MC1742A1 - Procede pour preparer un derive de 3'-azido-3'desoxythymigline et procede pour preparer une formulation pharmaceutique le contenant - Google Patents

Description

La présente invention concerne la 3'-azido-3'~ . désoxythymidine, ses dérivés pharmaceutiquement acceptables et leur utilisation dans le traitement ou la prophylaxie d'infections à rétrovirus de l'être humain.

Les rétrovirus constituent un sous-groupe des virus ARN qui, pour se répliquer, doivent tout d'abord faire une "transcription inverse" de 1'ARN de leur génome dans de 11 ADN (la "transcription" désigne conventionnellement la synthèse d'ARN à partir d'ADN). Dès lors qu'il est sous forme d'ADN, le génome viral est incorporé au génome de la cellule-hôte, ce qui lui permet de tirer pleinement parti des mécanismes transcription/translation de la cellule-hôte aux fins de la réplication. Une fois incorporé, 1'ADN viral est pour ainsi dire indifférenciable de 1'ADN de l'hôte et, dans cet état, le virus peut persister aussi longtemps que la cellule est en vie. Le virus étant sous cette forme pratiquement invulnérable à l'attaque, tout traitement doit être axé sur un autre stade de son cycle vital et doit nécessairement être poursuivi jusqu'à ce que toutes les cellules porteuses de virus soient mortes.

HTLV-I et HTLV-II sont tous deux des rétrovirus et sont connus pour être des agents responsables de leucémies de l'être humain. Les infections par HTLV-I sont notamment très répandues et sont causes de nombreux décès chaque année de par le monde.

Une espèce de rétrovirus a maintenant été isolée de façon reproductible à partir de sujets atteint du SIDA. Bien qu'ayant été largement caractérisé, ce virus n'a encore reçu aucun nom de plein accord et on le connaît ordinairement sous les désignations HTLV-III (Human T Lymphotropic Virus III)., ARV (AIDS Related Virus) ou LAV ( Lymphadenopa-thy Associated Virus). Il semble que le nom devant être consacré sur le plan international est "virus de l'immuno-déficience acquise" (AIDV pour Aquired Immune Deficiency Virus). Il s'est avéré que ce virus (dénommé AIDV dans le présent mémoire) infecte et détruit préférentiellement les

lymphocytes T portant le marqueur de surface OKT4 et on le reconnaît généralement à l'heure actuelle comme l'agent étiologique du SIDA. Le malade perd progressivement ce groupe de lymphocytes T, ce qui bouleverse l'équilibre global de son système immunitaire, réduit sa capacité à combattre d'autres infections et le prédispose à des infections opportunistes qui s'avèrent fréquemment fatales. Ainsi, la cause habituelle de mort chez les victimes du SIDA est une infection opportuniste, telle qu'une pneumonie ou un cancer induit par un virus, mais la mort n'est pas une conséquence directe de•1'infection par AIDV.

Récemment, AIDV a également été retrouvé dans d'autres types de tissus, y compris les lymphocytes B pré-

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sentant le marqueur T , les macrophages et le tissu non associé au sang du système nerveux central. Cette dernière infection a été découverte chez des malades manifestant les symptômes classiques du SIDA et elle est associée à une dé-myélinisation progressive qui entraîne des pertes et des symptômes tels que 1'encéphalopathie, la dysarthrie pro-qressive, l'àtaxie et la désorientation.

Il existe au moins quatre manifestations cliniques de l'infection par AIDV. Au stade initial de "porteur", le seul signe d'infection est la présence d'anticorps anti-AIDV dans le .courant sanguin. On est convaincu que ces "porteurs" peuvent transmettre l'infection, pa'r exemple par transfusion sanguine, rapports sexuels ou utilisation d'aiguilles de seringue usagées. Le stade de porteur peut souvent ne jamais évoluer jusqu'au deuxième stade qui est caractérisé par une lymphadénopathie généralisée persistante (LGP). On estime .généralement qu'environ 20 % des malades au stade LGP progressent vers un stade plus avancé connu en tant que "Syndrome Associé au SIDA" (SAS). Les symptômes associés à SAS peuvent comprendre un malaise général, une température élevée et des infections chroniques. Ce stade évolue jusqu'au stade terminal, fatal, du SIDA, lorsque le malade perd toute aptitude à combattre les infections.

♦

L'existence de ces rétrovirus, ainsi que d'autres, de l'être humain n'a été reconnue que récemment et, du fait que les maladies auxquelles ils sont liés menacent la vie du malade, il est urgent de mettre au point des moyens pour 5 combattre ces virus.

Divers médicaments ont jusqu'à maintenant été proposés comme "agents de traitement" du SIDA. Ceux-ci comprennent 1 ' antimoniotungstate, la suramine, la ribavirine et 11 isoprinosine, qui, soit sont quelque peu toxiques, soit 10 ne font pas montre d'activité anti-rétrovirale marquée.

Etant donné que le génome de AIDV est incorporé à 11 ADN de la cellule-hôte après l'infection et qu'il est pratiquement invulnérable aux attaques dans cet état, il persistera aussi longtemps que survivra la cellule-hôte, en provoquant entre-15 temps une nouvelle infection. Par conséquent, tout traitement du SIDA doit être poursuivi durant une longue période de temps, voire à vie, ce qui nécessite des substances dont la toxicité est acceptable.

Des compte-rendus ont décrit l'essai de composés 20 contre divers rétrovirus, par exemple le virus de la leucémie de Friend (VLF), un rétrovirus des murinés. Par exemple,

Krieg et coll. (Exp. Cell Res., 116 (1978) 21-29) ont constaté que la 3'-azido-31-désoxythymidine est active contre VLF dans des expériences in vitro, et Ostertag et coll. 25 (Proc. Nat. Acad. Sci. (1974) _71, 4980-85) ont déclaré que, sur la base de l'activité antivirale vis-à-vis de VLF et d'une absence de toxicité cellulaire, la 31-azido-3'-désoxy-thymidine "pourrait avantageusement remplacer la bromodésoxy-uridine dans le traitement médical de maladies provoquées 30 par des virus ADN". Cependant, De Clerq et coll. (Biochem.

Pharm. (1980) 2_9, 1849-1851) ont établi, six ans plus tard, que la 3'-azido-3'-désoxythymidine ne présentait pas d'activité appréciable à 1'encontre d'aucun des virus utilisés dans leurs essais, y compris le virus de la vaccine,HSVI et 35 herpesvirus varicellae (VZV). Glinski et al.(J. Org. Chem. (1973), 38,

4299-4305) signalent certains dérivés de 3'-azido-31-désoxythymidine (infra) et leur pouvoir de blocage de l'action de 1'exoribonucléase des mammifères.

(î

La Demanderesse a maintenant découvert que la 31-azido-31-désoxythymidine est douée d'une activité étonnamment puissante à 1'encontre des rétrovirus de l'être humain, et notamment d'une forte activité à 1'encontre de AIDV, ainsi que cela est prouvé par les résultats expérimentaux donnés ci-après. Cette activité fait que le compos est utile dans la thérapie des infections à rétrovirus de l'être humain.

Ainsi, selon un premier aspect de la présente invention, il est proposé un composé de formule (I) :

HO

(I)

(c'est-à-dire la 3'-azido-31-désoxythymidine) ou un dérivé ■ pharmaceutiquement acceptable de ce composé, pour qu'il soit utilisé dans le traitement ou la prophylaxie d'infections à rétrovirus de l'être humain. Le composé de formule (I) et ses dérivés pharmaceutiquement acceptables sont dénommés ci-après "composés selon l'invention"'.

L'activité de la 3'-azido-31-désoxythymidine contre les rétrovirus de l'être humain a été établie dans divers systèmes d'épreuve in vitro. Par exemple, l'infection par AIDV de la lignée des lymphoblastes humains H9 est empêchée efficacement par des concentrations en 3'-azido-3'-désoxythymidine aussi basses que 0,013 jug/ml, jusqu'à 20 heures après l'infection. L'infection par AIDV de lymphoblastes humains U937, de leucocytes stimulés à la phyto-hémagglutinine et de lymphocytes cultivés du sang périphérique est également empêchée avec des concentrations tout aussi basses. De plus, des expériences de provocation

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menées sur 10 jours en utilisant jusqu'à 5000 virions de AIDV par cellule et des lymphocytes auxiliaires T4 spécifiques du tétanos clonés n'ont montré aucune décroissance des cellules traitées avec la 31-azido-31-désoxythymidine, alors que les cellules non traitées ont été réduites de 5 fois. Les effets cytopathiques étaient également complètement bloqués dans la même lignée cellulaire transformée par HTLV-I et sur-infectée par AIDV.

D'autres études effectuées en utilisant la trans-criptase inverse de AIDV purifiée ont montré que cette enzyme est bloquée par le triphosphate de 3'-azido-3'-désoxythymidine sous l'effet d'un mécanisme d'inhibition compétitive .

Des essais cliniques en phase I ont également montré que la 3'-azido-31-désoxythymidine est capable de franchir la barrière hémato-encéphalique en des quantités cliniquement efficaces. Cette propriété est à la fois inhabituelle et intéressante pour le traitement et la prophylaxie des infections du système nerveux central provoquées par des rétrovirus de l'être humain.

La capacité de la 31-azido-3'-désoxythymidine à modifier l'évolution d'affections malignes d'origine rétro-virale a été démontrée sur un modèle souris, de telle sorte que l'administration de 3'-azido-3'-désoxythymidine empêchait la splénomégalie provoquée par le virus de la leucémie murine de Rauscher, l'équivalent murin de HTLV-I, administré par voie intraveineuse. Dans d'autres expériences, il a été montré que la 3'-azido-31-désoxythymidine inhibe la réplication in vitro de HTLV-I à des concentrations aussi basses que 0,8 jug/ml.

Ainsi, selon un autre aspect préféré de la présente invention, il est proposé d'utiliser un composé selon l'invention dans la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou à la prophylaxie d'infections à rétrovirus de l'être humain.

La présente invention propose en outre un procédé

r pour le traitement ou la prophylaxie du SIDA chez un sujet humain, qui consiste à administrer à ce sujet humain une quantité efficace d'un composé selon l'invention.

La présente invention englobe également un procédé pour le traitement ou la prophylaxie d'infections provoquées par des rétrovirus chez un sujet humain, qui consiste à administrer à ce sujet humain une quantité à effet antiviral d'un composé selon l'invention.

La présente invention propose de plus un composé selon l'invention pour qu'il soit utilisé dans le traitement ou la prophylaxie du SIDA ou d'une infection virale telle que définie ci-dessus.

Des exemples d'infections à rétrovirus de l'être humain que l'on peut traiter ou prévenir conformément à la présente invention comprennent celles dues aux rétrovirus lymphotropes des lymphocytes. T ( HTLV ) , notamment à HTLV-I, HTLV-II et AIDV (HTLV-III). Les affections cliniques que l'on peut traiter ou prévenir conformément à l'invention comprennent le SIDA, le syndrome associé au SIDA et les leucémies et lymphomes positifs à la recherche de HTLV-I. Les sujets pour lesquels le traitement est indiqué comprennent également ceux qui présentent des anticorps anti-AIDV, des infections par AIDV du système nerveux central, LGP et SAS.

Par "dérivé pharmaceutiquement acceptable", on entend n'importe quel sel, ester ou sel d'ester, pharmaceutiquement acceptable, ou n'importe quel autre composé qui, étant administré à un sujet humain, est capable d'apporter (directement ou indirectement) de la 3'-azido-31-désoxythymidine ou un inétabolite ou résidu de celle-ci doué d'activité anti-rétrovirale. Un exemple de composé qui n'est pas un ester est le dérivé dans lequel les atomes de carbone des positions 51 et 2 sont reliés par un atome d'oxygène en formant un groupe anhydro.

Les esters préférés du composé de formule (I) comprennent les esters d'acides carboxyliques, dans les

quels la portion non-carbonylée du groupement ester est choisie parmi les groupes, à chaîne droite ou ramifiée, alkyle, alcoxyalkyle (par exemple méthoxyméthyle), aralkyle (par exemple benzyle), aryloxyalkyle (par exemple phénoxy-méthyle), aryle (par exemple phényle éventuellement substitué par un ou des groupes halogéno, alkyle en C2~C4 ou alcoxy en C^-C^) des esters sulfoniques tels que des dérivés d'alkyl- ou aralkylsulfonyle (par exemple de méthanesulfo-nyle) ; et des esters mono-, di- et triphosphoriques. Pour ce qui est des esters susmentionnés, sauf indication contraire, tous les fragments alkyle présents dans ces esters contiennent avantageusement 1 à 18 atomes de carbone, en particulier 1 à 4 atomes de carbone. Tout fragment aryle présent dans ces esters comprend avantageusement un groupe phényle. Toute référence faite à l'un quelconque des composés ci-dessus englobe également une référence à un sel pharmaceutiquement acceptable de ce composé.

Des expériences ont montré que la 3'-azido-3'-désoxythymidine est transformée in vivo en son 5'-monophos-phate sous l'action d'enzymes cellulaires. Le monophosphate est ensuite encore phosphorylé par d'autres enzymes jusqu'à former le triphosphate en passant par le diphosphate, et d'autres études ont prouvé que c'est la forme triphosphatée de la 3'-azido-3'-désoxythymidine que l'on considère être le véritable terminateur de chaîne dans la transcription inverse de AIDV, comme le met en évidence son effet sur le virus de la myéloblastose aviaire et le virus de la leucémie murine de Moloney. Cette forme inhibe également in vitro la transcriptase inverse de AIDV alors qu'elle n'a qu'un effet négligeable sur 1'ADN-polymérase humaine.

Des exemples des sels pharmaceutiquement acceptables du composé de formule (I) et de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables comprennent des sels de bases, par exemple ceux qui dérivent d'une base appropriée, comme les sels de métaux alcalins (par exemple de sodium), de métaux alcalino-terreux (par exemple de magnésium), d'ammo

nium et de NX* (où X est un groupe alkyle en C^-C4).

La présente invention propose donc de plus les nouveaux dérivés pharmaceutiquement acceptables du composé de formule (I), autres que les dérivés en 5' suivants, à savoir le monophosphate, le monophosphate disodique, le monophosphate 2-cyanoéthy.lique, le triphosphate, le p-toluène-sulfonate, l'acétate, le méthanesulfonate et le dérivé de triphénylméthyle, et ceux où l'atome de carbone en position 5' est lié à un autre dérivé de nucléotide ou nucléoside.

Des exemples particuliers des dérivés pharmaceutiquement acceptables du composé de formule (I) que l'on peut utiliser conformément à la présente invention comprennent le sel monosodique et les esters en 5 ' suivants : monophosphate ; monophosphate disodique ; diphosphate ; triphosphate, acétate ; 3-méthyl-butyrate ; octanoate ; palmitate ; 3-chlorobenzoate ; benzoate ; 4-méthylbenzoate ; hydrogénosuccinate ; pivalate ; et mésylate.

La 3'-azido-3'-désoxythymidine ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de celle-ci (désigné ci-après par "ingrédient actif") peut être administré aux êtres humains pour la prophylaxie ou le traitement d'infections rétro-virales par toute voie appropriée, y compris les voies orale, rectale, nasale, topique (y compris buccale et sublinguale), vaginale et parentérale (y compris sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse et intradermique). On se rendra compte que la voie préférée sera fonction de l'état et de l'âge du receveur, de la nature de l'infection et de l'ingrédient actif choisi.

En général, une dose convenable se situe de 3,0 à 120 mg par kilogramme de poids corporel du sujet et par jour, de préférence de 6 à 90 mg par kilogramme de poids corporel et par jour, et mieux encore de 15 à 60 mg par kilogramme de poids corporel et par jour. La dose voulue est de préférence présentée en deux, trois, quatre, cinq ou six sous-doses ou davantage qui sont administrées à intervalles appropriés s'étendant sur toute la journée.

le

Ces sous-doses peuvent être administrées sous formes poso-logiques unitaires, contenant par exemple 10 à 1500 mg, de préférence 20 à 1000 mg, et mieux encore 50 à 700 mg d'ingrédient actif par forme posologique unitaire.

5 Des expériences sur la 3'-azido-3'-désoxythymi dine suggèrent qu'il faut administrer une dose de façon à atteindre des concentrations plasmatiques de pointe en composé actif qui sont environ 1 à environ 75pM, de préférence environ 2 à environ 50jaM, et mieux encore environ 3 à envi-10 ron 30pM. On peut y parvenir, par exemple, en injectant par voie intraveineuse une solution d'ingrédient actif à 0,1 à 5 %, éventuellement en solution salée, ou en l'administrant par voie orale sous forme d'un bol contenant environ 1 à environ 100 mg/kg de l'ingrédient actif. Les taux sanguins 15 désirés peuvent être maintenus par une perfusion continue de façon à fournir environ 0,01 à environ 5,0 mg/kg/heure ou par des injections intermittentes contenant environ 0,4 à environ 15 mg/kg de l'ingrédient actif.

Bien qu'il soit possible d'administer seul 1 ' in-20 grédient actif, il est préférable de le présenter sous forme d'une formulation pharmaceutique. Les formulations de la présente invention comprennent au moins un ingrédient actif, comme défini ci-dessus, associé à un ou plusieurs supports acceptables de cet ingrédient et éventuellement à d'autres 25 agents thérapeutiques. Chaque support doit être "acceptable" en ce sens qu'il doit être compatible avec les autres ingrédients de la formulation et n'être pas nuisible au malade. Les formulations comprennent celles qui sont adaptées à une administration orale, rectale, nasale, topique (y compris 30 buccale et sublinguale), vaginale ou parentérale (y compris sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse et intradermique). Les formulations peuvent être commodément présentées ; sous forme posologique unitaire et on peut les préparer par l'un quelconque des procédés bien connus dans l'art pharma-35 ceutique. Ces procédés comprennent l'étape consistant à mettre l'ingrédient actif en association avec le support qui

*1

se compose d'un ou plusieurs ingrédients secondaires. En général, on prépare les formulations en mettant uniformément et intimement en association l'ingrédient actif avec des véhicules liquides ou des supports solides finement divisés 5 ou les deux, puis en conformant le produit si nécessaire.

adaptées à l'administration orale peuvent être présentées sous forme d'unités discrètes telles que capsules, cachets ou comprimés, contenant chacune une quantité prédéterminée 10 de l'ingrédient actif ; sous forme de poudre ou de granulés; sous forme d'une solution ou d'une suspension dans un liquide aqueux ou non aqueux ; ou sous forme d'une émulsion huile-dans-eau ou d'une émulsion eau-dans-huile. L'ingrédient actif peut également être présenté sous forme d'un bol, 15 d'un électuaire ou d'une pâte. Les formulations à usage oral peuvent de plus renfermer d'autres agents courants en pratique, tels que des édulcorants, des aromatisants et des épaississants.

20 moulage, éventuellement avec un ou plusieurs ingrédients secondaires. On peut préparer des comprimés en comprimant, dans une machine appropriée, l'ingrédient actif sous une forme à écoulement libre telle qu'une poudré ou des granulés, éventuellement en mélange avec un liant (par exemple 25 la polyvinylpyrrolidone, la gélatine ou 1'hydroxypropyl-méthyl-cellulose), un lubrifiant, un diluant inerte, un conservateur, un désintégrant (par exemple 1'amidon-glycol-late de sodium, la polyvinylpyrrolidone réticulée, la car-boxyméthyl-cellulose sodique réticulée), un surfactif ou 30 un dispersant. On peut préparer des comprimés moulés en moulant, dans une machine appropriée, un mélange du composé réduit en poudre et humidifié par un diluant liquide inerte. Les comprimés peuvent éventuellement être enrobés ou sécables et ils peuvent être formulés de façon à effectuer une libé-35 ration lente ou réglée de l'ingrédient actif qu'ils contiennent, par exemple en utilisant de 1'hydroxypropylméthyl-

Les formulations de la présente invention qui sont

On peut préparer un comprimé par compression ou

cellulose en diverses proportions de façon à obtenir le profil de libération souhaité.

Les formulations adaptées à l'administration topique dans la bouche comprennent des tablettes qui renferment l'ingrédient actif dans une base aromatisée, habituellement du saccharose et de la gomme arabique ou adragante ; des pastilles renfermant l'ingrédient actif dans une base inerte telle que de la gélatine et de la glycérine, ou du saccharose et de la gomme arabique ; et des bains de bouche renfermant l'ingrédient actif dans un véhicule liquide convenable .

Les formulations adaptées à l'administration rectale peuvent être présentées sous forme de suppositoires préparés avec une base appropriée contenant par exemple du beurre de cacao ou un salicylate.

Les formulations adaptées à l'administration vagi nale peuvent être présentées sous forme de pessaires, tampons, crèmes, gels, pâtes, mousses ou formulations à pulvériser contenant, en plus de l'ingrédient actif, les support qui sont connus en pratique pour être appropriés.

Les formulations adaptées à l'administration paren térale comprennent des solutions injectables stériles isotoniques, aqueuses et non aqueuses, qui peuvent contenir des antioxydants, des tampons, des bactériostatiques et des solutés qui rendent la formulation isotonique vis-à-vis du sang du receveur visé ; et des suspensions stériles, aqueuses et non aqueuses, qui peuvent contenir des agents suspendants et des épaississants. Les formulations peuvent être présentées dans des récipients hermétiques pour dose unique ou doses multiples, ,par exemple des ampoules ou flacons, et être conservées en un état desséché par congélation (lyo-phylisé) qui ne nécessite que l'addition du véhicule liquide stérile, par exemple de l'eau pour injections, immédiatement avant usage. Des solutions et suspensions extem-poranées pour injections peuvent être préparées à partir de poudres, granulés et comprimés stériles du type précédemment décrit. A

Les formulations à dose unitaire que l'on préfère sont celles qui contiennent une dose ou unité quotidienne, une sous-dose quotidienne, comme indiqué ci-dessus, ou une fraction appropriée de celles-ci, d'un ingrédient actif.

Les ingrédients administrés peuvent également être utilisés en thérapie conjointement à d'autres médicaments tels que la 9-[[2-hydroxy-l-(hydroxyméthyl)éthoxyJméthyl]-guanine, la 9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)guanine (acylovir), la 2-amino-9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)purine, un interféron comme l'a-interféron, 1'interleukine-2, et le phosphonoformiate (Foscarnet) ou conjointement à une autre thérapie de modulation immunitaire, y compris les transplantations de moelle osseuse ou de lymphocytes ou l'administration de médicaments tels que le levamisole ou la thymosine qui servent à augmenter le nombre et/ou renforcer la fonction des lymphocytes comme il convient.

Il doit être clair qu'en plus des ingrédients spécifiquement mentionnés ci-dessus, les formulations de la présente invention peuvent renfermer d'autres agents classiques en pratique préparatoire.

Le composé de formule (I) et ses dérivés pharmaceutiquement acceptables peuvent être préparés d'une façon classique, par exemple comme décrit dans les références suivantes ou par des procédés analogues : J.R. Horwitz et coll., J. Orq. Chem., 29, (juillet 1964) 2076-78 ; M. Jmazawa et coll., J. Orq. Chem. , 43 (15)(1978) 3044-3048 ; K. A. Watanabe et coll., J. Orq. Chem., 45, 3274 (1980) ; et R.P. Glinski et coll., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 915 (1970), ainsi que par les procédés décrits dans les Exemples.

La présente invention englobe de plus un procédé pour préparer un composé de formule (I) et des dérivés pharmaceutiquement acceptables de celui-ci, qui consiste à (A) faire réagir un composé de formule :

' f1

4

1V

0

0

CH.

3

(II)

HO

(dans laquelle M représente un groupe précurseur du groupe 3'-azido) ou un dérivé de celui-ci (par exemple un ester ou un sel), avec un agent ou dans des conditions servant à transformer ledit groupe précurseur en le groupe azido

(dans laquelle R représente un groupe précurseur du groupe hydroxyle ou d'un groupe dérivé pharmaceutiquement acceptable de celui-ci) avec un agent ou dans des conditions servant 10 à transformer ledit groupe précurseur en le groupe correspondant désiré ;,ou

(C) faire réagir un composé de formule :

5 désiré ; ou

(B) faire réagir un composé de formule :

(III)

0

</

ou un équivalent fonctionnel de celui-ci, avec un composé servant à introduire le cycle de ribofurannosyle désiré à la position 1 du composé de formule (IV) ; ou (D) faire réagir un composé de formule :

0

0

N

CH,

3

R

1

(V)

1

5 (dans laquelle R est un groupe hydroxy ou R comme défini ci-dessus), avec un agent ou dans des conditions servant à transformer ledit composé en un composé selon l'invention ; et ensuite, ou en même temps, à effectuer l'une ou plusieurs des transformations facultatives suivantes : 10 (i) lorsqu'est formée de la 3'-azido-3'-désoxythymidine,

la transformer en un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables,

(ii) lorsqu'est formé un dérivé pharmaceutiquement acceptable de la 31-azido-3'-désoxythymidine, transformer 15 ce dérivé en le composé de formule (I) ou en un autre dérivé de celui-ci.

On notera que, dans le procédé selon l'invention décrit ci-dessus, les composés précurseurs de formules (II) et (III), ainsi que les agents et conditions susmentionnés, 20 sont choisis parmi ceux qui sont connus dans l'art de la chimie de synthèse des nucléosides. Des exemples de tels modes opératoire? de transformation sont décrits ci-après à des fins indicatives, mais il est clair qu'on peut les modifier d'une façon classique en fonction du composé, désiré 25 de formule (I). En particulier, au cas où il est décrit une transformation qui, faute de quoi, entraînerait la réaction indésirable de groupes labiles, ces groupes peuvent alors être protégés d'une façon classique, et les groupes protec-

lé

teurs éliminés après achèvement de la transformation. Ainsi, dans le procédé (A), le groupe M du composé de formule (II) peut par exemple représenter un halogène (par exemple le chlore), ou un radical hydroxy ou organosulfonyloxy, par 5 exemple trifluorométhylsulfonyloxy, méthanesulfonyloxy ou p-toluènesulfonyloxy.

un composé de formule (II) dans lequel le groupe M est un groupe halogéno (par exemple chloro) en configuration thréo 10 (dans lequel le groupe hydroxyle en position 5' est avantageusement protégé, par exemple par un groupe trityle) peut être traité avec, par exemple, de 11azoture de lithium ou de sodium. La matière de départ halogénée (par exemple par le chlore) à la position 3' en configuration thréo peut être 15 obtenue, par exemple, par la réaction du composé correspondant hydroxylé à la position 3' en configuration érythro avec, par exemple, de la triphénylphosphine et du tétrachlorure de carbone, ou en variante par traitement avec un halogénure d1organosulfonyle (par exemple le chlorure de 20 trifluorométhanesulfonyle) pour former un composé correspondant organosulfonyloxylé à la position 3' en configuration érythro qui est ensuite halogéné. En variante, le composé hydroxylé à la position 3' en configuration thréo de formule (II) peut être traité avec, par exemple, de la 25 triphénylphosphine, du tétrabromure de carbone et de 11azoture de lithium pour former le composé correspondant comportant le groupe azido à la position 3' en configuration érythro. Il est ensuite possible de procéder à l'élimination de tout groupe protecteur, par exemple comme ci-dessus. 30 Pour ce qui est du procédé (B), R peut représen ter un groupe hydroxy protégé, par exemple un groupement ester du type visé ci-dessus à propos de la formule (I), en particulier un groupe acétoxy ou un groupe éther tel qu'un groupe trialkylsiloxy, par exemple butyldiméthylsilyl-35 oxy, ou un groupe aralcoxy, par exemple triphénylméthoxy.

Ces groupes peuvent être transformés, par exemole par hydro-

Pour la préparation du composé de formule (I),

ir lyse, en le groupe hydroxy désiré ou bien, par transestéri-fication, être transformés en un autre groupe ester de la 3 ' - azido-31-désoxythymidine.

Pour ce qui est du procédé (C), on peut le mettre 5 en oeuvre, par exemple, en traitant la pyrimidine appropriée de formule (IV) ou un sel ou dérivé protégé de celle-ci,

avec un composé de formule :

(dans laquelle A représente un groupe partant, par exemple acétoxy ou benzoyloxy ou halogéno, tel qu'un groupe chloro, 10 et B représente un groupe hydroxy éventuellement protégé,

par exemple un groupe p-toluènesulfonyloxy), et en éliminant ensuite tous groupes protecteurs.

Concernant le procédé (D), R"*" peut représenter un groupe précurseur tel que décrit ci-dessus à propos de 15 R dans la formule (III). La 3'-azido-3'-désoxythymidine peut alors être obtenue, par exemple, par réaction avec un azoture de métal alcalin, par exemple l'azoture de lithium, avantageusement dans un solvant approprié tel que le dimé-thylsufoxyde humide, ce qui est suivi d'une hydrolyse par 20 un acide ou une base, avantageusement dans des conditions modérées.

La 3'-azido-3'-désoxythymidine peut être transformée en un phosphate ou autre ester pharmaceutiquement acceptable par réaction avec, respectivement, un agent phos-25 phorylant, par exemple POCl^, ou un agent estérifiant approprié, par exemple un halogénure ou anhydride d'acide. Le composé de formule (I), y compris ses esters, peut être transformé en ses sels pharmaceutiquement acceptables de façon classique, par exemple par traitement avec une base appro-30 priée. Un ester ou sel de la 3'-azido-3'-désoxythymidine peut être transformé en le composé apparenté, par exemple par hydrolyse.

ft

10

15

20

25

30

35

Les Exemples non limitatifs suivants sont donnés pour illustrer la présente invention. Tel qu'employé dans les Exemples, le terme "ingrédient actif" désigne un composé de formule (I) ou un dérivé pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.

Exemple 1 : Formulations de comprimés

On prépare les formulations de comprimés A et B suivantes en granulant par voie humide les ingrédients avec une solution de la polyvinylpyrrolidone, puis en ajoutant le stéarate de magnésium et en comprimant le mélange.

Formulation A

(a) Ingrédient actif

(b) Lactose B.P. (Pharmacopée

Britannique)

(c) Polyvinylpyrrolidone B.P.

(d) Glycolate de sodium-amidon

(e) Stéarate de magnésium

Formulation B

(a) Ingrédient actif

(b) Lactose

(c) Avicel PH 101

(d) Polyvinylpyrrolidone B.P.

(e) Glycolate de sodium-amidon

(f) Stéarate de magnésium

Formulation C Ingrédient actif Lactose Amidon

Polyvinylpyrrolidone Stéarate de magnésium mg/comprimé 250

210

15

20 5

500

mq/comprimé 250 150 60

15

20 5

500

mg/comprimé 250

26

9

12 3

300

mq/comprimé 250

26

9

12 3

500

H

On prépare les formulations D et E par compression directe du mélange des ingrédients, le lactose de la formule E étant de la sorte pour compression directe (Dairy Crest-"Zeparox " ) .

Formulation D mg/comprimé

Ingrédient actif 250

Amidon prégélatinisé NF 15 150

400

Formulation E mg/comprimé

Ingrédient actif 250

Lactose 150

Avicel 100

500

Formulation F (Formulation pour libération réglée)

On prépare cette formulation en granulant par voie humide les' ingrédients suivants avec une solution de la polyvinylpyrrolidone puis en ajoutant le stéarate de magnésium et en comprimant le mélange.

mg/comprimé

(a) Ingrédient actif 500

(b) Hydroxypropylméthylcellulose 112

(c) Lactose B.P. 53

(d) Polyvinylpyrrolidone B.P.C. 28

(e) Stéarate de magnésium 7

700

La libération du médicament se produit en une durée d'environ 6 à 8 heures et elle est terminée en 12 heures.

Exemple 2 : Formulations de capsules Formulation A

On prépare une formulation de capsule en mélangeant les ingrédients de la Formulation D de l'exemple 1 ci-dessus et en en remplissant une capsule de gélatine dure à deux parties. La formulation B ci-dessous est préparée d'une manière analogue.

J

Formulation B

mg/capsule

(a) Ingrédient actif 250

(b) Lactose B.P. 143

(c) Glycolate de sodium-amidon 25

(d) Stéarate de magnésium 2

420

Formulation C mg/capsule

(a) Ingrédient actif 250

(b) Macrogol 4000 BP 350

10 600

On prépare ces capsules en fondant le Macrogol 4000 BP, en y dispersant l'ingrédient, actif et en mettant la masse fondue dans des capsules en gélatine 15 dure à deux parties.

Formulation D mg/capsule

Ingrédient actif 250

Lécithine 100

Huile d'arachide 100

20 450

On prépare ces capsules en dispersant l'ingrédient actif dans un mélange de la lécithine et de l'huile d'arachide et en mettant le mélange dans des capsules en gélatine molle élastique.

2 5 Formulation F (Capsule à libération réglée)

On prépare la formule suivante de capsule à libération réglée en extrudant les ingrédients a, b et c, en fragmentant le produit extrudé en pastilles que l'on sèche, puis en enrobant les pastilles séchées d'une mem-30 brane (d) destinée à régler la libération de l'ingrédient actif et en les mettant dans des capsules à deux parties en gélatine dure.

(a) Ingrédient actif

(b) Cellulose microcristalline ^ (c) Lactose BP

(d) Ethyl-cellulose

n

Exemple 3 : Formulations injectables Formulation A

Ingrédient actif Acide chlorhydrique 0,1M Hydroxyde de sodium 0,1M Eau stérile q • s q • s . q . s .

pour pH pour pH pour

0, 200 4,0 à 4,0 à 10 ml

9

7,0 7,0

On dissout l'ingrédient actif dans la majeure partie de l'eau à 35 - 40°C et on ajuste le pH de la solution entre 4,0 et 7,0 avec l'acide chlorhydrique ou 10 l'hydroxyde de sodium selon le cas, puis on complète le volume indiqué avec de l'eau et on filtre sur un filtre stérile à micropores en recueillant le filtrat dans une fiole stérile en verre ambré de 10 ml (type 1), que l'on scelle avec des fermetures stériles. '

15 Formulation B

Ingrédient actif 0,125 g

Tampon de phosphate stérile apyrogène à pH 7 q.s. pour 25ml

Exemple 4 : Injection intramusculaire 20 Ingrédient actif 0,20 g

Alcool benzylique 0,10 g

Glycofurol 75 1,45 g

Eau pour injection 3,00 ml

On dissout l'ingrédient actif dans le glycofurol, 25 on ajoute l'alcool benzylique que l'on dissout et on complète à 3 ml avec l'eau, puis on filtre le mélange sur un filtre stérile à micropores et on le met dans des fioles stériles en verre ambré de 3 ml (type 1), que l'on scelle.

30 Exemple 5 : Ingrédients Ingrédient actif Solution de sorbitol Glycérol

Benzoate de sodium 35 Parfum, pêche 17.42.3169 Eau purifiée q.s. pour

0,2500 g 1,5000 g 2,0000 g 0,0050 g 0,0125 ml 5,0000 ml

VL>

On dissout l'ingrédient actif dans un mélange de glycérol et de la majeure partie de l'eau purifiée, on ajoute à la solution une solution aqueuse du benzoate de sodium puis on ajoute la solution de sorbitol et finale-5 ment le parfum. On complète le volume avec l'eau purifiée et on mélange bien.

Exemple 6 : Suppositoire mg/suppositoire

Ingrédient actif (63 (jm)* 250

Graisse dure, BP (Witepsol H15, Dynamit Nobel) 1770

* L'ingrédient actif est en une poudre dont au moins 90 % des particules ont un diamètre de 63 (jm ou moins.

On fond le cinquième du Witepsol (H15 dans une chaudière à chemise de vapeur sans dépasser la tempéra-15 ture de 45°C. On tamise par ailleurs l'ingrédient actif sur un tamis de 200 ym et on lui ajoute la base fondue tout en mélangeant jusqu'à ce qu'il se soit formé une dispersion homogène. On maintient le mélange à 45°C et on lui ajoute le reste du Witepsol H15 et on agite bien 20 pour assurer un mélange homogène. On fait passer la suspension sur un tamis en acier spécial de 250 {jm, et tout en l'agitant en permanence on le laisse refroidir à 40°C. A une température de 38 à 40°C on met 2,02 g du mélange dans des moules appropriés en matière plastique, 25 et on laisse refroidir les suppositoires à la température ordinaire.

Exemple 7 : Pessaires mg/pessaire

Ingrédient actif 63 ^m 250

Anhydrodextrose 380

30 Fécule de pomme de terre 363

Stéarate de magnésium 7

10

2020

1000

On mélange ces ingrédients et on forme les 35 pessaires en comprimant directement le mélange.

Exemple 8 : 3'-azido-3'-désoxy-5'-O-octanoylthymidine

On ajoute 1,2 équivalent de chlorure d'octanoyle à une solution de 31-azido-31-désoxythymidine dans la pyri-dine à 0°C. On laisse le mélange réactionnel se réchauffer 5 jusqu'à la température ambiante. Lorsque la chromatographie en couche mince (CCM) (CHCl3:MeOH à 20:1 ; sur gel de silice) indique une réaction complète, on verse la solution dans de l'eau glacée. 'On décante la phase aqueuse. On chromatographie l'huile résultante sur gel de silice élué avec 10 CHCl^rMeOH. En évaporant le solvant des fractions appropriées, on obtient le composé du titre sous forme d'une huile.

Analyse : Calculé: C-54,95 ; H-6,92 ; N-17,80 Trouvé : C-54,82 ; H-6,96 ; N-17,66 15 S7,46 (d, 1H, J5 6=1 Hz, 6H); &6,13 (t, 1H, l'H);

54,5-4,2 (m, 3H, 3'H et 5'CH2); $4,0-3,8 (m, 1H, 4'H); 52,3-2,1 (m, 4H, 2'H et (^2)1 d'octanoyle);

6l,81 (d, 3H, J5 6=1,0 Hz , 5CH3);

$1,5-0,6 (m, 13H, 5'octanoyle (CH2)5CH3).

20 Exemple 9 : 5'-acétyl-3'-azido-3'-désoxythymidine

On ajoute 2,1 équivalents de chlorure d'acétyle à une solution de 20 g de 3'-azido-3'-désoxythymidine dans 50 ml de pyridine à la température ambiante. On agite le mélange réactionnel pendant deux heures et le maintient à 0-5 °C pendant 20 heures. On le verse dans de l-'eau glacée sous agitation. On décante la phase aqueuse. On dissout le produit huileux dans de l'eau et l'extrait à l'eau (5 fois), à l'acide chlorhydrique 0,5N, à l'eau (2 fois), et le sèche sur sulfate de magnésium. On filtre la solution et l'évaporé sous vide. On dissout l'huile résiduelle dans du chloroforme, l'applique sur une colonne de gel de silice et la soumet à une chromatographie instantanée en utilisant du méthanol a. 2 % dans le chloroforme. On évapore les fractions contenant le produit et on chromatographie l'huile de nouveau en utilisant un mélange acétate d'éthyle:hexane (6:4 en volume). On évapore sous vide les fractions contenant le produit pour obtenir un solide blanc.

r

25

30

35

2.f

P.F. 96-98 °C

Analyse : Calculé: C-46,60 ; H-4,89 ; N-22,65 Trouvé : C-46,67 -, H-4,94 ; N-22,59 Exemple 10 :

5 En suivant le mode opératoire de l'Exemple 8 ou 9 ,

comme il convient, on prépare les composés suivants à partir de l'halogénure ou anhydride d'acide approprié. 3'-azido-51-O-benzoyl-31-désoxythymidine

Calculé: C-53-68 ; H-4,77 ; N-18,41 10 Trouvé : C-53,81 ; H-4,72 ; N-18,46

P.F. 54-59 °C 3'-azido-3'-désoxy-5'-O-pivoloylthymidine

Calculé: C-5.1,27 ; H-6,03 ; N-19,93 Trouvé : C-51,07 ; H-6,05 ; N-19,83 15 P.F. 9 9-100 °C

31-azido-3'-désoxy-5'-O-(3-méthylbutyryl)thymidine Calculé: C-50,24 ; H-6,13 ; N-19,53 Trouvé : C-50,27 ; H-6,11 ; N-19,49 5 7,46 (d, 1H, J5 6=1,2 Hz, 6H)

20 56,13 (t, 1H, 1 ' H )

64,55-4,15 (m, 3H, 3'H et 5'CH2)

$3,8-4,15 (m, 1H, 4'H)

«52,4-1,78 (m, 3H, 2'H et 5'méthine)

$1,80 (d, 3H, J5 6=1,2 Hz, 5CH3) 25 S 0,9 (d, 6H, J=6,4 Hz, méthyles sur 5'butyryle)

3'-azido-31-désoxy-5'-O-palmitoylthymidine

Calculé: C-61,67 ; H-8,57 ; N-13,85 Trouvé : C-61,85 ; H-8,59 ; N-13,75 §7,45 (d, 1H, J5 6=1,0 Hz, 6H)

30 Î6,12 (t,- 1H, l'H)

$4,5-4,05 (m, 3H, 3'H et 5'CH2)

£ 4,0-3,8 (m, 1H, 4'H)

S2,35-2,11 (m, 4H, 2'H et (CH2)1 de palmitoyle) 6l,8 (d, 3H, J5 6=1,0 Hz, 5CH3) 35 Si,35-0,6 (m, 29H, 5'palmitoyle (CH2)13CH3)

tf

-azido-31-désoxy-51-O-toluylthymidine

Calculé: C-56,10 ; H-4,97 ; N-18,17 Trouvé : C-55,88 ; H-5,00 ; N-18,09 P.F. 73 °C

RMN relevée dans DMSO-d^ :

Si ,95-7,29 (m, 5H, bH, cH, 6H)

$6,16 (t, 1H, l'H)

$4,6-4,4 (m, 3H, 3'H, 5'H)

#4,2-4,0 (m, 1H, 4'H)

52,39 (s, 3H, dCH3)

($1,6 3 (s, 3H, 5CH3)

-O-hydrogénosuccinate de 31-azido-3'-désoxythymidine Calculé: C-44,98 ; H-4,83 ; N-17,96 Trouvé : C-44,90 ; H-4,77 ; N-17,85 RMN relevée dans DMSO-dg :

5 7,46 (s, 1H, 6H)

66,13 (m, 1H, l'H)

54,48-4,40 (m, 1H, 3'H)

54,34-4,20 (m, 2H, 5'H)

53,99-3,94 (m, 1H, 4'H)

51.78 (s, 3H, 5CH3) azido-31-désoxy-5'-mésylthymidine

Calculé: C-38,25 ; H-4,37 ; N-20,28 ; S-9,28 Trouvé : C-38,15 ; H-4,38 ; N-20,19 ; S-9,30 P.F. 253°C (décomposition)

RMN relevée dans DMSO-d,- :

r 6

07,49 (d, 1H, Jg 5=1,0 Hz, 6H)

56,15 (t, 1H, Jx, 2,=6,6 Hz , l'H)

54,54-4,41 (m, 3H, 3'H, 5'H)

54,14-4,02 (m, 1H, 4'H)

53,24 (s, 3H, 5'mésyle CH3)

51.79 (d, 3H, J5 6=1,0 Hz, 5CH3) azido-51-O-(3-chlorobenzoyl)-31-désoxythymidine

Calculé: C-50,31 ; H-3,97 ; N-17,26 ; Cl->8,74 Trouvé : C-50,16 ; H-4,03 ; N-17,13 ; C148V,66 RMN relevée dans DMSO-d, :

te

Sll,31 (s, 1H, 3NH)

(57,98-7,43 (m, 5H, 5'phényle, 6H)

$6,17 (dd, 1H, Jlt 2 =6,1 Hz, Jx, 2b,=7,2Hz, l'H) S 4,68-4,48 (m, 3H, 3'H, 5'H) 5 $4,14-4,11 (m, 1H, 4'H)

<$2,48-2,41 (m, 2H, 2'H)

$1,64 (d, 3H, J5 6=1,2 Hz, 5CH3)

Exemple 11 : 2,5'-anhydro-3'-azido-3'-désoxythymidine

On mésyle 3,0 g (11,2 mmole) de 3'-azido-3'-dés-10 oxythymidine en ajoutant 2,7 ml de chlorure de méthanasul-fonyle à une solution de la matière de départ dans 2 ml de pyridine anhydre. On laisse la réaction évolue^ pendant une heure à 5°C, puis on verse le mélange réactionnel dans de l'eau glacée. On recueille le précipité par filtration. On 15 fait réagir le produit (3'-azido-5'-mésylthymidine) avec

0,78 g (5,6 mmole^ de carbonate de potassium dans 75 ml de diméthylsulfoxyde. On chauffe les corps en réaction dans un bain d'huile à 80"C pendant six heures, puis on les verse dans de l'eau glacée. On extrait le produit dans de l'eau avec 20 de l'acétate d'éthyle. On chasse le solvant sous vide et soumet le produit résultant à une chromatographie instantanée sur gel de silice en éluant avec CHCl^cMeOH (9:1 en volume). Après avoir évaporé le solvant des fractions appropriées, on obtient le composé du titre sous forme d'un 25 solide.

P.F. 184-186 °C

Exemple 12 : 3'-azido-3'-désoxythymidine a ^ 2,3'-anhydrothymidlne

On dissout 85,4 g (0,353 mole) de thymidine dans 30 500 ml de diméthylsulfoxyde anhydre et l'ajoute à 100,3 g (0,529 mole) de N-(2-chloro-l,1,2-trifluoréthyl)diéthyl-amine (préparée suivant le procédé de D.E. Ayer, J. Med.

Chem. , 6_, 608 (1963)). On porte cette solution à 70°C pendant 30 minutes, puis la verse dans 950 ml d'éthanol (EtOH) 35 sous agitation énergique. Le produit précipite de cette solution et on le filtre. On réfrigère le EtOH surnageant

or puis le filtre pour en retirer le composé du titre. P.F. 228-230 °C

b) 3'-azido-3'-désoxythymidine

On met en suspension 25 g (0,1115 mole) de 2,3'-O-anhydrothymidine et 29 g (0,446 mole) de NaN^ dans un mélange de 250 ml de diméthylsulfoxyde et 38 ml d'eau. On chauffe le mélange réactionnel au reflux pendant 5 heures, après quoi on le verse dans 1 litre d'eau. On extrait la solution aqueuse avec EtOAc (3 x 700 ml). On déshydrate sur Na2S04 les extraits obtenus en phase de EtOAc, les filtre, et chasse EtOAc sous vide pour obtenir une huile visqueuse. On agite cette huile avec 200 ml d'eau pour obtenir le composé du titre sous forme d'un solide que l'on recueille par filtration.

P.F. 116-118 °C

Exemple 13 : Sel monosodique de la 3'-azido-3'-désoxythymidine

On dissout environ 1 g de 3'-azido-3'-désoxythymidine dans 50 ml d'eau distillée. On ajuste le pH à 12 avec NaOH IN. On lyophylise à peu près la moitié de la solution. On obtient le composé du titre sous forme d'une poudre lyophilisée .

Analyse (cj_0H12N5Na°4 • 6/10^0) :

Calculé: C-40,03 ; H-4,43 ; N-23,34 ; Na-7,66 Trouvé : C-39,88 ; H-4,34 ; N-23,23 ; Na-7,90 Exemple 14 : Préparation du 5'-monophosphate de 3'-azido-3'-désoxythymidine On dissout 0,5 g (1,87 mmole) de 3'-azido-3'-désoxythymidine dans 5 ml de phosphate de triéthyle et on refroidit le mélange à -5°C. On ajoute 0,685 g (7 mmoles) d'oxychlorure de phosphore en une seule portion à la solution sous agitation rapide que l'on maintient ensuite à -10°C pendant 22 heures. On prélève une portion aliquote et l'ajoute à dë l'hydroxyde d'ammonium concentré. L'analyse de cet échantillon par CCM (cellulose, n-Pr0H:H20 à 7:3 en volume) fait voir qu'il ne reste pas de matière de départ et montre une seule tache fluorescente dont la mobi-

%%

lité est plus faible que celle du nucléoside. On verse le mélange réactionnel dans 20 ml de glace et d'eau. On dispose le tout dans un bain glacé et on ajuste le pH de la solution à une valeur de 7,5 par addition de NaOH 2N. On 5 extrait le mélange basique une fois au chloroforme et une fois à l'éther. On ajuste de nouveau la phase aqueuse pour obtenir un pH de 7,5 et la concentre sous vide pour chasser le solvant organique résiduel. On conserve la substance à -10°C avant de la purifier comme suit : 10 On prépare du charbon désactivé en lavant 100 g de charbon de coprah (particules de 0,074-0,297 mm) avec 500 ml de HC1 IN, 3 litres d'eau, 35 ml d'éthanol à 95 % contenant 3 % de toluène, 600 ml d'éthanol à 95 % et enfin largement à l'eau. On ajoute sous agitation 12 ml de char-15 bon désactivé (charbon humide déposé) à 30 ml de la solution de monophosphate (0,72 g, 1,8 mmole). On décante la liqueur surnageante et lave le charbon avec 150 ml d'eau. On élue le nucléotide du charbon en lavant avec 120 ml d'hydroxyde d'ammonium 1,5M dans de l'éthanol à 50 %. On 20 filtre cette solution à travers un filtre à pores de 0,22 micromètre , la concentre sous vide jusqu'à 10 ml, la filtre à travers une membrane Amicon Centriflo CF-25, et la lyophilise pour obtenir le 5'-monophosphate diammonique de 3'-azido-3'-désoxythymidine sous forme d'un solide. Ce com-25 posé est caractérisé comme un 5 1-monophosphate, de nucléoside par la faculté qu'a la 51-nucléotidase à le dégrader en donnant le nucléoside.

Exemple 15 : 5'-triphosphate de 3'-azido-3'-désoxythymidine et 5'-diphosphate de 3'-azido-3'-désoxythymidine 30 (a) Pyrophosphate de bis(tri-n-butylammonium)

On prépare une colonne de résine pyridinium DOW 50 (résine d'échange d'ions "Dowex" - DOW Chemical Laboratories) en versant 40 ml de résine dans une colonne de 25 cm de diamètre et on la lave à l'eau jusqu'à ce qu'il n'y ait plus 35 de couleur éluée. On dissout 1,12 g (2,51 mmoles) de pyrophosphate décahydraté dans 30 ml d'eau et l'applique sur

V}

la colonne. On élue la colonne à l'eau. On recueille une fraction de 125 ml de 1'éluant qui contient une substance absorbant les ultraviolets. On réduit le volume sous vide à 10 ml et on ajoute 1,2 ml de tri-n-butylamine. On réduit 5 le volume sous vide et sèche le résidu par co-évaporation quatre fois avec de la pyridine. On conserve le produit au réfrigérateur (-5°C).

(b) Forme hydrogénée du 5'-monophosphate de 3'-azido-3'-désoxythymidine

10 On prépare la forme hydrogénée du monophosphate en faisant passer 0,1 g (0,283 mmole) du sel d'ammonium obtenu à l'Exemple 14 dissous dans 6 ml d'eau, à travers une colonne de 1,5 ml (10 équivalents) de DOW 50 H+.

(c) Dérivé phosphoromorpholidé de 3'-azido-3'-désoxythymidine 15 On dissous dans 9 ml d'eau 0,283 mmole de la forme hydrogénée du monophosphate obtenu à l'étape (b). On ajoute 99 jal (1,13 mmole, 4 équivalents) et on chauffe la solution au reflux. On ajoute 0,234 g (1,13 mmole, 4 équivalents) de dicyclohexyl-carbodiimide dissous dans 5 ml de tertiobutanol, 20 en l'espace de 3 heures. On chauffe le mélange réactionnel au reflux pendant une nuit. On refroidit le mélange réactionnel à la température ambiante, le filtre, et chasse les solvants sous vide. On ajoute de l'éthanol et le chasse sous vide quatre fois. On dissout le résidu dans du méthanol et 25 précipite le dérivé phosphoromorpholidé par addition d'éther. On triture quatre fois le précipité avec de 1'éther et le sèche sur un évaporateur rotatif. On obtient le composé du titre.

(d) 5'-triphosphate de 3'-azido-3'-désoxythymidine

30 On sèche le dérivé phosphoromorpholidé obtenu à

l'étape (c) en en chassant quatre fois de la pyridine sous vide. On sèche également le pyrophosphate de bis(tri-n-butyl-ammonium) obtenu à l'étape (a) en en chassant quatre fois de la pyridine sous vide. On dissout le dérivé phosphoro-35 morpholidé dans 5 ml de pyridine et l'introduit dans le récipient qui contient le pyrophosphate réactif. On laisse

3®

la réaction se poursuivre pendant une nuit à la température ambiante. On chasse la pyridine sous vide. On ajoute de l'eau au résidu et la chasse sous vide trois fois. On congèle le résidu.

5 On dégèle le résidu et le dissout dans 50 ml d'eau.

On applique la solution sur une colonne (1 x 10 cm) de DEAE Sephadex A-25 qui a été équilibrée avec du bicarbonate d'ammonium 50mM. On élue les phosphates avec un gradient linéaire de 300 ml de bicarbonate d'ammonium 50-800mM. On rassemble 10 les fractions contenant le nuclétide diphosphaté ainsi que celles contenant le nucléotide triphosphaté. On sèche sous vide chacune des fractions globales de diphosphate et de triphosphate, les redissout dans l'eau, les sèche à nouveau, les redissout dans l'eau et les lyophilise.

15 Exemple 16 : Synthèse Enzymatique de 5'-triphosphate de

3'-azido-3'-désoxythymidine On synthétise le 5'-triphosphate à partir du 5'-diphosphate en utilisant la pyruvate-kinase et la nucléoside-diphosphate-kinase. Le mélange réactionnel contient : 6 mmoles 20 de 5'-diphosphate de 3'-azido-3'-désoxythymidine, 12 mmoles de triphosphate d'adénosine, 40 mmoles de MgCl2, 40 mmoles de sel potassique de pipérazine-N,N'-bis(acide 2-éthane-sulfonique) (tampon PIPES) (pH 6,8), 30 mmoles de pyruvate de phosphoénol, 40 Ul/ml de nucléoside-diphosphate-kinase 25 et 100 Ul/ml de pyruvate-kinase dans un volume final de

5 ml. On fait incuber le mélange réactionnel à 37°C pendant 5 jours. On applique le mélange réactionnel sur une colonne (2,5 x 10 cm) de DEAE Sephadex A-25 qui a été équilibrée avec du bicarbonate d'ammonium. On élue les nucléotides avec 30 un gradient de bicarbonate d'ammonium lOO-lOOOmM. On rassemble les fractions contenant le triphosphate et les évapore sous vide à siccité. On purifie davantage le composé en utilisant une colonne pour chromatographie préparative en phase liquide à haute pression (Whatman, Inc., Magnum 35 9 SAX) éluée avec un gradient de phosphate de potassium lO-lOOmM, pH 3,5. On purifie encore le composé résultant

M

en utilisant une colonne de DEAE Sephadex A-25 comme ci-dessus. On rassemble les fractions contenant le 5'-triphosphate tétrammonique de 31-azido-3'-désoxythymidine, les sèche sous vide, les redissout dans l'eau et les lyophilise 5 pour obtenir le composé du titre.

Exemple 17 : Activité Antivirale (a) (i) Malignité d'origine rétrovirale

10 virus de la leucémie murine de Rauscher, souche RVB3. Le traitement a commencé 4 heuresaprès l'infection à des doses de 80 mg/kg par voie intrapéritonéale toutes les 8 heures ou de 0,5 à 1,0 mg/ml par voie orale dans l'eau de boisson. On a constaté que ce traitement empêchait l'infection des cellules 15 de la rate et l'apparition consécutive de splénomégalie et supprimait également la virémie.

(ii) HTLV-I

On a cultivé conjointement des lymphocytes TM-11 (clone de lymphocytes T sensible à l'infection par HTLV-I) 20 et des cellules irradiées de tumeur MJ, productrices de HTLV-I, comme suit :

a) lymphocytes TM-11 seulement ;

b) lymphocytes TM-11 et cellules de tumeur MJ ;

c) lymphocytes TM-11, cellules de tumeur MJ et 3'-azido-25 3 '-désoxythymidine (3jjM) ;

d) lymphocytes TM-11, cellules de tumeur MJ et 3'-azido-3'-désoxythymidine (9pM) ;

e) lymphocytes TM-11, cellules de tumeur MJ et 3'-azido-3 '-désoxythymidine (27juM).

30 Au jour 18, on a extrait 1'ADN total de chaque culture et l'a mis à digérer avec Bam Hl pour produire un fragment du génome de HTLV-I, indépendant de toute séquence bordante de l'hôte et ayant un poids moléculaire standard de 3,3 kD. On a ensuite sondé le produit de digestion avec 35 du lambda-MT-2 radiomarqué, une sonde standard reconnaissant le fragment Bam Hl delHTLV-l.

On a administre de la 3'-azido-3'-désoxythymidine

4

a des souris BALB/c femelles infectees par 1,5x10 Pfu du

2P

On n'a observé aucune hybridation pour a), ce qui indique une absence de virus dans le témoin non infecté. On a observé un signal puissant avec b), le témoin infecté non traité. On a observé un faible signal avec c) , indiquant 5 une élimination incomplète du virus, et on n'a remarqué aucune hybridation en d) ni en e), ce qui dénote une extermination totale du virus.

On a également sondé chaque culture avec une sonde convenant à la chaîne des récepteurs des lympho-10 cytes T, et on a trouvé un fort signal pour toutes les cultures, démontrant la présence constante de TM-11 pendant toute la durée de l'expérience.

(b) AIDV (SIDA)

(i) Activité sur la Transcriptase Inverse 15 On a testé in vitro le 5'-triphosphate de 3'-azido-

31-désoxythymidine contre la transcriptase inverse de AIDV (AIDV-TI).

On a purifié AIDV-TI tirée de AIDV pastillé et extrait, par élution à travers des colonnes de DEAE et de 20 phosphocellulose. L'activité enzymatique était linéaire durant 60 minutes et stable pendant au moins 2 mois par conservation dans du glycérol à 60 % et 1 mg de sérum-albumine bovine par ml. En utilisant rA-odT(^2-18) comme amorce-modèle, AIDV-TI présentait un pH optimal de 7,0 à 7,3, un 25 optimum de MnCl2 0,3mM et un optimum de MgCl2 -5mM. L'activité en présence de MgCl2 5mM était 10 fois plus grande que l'activité en présence de MnCl2 0,3mM. On a également constaté une activité enzymatique maximale dans KCl 80 à 140mM et NaCl 60 à lOOmM. L'incorporation de [^H]-dTTP 30 était linéaire par rapport à la concentration en enzyme.

Quand on l'a testé, le 5'-triphosphate de 31-azido-3'-désoxythymidine s'est avéré être un inhibiteur compétitif de TI-AIDV, présentant un Ki de 0,04 pM en utilisant rA-odT^12_lg^ comme amorce-modèle. L'enzyme a un Km de 2,81 ^uM

35 pour le dTTP,ce qui suggère que le 5 '-triphosphate de 3'-azido-3'-désoxythymidine se lie plus fortement à l'enzyme que ne le

fait la dTTP.D'autres expériences portant sur les transcrip-tases inverses du virus de la myéloblastose aviaire , du virus de la leucémie murine de Moloney et du SIDA,ont montré que le 5 1-triphosphate de 31-azido-31-désoxythymidine est un bloqueur 5 de .1 'allongement delà chaîne d'ADN.

(ii) Activité Anti-AIDV in vitro

On a testé la 31-azido-3'-désoxythymidine et constaté qu'elle est douée d'activité dans un certain nombre de systèmes d'épreuve in vitro. On a mesuré les effets du médi-10 cament en déterminant l'activité de la transcriptase inverse dans des surnageants provenant de cellules infectées, non infectées, et traitées par le médicament. La 3'-azido-3'-

I

désoxythymidine bloquait efficacement l'infection par AIDV de lignées de lymphoblastes humains H9 et U937, à des con-15 centrations de 2,7 à 0,0013 pg/ml. De même, l'infection de leucocytes normaux stimulés à la phytohémagglutinine et de lymphocytes du sang périphérique cultivés était inhibée à des concentrations en médicament aussi basses que 0,013 jug/ml. Des expériences d'addition et de suppression du médicament 20 dans des cellules H9 ont révélé que la 3'-azido-3'-désoxythymidine est plus efficace lorsqu'elle est présente au moment de l'infection de cellules sensibles par le virus,

mais garde encore la majeure partie de son activité antivirale lorsqu'elle est ajoutée aussi tard que 20 heures 25 après l'infection initiale par AIDV. L'inhibition de la réplication virale était aussi évidente lorsque le médicament était dans le milieu durant seulement la période de 20 heures d'absorption des virus. On observait les effets à 0,13 et 0,013 pg/ml. La 3'-azido-3'-désoxythymidine ne présen-30 tait pas d'activité directe anti-transcriptase inverse à

1'encontre de virions de AIDV purifiés. De même le médicament ne présentait que peu ou pas d'effet sur la production et la libération de virions à partir de la lignée cellulaire H9 chroniquement infectée par AIDV. , 35 (iii) Prévention de 1'Infection par AIDV

On a déterminé comme suit l'aptitude de la 3'-azido-3 '-désoxythymidine à bloquer l'infection de cellules par AIDV.

l*h

On a infecté des lymphocytes auxiliaires T4 positifs au tétanos clonés avec une masse commune d'isolats de AIDV (à des doses de provocation allant jusqu'à 5000 virions/ cellule) et on a contrôlé la survie des cellules après l'in-5 fection. Après 10 jours sous culture, on n'observait aucun effet cytopathique viral dans des lymphocytes T infectés traités avec 8,8 et 1,3 pg/ml de 3'-azido-31-désoxythymidine, alors que des cellules infectées non traitées avaient régressé de 5 fois. On a également évalué la survie des 10 cellules pour une lignée cellulaire transformée par HTLV-I, sur-infectée par AIDV, issue des cellules ci-dessus. A des concentrations de 2,7, 0,27 et 0,13 pg/ml, la 31-azido-31-désoxythymidine bloquait totalement les effets cytopathiques après 7 jours. On a observé des effets de protection à 1'en-15 contre d'infections induites à la fois par des virions libres et par des virus associés à des cellules. A une concentration de 0,27 pg/ml, la 3'-azido-3'-désoxythymidine empêchait également efficacement l'induction d'effets cytopathiques par un isolât Haïtien moins apparenté de AIDV. 20 Exemple 18 : Détermination de la Toxicité

On a administré de la 31-azido-3'-désoxythymidine à des souris ainsi qu'à des rats. La était supérieure

à 750 mg/kg chez les deux espèces.

3S*

Claims (49)

REVENDICATIONS

1.- Composition pharmaceutique qui contient, comme substance active, de l'azido-3' désoxy-31 thymidine, ou un dérivé de celle-ci acceptable du point de vue pharmaceutique, et, pour cette substance, un

5 excipient également acceptable du point de vue pharmaceutique.

2.- Composition selon la revendication 1 dans laquelle l'excipient est une matière autre que l'eau.

10 3.- Composition selon l'une des reven dications 1 et 2 qui est stérile.

4.- Composition selon la revendication 3 qui est conçue pour être administrée par injection.

5.- Composition selon la revendication 4

15 qui est contenue dans un flacon scellé.

6.- Composition selon l'une des revendications 3 et 4 dont l'excipient est de l'eau stérile.

7.- Composition selon l'une des revendications 1 et 2 qui est conçue pour être administrée par

20 la voie orale.

8.- Composition selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 7 qui est présentée sous la forme de comprimés ou de capsules.

9.- Composition selon l'une quelconque

25 des revendications 1, 2 et 3 qui, après avoir été administrée par la voie orale, assure une libération étalée dans le temps de la substance active.

10.- Composition selon la revendication 7 qui renferme en outre une substance aromatisante.

IG

11.- Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 qui contient une dose unitaire de la substance active, ou un multiple de cette dose.

12.- Composition selon la revendication 11 dans laquelle la dose unitaire de la substance active est comprise entre 5 et 1500 mg.

13.- Composition selon la revendication 11 dans laquelle la dose unitaire de la substance active est comprise entre 10 et 1000 mg.

14.- Composition selon la revendication 11 dans laquelle la dose unitaire de la substance active est comprise entre 20 et 700 mg.

15.- Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 dans laquelle la substance active est l'azido-3' désoxy-3' thymidine.

16.- Procédé de préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, procédé selon lequel on associe l'azido-3' désoxy-3' thymidine, ou un dérivé de celle-ci qui soit acceptable du point de vue pharmaceutique, avec l'excipient acceptable du point de vue pharmaceutique.

17. Dérivés de l'azido-3' désoxy-3' thymidine acceptables du point de vue pharmaceutique, qui, après avoir été administrés à l'homme, sont à même de fournir (directement ou indirectement) de l'azido-3' désoxy-3' thymidine, ou un métabolite ou un radical de celle-ci doué d'une activité anti-rétrovirale,

dérivés qui ne font pas partie des dérivés en 5' suivants : monophosphate,monophosphate de disodium, monophosphate de cyano-2 éthyle, triphosphate,p-toluène-sulfonate, acétate, méthane-suifonate et dérivés triphénylméthyliques ainsi que ceux dont l'atome de carbone en 5' de l'azido-3' désoxy-3' thymidine est lié à un autre dérivé de nucléotide ou de nucléoside.

&

18.- Dérivés acceptables du point de vue pharmaceutique, tels que spécifiés à la revendication 17, sous la forme de sels ou d'esters de l'azido-3' désoxy-3' thymidine, ou d'esters de tels sels, qui sont acceptables

5 du point de vue pharmaceutique.

19.- Dérivé selon la revendication 17, pris dans l'ensemble constitué par le diphosphate en 5', le méthyl-3 butyrate en 5', l'octanoate en 5', le palmitate en 5', le chloro-3 benzoate en 5' , le benzoate

10 en 5', 1'hydrogéno-succinate en 5' et le pivalate en 5' de l'azido-3' désoxy-3' thymidine.

20.- Procédé de préparation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, procédé selon lequel :

ou bien

15 (A) on fait réagir un composé répondant à la formule II :

o

(dans laquelle M représente un radical précurseur du radical azido-3'), ou un dérivé de celui-ci (par exemple un ester ou un sel), avec un agent ou dans des conditions aptes à provoquer la conversion du radical précurseur mentionné en le radical azido souhaité,

ou bien

(B) on fait réagir un composé répondant à la formule

III :

0

hn

CH

3

0

n

r

(m)

N

3

5 (dans laquelle R représente un radical précurseur du radical hydroxy ou d'un radical qui en dérive et qui est acceptable du point de vue pharmaceutique) avec un agent ou dans des conditions aptes a provoquer la conversion dudit radical précurseur en le radical correspondant 10 souhaité,

ou bien ou un équivalent fonctionnel de celui-ci, avec un composé apte à introduire le cycle ribofurannosyle voulu à la position 1 du composé de formule IV,

ou bien

(C) on fait réagir un composé répondant à la formule IV

0

H

(IV)

(f

75

(D) on fait réagir un composé répondant à la formule V :

0

n

.ch3

0

R

1

(V)

(dans laquelle R représente un radical hydroxy ou a la

15

signification qui a été donnée ci-dessus pour R), avec un agent ou dans des conditions aptes à provoquer la conversion dudit composé en l'azido-3' désoxy-3' thymidine ou en un dérivé de celle-ci qui soit acceptable du point de vue pharmaceutique,

et

(î) lorsque c'est l'azido-3' désoxy-3' thymidine qui est formée on la transforme en l'un de ses dérivés acceptables du point de vue pharmaceutique, et

(ii) lorsqu'il se forme un dérivé, acceptable du point de vue pharmaceutique, de l'azido-3' désoxy-3' thymidine on transforme éventuellement ce dérivé, en même temps ou ultérieurement, en l'azido-3' désoxy-3' thymidine ou en un autre dérivé de celle-ci.

ou dérivé de celle-ci acceptable du point de vue pharmaceutique, pour le traitement préventif ou curatif d'infections à rétrovirus chez l'homme.

21.- Azido-3' désoxy-3' thymidine,

ko

22.- Azido-3' désoxy-3' thymidine pour le traitement curatif ou préventif d'infections à rétrovirus chez l'homme.

23.- Azido-3' désoxy-3' thymidine -pour 5 le traitement curatif ou préventif du SIDA ("AIDS").

24.- Azido-3' désoxy-3' thymidine pour le traitement curatif ou préventif de la lymphadénopathie généralisée progressive ("PGL").

25.- Azido-3' désoxy-3' thymidine pour

10 le traitement curatif ou préventif du complexe en rapport avec le SIDA.

26.- Azido-3' désoxy-3' thymidine pour le traitement curatif ou préventif d'une infection par AIDV.

15 27.- Azido-4" désoxy-3' thymidine pour le traitement curatif ou préventif d'une infection à HTLV (human T-cell lymphotropic virus).

28.- Azido-3' désoxy-3' thymidine pour le traitement curatif ou préventif d'une infection à

20 HTLV-I ou à HTLV-II.

29.- Azido-3' désoxy-3' thymidine pour le traitement curatif ou préventif de l'état porteur d'AIDV.

30.- Azido-3' désoxy-3' thymidine pour

25 le traitement curatif ou préventif d'un sujet humain ayant des anti-corps anti-AIDV.

31. Dérivés, acceptables du point de vue pharmaceutique, de l'azido-3' désoxy-3' thymidine pour le traitement curatif ou préventif d'une affection

30 telle que spécifiée à l'une quelconque des revendications 22 à 29.

32.- Dérivés acceptables du point de vue pharmaceutique tels que spécifiés à l'une des revendications 21 et 30 sous la forme de sels ou d'esters,

35 acceptables du point de vue pharmaceutique, de l'azido-3* désoxy-3' thymidine.

¥

33.- Application de l'azido-3' désoxy-3' thymidine, ou d'un dérivé de celle-ci acceptable du point de vue pharmaceutique, dans la fabrication d'un médicament pour le traitement curatif ou préventif d'une infection

à rétrovirus chez l'homme.

34.- Application de l'azido-3' désoxy-3' thymidine dans la fabrication d'un médicament pour le traitement curatif ou préventif du SIDA ("AIDS").

35.- Application de l'azido-3' désoxy-3' thymidine dans la fabrication d'un médicament pour le traitement curatif ou préventif de la lymphadénopathie généralisée persistante ("PGL").

36.- Application de l'azido-3' désoxy-3' thymidine dans la fabrication d'un médicament pour le traitement curatif ou préventif du complexe en rapport avec le SIDA (para-SIDA ou "ARC" ou "AIDS-related complex").

37.- Application de l'azido-3' désoxy-3' thymidine selon la revendication 33, application dans laquelle l'infection est une infection à AIDV.

38.- Application de l'azido-3' désoxy-31 thymidine selon la revendication 33, application dans laquelle l'infection est une infection à HTLV ("human T-cell lymphotropic virus").

39.- Application de l'azido-3' désoxy-3' thymidine selon la revendication 33, application dans laquelle l'infection est une infection à HTLV-I ou à HTLV-II.

40.- Application de l'azido-3' désoxy-3' thymidine selon la revendication 33, application dans laquelle l'infection est un lymphome ou une leucémie positive à HTLV-I.

41.- Application de l'azido-3' désoxy-3' thymidine dans la fabrication d'un médicament pour le traitement curatif ou préventif de l'état porteur de AIDV. ^

42.- Application de l'azido-3' désoxy-3' thymidine dans la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un sujet humain ayant des anti-corps anti-AIDV.

43.- Application de dérivés,acceptables du point de vue pharmaceutique, de l'azido-3' désoxy-3' thymidine dans la fabrication d'un médicament pour un traitement curatif ou préventif tel que défini dans l'une quelconque des revendications 33 à 40.

44.- Application de dérivés, acceptables du point de vue pharmaceutique, de l'azido-3' désoxy-3' thymidine selon la revendication 41 sous la forme de sels, d'esters ou de sels de tels esters de l'azido-3' désoxy-3' thymidine, acceptables du point de vue pharmaceutique.

45. Composition contenant de l'azido-3' désoxy-3' thymidine, ou un dérivé de celle-ci acceptable du point de vue pharmaceutique, telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour une application telle que définie dans l'une quelconque des revendications 21 à 32.

46. Application de l'azido-3' désoxy-3' thymidine, ou d'un sel de celle-ci acceptable du point de vue pharmaceutique, selon l'une quelconque des revendications 33 à 44, application dans laquelle le médicament est une composition telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 15.

47.- Composition telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 15, composition dans laquelle la substance active est un composé tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 17 à 19.

48.- Composition telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 15, composition dans laquelle la substance active est un composé qui a été préparé par le procédé de la revendication 20.

49.- Composition, application de cette composition, ou cette composition pour son application selon l'une quelconque des revendications 45 à 48 lorsque la composition en question a été préparée par le procédé de la revendication 16.