aktivitását, és minimális nemkívánatos mellékhatást mulatnak, ha mutatnak egyáltalán. Az ilyen sók lehetitek, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az (a) szervetlen savakkal képzett savaddíciös sók (például sósavval, hidrogén-bromíddal, kénsavval, foszforsawal. salétromsavval és bssonlókkai), valamint a szerves savakkal képzett savaddicíós sók, például ecetsavval, oxátsawal, borkő-savval, borostyánkósíivval, almasavval, aszkorbissavval, bmzoesavvaí, csersavval, pamoénsawal, asgínsavval, pölighüamlnsavval, noéMsztiSfonsavva!, nafol-diszulfonsavvaí és polig&lakturonsavval képezett sók; (b) a pelivalerts íemknriortökkal képzelt bázts-addíciós sók, például cinkkel, Kalciummal, hizmuhal, báriummal, magnéziummal, alumíniummal, rézzel, kobalttal, nikkellel, kadmiummaí, nátriummal, káliummal és hasonlókkal, vagy az N,N,dibt^nUkíiísn-dsíjminbaí, ammótunm ionból vagy eiíléntiiamiríbói képződő szerves kationnak il tetve (c) az (a) és (b) kotrtfomádójával, például egy cink-cssrsavss só, vagy tamilt.

Az aktiv hatóanyag módosítása, specifikusan az Ni 4f és 5M3 pozíciókban , érintheti az: aktív molekulák biológiai felhasználhatóságát és tnetebolízmnsának sebességét, és ez által az aktív molekula felszabadulásának szabályozási lehetőségéi biztosítja. A módosítások emelteit érinthetik a vegyület vírusellenes hatását, néhány esetben növelve a kiindulási vegyület aktivitását Ezt könnyen megbecsülhetjük, ha elkészítjük a származékot, és·' vizsgáljuk a viruseilenes aktivitását az alábbiakban, ismertetett ötödszer szerint, illetve egyéb, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel.

Az FTC racém elegyet előállíthatjuk, az 1991. augusztus S-áu publikált, az Bntory University által benyújtott WO 91/Hí §6 számú PCT internatíonái Pnblieatlon-ban közölt leírás szerint, illetve az 1. példában közöli módszer alkalmazásával. A módszer általában abból áll, hogy egy allíletert vagy aiiÜésztert, általános képlete CHF 2I -CHCffF 2F-OS, vagy az ROCííF 21'-CH=-CH-CH F 2F OR általános képletű 2-böíén-L3-dfoi dióiétól vagy diészterét ozonízáljuk, amely általános képletben R jelentése védőcsoport, például alku-, szüli- vagy aciksoport, így hozunk létre egy OHC-CHÁ2 F -OR általános képletű glíkelaldefeideS; a gllkoíaldshídhez tíoglikolsavat adunk, így hozzuk a létre a 2-(R-<5X.i}-met.íl-5-oxo~l,T-oxiStioián általános képletű vegyületet; a lakion! különböző vegyietekké redukálj uk,ameiyek egy lehasadó csoportot tartalmaznak az oxaliolán gyűrű 5-ös pozíciójában; ezeket a vegyületeket szililezeit S-íluor-eitozinnal kapcsolva SáCMF jelenlétében kapjuk az FTC S-ízomerjét; ezután adott esetben eltávolítjuk a vétlőcsoportokat.

t Példa

A f^-8-»,L-2-hldrtsx!metiÍ-S-(5-«tsor-<;ítozín~ 1-0}- i,3-osaísolás előállása

Az: FTC racém előállítására szolgáló eljárást a 2, ábrán mutatjuk be, és részletesen ismertetjük az alábbiakban.

AzAaíébiJ-diolmggy&lgsg

Egy száraz, kétliteres: hárönmyakú lombikban semleges atmoszférában 10ö gramm (93,5 ml - 1,135 mól ~ Í,ŐÖ ekv) 2-butén-l,4-dloh. és 15 gramm (körülbelül 0,1 ekv.} Í>MAP-ot (4-dímetilaminopíridín} oldunk SÖO ml száraz piridisben, majd tX'C-ra hűtés közben kevertetjük. Ez: után lassan (hogy elkerüljük a túlmelegedési) 2őÖ ml (2,2 efev.) butÍril-kloridot adunk hozzá, és egy óra hosszat kevertetjük. A reakciót kísmennyiség.ü víz hoz2á adásával állítjuk le, A folyadékot ílefomtáíjiík a sóról, majd csökkentett nyomáson bepárelítik. A visszamaradt sót vízben oldjuk, és a vizes oldatot kétszer extraháljuk eíiléterröl:. A kombinált egyéb rétegeket egyszer mossuk telített CuSO F 4 r -gyei, kétszer mossak Norit-oí tartalmazó NaHCöF 3 F -mai, maid vákuumban ceiiidugőn szűrjük át.

A töményített reakcióéi egyst éterben oldjuk, majd mossuk, ugyanazzal az eljárással, mint amit az. előzőkben a sóoldatnál alkalmaztunk, Az egyesített szerves· fázisokat rotációs hepárlóval betöményítjük, majd vákuumba tesszük. Ez a reakció tipikusan közel kvantitatív, A méret szükség esetén könnyen növelhető. A termék, az 1,4dibutirí 1-2-butén-l ,4-dfol színtelen vagy gyengén sárga, tiszta folyadék.

AyédgrtáioLozonolízise

1,365 mel 3,A-díhutirii-2-böiés5~i,4-dioli oldunk 4 Iker száraz díklórmesánban, egy száraz, ötliteres háromnyakö lombikban, amelyet egy széles; szánté csövei, valamin! egy nyitott csövei szereltünk fel a gáz bevezetéséhez. A eső optimális esetben nem egy zsugorított, gázbuboréköltató cső, amely a tömény oldattal érintkezve elzárédlk. Az oldatot kevertetjük, majd ~?3'^:'ü~ra hütiük, miközben semleges gázt. buborékohatunk át az oldaton. A gázbevezetést lezárjuk, mihelyt, az oldat megfelelő mértékben lehűlt, tnajá a lombikot és a keverő berendezést az ózongenerátorhoz visszük. Az oldaton oxigént buborékohatunk át legalább 20 percig, miközben jégfürdőben tartjuk. Egy Cryocool ideális ahhoz, hogy ennek a hosszá reakciónak az alacsony hőmérsékletét fenntartsuk. Az ózont ezután 55-59 kPa nyomáson vezetjük be. A reakció teljes lejátszódása után az ózon áramlását leálllíjuk, maid oxigént buborékoltatunk át az oldafon körülbelül fél óra hosszat, mielőtt három ekvivalens Me-i 2| S-t adnánk hozzá; A lombikot eltávolítjuk a hdtőfSrdőfoől, majd egy clszsvőfülkébe tesszük, ahol körülbelül két rtapig kevertetjük, hogy a reakció teljesen lejátszódjon. Az oldatot betároljuk és néhány órára csökkentet? nyomásra tesszük,

Ea a reakció általában 95%-os kitermeléssel adja a védett aldehidet (.2-butiriloxi-aceíaldeiutl),. egy színtelenvilágossárga, tiszte folyadékot.

Az aldehidet (1,8 ekv,} toluolban okijuk, igy kapunk egy -0,80-0,85 mol.i-es oldatos egy Dean Stark csapdával felszerelt lombikban, 1,1 ekv. íiogllkoisavst adunk hozzá, majd az elegyet refluxáltatjuk. A vizes azeotróp formában a csapdán keresztül távolitjuk el, A reakció három óra stett lejáts'zöáik, majd hagyjuk ssobahőmérséklstre hűlni. A szerves oldatot kétszer mossuk azonos térfogatú NaHGÖ j 3f ohlastal, majd egyszer vízzel, MgSO {· 4 r -en és Norít-on száriíjuk, majd. celiten vákuomsztőrjük, mielőtt csökkentett nyomáson bepárolnánk. Az első NaHCO r 3 j mosöfólyadá kot. éterrel vissza-extraháljuk: az: étert egyszer mossuk vízzel, MgSOf 4l· -en és Nork-ön szárítjuk, majd «eliten vákuumszörjük, és a másik, a toiuolos oldatból származó anyaggal együtt bepótoljuk. Az egyesített anyagot éjszakán át csökkentett nyomáson tartjuk.

A reakció általában 90%-os kitermeléssel eredményezi a 2Abu?irjloxi)-metil-S-oxo-l ,3-oxasiöiání.

1,8 ekvivalens 2-buhí'iloxi-metíl-5-oxo~ 1 A-oxatíolánt oldunk száraz. THF-ben,, igy kapunk egy 0,23 mol/3-es oldatot egy száraz, háronmyskú lombikban, amelyet mechanikai keverővel látunk el, és semleges atmoszférában tartjuk. Az oldatot kevertetjük és OAAra bútjük, mielőtt 1,1 ekvivalens, THF-ben oldott, 3,0 mol/l koncentrációjú Li(í-BuO)f 3r AlH-t adunk hozzá egy 'ksíiöIöu keresztül. A redukció körülbelül 3 óta .alatt teljesen lejátszódik, ez? vékonyréteg kromatográfsával lehet keverni 2.T arányú éter/bexáa oldószer-rendszert és ámzsaidehid festéket használva.

Ezután körülbelül 10 ekvivalens frissen desztillált Acj· 2 i Ö-ϊ adunk hozzá, és 2 napig hagyjuk kevertetot, az acetilexett termék előállítása céljából. A reakciót telített hisHCOiol· hozzáadásával álirtjuk le, éjszakán át kevcrteíve. Az oldatot hepároljuk, és még további NaKCOí 3 f hozzáadásával kevertetjük éjszakán át. Ezt extraháljuk éterrel, amit .azután (óvatosan j kétszer mosunk telített NaHCOf 3 h -mai és egyszer vízzel, hlgSöJ 4f en és 'Norit-on szárítjuk, celiten· vákunmszöíjük, majd bepároljuk. A termék sötéísárga, tiszta folyadék.

öázkrmatcgtáfiás vizsgálat szerint (kezd. hőm.: T-~SÖ€; idö~5 perc; prog. seb..: ({H/perc; végső hönt.: 24Ö*C) általában körülbelül 7C%-os tisztaságú anyagot kapónk..

A.Gfo<lfcgj.Aassailgzése ő-fluor-eitozint 0,85 ekvivalens, az. előző lépésben kapott acetdezeít laktól mennyisége alapján, a tisztaságot GC-vel jelezve) refíuxálíaíással szililezönk legalább 16 ekvivalens hexametil-diszíhízánnal, amely katalitikus mennyiségű tiszta ammóninnt-szuifátot (0,05-0.lö ekv.) tartalmaz·, két óra hosszat, az: titán, hogy az oldat kitisztult A lombikokat azután szorosan lezárjuk, majd az oldószer csökkentett nyomáson eiíávohsjuk. vákuumszivattyú és csapda alkalmazásával. A terméket, egy' fehér szilárd anyagot csökkentett nyomáson hagyjuk éjszakán át, ameddig fel nem használható az alábbi kapcsolási reakcióban.

Λ szi H5 kpzi π ti

33,86 g (0,124 mól) szíliSezeü 5-íiuor-eiíozin 359 ml száraz diklórttretártban készült oldatához. 135,6 mi SoCLHf oldatot adunk (I mohi oldat diklőmjeíánban) fatmgésu atmoszférában. Az oldatot 15 percig szobaltőmérsékleten kevertetjük. Ezt sz oldatot egy ksnídön keresztül 38 g iaktol-acetát (0,113 mól) 490 ml dtklórmeíánban készült oldatához adjuk nitrogén atmoszférában, '39 perc alatt.

A reakciőelegyet 2 óra hosszat kevertetjük, ekkor a reakció lejátszódásának mértékét vékonyréteg krom.atográSával ellenőrizzük, A reakcíóelegyet SOO ml diklőrtaetánnul hígítjuk, és ammőníum-hldroxid oldat hozzáadásával állítjuk ie. A IÖÖ ml ammóníuro-hídroxid oldatot lassan adjuk hozzá, a reakcióelegy hőmérsékletét 39°C alatt taxijuk, igy' kapunk egy fehér csapadékot.

A keveréket további 38 percig kevertetjük, ssajd sziiikagél oszlopon engedjük át (18 e. áímérőjü, 12,5 cm magas). Ezután egymás után a kővetkezőkkel eluáijnk: 2 liter dlklórmetám, 2 liter etilaeetát, és 4 liter oislacetát.etanol (9:1) eleggyeí. Az ctilacetár és az etilacetúi'eísnol eluensek tartalmazzák a kívártl terméket. Ezeket az oldatokat egyesítjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. A megmaradó ragadós fehér anyagot 208 ml száraz éterrel mossuk, így kapunk egy fehér szilárd anyagot (23,35 g; 71%), ez az FfC-S-batlrát,

8,74 g {0,926 mól) FTC-b’-buiit'átoí tikiunk 250 ml etsrtuihaa, 2,85' g (8,052 tnol) nátrium-metoxidot adunk hozzá szobahőmérsékleten. A reakciőelegyet 1 óra hosszat kevertetjük, ekkor a reakció lejátszódásának, mértékét vékonyréteg liromatográfíávul ellenőrizzük. 18 ml NHMfCl oklatot adunk a reakció elegyhez a reakció leállitá-sára, majd az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, A jnarsáékot 5 g szilikagélre abszorbeáljuk, majd egy kis oszlopon engedjük át, etllaceíái: etanol (9:1) elegyet használva eluensként. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd szárazra pároljuk, így kapunk egy ragadós szilárd anyagot, amit száraz éterrel mosva kapjuk a szilárd fehér ETC-t (6,88g,.88%), [í lí H NMR; (DMSO-dt 6-t )8,18 (ÍR, d, Hj 6( , 5=-8,4 Hz),.7,81 & 7,57 {'2H, szeles, NHÍ 2r ),6,12 (IH, dd, Hri l·, >5,7 & 4,2 Hz), 5,48 (1 H,t, ÖF,>5,7 Hz), 5,1? (IH, ί, 1Η( 4> >3-ö Hz), 3,74 (2H, m, MSI), 3,41 (1H, dd. 1102(-, >5,7 & 11,7 Hz), .3,11 (IH, dd, 1Η(-2(, >4,2 & 13,7 Hz); •I í 131 C NMRj : (DMSO-d í őt..) 157,85 (d, >13,4 Hz), 153,28, 136,12 (d, >241 Hz), 126,01 (d, >32,6 Hz), 86,90, 86,84,62,48, 37,97], olvadáspont 195-WC.

íjl^Ann_;yepzl^agtíomgr^..n;zidyáhísa

Az alábbiakba» megadnrtk egy eljárást, amellyel a nukleozid enat-tsomerek racém elegyei· rezolváini lehel, beleértve, de nem korlátozva magunkat az FTC (4) és {-}· eaaailexBsrett. A módszar használható még szénhidrátok ***♦ «ΦΦ» Φ« ♦ * * „ * * «.«« * Φ * φ *'* Φ «φ vagy szénhidrát-szerű egységek rezoíváiására, száz. például az SJ-oxatiólán és az 1 ,3-dtoxolán származékok rezol válására. A módszer sorato egy olyan enzimet aikateazank, amely a racém elegyben levő egyi k ensntiomenfe! vaíő- reakciói jobban katalizálja. Áz elreagóíi enantiomert a raagáiatlan enantiomeríől a fizikai szerkezetben beállt áj különbség alapján lehet elválasztani. Az alábbiakba?! közóit leírás lapján, a szakterülete?! jártas szakember képes olyan -enzimet választani, amely a-választott nukleozid eMtem szelektív {illetve a nem választott -enasxtíomerreszelektív, azaz annak egy eliminálás! módszere), oly módon hogy az alábbiakban tárgyalt enzimek közül választ egyet, illetve más ismert enzimek szisztematikus kiértékelésével. Ennék a leírásnak az alapján, a szakterületen jártas szakember azt is tudja, hogy miképpen keli a s?mbsztrátot a kívánt rezolválás elérése céljából. Királis NMR eltolási reagensek, polarimetria vagy királis HPLC alkalmazásával a kinyert észter optikai désulása meghatározható.

Az alábbi példák tovább illusztrálják az esizimek enantiomerek rácéra elegyesnek razoiválására való alkalmazását. Más ismert, racém elegyek rezolválására használt módszerek Is alkalmazhatók az alábbiakban ismertetett rezolválast módszerek kombinálásával. Az összes ilyen módosítást a találmány oltalmi körébe tartozónak tekintjük.

Λ CS’-nsíkleozid-észfezek hsdrolíziséK alapuló rezolválás

Az egyik megvalósítási raéd szerint a módszer abban áll, hogy nukleozid raeerrsáíok egy keverékének CS’hidrojól csoportját egy acil-vegyölettei reagáltatjuk, így hozunk létre C5'-észtereket, amelyekben a mtkleozíd az észter ‘'karbisíol” végén található. A nukieozsd CS’-észterek rácára elegyét azután egy olyan enzimmel kezeljük, amely kiemelten hasítja vagy bidrolizália az egyik enantiomert,. míg a másikat nem, egy adott időszakban.

Ennek a módszernek előnye, hogy használható számos kálőnböző rmkleozid rezolválására, beleértve a parin és plrmüdín rarkleozídókat, amelyek adott esetben a széstóldrái vagy bázis részen helyettesítve vannak. A módszer használható olyan nukleozld származékok rezolválására, amelyek további heíero&tomok&t tartalmaznak a szénhidrát részben, ilyen példáid az FTC és a BCIÍ-JS9. Ennek a módszernek a széleskörű alkalmazhatósága abból a tényből származik, hegy jóllehet az észter karóinál része szerepet játszik egy enzim azon képességében, hogy ísveizkisíöobözteti az enanísomerekst, ezeknek aa enzimeknek a to felismerési helye az észter karbonsav részében van. Emellett lehetséges egy enzim/szubszttát vizsgálat eredményeinek sikeres extrapolálása egy másik, látszólag eltérő rendszerre, azzal a feltétellel, hogy a két .szubsztrát ugyanaz, vagy lényegében hasonló.

Ennek a módszernek egy másik előnye, hogy regsoszslektív. Azok az enzimek, amelyek észtereket hidrolizálnsk, általában nem 'katalizálnak más, a molekula más részén lejátszódó reakciókat. Például a 'lipáz· enzim katalizáló a ^-hídroxímeííí-S-oxo-U-oxatiolán hidrolíziséi, anélkül, hogy a belső lakion! hídrölizáiná. Ez erős ellentétben áll az észter hidrolízis kémiai megközelítésével.

Ennek a módszernek további előnye, hogy a bidrohzálatían enantiotoer és a hídról szák enantirsraer elválasztása & makcióelegyből meglehetősen egyszerű. A hidraíizálntlan ensntiorasr sokkal bpolvlebb mmt a hídról szák enantioraer, és hatékonyan kinyerhető egy egyszerű extrakeíével, apoláros szerves oldószeírei vagy oldószer keverékkel, beleértve a hexánt és a hexameter elegyet, A kevésbé lípofsí, polúrosabb hiárolizáli essantioraer egy polárosafeh oldószerrel végzett ex-rakeiőval nyerhető ki,. például edíaoetáhal, vagy líotilezéssel, majd eninoins vagy metanolé;; exirakcióval, A hidrolízis során ei keli kerülni az. alkoholt, mivel bizonyos körülmények közölt denaturálhatja az enzimeket.

•'«fc fcfcfc fc fcfc ·* * « ♦ fc fcfcfc fc « * fc fc* * «fc fcfc

Eíszísnek és szufosztrátök

Az. enzim és a szabszirát helyes illesztésével beálhthsitjuk a körül idényeket bármelyik nukl'eozld erwtiotnsr izolálására. A keresse» enartíiomert izoiáibaijtsR úgy, hogy a raeétn. elegyet egy ©lyao enzimmel kezeljük, amely a keresett enaxstiomert hidrolizálja (majd szt követőére a poláros- hídrolizátómot egy poláros oldószerrel extraháljuk), illetve egy olyan enzimmel kezeljük, amely a nemkívánatos ereandomen hidrolizálja (majd a nemkívánatos enantíomert egy spoláros oldószerrel eltávolítjuk).

Azok közé az enzimek közé, amelyek az észtereket hidrolizálj&k, tartoznak az észterázok, például a sertésnssj észteráz, a lipázok, beleértve a sertés paukreász lipázt, valamint asr Amm PS-S90 lipází, a szobtllizínt és az. A-kimothpszIní,

A 3. ábrán egy folyamatábra látható, amely az slkalikus fessd-áíáznak és a kígyóméreg foszíodsészteráxmtk áss FTC {-;} ás (-) essstiontereivel szembeni speelíkását mutatja, Amint az látiraié, az alkalikus foszfasáz az FTC snindké; enmüíotrteriének .a trifoszrátját mdrolízálja, ennél ingva gém hatékony elválasztási eszköz. .A tossríheiészreráz 1 jobban hidrolizálja az FTC {+) enanfiometjál a monoészíerré, amit azután az 5‘«attkiéoddáz hatásának kitéve eló lehet állítani a{T)-FrC-t

A nukleozsd CS^pozíciájáaak észterezésére legfeatékonyahban használható acrlcsoportot meg lehet határozni, anélkül hogy tál sok kísérletet kellene végezni, a kiválasztott enzimrendszer számos, homológjának értéke lésével. Például, ba az 3,'3-<?x&ltolán ntódeozidokat v&jsavvál észterezzük,, akkor a rezfriválást mind a sertésmáj ésssíerjizz.al mind az Aretano PS-Eöö-zal nagy enantíossrelekf ivitásssl, de ellentétes szelektivitással végezhetjük. A sertésmáj észteráz jobban iridrodzálja az FTC (+') enantsönrerjét, az Amaáo PS-SSÜ jobban hidrolizálja az FTC (-) enantion-iesjét. Az enanttómereh elválasztásának sikerét százalékbari kifejezve az '1. táblázatban láthatjuk, és a százalékútok azt fejezi ki, hogy mennyi tisztított feudrát-észter marad -az enzimmel kezelt keverékben {azaz a ()· FTC butirátésztere a PLE esetében és a (+ í-FTC butírStósztere az Amano PS~§ÖÖ esetében),

Azokra az alcsoportokra, amelyeket megfmtolhatönk sgy adott nokleozid enantíomer keverékében való alkalmazás szempontjából egy adott enzimnél, az alábbi példákat adhatjuk meg, anélkül, hogy ezekre kori átóznánk magunkat karbonsavak és helyettes! tett alkíl-ksrbonsavak, beleértve az ecetsavat, propioresavat, vajsavat és pentíknsavat. Bizonyos enzimeknél előnyős lehet olyas aell-vegyület alkalmazása, amely jelentős elektronszivó hatással rendelkezik, hegy az észierkótés gyengítése révén eiősegiísíík a hidrolízist. Az elektronszivó acilcsoporíok közé tartoznak például az. A-haloészterek, például a 2-klór-propionsav, 2-klér-vujsav és a .2-klór-jxaatáresav; Az Ahaló-észterek kiváló ssnbsztrátjal a Sípszóknak,

Rezoíválásl körülmények

Az enzimatikus hidrolíziseket általában az enzim katalitikus mennyiségével végezzük vizes puflerhen, amelynek pH-ja közel van a kérdéses enzim pH-optítnnmához. Ahogy a reakció előrehalad, a pH lecsökken a felszabadok karbonsav hatására. Vizes bázisokat kell a reakcioelegybea adui, hogy a pH értékét az enzim pH optknsimához közel tartsuk. A reakció előrehaladását könnyen követre! lehet a pH változás figyelésével, illetve n pH foiKrto.rlásafeoz szükséges hozzáadott bázis mennyiségével. A hidrofófe észter (a hidroiizálatian enantíonter) és a sokkal poiárosabb alkohol (a hidrolizák erearetiomsr) egymás után szelektíven exiraháíható az oldatból, a szerves χ

*:*·« ♦ * * * * X φ «9 * oldószerek gondos- megválasztásával. Egy másik módszer szerint a rezei válandó anyagot egy oszíopon lehet kibocsátani, amely az enzimet egy hordozóhoz rögzítve tartalmazza,

A heterogén körül mények között végzett enzimatikas hidrolízisek problémája az, hogy nehezen reprodukálhatok. Ennél fogva az az előnyős, ha a hidrolízist homológ körülmények között hajtjuk végre. Az alkohol típusú oldószerek nem előnyösek,, mert denaturálhatják az enzimeket, A homogenitást nem-ionos felületaktív anyagok, például Triton X-108 alkalmazásával érhetjük eh Azonban ezeknek a felületaktív anyagoknak a hozzáadása nemcsak segíti a kiindulási anyag feloldását, hanem javítja & termék vízben való oldhatóságát is. Ennél fogva, jóllehet az enzimes reakció hatékonyabb, ha nem-ionos felületaktív anyagot adunk a reakcsöeíegyhez, mint hegy ha heteroiög körülmények között dolgozunk, ezzel mind a visszanyert kiindulást anyag, mind a -terűtek izolálását megnehezítheti ük. .A termék megfelelő kromatográfiás és kémiai (például szelektív sóképzés) technikákkal izolálható, A dtacíiezeie stukieozídokat használhatjuk, de gyakran meglepően bpoíilek, és nehéz a használt közegben felokfetn őket.

2. Példa

Az FTC-észterek enaatíoszefektiv hpázzal katalizált hidrolízise

Az FTC számos S’-O-aci; származékát -a (fehFTC N-bidrokloríd só szelektív O-acs lezésével áiliijuk elő (lásd 1. táblázat és 4. ábra). .A származékok lipázok általi hidrolízisének hatékonyságai: vizsgáljuk. Amint az az 1. táblázatban látható, a sertésmái észíeráz (ELE) nagyon magas szelektivitást mutat az FTC (-fj-enanísűmerjévei szemben, a (-)-FTC buiirátját lényegében túlnyomó részben a HPLC-vel analizált keverékben, hagyva, A hidralrzis sebességéről is azt találtok, hogy asz aciicsoport természetétől fögg; az aoeíilszármazék hidrolízise lényegesen lassúbb, mint a btiííril szteazéké. Kiderült, hogy az FTC propíonsav észterének hidrolízise még gyorsabb, mint amit a. butid! szármáiknál megfigyelhetünk. A kinyerés százalékát és az enantíomer felesleg százalékát HPLC alkalmazásával határozzuk meg. Jóllehet az enaniioszelektivítús kiváló, ha PLE-t használunk (tipikusan 978«, vagy magasabb), a további dúsítási szekvenciális enzimatikus hidrolízis reakciókkal lehet elérni, amelyekben a PLE-val katalizált hidrolízisből származó enantíoszefektíven dúsított feutirátot PS-SPÖ-as enzhnatskus hidrolízisnek vetjük alá.

1. táblázat

Szubsztrát	%-os kinyerés	% £,E.
FTC észterek FLE-vel
		{-rd'-TC (buiirát)
acetát	32, ÓS	íkíí.
propio.aát	39,87	n.a.
batirát	48,0(1	98
hátirat	45,71	98,6

lő

FTC észterek PS-SOÖ-zstl
		(-t-)-FTC (butirát)
aeetát.	73,17	o,
propionát	52,67	»,£!.
bodrát	58,34	n,a.
valerát	41,58	94

3. Példa

Eljárás (+}~ és (->FFC eíöáilííásártt a»: FÍC-határM etssnílöszelektív,, lipázzsl katalizált hidrolízise révén

A (é)-FTC 5’0-butirátjáből 149 mg-ot (8,47 sead) oldunk 56 tnl oldatban, amelynek összetétele'. 4:1 arányú pH~8 puíforacstöökril, A tiszu oldatot kevertetjük, majd: 26 mg sertésmáj észterázzal (PLE-A) kezeljük (4. ábra), A reakció előrehaladását HPLC-vel követjük (4. ábra). 28 óra elteltével (5235-os konverzió a reakcióelegyet 2x80' ml kloroformmal és 98 rnl etiíaeetáttsl extraháíjuk. A szerves fázisú exírtikturnokat egyesítjük, vízmentes magttézíum-szolfáton szárítják, szűrjük, nnijd rotációs bepárlőn betöményítjűk. A kapott maradékot 2xlt)80m pTLC lemezekre higstíuk etílaoetát mint ebiálószer alkalmazásával (kettős elnáló}, így kapunk izolálás «tás 53 mg (a kiindulási anyag 36%-a) P'FC-buíirátöt, amelyről HPLC elemzéssel megállapítható, hogy 98%-os tisztaságú enantiomer, A enanliomer szempontból feldúsított butirátot azután 1,6 ml etanollal kezeljük,ma jó 28 mg (9,38 mmol) nátrium-metoxidöt adunk hozzá. A kapott eiegyet szohahősnérsékíeten kevertetjük, é-s a reakció előrehaladtét HPLC-vel követjük, A. reakció 39 perc alatt teljese» lejátszódik. Az oldószert rotációs bepárlövaí eltávolítjuk, így kapunk 76 mg nyers teher szilárd anyagot, amelyet 198öm pTLC-vel eluálunk, etll&cetáfcetanol 5:1 arányó elegyét használva eluensként a (-i-PTC-t szilárd fehér anyagként izoláljuk (33 rag; §2%-os kitermelés). Az FTC HPLC elemzése azt mutatja, hogy az FTC S -Ö-aeeíáí származéka formájában 97%-os tisztaságú fAj(! 28 f , r Dl· } -129.5° {c-· 0,8S; abss, etanoi).

A feldolgozási lépésekben elkerülhető emulziók képződése, ha kloroformot adunk a reakclóelegyhez a reakció teljes lejátszódása után (amely egyúttal denaturálja az enzimet), az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítják, majd kloroformmal extraháljuk.

Hasonlóképpen, 1,2 mmol (375 mg) (*)-FTC S’-O-htstirátot okiunk 48 ml 4H arányú pH~8 puffer, aceti>?:itrii elegyben, A tiszta oldatot kevertetjük, majd 58 mg sertésmáj észterázzal (PLE-A) kezeljük. A reakció előrehaladását HPLC-vel követjük. 9Θ perc elteltével (38%-os konverziói a reakeieelegyhez 158 ml kloroformot adunk. A rétegeket elválasztjuk, majd a vizes rétegei lloől száljuk, az oldószer eltávolítása céljából. A liofslezés után megmaradó fehér maradékot 3x1 Ö mi abszolút eismolkd extraháljsjk. Az extraktumokat megszűrjük, egyesítjük, majd csökkentett nyomáson tömény-kjük, így kapunk 179 mg nyom olajat. A nyersanyagot egy 45x30 mm-es szilikagél oszlopot} eluáljuk 3x74 mi etilaeeíátot, majd 5:1 arányú etiiae.stát-etaríol eiegyet haszstálva. a (+)-FTC-t fehér szilárd anyag tonnájába?! izoláljak (199 mg; 3739, a kiindulási butirát alapján). A (tj-ETC HPLC elemzése azt mutatja, hogy az 5O-acetál származék 97,4%-os tisztaságú; [AjOít 29t, F Dl·} Ή 13,4* (e-7,53, abszolút etanoi).

Egv hasonló reakciót végzünk Ó,32 sasd (37 mg) FTC 5'O-baíiráöal és 7 mg FS-Söíi-zal 4,0 mi 4;{ arányú pH»“8 pafísr-aceieníirií «jegyben, A reakció lényegesen lassúbb, mint a PLE-A-val, és 59%-os konverzió eléréséhez órára van szükség, A kinyert hutirás. (11,4 mg; 31% a kiindulási mennyiségre számítva) 94%-osisak bizonyuk

HEt-C-veL

Egy másik megvalósítási mód szerint oitídís-dezoxieiftdín dezammázt használunk a 2-hídsO>dmeíib5-(5citox iu-l-lij-l,3-oxtrtíoláís és szárjrtazékat, beleértve a 2-hidroximoíti-5'(5-fluor-<:itozín-I-}l)-l,3-oxalioláu raeém elegyek rezolválásárs. Az enzim a citozin egység uraetllá való dezmmoálását katalizálja. Kiderült, hogy az 1,3oxaüoíán rtukleezidok egyik enanílomstje «gy előnyben részesített szubsztráija a citidlrí-dezoxicitiáin dezamináznak.. Azt az enítntiomert, amely nem konversáhklfk «mdl származékká, (és ennél fogva még bázikus) savas oidaltal extraháljuk az oldatból. Bhénsitaót keli, hogy elkerüljük az. erősen savas oldatok alkalmazásét (pH 3,0 alatt), amely elhasíffeaíja az oxatiolán gyűrűt.

A chidin-dezoxlciíiditr deztunináz patkány vagy emberi májból izolálható, illetve rekombínáns szekvenciáról expmsszálható 'Esdseriehsa eoli-ban.

A esthbo-nnkleozíd enantiomerek rezolválásásak módszere dddlo-ezoxsoitidin dezamíoáz alkalmazásával használható egyedüli rezolválási módszerként, illetve más rezolválási módszerekkel kombinálva is használható, beleértve az á'-O-nokleozid észterek eszirnatikus hidrolíziséi is, az előzőkben leírt módon.

A fentiekbe» ismertetett módszer ntrkisozsci enantiomerek raeém elegyedtek rezolváiására kombinálható más- klasszikus enantiomer rezoivídási módszerekkel, hogy ezzel javítsuk a végtermék optikai tisztaságát

A rezolválás klasszikus módszerei közé tartozik számos különböző fizikai és kémiai technika. Gyakran a legegyszerűbb és leghatékonyabb módszer az áíkrisiályositás, azon az elvi alapon, hogy a raoemátok gyakran jobban oldódnak, mint a megfelelő enantiomerek. Az átknstályosiíásí bármelyik lépésben elvégezhetjük, beleértve a végső enantiomer termék acilezeít származékait is. Ha sikeres, akkor ezt az egyszerű módszert kell választani.

Ha átkristályositássai nem kapunk megfelelő, elfogadható optikai tisztaságú kiindulási anyagot, akkor más módszereket kell kifejleszteni. Ha a nnkloozid bázikus (például a citidin), akkor királis savakat használhatunk, ameiy dlasztereomer keverékeket képeznek, és amelyek lényegesen eltérő oldhatósági tulajdonságokkal rendelkezhetnek. A királis savakra példa, anélkül, hagy ezekre korlátoznánk magunkat: almasav, maodulasav, dibenzoil-feorkősav, 3hröni-S-szaifonsav, lö-kámfor-szulfonsav és· di-p-íoiuotl-borkősav. Hasonlóképpen, a szabad bsdroxil-csoporí actlezése egy királis sav-származékkal eredményezi thaszíereomer elegyek képződését, amelyeknek fizikai tulajdonságai lényegesen eltérhetnek, és ez lehetővé teheti az elválasztásukat.

Az enantlomerikos&n dúsított rnAleoztdokból kis mennyiséget elő lehet állítani, illetve tisztítani lehet olymódon, hogy a raeém elegyet egy olyan HPLC-oszioptm beoságuk át, amelyet királis elválasztásokra terveztek, beleértve a ciklodextrtnes kötésit oszlopokat, ttmelyekef. a felnin Corporation forgalmaz.

·*♦»

4. Példa:

Nakleozldok racém elegyeinefe elválasztása HPLC-vel

A (á-)-FTC C4‘-enant?omerjéinek rezciváiását királis cikhxiexn'irs kötésű (cycfobond AC-l) oszlopon végezzek (kaiaia Corporaiíon, Wofeurn MA). A körülmények sz. alábbiak; .izokratikus 0,5%-os metanol vízben; áramlási sebesség i .nal/perc, UV detektálás 262 nm-en. A HPLC minőségű metánéit a j.T.Bsker-től (Philispsburg, KI) vásároljuk. A racém elegyeset injektáljak, majd frakciókat szedünk. Az egyes en&ntiotnereket. tartalmazö frakciókat egyesítjük., lefagyasztjuk, majd itoFiízáljuk. A vegyületeket UV spektroszkópiával valamint HPLC reieneiós idejükkel jdlemezzük. A {-)-enantiomerek általában kisebb retenclós idővel rendelkeznek, mint a (-+)enairtieraerek [Í.Liquid Cfcrom&tograpfry, j 74 , 353-376 (lü84)j, A vegyületek keocentráeióját UV spektroszkópiával határozzuk meg, Ismert koucentráeiéjö (15 prool/l) vizes íörzsoiáatot használva biológiai kiértékelési módszerekkel. Az elválasztott enaottotnorek retenciós Iáéit a 2, táblázatban. adjuk meg.

2. táblázat AzJGU «tatokra^

Vegyidet	Rí(pere)
(-)-FTC	8.3
(‘j-FTC	8,7

S. PHda

Alternatív módszerek FTC enantiemerek elválasztására egy királis oszlop felhasználásával

Egy Cyclobond-1-Ae oszlop (Spm, 25 cm x 4,6 mm, Rainin Corporatlöís, Wobv.m, MA, katalögos-szám AST-41049) lelbasznáiásával, Izokratikus metanolt (Fisfeer Scieniidc, lse., HPLC ntínőség, katalógus-szám A-452-4 vizben) alkalmazva 0,6 ml/perc áramlási sebesség mellett, UV detektálás 262 nm-eo, sz FTC enantiomerek reteneíős ideje a (-}-FÍ'C esetében 12,68 perc liléivé a s +-)~FTC cselében 13,2 perc.

Egy Chítalpac AS .oszlop (löpm, 25 cm s 4,6 mm, XTJBafcer Inc., PhílEshurg, NJ, katalógus-szám 7406-ÖÖ,. sorözatszáfö 09-29-10320} fcihaszríálásával, izöpropanoit (Fisber Scieutifie, Inc., HPLC minőség, katalógus-szám A451-4) alkalmazna 0,8 ml/perc áramlási sebesség mellett,, UV detektálás 262. nm-en, az F'FC^antiotnerek. retenciós. ideje a (-)-FTC esetében 5,9 perc illetve a (+)~FTC esetében 9,8 perc,

IV. A 2-Fidn?xlm.etil-5-|'5-0asr-ert<ÍZ.ln-l-ii)-U3-püadniáa CFT€^wl hatékonyság»· a HÍV reolikáriójfeafe.g«S»te

Gyakran kívánatos, -hogy nukleozidck .számos racém elegyét átvizsgáljuk előzetes lépésként annak meghatározására, hogy melyiket lehet tovább rczolválni enaaterioíírcírikösau dúsított komponensekké, és a továbbiakban ki lehet értékelni az anfrví'fális aktivitásukat A nökleozlástak azt a képességét, hogy gátollak a HÍV repiíkációját, számos kísérleti módszerrel lehet mérni. Az alábbiakban használt technika, amelyet a későbbiekben részletesen ismertetünk, Kiéri a vírus replikáeiő gátlását fifohemaggíuíínmnel (PHA) serkentett,, Í-HV- Ϊ vírussal (LAV törzs) fertőzőit humán perífersáüs vér mononsádeárls (PBM) sejtjeiben. A keletkező virus mennyiségét úgy határozzak -meg, hegy merjük a vírus által kódolt révész trsoszkríptáz enzim mennyiségét. ,Λ keletkezett enzim mennyisége arányos a keletkező vírus mennyiségével, Á 3. táblázatban láthatjuk az ECi 50 l· értékeket (a nukleonénak az -a koncentrációja, amely' 50%-fean gátolja a vírus repilkáciéját PBM sejtekben, a becsült hiba lö%), és az ICj- 50T értékeket (a nukleozidnak az a koncentrációja, amely 50%-ban gátolja a mítogénnel serkentett, nem fertőzött hantán PSM sejtek szaporodását) számos (áj-bS-osatíoltei és nukleoziára.

6. Példa

A <A)~l,3-öxst!öián sukfeozitfok astl-HiV aktivitása

A. Hepatitisz B-re és HfV-I -re szerooegativ egészséges donoroktól származó háromnapos Srtohemagglutininnel serkentett PBM sejteket (löt §1 sejt/ml) fertőzünk HIV-i-gyel (LAV törzs), körülbelül százszor magasabb koncentrációban, mint az 50%-os szüvetíenyészstt fertőző dózis (TICP 50) milliliterenként, majd különböző koncentráció amratáhs vegyületek jelenlétében illetve távoliétéhen tenyésztjük.

8. Körülbelül egy órával a fertőzés atást a vizsgálandó anyagot tartalmazó közeget (a végkonoeritráció kétszerese a közegben), illetve a vizsgálandó anyagot nem tartalmazó közeget hozzáadtuk a kímbikokhoz. (5 mi; végtérfogat 10 mi). Pozitív kontrollként AZf-t használunk.

C, A sejteket a viros hatásának tesszük ki (körülbelül 2xlöí 5; dpm/ml, reverz ír&oszkriptáz esszé alapján meghatározva), majd. egy szésdloxid inkubátorba tesszük: őket. A Κ1ΛΜ (LAV törzs) vírust, a Center fór 'Drsease Costrol-bói kapjak (Afertí, Georgia). A P8M sejtek tenyésztésére, a vírus kinyerésére és a reverz transzkriptáz akti vitás meghatározására használt módszereket McDoogal és munkatársai (3. Immun. Metb,, j 7öj , 171-133 (19S5)j valamint Spira és munkatársai (.1. Cü«. Meth., 1 25) , 97-99 (1987)] írták le, azzal az eltéréssel, hogy fengízont nem tettek a táptalajba [lásd Schijiazi et at, Antinherobial Agents and Chemotherapy, j 32] , 1784-1787 (1988); Aníimierobiál Agents and Chemotberapy, j 341 , 1061-1067 (1990)}.

£>. A hatodik napon a sejteket és a felülúszót egy IS ml-es centrifuga csőbe tesszük, majd lö percig körülbelül 900 g-vel centrifugáljuk. A felüklszóból S mi-t eltávolítónk, majd a vírust ccntrifugálással tóménvitjük <4ö -OOO/perc·, 30 perc, Beckman 70.1 Ti rotor). Az oldatba vitt vírus üledéket feldolgozzuk, hogy meghatározzuk a reverz transzkriptáz szintjeit. Az eredményeket a fölülúszó minta dpavird-ében adjuk meg. A felülúszó kisebb térfogataiból (1 ml) s?zármazó vírus is töményiíbető eemríSbgálással,, mielőtt oldatba, vinnénk, és meghatároznánk & reverz transzkriptáz szintjét,

Az átlagos hatékony ECb Sör koncentrációt az átlagos hatás módszerével határozzuk meg [Arstünicreblál Agents and Chemotherapy, 1 3ö{ , 491-498 (1986)], Röviden, a vírus gátlás! százalékát, amelyet a reverz transzkriptáz mérésekből határozunk meg, ábrázoljak a vegyület mikromoláris kímeentráelójáva; szemben. Az EC r 5(1 j az a koncentráció, amelyben a vírus koncentrációját 59%-ban gátoljuk.

S, Mhogénnel serkentett nem-fertőzött humán PBM sejteket (3 x [Ot 5'j sejt/ml) tenyésztünk a hatóanyag jelenlétében és távollétében a lentiekben az and viráiis vizsgálatra leírt körülményekkel azonos körülmények között.

A sejteket 6 nap elteltével henrcseiíoméíerrel és a trípánkék kizárási módszerrel megszámláljuk [Scbinazi et ah.

* ♦*» o«

Arttirnicröbial Agettís and Cbemetherapy, j 22l (3), 499 (I982)j, Az IC) 50f- a vegyületnek az. a koncentrációja, .amely 50%-ban gátolja a sejtek normális szaporodását.

3, táblázat

Az L3-oxatioiáÍ8 aafeíeoatáak kQgfeóaS analógjainak EC»ós IC^; értékel barnán F'SM sejtekbe»

Kési	X vagy Y	R	Atrtivit'álts ECja, gombi	Citotoslkos ÍCjíf, proold
ÖLS-009	X-O	H	>108	>108
DCS-ÖíÖ	x--o	Me	64,4	>108
DLS-027	xo	F	>100	>108
DLS-028	x-o	Cí	60,8	>108
DLS-044	xo	Br	>100	>100
DLS-029	xo	1	>100	>100
DtS-028		u	9.02	>180
DLS-011	Y^NHa	Me	>10	>180
DLS-022	y~nh2.	F	0,01	>180
DLS-823	y-nh2	Ci	38,7	>180
DLS-Ö21	y«nh2	Br	77,4	>180
ÖLS-026	Y~NH;	1	0,72	>100
DLS-Ö5S(-!	Y-NÍ-L	F	0,003	>100
DLS-059	Y-NHj	F	0,84	>100
DLS-053	Y=NH>	: CE,	éÖ,7	>109

A táblázat alatt a V-Π és VIH általános képietü vegyületek láthatók, ezekre vonatkozik az Χ,Υ és R.

Amint azt a 3, táblázatban jelezzük, a helyettesített eitözin-i,3-nukieo Adok általában sokkal aktívabbak, «tini a meg&leiő tsraoíl nukleozídok. Az ECr 50 j· és IC ( Sö j meghatározások hibáját Al0%-ra becsüljük.

Az egyik vegyület, a fAj-FTC (jelöljük még ‘‘DLS”822”-«ek, k-as vegyületnek) nemcsak kivételes aktivitást mutat (körülbelül 16 ntnol/i PBM sejtekben), hanem eteglelsetósen alacsony a íoxieitása is {>108 nmol/I PSM-ben, Verő és CEM sejtekben).

A íA)~ETC iCI Sör értéke 180 pmol/l-rsél magasabb, jelezve, hogy a vegyület nem toxikus fertőzetlen PBM sejtekre, egészen 108 gmol/l-lg.

7. Példa

A OTLC-veí rezolváit FTC enanöomerek atrtivirtsFís aktivitása

Az RFC enantioroerekeí a 4. példában leírtak alapján izoláljuk, ás az aoilvirálls akti vitása kát a é. példában leírtak alapján értékeljük, Az eredmények a 4, íáblázatban láthatók, ás az 5. ábráit ábrázoljak ekei,.

4, táblázat

Az FTC (T) és í-j ea»gtk»Hterjeig«k antivirábs tiktiyitása

Kezelés	Kese,, pnsol.4	ÖPM/mí	%*»s gátlás (korrigált)	CCíic.g.M
;FTC(a}	0,0001	73,755	26,6	0,018
	0,005	83,005	10,3
	0,01	60,465	41,3
	0,05	34,120	78,4
	0,1	14,160	92,4
	0,5	18,095	88,1
	1	7,555	99,7
	5	7,940	99,3
	10	5,810	101,7
FTC(-)	0,001	76,275	23,8	0,02
	0,005	58,590	43,3
	0,01	75,358	24,8
	0,05	28,890	76,2
	0,1	13,175	93,5
	0,5	9,485	97,0
FTC < i ·)	0,001	94,340	3,8	0,28
	0,005	107,430	-10,6
	0,01	99,465	-1,8
	0,05	87J20	11,2
	0,5	86,340	12,7
	0,5	33,225	71,4

Amint az a 4. táfciázaíböl látható, ebben a kísérletbe» a? FTC (-) snanuomerje körülbelül egy nagyságrenddel hatékonyabbnak látszik, mint a (+)-FTC enaniiomer, és körülbelül ugyanazzal az anti-HiV aktivitással rendelkezik, mint a rácéra elegy. Sem az enatéiomerek,. sem a racém elegy neat tcx.ik.as egészen, löö uraol/1 koncén!rációig, amit a tripáukék kizárási módszerrel mérünk humán PBM sejtekben.

8. Példa

A 3, példában leírtak alapján moháit P TC easatiemerek animrális aktivitása A (±)-F'Tü emmiiomesjeii a 3, példában leírtak alapján rezolváljuk, majd az aativirális aktivitásukat a 6, példában leírtak alapján értékeljük ki. Az eredmények a 6, ábrán láthatók. Antxnt azt a 6. ábrán jelezzük, az FTC racém ©legyének ECl· 50 [ értéke ©,017 pmol/l. a !->FTC Eej 50 F értéke 0,087? p.mol/1, és a Cte-FTC ECKíOl értéke 0,84 pmoi/i.

» 9 A * * * * *»

0. Példa

A (Tj-FTC felvétele hutád» FBM sejtekbe

Vizsgálatokat végeztünk radioaktív izotóppal jelzett FFC-vel a kiindulási hatóanyag ás metabolitfisí intraceiluláris profilja követése céljából. Az összes vizsgálatot két párhuzamosban végeztük. A humán perifériális vér oxostmíádetós sejteket {PSM sejtek.) RPM11640 táptalajban szuszpendálmtk, amely 10% borjámagzat szérumot és antibiotikumokat tartalmaz (2x10; 6Ϊ sejt/ml) (10 mi időpontonként) és IÖ gmol/1 FTC hozzáadása után (specifikus aktivitása körülbelül 7ÖÖ dpm/pmol), A sejteket a hatóanyag hatásának tesszük ki 2, 6, 12 és 24 óra elteltével. Ezekben az időpontokban a táptalajt eltávolítjuk, és a sejteket kétszer mossuk hideg Hsuk féle kiegyensúlyozott séoklatt&l. Az extrabálást 0,2 sni őö%-os hideg meíanoi/viz elegy hozzáadásával végezzük, majd éjszakán át -7ö'-C-on tároljuk. A következő reggelen a sznxzpenziókat centrifugáljuk, majd az exirakciókat kétszer megismételjük (0,5 óra, -WC). Az összes egyesített felüiúszót (0,6 ml) imflieszük. A maradékot 250 pl vízben szüszperuiáljak, majd 58- IGÖul-es alikvot részeket elemzőnk HPLC-vel. Az míraeeiloiáris kiindulási hatóanyag és ntefaboiíkus származékai mennyiségi meghatározását HPLC-vel végezzük. Mivel néhány vegyület savra érzékeny lehet, a muabolitok elválasztására egy, a fiziológiás pH-feoz közeli pH-val rendelkező puffer-rendszert használunk,

A 7. ábrán a trtciált (£)-FTC humán PBM sejtekben való jelenléte (felvétele): (két meghatározás átlaga) (átírató órában, pmoi/lö; &T sejttel szemben. A felvételi vízsgáb-ol·: azt mutatják, hogy a radioakttv.an jelzett PTC-t könnyes felveszik a humán limfbeiíák, amelyek az FTC-bóí nagy mennyiségben álltjának elő 5-triibszfat származékot.

(11, Példa

Az FTC antí felnövi rális aktivitása különböző sejts'onaiakbao

Az FTC arttlreiroviráiis aktivitását számos sejtvonalban mérjük, s 6. példában leírthoz hasonló, de nem azonos: eljárással, A sejtvonalskaí humán donoroktól kapjuk (AIDS Research and Reference Reagant Program, NIH, Rockvlile, Maryiand, ATCC, illetve Vöröskereszt), A CPM timidín-kiriás deőcietss sejteket úgy' állítjuk elő, hogy a CE.M sejteket egymás után többször átoltjuk 5~bfmm2Aíez.öxí-ar!diu jelenlétében. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be.

5, táblázat

Sejtreadszes' (vírttstőm)	ECsii (gmöl/l) (ág-FFC
hiy-i
PBMC(LAV-l)	0,027
Μ1 z t r 11I.V (j jg)	0,80
CEM(LAV-l)	0,00
CEM-TK(-) (LaV-1)	0,026
CEM ( H'i'l.V;;,.;) N1H	0.09

Sejtren dsze r (vfeustörxs)	KCs8 (puatrf/l) (ij-FTC
HiV-2
PBMC (ROD2)	0,0038 (H-FTC
	0,0007 (-I-FTC
	0.026(+)-FTC
SÍV
ΑΆ-2 {S0V2S I)	4,6
C-8166 (SIV251	<8,0
HV
CrEK <61E>	<1

ÍL Példa

A (-xpF'FC kiáramlása hantán PBM sejtekbe!

Vizsgálatokat végeztünk radioaktív izotóppal jelzett FTC alkalmazásával, a kiindulási vegyület és metaboiitjai ImracAíIáris profiljának követésére a sejtben, miután a hatóranyagöt tartalmazó táptalajjal inkubáltuk 24 óra hosszat, majd eltávolítjuk a hatóanyagot. Ezzel a vizsgálattal azt az időt mé-jük, amely ahhoz kell, hogy a tfíoszíátek intraeelluiáris szintje lecsökkenjen, .A vizsgálatokat két párisuzamosban végezzük. A nem fertőzött sejteket (2x1 OÍ ét /mi) a megfelelő, szérummal kiegészített táptalajban szuszpeudáljuk (10 ml idöpomőnkésü), majd STAT-on ittkubáljuk egy széndioxid termosztátban (5% €Ο|2(). A radíoakttvan jelzett FTC koncentrációja 10 pmol/1. Mintán a sejteket impuizosszerüen jelezzük 24 óra hosszai, a sejteket alaposan, mossuk, majd az aotlvlrális hatóanyagot nem tartalmazó friss táptalajt adnak Isozzá (0 éra), ö, 2, 4, é, 12, 24 és 48 óra elteltével (második inkubációs idő) a sejteket eltítvoiiijnk, majd azonnal extraháijuk 60%-os hideg metanob'YÍz «léggyel. Az exírákiumot centti ftgálással és a sejtüledék eltávolításával kapjuk. Az extraktumokss liof lezz,ük, majd -?{PC«on. tároljuk. Az elemzés előtt az astyagot 25(1 gl HPLC pufferben szaszpendáljuk, és azonnal elemezzük, A kiindulási hatóanyag és tsei&bölikus származékai mennyiségi meghatározását HPLC-vel végezzük, vagy Mlcre-meftics vagy HewlettPackard modell 1090 HPLC rendszer alkalmazásával, Fartísil IÖ SAX oszlopos anioncserélővel (Whatman, Inc.), I ntl/perc áramlási sebességgel, 6,9 kPa nyomáson, VV detektálás 262 nro-en. A mobil fázis sonmeníesltett viz (A), 2 mmol/l NaHr2j· POrár/ié romoló NaOAc (pH“6,6) (S), 15 mmol/l NaHÍ2j PO( 4 l·/120,2 mmol/l NaOAc (plí-éí,6) IC), és 10Ö mmei/l NaH j 2 r PO l· 4 f /8®ö mmol/l NaOAc (pH^::6,6j (D),

Elválasztási módszer: jssöfoatifcus 5 percig A-val, majd 15 percig: lineáris gradiens 1ö0% B-ig, majd 20 perces lineáris gradiens iöö% C-ig, majd 10 perces lineáris gradiens 100% D-lg, végül 30 perces izokratikus HjO% C-vel, (T)-rrc

5,0

39,0

55,0

Retenciós idők (pere) humás sejtekben:

Vajtemta Momtfes^^ .'ÍÁiifefeíl

68.0 *»*♦ »««« * » « X Φφ * » φφ, » * 4 4 « » φ * * Κ ♦* ♦♦

Α 8. ábra egy grafikon, amely a radioaktív izotóppal jelzett {(á)-FTC távozását mutatja a humán PBM sejtekből, órában mérve a hatóanyag eltávolítása. után, a koncentráeiö függvényében (pmol/iöT 6Í sajt). Amint azt az ábrán jelezzük, az FTC-irifoszfát íuíraeelialásis felezési ideje körülbelül 12 óra, és könnyen kimutatható iníraceliulárisan 1-5 gttiOl/l koncentráciÓNní 48 órával az extracelfeláris hatóanyag eltávolítása után, ami jóval a hatóanyag EC r Sö 1 értéke feleit van. Emellett, a (±>FFC trífoszfat affinitása a (±>FFC-trífoszfátfeoz HÍV reverz transsíkripíáz alkalmazásával 0,2 gmol/'l, ami a 48 órás konceníráeiószinl alatt van.

12, Példa

A (i)-FTC gyógyászatílag elfogadható származékainak anti-HIV aktivitása

a. A fo)~FTC-nek számos győgyászatilag elfogadható sóját állítjuk elő, oly módon hogy a PSM sejtekben antl-HÍV aktivitás szempontjából fontosnak bizonyult 5* és N'l 4? pozíciók származékait állítjuk elő, ahhoz hasonló eljárással mint sutit a 6. példában leírtunk. Az eredmények az alábbiak. A vfo-FTÜ S'-O-buíirát észterének ECt 50 l· értéke 0,0017. A (é)-FTC Nt 4í -acetil származékának ECr5öt értéke 0,0028. A ÍM-FTC ő'-O-buursf, Ni 4t észterének FCt Sör értéke 9.,0858,

b. A (ej-FTC S’-O-butirát észter anlí-HíV aktivitása MT4 rendszerben (EG r 50 r ) 0,04 umoiZI. Ugyanebben a vizsgálatban az aeilezetlen (ej-ETC 1C50 értéke 6,52 arneiZl, Az AZT ÍCSÖ értéke ebben a rendszerben Ö.69 μηχοΐ/ΐ.

S 5. Példa

Az FTC {+) és (-} essantíomerjes aktivitásának értékelése 2,2,15 sejtíasjyeszetekben

Az FTC enamiomerjeinek az a képessége, hogy gátolják a vírusok szaporodását 2.2.15 sajttestyészetekbea (HepG2 sejtek, hepatitisz virlonnai transzformálva), amit részletesen leltünk az alábbiakban.

Az antivirális hatás vizsgálatának összefoglalását és leírását ebben a tenyész-rendszerberr, valamint a HBV DNS elemzését leírták {Korba and Milman, AntMral Rés,, j Iái ,217 (1991)]. Az ami virális értékeléseket a sejtek két különböző ámításával végezzük. Mindegyik lemez mindegyik lukét ugyanazzal a sejisűmséggel oltjuk, be ugyanabban az időpontban.

Vizsgálati pasas méterek

Mivel mind az iníracelltsláris mind az, extracelioláris H8V DNS szint inasától is változik, csak a 3,5szőrösnél (a HBV vlrroo BNS-re nézve) vagy a 3,0-skd (a. HBV DNS replikáeíós intermedlerjeire nézve) nagyobb csökkenéseket ezeknek a HB V DNS formáknak kezeletlen sejtekben mért átlagos szintiéhez viszonyítva, tekinthetők statisztikailag szignifikánsaknak [PeO,Ö5j. Az integrálódott HB-V DNS -szintjét az egyes eelluláris DNS készítményekben (amely ezekben a kísérletekben sejtekre számítva állandó maradj használjak az iötracelluláris HBV DNS formák szintjének számítására, ezzel biztosítva, hogy a különböző minták között azonos mennyiségű sejtes DNS-t hasonlítunk össze.

Az extmcekttiárís HBV virien DNS tipikus értékéi kezeletlen sejtekben 50-150 pg/rní táptalaj között vannak (átlag körülbelül 76 pg/mi j. Az íötraceliuláris HBV DNS replikáeíós intermedierek menny bégé kezeletlen sejtekben φφ * κ « Φ > $

50-ίΟθ pg/ug sejt DNS között változik (az átlag körölbidül 74 pg/pg sejt DNS). Általában az intrseetfoláris HBV DNS szintjének csökkenései az anhviráíis vegyületekkel való kezelés következtében sokkal kevésbé élesek, és lassabban történnék meg, mist a HBV vírion DNS koncentrációjának csökkenései (Korba and -Milntan, Ántlvhai Rés., '! Ifi , 217 (1991)].

•Az a mód, ahogyan ezekben a kíséri etekben a hibridizációs elemzéseket végezzük, -egy körül belül 1 A pg hstracellulárisHBV DNS és 2-3 genomiális kópia ekvivaleíteíát'eredményez sejtenként, és t.,ö pg/ml exfmcellaíárls HBV DNS és 3xlÖt 5Í vinssrészeeska'ml ekvivalenciát eredményez.

A toxidtás elemzése

A toxicitási vizsgálatokat ajsért végezzük, hogy megbecsüljük, hogy bármely ímtlvkábs hatás nem egy általános, & sejtek életképességét érintő hatás kővetkezmenys. Az itt használt módszer a semleges vörös festék felvétele, atsí egy standard és széles körben vizsgálati módszer a sejtek életképességének meghatározására számos különböze vlnis~gazb;a;servezet rendszernél, beleértve a HSV-t és a .HIV-et. A toxicitási vizsgálatokat 96 lukas lapos fenekű szövettenyészto lemezeken végezzük. A toxicitási vizsgálatokbím használt sejteket elszsíporítjok, és a vizsgálandó vegyületekkel kezeljük, ugyanazzal a rendszered, mint amit az alábbiakban az antivirálss vegyületekre ismertetünk. Mindegyik vegyüíetet 4 különböző temcentrációhan vizsgáljuk, mindegyiket három párhuzamos tenyészetheti <”Á, B” és ”C‘^! lusak), A semleges vörös festék felvételének mértékét használjuk, a toxlciíás relatív szintjének meghatározásra. A bejutott festék 510 íun-ee mérhető sbszorbsnciáját használjak a mennyiségi vizsgálatokra. .Az értékeket az átlagos A (sin ;· értékek száztilékábso fejezzük ki 9 külön, kezeletlen sejtekből álló tenyészetből, amelyeket ugyanazon a 96 lukas lemezen tartunk fene, mint a teszí-vegyüieteköt. Az 5-ö's lemezen levő 9 kontroll tenyészet íestekfeivéteíe 91,6% és 11.0,4¼ között változik, aó-os lemezen 96,6% és 109% között változik. Az erödmésyeket a 6.. táblázatban mutatjuk be.

6. táblázat

A vizsgált s'eavSfetek texloltásának vizsgálata 2.2.15 sejtekfeen

Leroest	Vegyület	Konc. í.uimsIA)	Festékfeivétsl (a Somtroll %-a)
A luk	S lak	C luk
5	DMSO	Ííö,ö’	8,7	1,6	0,9
		3,3	55,9	68,7	61,7
		1,8	91,2	96,4	106,8
		0,3	98,7	102,9	93,6
6	(M-FTC	.380	55,0	51,1	51,5
		100	64,1	66,6	77,6
		36	98,7	94,3	96,4
		10	94,3	94,9	92,2

.26

Lemez	Vegyüiet	Konc, (p.moVf	Festékfeívétíá (a kontroli	%-3)
A lak	B lók	C lak
6	(+)-FTC	300	43,4	56,7	58,5
		100	77,7	66,3	72,1
		39	81,1	88,3	88,1
		19	90,9	99,4	90,5

A * a DMSO koncentrációknál az eredeti törzsei ást százalékát jelenti.

A toxicitás értékelése

Amint azt a 6. táblázatban jelezzük, nem figyelhető meg jelentős teieiíás (azaz a kezeletlen sejtekben megfigyelt testékíelvéteU szint 59%-nál nagyobb csökkenés) a vizsgálati; vegy-öleteknel az antivirálís kiértékeléshez' használt koncentrációban. Mindkét vizsgált vegyüiet, azaz a (->H'C és a (%-FTC toxikusnak tűnt a teteitáss vizsgálatokban alkalmazott legmagasabb, koncenírácsóknál (389 nmol/l).

Astsvsráiis értékelés

Ssassfek

A normális variációkon beiül a HBV vition DNS és az Intracellnláris HBV replikáeios intermedierek [HBV SI| szintje állandó maradt a kezeletlen sejtekben a fertőzési periódus alatt A DMSO, 1%-os koncentrációban nem érintette a HBV replikáeió színijét 2.2.15 sejtek tenyészetében.

Amint az a ?. táblázatban iáshatő, mind a (-)-FTC mind a ( ó-FTC jelentősen gátolja a HBV repiíkációját a vizsgált szinteken. Amint az a 8. táblázatból látható, a (~}~FPC még jelentősen gátolja a HBV vsrion DNS és az mtraceikdárís HBV DNS szintézisét 4, 1 és 8,25 μηιοίό koncentrációban.

7« tá bláza t

l.ask	Kezelés	HBV vsrioa DNS' (pg/ml szaporító táptalaj)	Inirseeliníáns HBV DNS
0. nap	4, nap	9. nap	Mono	Rifamplem
7 A	Kezeletlen sejtek	59	57	94	2,7	93
78	Kezeletlen sejtek	47	64	88	2,5	93
8A	Kezeletlen sejtek	65	190	71	2,2	97
88	Kezeletlen sejtek	77	65	110	2,4	62
i 7K	DMSO @ fok	190	50	48	1,9	95
71.	DMSO @ 1%	4§	96	54	2,8	98
i ék	ÖMSÖ<$ 1%	93	63	68	ZvZ	86
: 8L	DMSO@, 1%	66	57	59	1,6	97

Lek	Kezelés	HBV vínea DNS (pg/rnl szapuritó táptalaj)	Issiraceliiiíáris HBV DNS (pg/pg sejt DNS)
8. nap	4. nap	9. nap	Mono	Rí fám picin
9U	(-)-FTC @ lögrasl/l	120	36	1	u	14
9V	(-)-FTC @ tö gmoFl	89	43	1	1,5	19
IOU	(-)-FTC @ I Ö úrnőid	58	41	6,1	1,9	13
iOV	(->FTC 19 pmol/l	110	32	8,1	1,2	lő
9W	(-;)-FTC @ 10 pmolíl	88	42	0,1	0,8	14
9X	(-í-)-FTC :@ 19 psíol/l	58	57	8,2	0,4	19
10W	(+)~FTC @ IÖ pmokl	69	55	8,1	9,7	17
IÖX	(+)~FTC @ 18 pmold	45	39	0,1	8,4	15

* Az érzékenység vágási értéke & HBV wioöra 0,1 pg/mi @ Az intraeelluláris HB V DNS-í ά 9. napi kezelést követé 24 óta múlva elemezzük. Az Integrálódott HBV DNS szintiét a« egyes sejték DNS preparátumaiban használjuk arra, hegy kiszámítsak az episzomális 3,2 kb méretű HBV genomek szintjét (MOND) és a HBV DNS replikáeíös satemsetileíjeinek (RÍ) szintjét.

8. táblázat

Luk	Kezelés	HSV vírioa DNS' (pg/snl szaporrié táptalaj)	íntracellHiáns HBV DNS* (pg/pg sejt DNS)
8. nap	4. aap	9, nap	Morse	Rsfísmpicsn
• 31A	Kezeletlen sejtek	64	54	65	2,8	65
313	Kezeletlen sejtek	51	54	7?	2,0	53
: 32A	Kezeletlen sejtek	100	76	56	3,5	81
323	Kezeletlen sejtek	53	97	83	3,1	68
3SA	(-)-FTC 4 proöl/l	74	27	>0,5	1,4	I
3SÖ	(-)-FTC @ 4 íimd/1	87	28	>0,i	0,5	I
3ŐA	(->FTC @ 4 μrock'1	120	20	1	0,9	1
36B	(-)-FF’C @ 4 pmőVI	59	16	0,2	0,2	2
35C	(-)-FTC @ 1 prnold	70	13	>0,1	5,7	2
350	(-)-FTC @ 1 pmold	02	IS	>9,1	1,2	3
3őC	Ó)-FTC@ 1 pmold	60	-f-y Λ-.'v	1	1,4	X.
361)	(-)-FTC @ 1 pntol/l	89	28	0,3	1,5	4
35E	(-)-FTC @ 0,25 umoH	84	15	>8,1	1,5	4
3SF	f-j-FTC @ 0,25 umold	89	lő	4	2,2	4

2§

I.nk	Kezelés	HBV virlea DNS* (pg/ml szaporáéi tápfsdsj)	intraoellídárts HBV ÖNS* ípg/pg sejt BNS)
Ö, nap	4. nap	9, sáp	Monrs	Ksfampscm
36E	<-)-FTC@$,25 utnolÖ	66	13	1	1,8	8
3ŐP	(-)-FTC @$,25 nmolÖ	49	19	0,1	0,3	9

* Az. érzékenység vágási érték® a HBV vírlonra 0,1 pgrtnl @ Az intraceiluláris HBV ONS-r. a 9. s«pt kezdést követő 24 óra múlva elemezzük. Az hrtegrálődott HBV DNS szintjét az egyes sejtek. DNS preparáínmalhan használjak arra, hogy kiszárnítsnk az epsszomálís 3,2 kb mérető HBV gesemok szintjei (MONO) és a HBV DNS repiíkáeiós intermedserj esnek (KI) színijét.

A (ij-FTC felvétele huntáts ntájxejtekhe; az FTC HVB aktivitása

A 9. példában közölt eljárást Ismételjük meg humán májsejtekkei (Hepö2 sejtek, hozzáférhető az ATCCnél), hogy meghatározzuk az FTC felvételét és mechanizmusát ezekben a sejtekben. .Amint az .a 9. ábrán látható, a (±)-FTC-í a HepC2 .sejtek nagy mennyiségben veszik fel. Ezek a humán máísejtek a (±>FTC-t nagy százalékban metabölízáiják (Tj-ETC trifirszlattá.

Ezek az adatok, más, a szövegben megadott adatokkal együtt azt mutatják, hogy a (*)~FTC, valamint (-) és (;-) enantiomerjel feszforilezdduek a májsejfékben. Ezek a sejtek transzíbrrnáíhatók hepatitisz 8 -vírussal.

15. Példa

Az PTC feljutása ss barnás HepG2 sejtekből

A 10. ábrán a (j 3Í Hj-(±)-PTC és foszfortItezeit származékai kiáramlását mutatjuk he humán HepO2 sejtekből pmol/löt őt sejtnél az. idő függvényében, mintán a sejteket hnpteztsszerüen megieleztük 10 umotd [! 3Í H)~(A)-ETC-veÍ (796 DEMÁnol) 24 óra hosszat, majd a vegyület koncentrációját értékeljük .24 órával az eltávolítás teán.

A FI. ábrán a jt 3; HjdA)-FTC és fbszforiiezeit származékainak kombinált koncentrációja látható hunsáts HepO2 sejtekben lö umot-l jt 31 Hj-jAj-FTC-vel való inkubálás után (700 DFM/moij 24 óra hosszat, pmol/löt öt sejtnél az idó függvényében.

Amint az látható, még 48 óránál is, rőbb mint 1 pmol/l aktív vegyület (amely lényegesen magasabb mint a vegyület EC (501 értéke) van jelen a sejtekben.

y, Tosleitás a granniouba-mskrofág prefearw sejtekben lő. Példa

Az FTC hatása a graatdoeste-snahröíág prefetirzor sejtek tetepképződésére

A 12. ábra egy grafikon, amely az FTC (-) és (-íj emmhom-srjeinek hatását mutatja a grasuiocita-makrofág prekurzor sejtek telepképző képességére, amint azt a százalékos íülsáéssel lehet mérni a nmol/i-ben mért. koncentráció függvényében [(->-FTC: üres körülmény; (-tj-FTC;: tele kór; AZT: tele négyzet]. Amint azt jeleztük, az

FTC (-í-enantiotnerie kevésbé toxikusnak tűnik, azaz magasabb az IC'Hol· értéke, mint akár a (Ls-enantionteré vagy az AZT-s ebbe® a sejívonaiban,

Vi^£I£janaako^^

17. Példa

Az FTC msrtahoifomnsa patkányoknak beadva

A <±)-FTC-t Intravénása® adjuk be lö, 5Ö és 199 mg/kg dózisban patkányoknak, majd a plazma hatóanyagkoncentráció az ídö tuggvényében görbe Haiti területet (AUC), a teljes knirüíést (CLh Ti'), az eloszlás egyensúlyi állapot! térfogatát (Vb SS i ), az átlagos tartózkodási időt (MRT) és a felezési időt kiértékeljük. Az eredmények a 9, táblázatba® láthatók.

9, táblázat

Húzás mg/kg	AUC mg b/L	Ck 17h/kg	Vss L/kg	| M.RT i &	ísA Is
10	9,65	0,988	0,753	j 0,768	9,757
SO	57,11	0,874	9,699	j 0,890	9,815
109	129,72	0,8.30	9,663 j 0,798	9,969

*ÁiJC ~ a plazma hatóanyag koncentráció - idő görbe alatti terület;

CL «teljes kiürülés;

V$s “ az eloszlás egyensúlyi térfogata;

MRT - átlagos tartózkodási ídö;

tü “ (élezési idő.

IS, Példa

Az .FTC farmakolíhsedkal paraméterei síz FTC intravénás vagy orális beadása után Modell-foggeíien íarmakokinetikai paraméterek származtak a fi)~FTC intravénás (ív) és orális (P.O,) beadásából 33,3 mg/kg dózisban rbesus majmoknak beadva. Az eredmények a 18. táblázatiban láthatók. Fontos, hogy a vegyidet biológiai hasznosulása majmokban 73% (±ó%).

**-*·* ·-*«.« 44 » * ν χ «, * ♦ X

10. táblázat

Mo4gitQs.ggdea farinakcliánetíkaí paraméterek a ffc>FTC Intravénás (iv) vagy orális t'R.Ö.)

Majom	AUC mg ML	et-r L/h/kg	vss L/kg	MRÍ fe	&	&st lí	F %
tv.
RUh	19,14	1/74	2,71	.1,56	1,28
RMi	26,31	1,26	1,97	1,56	1.22
RJd	22.51	1,48	2,09	1,36	1,47
Átlag	22,65	1,49	2,2.3	1,49	1,32
*S.D.	3,59	9,24	9,42	0,12	9,13
R.O.
RUh	13,21			2,07	1,58	0,48	71
i RMi	21,11			2,32	l,0S	0,43	§9
RJd	15,29			3,23	1,47	0,31	68
Adag	16,54			2,54	US	0,41	73,09 (;±6)
±S.D.	4,09			0,61	0,26	0,09	6/24

' AUC a plazma hatóanyag koncentráció - idő görbe idatti terület; CL -teljes klürOlés;

V_ss ~ ííz eloszlás egyensúlyt térfogata;

M&T - átlagos tartózkodási idő;

lé - felezési idő;

F ~ biológiai hasznosulás;

Kg ~ eis&tesad'ö abszorpciós sebességi állandó.

11. táblázat dezsmissált metaboKti&S CSF/szérum aránya a kezelés után 8 órával

Majom	Beadás módja	FTC	Metaimlít {ΓΠΓϊ
RUh	tv.	0,976	0,024
RMI	l.V.	9,962	0,032
RJd	l.V.	0,162	9,052
Átlag		0,190	9,036
S.D.		0,054	0,014

***«

Majom	Beadás módja	FfC	Metabelít (FTC)
RUh	P.O.	0,84$	8,026
RMí	P.O.	0,839	0,93?
R.íd	P.O.	0,117	0,055
Átlag		0,86$	0,039
X S.D.		0,943	0,015

19. Példa

Az FTC és metafcolltjainak CSF/szérnnt aránya rhesws majmaidban

A (±)-FTC-nek azt a képessegét, hogy átlépi az agy-vér gátat, úgy vizsgáljuk, hogy 33,3 mg/kg aktív hatóanyagút adunk be rhesns majmoknak, és mérjük a (*)-FTC mennyiségét a gerínefolyadékbas (CSF)· és a vérszérumban, egy órával a beadás után, Az eredményeket a 11, táblázatban mutatjuk be. Az adatok m mutatják, hogy' jelentős mennyiségű aktív hatóanyag lépi át az agy-vér gátat ebben az emlősben.

nk GyógyÁSzab készítmények készítése

A HÍV vagy HBV fertőzésben szenvedő emberek kezelhetők hatásos mennyiségű (A)-FTC, illetve (-) vagy (a) enanüomsrjeí, illetve ezek gyögyíiszaiiiag elfogadható származékai vagy sói beadásával, gyógyászatilag elfogadható hordo?Z> vagy hlgitószer jelenlétében. Az aktív anyagokat bármely megfelelő módon be lehet adni, például orálisan, parenterálisan, intravénásán, inttKÖsrmáíissn, szubkután vagy topikálisan, folyékony vagy szilárd formában.

Az sktiv hafotmyagot olyan mennyiségben tesszük a gyógyászatilag elfogadható hordozóba vagy Ingitöszerbe, amely elegendő ahhoz, begy egy betegnek terápiás szempontból hatásos mennyiséget vigyünk be a vegyületből, hogy in vivő gátoljuk a viráiis replikációt, különösen a HÍV ás HBV replikádét, anélkül begy súlyos toxikus tüneteket okoznánk® kezelt betegben, A gátló mennyiség alatt olyan mennyiségű aktív hatóanyagot értünk, amely elegendő abhoz, hogy gátló hatást fejtsen ki, amely gátló hatást például egv, sz előzőkben ismertetett módszerrel vizsgálunk.

A.(-}, (+) vagy (A)-FTC egv előnyős dózisa az: Összes említett körülmények közön körülbelül 1-50 mg/kg, előnyösen 1-20 mg/kg, még általánosabban 0,1-108 mgftestsúlykilogramm naponta. A gyógyászatilag elfogadható származékok effektiv áozbtattomáaya számítható, a beadandó kíseáulási nukfenzidok súlya alapján. Ha a származék önmagában is mutat aktivitást, akkor a hatásos dózis a fenlek szerint becsülhető, a származék sólya alapján, vagy más módszerekkel, amelyek a szakterületen jártas szakember számára ismertek.

A hatóanyagot egységekben, valamely .alkalmas dózisfcnnában adjuk be, beleértve, anélkül» hogy ezekre korlátoznánk magunkat a 7-389 mg, előnyösen a 78-1408 mg: hatóanyag per egységdőzisi,. .Általában egy 50-1098 mg-os orális dózis megfelelő, ideális esetben a hatóanyagot úgy adjuk be,_: hogy a hatóanyag plazma esúcskoncentrádöja 0,2-78 umoi/S, előnyösen körülbelül 1,0-10 omold legyen. Ezt ügy érhetjük el például, hogy az aktív adalékanyagból 0,1-5%-os

CO oldatot készítünk intravénás injekciázáshoz, adod: esetbe» sőoldaífean, vagy bolns-ként adjuk be az aktív adalékanyagot

Az aktív adalékanyag koncentrációja a gyógyászati készítményben függ az abszorpciótól, az inaktiválástól és a hatóanyag kiválasztásának sebességétől, valamint egyéb, a szaktcrúlcien jártas szakember számára ismert faktoroktól. Meg kell jegyeznünk, hegy a dózis-értékek szintén, változnak a kezelendő állapot súlyosságától függően. Azt is meg keli érteni továbbá, hogy bármely adott egyed esetében a specifikus dözistartományt időben változtatni keik az egyedi Igényektől és a készítményeket beadó személy szakmai Itéleféioi függően, illetve felől kell vizsgálni a készítmények adagolását és a bennük beállított könecntráeiő-tartományok csak példaként vannak megadva, semmi esetre sem szándékozunk ezzel a találmány oltalmi körét szűkíteni. Az aktív adalékanyagot beadhatjuk egyszerre, illetve feloszthatjuk számos kis dózisra különböző időpontokban.

Az aktív adalékanyag beadásának előnyős módja az orális beadási mód. Az orális készítmények általában tartalmaznak egy semleges hlglfószert vagy egy eltelő hordozót. Ezek zselatin: kapszulákban, vagy tablettákká préselve lehetnek. Az orális terápiás beadás céljára az aktív adalékanyagot töltőanyagokba tehetjük, és használhatjuk tabletták, kapszulák formájában. A gyógyászatüag elfogadható kötőanyagok és/vagy adjuváns anyagok is részét képezhetik & készítménynek.

A tabletták, pirulák, kapszulák és hasonlók akármelyiket tartalmazhatják az alábbi adalékanyagok közül, illetve a hasonló természetS anyagok közül: egy kötőanyag, például mikrokristályos cellulóz, akácía gumi vagy zselatin; egy töltőanyag, például keményítő vagy laktóz, egy szétbomiassió ágens, például síginsav, Frimogei vagy kukoricakeményltő; egy esúsztníőanyag, azaz például magnézium-sztesrát vagy Stsrotes; egy fényesítő, azaz kolloid szilicsum-dioxid-, egy édesítőszer, azaz például szacharóz vagy .szacharin; vagy egy illatosító anyag, azaz például borsments, metil-szallcílát vagy narancs illatosító. Ha a dózisforma egy kapszula, akkor a fenti típusú anyag mellett tartalmazhat egy folyékony hordozót, például zsírsavat. Emellek a dőzísfortuák íartaisrsazhatnak más anyagokat, amelyek módosítják a dózis megjelenési formáját, például cukor, ssiíak borítást vagy más bélben oldódó ágenst.

A (rt)-FTC vagy .{-} illetve (+} cnantiomcre vagy gyógyászatllag elfogadható származékai vagy sói beadhatók egy elíxir, szuszpenziő, szirup, rágógumi vagy hasonlók komponenseiként. Egy szirup tartalmazhat a hatóanyag mellett szacharózt édesítő anyagként, valamint bizonyos konzerváló anyagokat, festékeket illetve színező és Ízesítő anyagokat.

A (kj-FTC vagy (~) illetve (-!-) en&ntíoraere vagy gyögyászaliSag elfogadható származékai vagy sói elkeverhetők más aktív adalékanyagokkal, amelyek nem korlátozzák a kívánt hatást, illetve olyan anyagokkal, amelyek kiegészítik a kívánt hatást, ilyenek például az antibiotikumok, gombaellenes szerek, gyulladásgátlök vagy más aeíiviráiis szerek, beleértve más nokleozid anti-HlV vegyüieteket,

A parenterális, Intr&dermális, sznbkután vagy topíkáüs módon alkalmazott oldatok vagy sznszpeoziok az alábbi komponenseket tartalmazhatják;: egy steril hígstószart, például vizet az: injekcióhoz:, séoldatot, rögzített olajakat, polfoídén-giikolokat, glicerint, propllén-glikolt vagy más szintetikus oldószereket; snlíbakforiális ágenseket, például benzil-aikűhoh vagy rnetíl-psrabénekeí; aniíoxldán.sokat, péidául aszkorbinsavat vagy nátriosn-hiszuifiíok kelátképzö anyagokat, azaz például etiléndiamin-tetraecetsavst; puffereket, azaz peldáuí cifrátokat, foszfátokat, és az ozsnozisnyomá» beállítására szolgáló anyagokat, azaz például náírium-kiortdot vagy glükózt. A kiindulási készítmény tehet ampullában, eldobható fecskendőben vagy több dózssi tartalmazó ampullákban, üvegekben vagy műanyag tartókban.

Ha intravénásán adjuk be, akkor -az előnyős hordozók a Szioiógiás sóoidat illetve a foszfáttal puíferelt •sőoldat (PBSj,

A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint az aktív hatóanyagokat olyan hordozókkal készítjük, amelyek megvédik a vegyületet attól, hogy a testből gyorsan eílmmálódiori, száz például szabályozott felszabadalásü készítményt álhitünk elő, beleértve irapianfáiutnckat és mikrokapszulúzoö leadó rendszereket. A biológiailag lebontható, biokompatibílis polimerek használhatók, Ilyen például az etilén-vinllscetát, a polianlddridek, poliglikolsav, a kollagén, a poiiortoészterek és a poliíejsav. Az ilyen készítmények készítésére alkalmas módszerek a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvalóak. Az anyagok 'kereskedelmi forgalomban hozzáférhetők az. Alza Corporation-től illetve a Nova Phartnaoetdicals, Inc.-tőí.

A itposzómás szuszpenziők: (beleértve a fertőzött síitekre a vitális antigének elleni monoklonálts antitestekkel irányított llposzómákat) is előnyösen használható gyógyászatilag eirogadhaio hordozók. Ezeket elóálííihötink a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel (4,522,811 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi bejelentés, amelyre a továbbiakban hivatkozunk], Például a liposzémás készítményeket úgy állíthat; ok elő, hogy’ a megfelelő lipldfékjét (azaz például a sztearoli-íöszladdd-eümotaramt. sztearoilfoszfatidll-kolínt, arachidöil-íbszfeddü-kolint és a koleszterolt) egy szervetlen oldószerben oldjuk, amelyet azután lepárolunk, egy vékony fámét vagy száraz lipidet hagyva hátra a tárolóedény felszínén. A hatóanyag vagy monoíöszfátja, dsfbszfeíja és/vagy íriiószlnba vizes oldatát ezután betesszük a tárolóeöéuybe. A tárolóedényt azután kezünkkel megpörgetjük, hogy a lipidet leválasszak 3 tárolóedény oldalairól, és diszpergáljuk a iipld aggregátumokat, ezzel létrehozva a liposzóraális szwzgmsiőt

Áx FTC snoöíS, dl· és tnfoszfátjait az alábbiak szerint állíthatjuk elő,

A monofbszfáíot Imái és munkatársié módszerével állíthatjuk elő [Journal of Organie Chemistry, i 34j (t?), 1547-1550 (10Ő9)]. Például körülbelül löö mg FTC-t és körülbelül 28Ö gl fosztóríl-klorídot reagáltatunk kevertstés közben körülbelül S ml száraz etilseetátban körülbelül Ö^;iC-on körülbelül négy óra hosszak. A. vizes fázist aktivszenes oszlopon tisztítjuk, 5%-os ammőninm-nídroxíddal eluáljuk, amely etanol és viz 1:1 .arányú eiegyében készült. Az: eiuáiószer bepárlásával kapjuk az ammónium-FTC-S'-'ínonofoszi'átot.

A ditbszístot Davísson és munkatársai módszerével állíthatjuk elő [Journal of Organie Chemistry, j 52i (9), 1794-1801 (1987)1 Az FTC dífoszfútot a megfelelő íozilátból állíthatjuk elő, például úgy, hogy a suikleozid tozíl-fcloriddal reagálhatjuk pirrdmbeu szobahőmérsékleten körülbelül 24 óm hosszat, a terméket a szokásos módon feldolgozzuk (például mossuk, szárítjuk és krlstályosítiuk).

Λ trifoszfútoí Fioard és munkatársai módszerével állítbatiuk de [Journal of the American Chemical Society,

I §7'| (8), 17S5-1738 (1965)]. Az FFC-i aktiváljuk (smidazolidot állítunk elő, a szakterületei! jártas szakember számára ismert roőadszerrel), inaid trilmtil-aínínönium-piröibszfáttsl kezeljük diraeíilibrmamidban. A reakcióban elsősorban a n.ükieezld trifoszfeíját kapjuk, valamennyi reagálaíian monofcszíáttal és difoszfátíai, A tisztítást egy *

• * * ♦ φ φ«« * * * φ * * *♦

DEAE oszlopon végezzük anioncseréíö kromatográtsával, majd a íníoszíatot péhiáni tetranátrímn sója formájában izoláljuk,

A találmányt az előnyös megvalósítási módjaira hivatkozva irtuk le. A találmány variációi és módosításai a szakterületen jártas szakemberszámára nyilvánvaioak lesznek a találmány előző, részletes leírásából. Az összes ilyen variáció és módosítás a függelékben megadótt Igénypontok oltalmi körébe tartoznak.

Claims (4)

1. SZABADA.LW IGÉNYPONTOK

   1. Gyógyászati késmtmúny, azzal jellemezve, hogy HÍV vagy HBV fertőzés kezdéséhez hatásos: mennyiséget tartalmaz (')-8-íL}-2-hidrexí-ínetíÍ-5-(3-{luor-díoztö-3-H)-í ,3-osati<5íán vagy annak fízíelőgiatiag elfogadható sója és egy más antlvtrális szer -kombinációjából egy gyógyászatilag eifegaáhaíó hordozóban.
2. 2. As 3. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ami. jellemezve, hogy a más nntiviráiís szer egy más nokíeozid soti-HIV vegyidet.
3. 3. Az I. igénypont szerinti gyógyászati készítmény HÍV fertőzés kezelésére,
4. 4. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati készítmény HBV fertőzés kezelésére.