HU227303B1 - Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants - Google Patents
Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants Download PDFInfo
- Publication number
- HU227303B1 HU227303B1 HU0301904A HU0301904A HU227303B1 HU 227303 B1 HU227303 B1 HU 227303B1 HU 0301904 A HU0301904 A HU 0301904A HU 0301904 A HU0301904 A HU 0301904A HU 227303 B1 HU227303 B1 HU 227303B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gene
- promoter
- plant
- plants
- dna
- Prior art date
Links
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 title claims abstract description 39
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title claims abstract description 39
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 title abstract description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title description 54
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 281
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 85
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 44
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 88
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 61
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 61
- 108010031746 Dam methyltransferase Proteins 0.000 claims description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 56
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 34
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 30
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 claims description 7
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 6
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 claims description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 24
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 abstract description 20
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 abstract description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 16
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 abstract description 16
- 101710196632 LexA repressor Proteins 0.000 abstract description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000411 inducer Substances 0.000 abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 265
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 81
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 101150047523 lexA gene Proteins 0.000 description 58
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 56
- 101100235354 Pseudomonas putida (strain ATCC 47054 / DSM 6125 / CFBP 8728 / NCIMB 11950 / KT2440) lexA1 gene Proteins 0.000 description 52
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 51
- 239000000047 product Substances 0.000 description 47
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 45
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 44
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 43
- 230000006870 function Effects 0.000 description 34
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 31
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 27
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 26
- 238000011161 development Methods 0.000 description 23
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 23
- 239000002585 base Substances 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 21
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 19
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 18
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 14
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 13
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 101710159129 DNA adenine methylase Proteins 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 11
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 11
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 10
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 10
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 9
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 8
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 8
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 7
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 7
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 7
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 6
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 6
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 6
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 5
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 5
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 101150061009 C1 gene Proteins 0.000 description 4
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 4
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 101800000585 Diphtheria toxin fragment A Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 101150052580 dam gene Proteins 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 3
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 3
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 3
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101150067011 CDC21 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 230000004034 genetic regulation Effects 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 208000017740 grade III prostatic intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 2
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 101000622007 Crotalus adamanteus Snake venom metalloproteinase adamalysin-2 Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000030914 DNA methylation on adenine Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 101150034144 ci gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 230000001631 hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000017346 meiosis I Effects 0.000 description 1
- 230000023439 meiosis II Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- WCYWZMWISLQXQU-UHFFFAOYSA-N methyl Chemical compound [CH3] WCYWZMWISLQXQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- -1 methyl radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000012022 methylating agents Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000023409 microsporogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000885 phytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008119 pollen development Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000005849 recognition of pollen Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000009333 weeding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S47/00—Plant husbandry
- Y10S47/01—Methods of plant-breeding and including chromosome multiplication
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás reverzibilis hímsterilitás kialakítására növényben szövetspecifikus promotert, domináns negatív gént, valamint DNS-kötő proteinhez kapcsolt transzkripciós aktivátort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó génkonstrukció alkalmazásával, valamint eljárás hímsteril növények előállítására. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárásokkal előállított növények is.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható hímsteril növények előállítására, melyek - azonos fajba tartozó hímfertilis növényekkel végzett - keresztezésével hibrid vetőmagvak állíthatók elő.
A találmány szerinti megoldás alkalmazásával a növényi egyedfejlődés úgy módosítható, hogy egy adott növényt lépcsőzetes hatásmechanizmusú szabályozóelemeket és strukturális géneket tartalmazó genetikai konstrukcióval transzformálunk, ami a növény fenotípusának reverzibilis megváltozását eredményezi. Az ilyen célra alkalmas konstrukció szövetspecifikus promotert, domináns negatív gént, valamint - DNS-kötő proteinhez kapcsolt transzkripciós aktivátort kódoló - nukleotidszekvenciát tartalmaz. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során a reverzibilis hímsteril transzgenikus növények előállítására domináns negatív génként DAM-metilázgént, szövetspecifikus promoterként pedig portokspecifikus promotert alkalmaztunk.
Nagy szükség van olyan reverzibilis genetikai rendszer kifejlesztésére, amely - különösen az önbeporzó növények esetében - hímsteril növények létrehozására alkalmas. A hibrid vetőmagvak nagyüzemi méretű előállítása a mezőgazdaság jelentős ágazatává vált. A hibrid vetőmagvakból kikelt növényekben nem jelennek meg azok a heterózishatások, amelyek két - genetikailag különböző - tenyészvonal keresztezése esetében előfordulnak. A hibrid utódnövények jellemzői mindkét szülői vonalénál jobbak, jellemzően az életképesség (vigor), a hozam és az egyformaság tekintetében. A hibrid vetőmagváltozatok a szabadbeporzással előállított vetőmagvakhoz képest sokkal vonzóbbak a növénytermesztők számára, ezáltal piaci értékük is sokkal nagyobb, mint a hagyományos vetőmagvaké.
Az önbeporzással létrejött magvak nélküli hibrid vetőmagvak előállítása céljából olyan beporzást szabályozó eljárásokat kell kifejleszteni, amelyek biztosítják az idegenbeporzást, illetve megakadályozzák az önbeporzást. Az ilyen eljárások közé mechanikus, kémiai és genetikai eljárások tartoznak.
A hibrid vetőmagvak termelésének mechanikai eljárásait akkor alkalmazzák, ha a szóban forgó növény hím- és nőivarú virágai térben elkülönültek, illetve, ha külön - porzós, illetve termős virágú - növényen helyezkednek el. Például a kukoricanövény pollentermelő hímivarú virágai a növény csúcsán lévő virágzatban, nőivarú virágai pedig a szárat körülölelő levelek tövében található virágzatokban helyezkednek el. A kukorica idegenbeporzása a nőivarú szülő „címerezésével” biztosíthat, ami megakadályozza az önbeporzást. Bár a hibrid vetőmagvak előállítására a kukoricához hasonló növények esetében a porzós virág(zat) eltávolítását alkalmazzák, ez az eljárás munkaigényes és költséges - mind a virágzat eltávolítása, mind az annak következményeként bekövetkező hozamveszteség miatt.
A legtöbb gazdasági jelentőségű terménynövény egyetlen virágban funkcionális hím- és nőivarú szerveket egyaránt tartalmaz, így a porzó eltávolítása nem egyszerű feladat. Bár lehetőség van a porzók - pollenkiszabadulás előtti - manuális eltávolítására, a hibridelőállítás e formája rendkívül munkaigényes és drága. Ezzel a módszerrel csak akkor állítanak elő vetőmagvakat, ha az így nyert magvak értéke és mennyisége garantálja a befektetett munkát.
A hibridmagvak előállításának másik általános módja - az életképes pollenek elpusztítására, illetve kialakulásuk megakadályozására szolgáló - vegyszerek alkalmazását foglalja magában. Az ilyen - gametocideknek nevezett - vegyszereket ideiglenes hímsterilitás kialakítására alkalmazzák. A hibrid vetőmagvak gametocidek alkalmazásával történő széles körű előállítását a vegyszerek árával és hozzáférhetőségével, valamint az ilyen eljárások hatásának megbízhatóságával és időtartamával összefüggő problémák korlátozzák. A gametocidek egyik legfőbb hátránya, hogy fitotoxikus hatásúak, melynek súlyossága a növény genotípusától függ. Az ilyen vegyszerekkel kapcsolatos további problémák közé tartozik, hogy a hosszú virágzási periódusú terménynövények esetében nem hatásosak, mivel a kialakuló újabb virágok porzóit nem befolyásolják; ilyen esetekben a vegyszerek ismételt alkalmazására van szükség.
A szántóföldi terménynövények hibrid vetőmagjainak nagyüzemi termelésére alkalmazott jelenlegi eljárások közül számos a beporzás genetikai szabályozásán alapul. A nőivarúként alkalmazott növények vagy nem termelnek pollent, vagy nem képesek a pollen kibocsátására, vagy biokémiailag képtelenek az önmegtermékenyítésre. Az önmegtermékenyítésre nem képes növényeket „öninkompatibilis”-nek nevezzük. Az öninkompatibilitási rendszer alkalmazásával kapcsolatos nehézségek közé tartozik az önmegtermékenyítésre alkalmatlan nőivarú vonalak hozzáférhetőségének és szaporíthatóságának, valamint az öninkompatibilitás stabilitásának problémája. Bizonyos esetekben az öninkompatibilitás kémiailag megszüntethető, vagy az éretlen rügyek - pollenképződést gátló biokémiai mechanizmusok aktiválódása előtt - manuálisan beporozhatok. A deaktiválható öninkompatibilitási rendszerek gyakran nagyon érzékenyek a klimatikus viszonyokra, melyek megszüntetik vagy csökkentik az önbeporzás biokémiai gátlásának hatékonyságát.
A nagyüzemi vetőmagtermelésben szélesebb körű érdeklődésre tarthatnak számot a pollenkontrollon alapuló genetikai mechanizmusok, melyek hímsterilitást okoznak. Az ilyen rendszerek két általános típusba sorolhatók: (a) a „gén okozta” hímsterilitás, ami egy vagy több sejtmagi gén miatt a pollenképződés hibáját eredményezi; és (b) a citoplazmikus genetikai hímsterilitás, melyet általánosan „citoplazmikus hímsterilitásnak” (CMS) neveznek. Ez utóbbi rendszerben a pollenképződést egy citoplazmikus organellum (általában egy mitokondrium) módosításával blokkolják.
HU 227 303 Β1
Bár léteznek citoplazmikus hímsterilitáson alapuló hibridizációs eljárások, nagyüzemi alkalmazhatóságukat számos tényező csökkenti. A CMS-rendszerek egyik példája a citoplazmában elhelyezkedő mitokondriumban végrehajtott specifikus mutáció, amely - megfelelő sejtmagi háttér esetében - az érett pollen képződésének meghibásodását eredményez. Bizonyos esetekben a sejtmagi genetikai háttér kompenzálhatja a citoplazmikus mutációt, miáltal helyreáll a normális pollenképződés. A specifikus sejtmagi „helyreállító” gének a CMS-rendszerrel kezelt mitokondriumot tartalmazó növényekben lehetővé teszik a normális pollenképződést. A citoplazmikus hímsterilitási rendszer nagyüzemi vetőmagtermelésre történő alkalmazása esetén általában három tenyészvonalat használnak: egy hímsteril vonalat (nőivarú szülői vonal); egy „fenntartó” vonalat (amely a hímsteril vonallal azonos genetikai összetételű, de teljesen működőképes mitokondriumot tartalmaz); és egy hímivarú szülői vonalat. A hímivarú szülői vonal a specifikus helyreállító géneket hordozza, így rendszerint „helyreállító vonal”-nak nevezik - ez a vonal a hibridmagvak számára fertilitást biztosít.
A zöldségfélék esetében, melyeknél a hibridből nem vetőmagvak kinyerése a cél, a CMS-rendszer a fertilitás helyreállítása nélkül alkalmazható. Olyan növények esetében, melyeknél a hibrid gyümölcse vagy magja jelenti a kereskedelmi értékű terméket, a hibrid vetőmag fertilitását a hímivarú szülőben specifikus helyreállító génekkel biztosítani kell (vagy a hímsteril növényt be kell porozni). A nem helyreállított fertilitású hibrideket úgy porozzák be, hogy a hibridek közé kis százalékban fertilis hímivarú növényeket helyeznek. A legtöbb növényfaj esetében a citoplazmikus hímsterilitás anyai ágon öröklődik, mivel valamennyi citoplazmikus organellumot a petesejt örökíti, s ez korlátozza a rendszer alkalmazhatóságát.
A CMS-rendszereknek olyan hátrányai vannak, melyek eleve kizárják, hogy a hímsteril növények előállítására egyedüli megoldásként legyenek alkalmazhatók. Például egy adott CMS-típus kukoricában (T-citoplazma) szenzitivitást okoz egy bizonyos gomba fertőzésekor termelődő toxinra. Bár a citoplazmikus hímsterilitási rendszert számos terménynövény esetében alkalmazzák, bizonyos környezeti feltételek mellett alkalmazhatatlanná válnak.
A sejtmagi („gén okozta”) sterilitás domináns és recesszív egyaránt lehet. Hibridmagvak előállítására a domináns sterilitást csak akkor alkalmazható, ha lehetőség van a nőivarú vonal szaporítására (például in vitro klonális szaporítással). A recesszív sterilitás abban az esetben alkalmazható, ha a steril és fertilis növények könnyen megkülönböztethetők. A gén okozta sterilitási rendszerek nagyüzemi alkalmazhatóságát azonban korlátozza a klonális szaporítás, valamint az önmegtermékenyítésre képes növények kigyomlálásának költségessége.
A hímsterilitás indukálásának genetikai eljárásainak kifejlesztése terén különösen előnyös lenne olyan gének felismerése, amelyek képesek megváltoztatni a növények egyedfejlődését, mivel a hibrid vetőmagvak jelenlegi előállítási eljárásainak (így a citoplazmikus hímsterilitási és az öninkompatibilitási, valamint a mechanikus rendszereknek) számos hátrányos tulajdonsága van.
A növények egyedfejlődését módosító genetikai eljárások kutatása a találmány szerinti metilázgének felismerését eredményezte. A specifikus gének vagy promoterek DNS-metilálási mintázatának változásai a génexpresszió megváltozását eredményezik. A DNS metilálása a növények és állatok egyedfejlődése során a génszabályozás egyik faktora.
A metilálási mintázatok, például metilszenzitív CpGtartalmú promoterek (gének) alkalmazásával állapíthatók meg. Az aktív transzkripciót mutató szekvenciák általában kis százalékban metiláltak. Állatokban a metilálási helyek a CpG-helyeknél (gyököknél) módosítva vannak. Baktériumokban és emlősállatokban az adenin (A) és a citozin (C) metilezésének genetikai szabályozását gének vezérlik. Növényekben a metilgyökök a „CXG szekvenciában (amelyben X jelentése A, C vagy T) fordulnak elő, s a metilgyök a citozinhoz kapcsolódik. Az adenin metilálódásának köszönhető inaktiválódás növények esetében nem ismert, különösen nem a GATC szekvenciában lévő adeninnél, amelynek metilálódása egyéb rendszerekben ismeretes.
Bár az idevonatkozó szakirodalomban nem található utalás arra, hogy transzgenikus növényben a kívánt cél elérése érdekében a szövetekben a metilálódás specifikusan vagy más módon indukálható lenne, ismeretes, hogy transzgenikus organizmusokban a promoter metilálása a gén inaktiválását és az organizmus fenotípusának megváltozását okozhatja.
Az irányított metilálás - növényi egyedfejlődés módosításának, így például a hímsterilitás kialakításának eszközeként történő - alkalmazását akadályozhatják a szervezetben mindenütt jelen levő célra általános hatást gyakorló gének expresszáltatásával kapcsolatos nehézségek; ilyenek például a metilázgének, így például az E. coli DNS-adenin-metiláz (DAM), amelynek célszekvenciája a GATC, s amely - a növény káros befolyásolása nélkül - specifikus egyedfejlődési lépések szabályozásának eszközeként alkalmazható. A DAM célszekvenciája számos promoterben megtalálható, így a sejt életképessége szempontjából kulcsfontosságú promoterek és/vagy gének inaktiválása a növény életképessége fenntartásának problémáját okozhatja. A hímsterilitás genetikai eszközökkel történő kialakítására a metilálás csak abban az esetben lehet alkalmas, ha sikerül a - gazdarendszerbe exogén vektor útján bejuttatott - metilálási folyamatot megfelelő módon „kompartmentalizálni. Ennek megfelelően, a találmány szerinti megoldás kidolgozása során eljárásokat és készítményeket fejlesztettünk ki gének (így például a DAM-gén) - növényi egyedfejlődés módosítása érdekében történő - kompartmentalizálására és manipulálására.
A találmány tárgyát képezi egy izolált DNS-molekula, amely olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely szekvencia - amennyiben a DNS-molekula egy rekombináns DNS-konstrukció részét képezi - képes a DNS3
HU 227 303 Β1 szekvencia portokszövetben történő expressziójának szabályozására.
Az izolált molekula a következő nukleotidszekvenciákat tartalmazhatja: a DP5055 Sca-Ncol-fragmensének nukleotidszekvenciáját; az 1. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia 1488. helyén lévő startkodontól 5’-irányban legalább 503 bázispárból álló nukleotidszekvenciát; az 1. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia 1488. helyén lévő startkodonhoz képest 5’-irányban a -503. helytől a -1. helyig terjedő nukleotidszekvenciát; az 1. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia 1488. helyén lévő startkodonhoz képest 5’-irányban a -587. helytől a -1. helyig terjedő nukleotidszekvenciát; az 1. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia 1488. helyén lévő startkodonhoz képest 5’-irányban a -890. helytől a -1. helyig terjedő nukleotidszekvenciát; az 1. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia 1488. helyén lévő startkodonhoz képest 5’-irányban a -503. helytől a -134. helyig terjedő nukleotidszekvenciát.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy rekombináns DNS-konstrukció, amely a következő komponenseket tartalmazza: DNS-szekvencia, amely olyan génterméket kódol, mely expresszálódva gátolja a pollenképződést vagy a pollen működését; operátor, amely a DNS-szekvencia expresszióját vezérli; DNS-kötő proteint kódoló gén, mely protein képes az operátorhoz kötődni és ezáltal a domináns negatív gén transzkripcióját aktiválni; valamint - a DNS-szekvenciához működőképesen kapcsolt - szövetspecifikus promoter.
A találmány szerinti rekombináns DNS-konstrukció a fentieken kívül az alábbi komponenseket tartalmazhatja: DNS-szekvencia, amely olyan génterméket kódol, mely növényben expresszálódva gátolja a pollenképződést vagy a pollen működését; operátor, amely a DNS-szekvencia expresszióját vezérli; valamint a pollenképződés vagy -működés szempontjából kulcsfontosságú sejtekre specifikus promoter, amely működőképesen kapcsolódik az említett DNS-szekvenciához. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a rekombináns DNS-konstrukció tartalmazhat még szelektálható markergént, DNS-kötő régiót kódoló DNSszekvenciát, illetve aktiválódomént kódoló DNS-szekvenciát.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a rekombináns DNS-konstrukció olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely géntermékként citotoxint kódol. Egy további megvalósítási mód szerint a DNS-konstrukció promoterként portokspecifikus promotert tartalmaz, és a következő konstrukciók valamelyikét tartalmazza: DP5814, DP6509, PHP8036, PHP8037 és PHP6520. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a DNS-konstrukció operátorként lexA-operátort tartalmaz. A találmány egy további megvalósítási módjának megfelelően a rekombináns DNS-konstrukció szelektálható markergént is tartalmazhat.
A találmány egy másik megvalósítási módja értelmében a rekombináns DNS-konstrukció - a rekombináns DNS-konstrukció fentebb meghatározott operátorához kötődni képes - DNS-kötő proteint kódoló DNSszekvenciát, valamint e DNS-szekvencia expresszióját szabályozó promotert tartalmaz. A találmány e megvalósítási módja szerinti rekombináns DNS-konstrukció szelektálható markergént is tartalmazhat. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a rekombináns DNS-konstrukció olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely DNS-kötő proteinként lexA-proteint kódol. Egy további megvalósítási mód értelmében a rekombináns DNS-konstrukció promoterként a pollenképződés és a pollenműködés szempontjából kulcsfontosságú sejtekre specifikus promotert tartalmaz. Egy másik megvalósítási mód szerint a rekombináns DNS-konstrukció promoterként portokspecifikus promotert tartalmaz, amely a fentebb meghatározott izolált DNS-molekulát tartalmazhatja. A találmány e megvalósítási módja szerinti konstrukció promoterként indukálható vagy konstitutív promotert egyaránt tartalmazhat, melyek közül konstitutív promoterként a kukorica ubikitinpromotere előnyös. A rekombináns DNS-konstrukció a PHP6522vagy a PHP6555-konstrukció egyaránt lehet.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy expressziós vektor, amely a találmány szerinti izolált DNSmolekulát tartalmazza. A találmány szerinti expressziós vektor génterméket kódoló DNS-szekvenciát is tartalmazhat, amely működőképesen kapcsolódik a promoterhez. A találmány egyik megvalósítási módja szerinti expressziós vektor génterméke gátolja a pollen működését vagy képeződését. A találmány egy további megvalósítási módja értelmében az expressziós vektor olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a promotert illetően heterológ eredetű. Szintén a találmány tárgyát képezik az ez ilyen expressziós vektort tartalmazó transzgenikus növények.
A találmány egy további megvalósítási módja értelmében a portokspecifikus promoter az 5126f-promoter nukleotidszekvenciáját tartalmazza, amely képes a génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának szabályozására. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a géntermék gátolja a pollenképződést, illetve a pollenműködést. Egy másik megvalósítási mód értelmében a géntermék citotoxint tartalmaz.
A találmány tárgyát képezik továbbá egy eljárás reverzibilisen hímsteril növények előállítására, melynek során (i) egy első növényt hímsterilitás kialakítása céljából rekombináns DNS-konstrukcióval transzformálunk, mely konstrukció az alábbi összetevőket tartalmazza: (1) pollenműködést és -képződést gátló génterméket kódoló DNS-szekvencia expresszióját szabályozó lexA-operátort, amely a DNS-szekvenciával működőképesen kapcsolódó szövetspecifikus promoter részét képezi, és (2) lexA-repressszort kódoló DNSszekvenciát, amely működőképesen indukálható promoterhez van kapcsolva; és (ii) a növényt a hímsterilitás visszaállítása céljából indukálóreagens hatásának vetjük alá. A találmány további megvalósítási módjaiban szövetspecifikus promoterként portokspecifikus promotert alkalmazunk. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint portokspecifikus promoterként az 5126-os promoter nukleotidszekvenciáját tartalmazó promotert alkalmazzuk, amely képes egy génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának szabályozá4
HU 227 303 Β1 sára. A találmány további megvalósítási módja értelmében a géntermék domináns negatív gén terméke, például DAM-metiláz lehet.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy hímsteril növény, valamint eljárás hímsteril növény előállítására, melynek során (i) genetikai transzformációra alkalmas pollentermelő növény genomjába olyan rekombináns DNS-molekulát juttatunk be, amely a következő komponenseket tartalmazza: (1) DNS-szekvencia, amely egy növényben expresszálódva pollenképződést vagy pollenműködést gátló génterméket kódol, (2) operátor, amely a DNS-szekvencia expresszióját szabályozza, és (3) a pollenképződés vagy -működés szempontjából kulcsfontosságú sejtekre specifikus promoter, amely működőképesen kapcsolódik a génterméket kódoló DNS-szekvenciához; és (ii) a pollentermelő növényt olyan körülmények között neveljük, melyek a DNSszekvencia expressziója eredményeként elősegítik a hímsterilitás kialakulását. A találmány szerinti megoldás e szempontjának további megvalósítási módjaiban a pollentermelő növény genomjába olyan rekombináns DNS-molekulát juttatunk be, amely géntermékként citotoxint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. A találmány egy másik megvalósítási módjában a pollentermelő növény genomjába olyan rekombináns DNS-molekulát juttatunk be, amely promoterként portokspecifikus promotert tartalmaz. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a rekombináns DNS-molekulában portokspecifikus promoterként az 5126-os promoter nukleotidszekvenciáját tartalmazó promotert alkalmazzuk, amely képes egy génterméket kódoló DNSszekvencia expressziójának szabályozására. Egy másik megvalósítási mód értelmében olyan rekombináns DNS-konstrukciót alkalmazunk, amely operátorként lexA-operátort tartalmaz. A hímsteril növény előállítási eljárása során olyan rekombináns DNS-konstrukciót is alkalmazhatunk, amely a fenti komponenseken kívül szelektálható markergént is tartalmaz.
A találmány tárgyát képezi tovább egy hibrid vetőmag, valamint eljárás hibrid vetőmag hímsteril növényből történő előállítására, melynek során (i) genetikai transzformációra alkalmas pollentermelő növény genomjába olyan rekombináns DNS-molekulát juttatunk be, amely a következő komponenseket tartalmazza: (1) DNS-szekvencia, amely egy növényben expresszálódva pollenképződést vagy pollenműködést gátló génterméket kódol, (2) operátor, amely a DNS-szekvencia expresszióját szabályozza, és (3) a pollenképződés vagy -működés szempontjából kulcsfontosságú sejtekre specifikus promoter, amely működőképesen kapcsolódik a génterméket kódoló DNS-szekvenciához; (ii) a pollentermelő növényt olyan körülmények között neveljük, melyek a DNS-szekvencia expressziója eredményeként elősegítik a hímsterilitás kialakulását; (iii) a hímsteril növényt fertilis hímivarú vonalból származó pollennel keresztezzük, amely genomjába integrálódva olyan rekombináns DNS-molekulát tartalmaz, amely a hímsteril növény rekombináns DNS-ének operátorához kötődni képes - DNS-kötő proteint kódoló DNSszekvenciát, és a DNS-szekvencia expresszióját szabályozó promotert tartalmaz; és (iv) betakarítjuk a helyreállított fertilitású hibrid magvakat. A találmány szerinti megoldás e szempontjának további megvalósítási módjában a pollentermelő növény genomjába olyan rekombináns DNS-molekulát juttatunk be, amely géntermékként citotoxint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. A találmány egy másik megvalósítási módjában a pollentermelő növény genomjába olyan rekombináns DNS-molekulát juttatunk be, amely promoterként portokspecifikus promotert tartalmaz. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a rekombináns DNSmolekulában portokspecifikus promoterként az 5126-os promoter nukleotidszekvenciáját tartalmazó promotert alkalmazzuk, amely képes egy génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának szabályozására. Egy másik megvalósítási mód értelmében olyan rekombináns DNS-konstrukciót alkalmazunk, amely operátorként lexA-operátort tartalmaz. A hímsteril növény előállítási eljárása során olyan rekombináns DNS-konstrukciót is alkalmazhatunk, amely a fenti komponenseken kívül szelektálható markergént is tartalmaz.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás reverzibilis hímsterilitás kialakítására egy növényben, melynek során (i) genetikai transzformációra alkalmas pollentermelő növény genomjába egy első rekombináns DNS-molekulát juttatunk be, amely a következő komponenseket tartalmazza: (1) DNS-szekvencia, amely egy növényben expresszálódva pollenképződést vagy pollenműködést gátló génterméket kódol, (2) operátor, amely a DNS-szekvencia expresszióját szabályozza, és (3) a pollenképződés vagy -működés szempontjából kulcsfontosságú sejtekre specifikus promoter, amely működőképesen kapcsolódik a génterméket kódoló DNS-szekvenciához; (ii) a pollentermelő növényt olyan körülmények között neveljük, melyek a DNS-szekvencia expressziója eredményeként elősegítik a hímsterilitás kialakulását; és (iii) a hímsteril növényt - fertilis hímivarú hibridnövény előállítása céljából - fertilis hímivarú vonalból származó pollennel keresztezzük, amely genomjába integrálódva egy második rekombináns DNS-molekulát tartalmaz, amely - a hímsteril növény rekombináns DNS-ének operátorához kötődni képes - DNS-kötő proteint kódoló DNS-szekvenciát, és a DNS-szekvencia expresszióját szabályozó promotert tartalmaz. A találmány szerinti megoldás e szempontjának további megvalósítási módjaiban a pollentermelő növény genomjába olyan rekombináns DNS-molekulát juttatunk be, amely géntermékként citotoxint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. A találmány egy másik megvalósítási módjában a pollentermelő növény genomjába olyan rekombináns DNS-molekulát juttatunk be, amely promoterként portokspecifikus promotert tartalmaz. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a rekombináns DNS-molekulában portokspecifikus promoterként az 5126-os promoter nukleotidszekvenciáját tartalmazó promotert alkalmazzuk, amely képes egy génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának szabályozására. Egy másik megvalósítási mód értelmében olyan rekombináns DNS-konst5
HU 227 303 Β1 rukciót alkalmazunk, amely operátorként lexA-operátort tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az első, illetve a második rekombináns DNSmolekulaként olyan DNS-molekulát alkalmazunk, amely szelektálható markergént is tartalmaz. Egy további megvalósítási mód értelmében első rekombináns DNS-molekulaként olyan DNS-molekulát alkalmazunk, amelynek DNS-szekvenciája DNS-kötő proteinként lexA-proteint kódol. Egy másik megvalósítási mód szerint második rekombináns DNS-molekulaként olyan DNS-molekulát alkalmazunk, amely promoterként a pollenképződés vagy -működés szempontjából kulcsfontosságú sejtekre specifikus promotert tartalmaz, amely például portokspecifikus promoter lehet. A portokspecifikus promoter olyan izolált DNS-molekulát tartalmazhat, amelynek nukleotidszekvenciája a portok szövetében DNS-szekvencia expressziójának szabályozására képes (amennyiben a DNS-molekula egy működőképes rekombináns DNS-konstrukció részét képezi). A második rekombináns DNS-molekula promoterként indukálható vagy konstitutív promotert egyaránt tartalmazhat, így például a kukorica ubikitinpromoterét.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy transzformáit növényi sejt, valamint egy ilyen növényi sejtből regenerált növény. A találmány szerinti transzformált növényi sejt izolált DNS-molekulát hordozó expressziós vektort tartalmaz, mely DNS-molekula nukleotidszekvenciája egy portokszövetben lévő DNS-szekvencia expressziójának vezérlésére képes, amennyiben a DNS-molekula egy működőképes rekombináns DNSkonstrukció részét képezi. Az expressziós vektor - a promoterhez működőképesen kapcsolva - tartalmazhat még egy génterméket kódoló DNS-szekvenciát is. Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárásokkal előállított hibrid vetőmagvak és steril növények is.
A találmány szerinti megoldás értelmében - a növényi egyedfejlődés módosítására alkalmas kaszkádmechanizmus létrehozása céljából - egy transzformáló genetikai konstrukcióban két típusba tartozó genetikai rendszert kombináltunk. Az egyik rendszer fő komponense egy szövetspecifikus promoter, amely génexpressziót vezérel (például egy transzkripciós aktivátor expresszióját). A másik rendszer olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely pollenképződést vagy pollenműködést gátló génterméket kódol; ilyen DNS-szekvencia lehet például egy domináns negatív gén, például egy metilázgén, melynek expressziós terméke gátolja a pollenműködést vagy a pollenképződést.
A találmány szerinti megoldás lényeges komponense a fenti két rendszer elemeit tartalmazó transzformáló genetikai konstrukció, amely szabályozóelemeket és strukturális géneket foglal magában, melyek egymással kölcsönhatásba lépve - típusuktól függően - megfelelő fenotípus kialakulását eredményezik. Ha valamelyik szülői növényben jelen van a találmány szerinti konstrukció, a találmány szerinti megoldás számos előnye valósulhat meg. Például, a hímsterilitás egy lépésben létrehozható. A találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezése során - növények hímsterilitásának létrehozásakor - olyan genetikai konstrukciót alkalmazunk, amely szövetspecifikus promotert, domináns negatív gént, valamint (a domináns negatív gén aktiválására képes transzkripciós aktivátort magában foglaló) specifikus DNS-szakaszt tartalmaz. A találmány szerinti megoldás - egyik szempontjának megfelelően - új, sejtmagi alapot biztosít a hímsterilitás genetikai manipulációjára.
Közelebbről, a találmány szerinti megoldás céljaira alkalmas genetikai konstrukció domináns negatív gént és egy specifikus DNS-szakaszt tartalmaz, amely (a domináns negatív géntől 5’-irányban elhelyezve) egy DNS-kötő génnel és - az expressziót a fejlődés specifikus stádiumában vagy stádiumaiban szabályozó - promoterrel együtt a domináns negatív gén expresszióját szabályozza.
Domináns negatív génen olyan gént értünk, amelynek expressziója a növényben domináns fenotípust eredményez. Herskowitz (1987) a „domináns negatív’’ kifejezést olyan gén jelzésére alkalmazta, amely mutáns polipeptidet kódol, mely polipeptid túlzott mennyiségben termelődve károsítja a vad típusú gén aktivitását (vad típusú génen olyan gént értünk, amelyből a mutáns gén származik). A találmány leírásában a „domináns negatív gén” kifejezést olyan génre alkalmazzuk, amely a gént felvevő gazdasejt endogén genetikai folyamatát megszakító terméket kódol, és egyetlen kópiában is hatásos, illetve, amely a géntermék megnövekedett mennyiségű termelődése vagy a gén több kópiájának együttes expressziója révén fejti ki hatását. A domináns negatív gének jellemző képviselői a citotoxikus gének, a metilázgének és a növekedésgátló gének. A domináns negatív gének közé tartozik a diftériatoxin A-láncának génje [Czako és An, (1991)], a sejtciklus-megoszlási („cell cycle division”) mutánsok, mint például kukoricában a CDC [Colasanti és munkatársai (1991)], a WT-gén [Farmer és munkatársai (1994)] és a P68-gén [Chen és munkatársai (1991)]. A találmány szerinti genetikai konstrukciókban domináns negatív génként alkalmazható gének példái közé tartoznak a DAM-metilázgének, mint például az E. coliból izolált DAM-metilázgén. Az ilyen alkalmazható gének származási környezetükre károsak vagy ártalmatlanok egyaránt lehetnek. Az alkalmasnak ítélt gén származási forrásában kulcsfontosságú szerepet tölthet be.
A találmány egy jellemző megvalósítási módja szerint a speciális növényi szövetek fejlődésének módosítása céljából DNS-metilálást eredményező domináns negatív génként DAM-metilázgént alkalmazunk. Ezt a gént a pollenképződés szempontjából kulcsfontosságú jelentőségű DNS-szakasz inaktiválására alkalmazzuk, ami hímsteril növény kialakulását teszi lehetővé.
A találmány szerinti első genetikai konstrukció komponenseit a következőkben mutatjuk be.
A konstrukcióban egy bakteriális DNS-kötő proteint (például lexA) kódoló génhez transzkripciós aktivátor van kapcsolva (például a kukorica C1 -génje). Ez a génfúzió [„lexA-C1”; Brent és Ptashne (1985)] a konstrukcióban portokspecifikus promoter (például az 5126-os
HU 227 303 Β1 promoter) szabályozása alatt áll. E genetikai konstrukciót a következőképpen jelöljük:
5126::lexA-C1
A DAM-metilázgén egy - lexA-kötőhelyet (Lex) tartalmazó - minimális 35S-promoter mögött helyezkedik el (35S-lexAop::DAM).
A „35S-lexAop::DAM” és az „5126::lexA-C1” egyetlen - előnyösen szelektálható markergént is tartalmazó
- plazmidban elhelyezkedő két különböző transzkripciós egység.
Amennyiben regenerálható növényfajt alkalmazunk, a találmány szerinti konstrukcióval transzformált tenyészetből ilyen konstrukciót tartalmazó transzgenikus növény regenerálható.
A transzformált sejtből vagy tenyészetből a találmány leírásában ismertetett, illetve szakember számára ismert eljárások alkalmazásával regenerálunk növényt. Ebben az összefüggésben a „tenyészet” kifejezésen összetapadt sejtek halmazát, kalluszt vagy ezek
- tenyésztés céljaira alkalmas - származékait értjük. A regenerálásra a növényfajtól függően más-más eljárást alkalmazunk. A magvakat a regenerált növényből vagy a regenerált növény és azzal azonos fajba tartozó, alkalmas növény - szakember számára ismert nemesítés! eljárásokkal végzett keresztezésével kapott utódnövényekből nyerjük.
Amennyiben a növényeket a találmány szerinti első konstrukcióval transzformáljuk, nagyobb mértékű expressziét kapunk, mint abban az esetben, amikor a transzkripciót csak a DAM-metilázgén portokspecifikus promotere szabályozza. A fokozott expresszié a „lexAC1” transzkripciós aktivátor termelődésének köszönhető, amely specifikusan a Lex-operátorhoz kötődik, és hímsterilitást előidézve - a DAM-metilázgén expresszióját szabályozza. A találmány szerinti eljárások különösen jól alkalmazhatók olyan gének expresszáltatása (például kukoricában), amelyek mutációval módosítva domináns negatív fenotípus megjelenését eredményezik. Az ilyen gének által kódolt géntermékeknek általában nagy mennyiségben kell expresszálódni ahhoz, hogy módosítsák a vad típusú protein működését (például a kukorica CDC21-génje).
E hatás ellenkezőjének elérése céljából az első konstrukciót tartalmazó első növényt egy - az 5126promotert vagy más alkalmas promotert (például egyéb portokspecifikus promotereket, mint például az 5126-os promoter deléciós mutánsait vagy konstitutív promotereket) a csak a „lexA” DNS-kötő proteint expresszáló lexA-génhez kapcsolva hordozó - második konstrukciót tartalmazó második növénnyel keresztezzük. A lexA-protein specifikusan kötődik a LexA-operátorhoz, de nem aktiválja a génexpressziót, hanem éppen ellenkezőleg, gátolja azt, leállítva ezáltal a DAMmetilázgén expresszióját, és hímsterillé téve az első és második genetikai konstrukciót egyaránt tartalmazó növényt.
A találmány szerinti megoldás értelmében az említett rendszer komponenseinek egy másik felhasználási lehetősége szerint az 5126-os szövetspecifikus promoterbe egy lexA-DNS-kötő helyet (azaz lexA-operátort) foglalunk, és a lexA-represszor expresszióját indukálható promoter vezérlése alá helyezzük. Az 5126-os promoter transzkripciójának következtében expresszálódó gének a lexA expresszióját indukáló reagens alkalmazásának hatására gátlás alá kerülnek (represszálódnak). A lexA represszor protein az 5126-os promoterben lévő lexAop-régióhoz kötődik, és ennek következtében leállítja a riportergén expresszióját. Amennyiben ezt a rendszert, például, DAM-metilázgénnel alkalmazzuk, az indukálóreagens alkalmazásával visszaállítható a steril fenotípus, és a növény hímfertilissé válik.
A találmány szerinti, példaként szolgáló genetikai konstrukció a következő komponenseket tartalmazza:
(1) 5126::lexAop::DAM-metiláz;
(2) [hormonnal (auxin, szalicilsav), kémiai reagenssel és hasonlókkal indukálható promoter]::lexA; és (3) szelektálható marker, amely például herbicidvagy antibiotikumrezisztenciát biztosít, vagy kiegészíti az aminosav-, illetve nukleinsavauxotrófok hiányosságait.
Az ilyen konstrukcióval transzformált növények indukálóreagens hiányában hímsteril fenotípusúak, de megfelelő időpontban indukálószer hozzáadásával hímfertilisekké tehetők, s ennek köszönhetően - a fertilitás visszaállítása céljából - nincs szükség a sterilitást biztosító konstrukciót tartalmazó növények, illetve a represszorkonstrukciót tartalmazó növények keresztezésére (lásd U.S. 07/848,465). A herbicidrezisztenciagének példái közé tartozik a BAR- és PAT-gén, melyek a glüfozináttal (bialaphos) szemben alakítanak ki rezisztenciát.
Amennyiben a találmány szerinti konstrukciót szelektálható markerrel, például herbicidrezisztencia-génnel kapcsoljuk össze, az így kapott konstrukció lehetővé teszi, hogy a hímsteril növények hímfertilis növényekből származó pollennel végzett keresztezésével kapott növényeket herbiciddel kezelve elpusztítsuk a szegregálódó hímfertilis növényeket. A herbicidkezelés után csak a hímsteril növények maradnak életben.
E rendszer komponenseinek növény transzformálására alkalmas rekombináns DNS-konstrukcióban történő alkalmazásának egy másik lehetősége, hogy egy szövetspecifikus promoterbe, például az 5126-os portokspecifikus promoterbe (amely pollentermelést vagy pollenműködést gátló génterméket kódoló DNS-szekvenciához, például egy domináns negatív génhez, így például DAM-metilázgénhez működőképesen kapcsolódik) DNS-szekvencia expressziójának szabályozására képes operátort (például lexA-operátort) építünk be. A promoterbe történő beépítés érdekében az operátort
- szakember számára ismert eljárások alkalmazásával
- a találmány szerinti promoterek nukleotidszekvenciájába foglaljuk (5’- vagy 3’-irányban).
A hímsterilitás megszüntetése céljából egy fenti konstrukcióval transzformált növényt egy második növénnyel keresztezünk, amely 5126-os promotert vagy más, megfelelő promotert (például egyéb portokspecifikus promotert, mint például az 5126-os promoter deléciós mutációt hordozó származékát vagy egy konstitu7
HU 227 303 Β1 tív promotert magában foglaló második konstrukciót tartalmaz. A második konstrukció promotere - az első konstrukcióban lévő operátor megkötésére képes DNS-kötő proteint kódoló gén, például a lexA-gén expresszióját szabályozza. Közelebbről, a DNS-kötő protein az első konstrukcióban lévő operátorhoz kötődik, és expressziót elnyomó (represszáló) tulajdonsággal bír, ezáltal leállítja a pollentermelést vagy -működést gátló génterméket kódoló DNS expresszióját, s az első és második genetikai konstrukciót egyaránt hordozó növényt hímfertilissé teszi.
A találmány egy speciális megvalósítási módja értelmében a második konstrukció által kódolt LexA represszor protein az első konstrukcióban lévő 5126-os promoterbe foglalt lexA-operátorhoz kötődik, s ennek eredményeként leállítja a pollenképződést vagy -működést gátló gén (például egy domináns negatív gén, így például a DAM-metiláz) expresszióját, és a transzformáit növényt hímfertilissé teszi.
Ha egy találmány szerinti konstrukciót szelektálható markergénnel - például herbicidrezisztencia-génnel - kapcsolunk össze, a kapott konstrukció lehetővé teszi, hogy a hímsteril növények hímfertilis növényekből származó pollennel végzett keresztezésével kapott növényeket herbiciddel kezelve elpusztítsuk a szegregálódó hímfertilis növényeket. A herbicidkezelés után csak a hímsteril növények maradnak életben.
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítására olyan genetikai konstrukciót alkalmazunk, amely domináns negatív génként metilázgént tartalmaz, amely működőképesen egy szövetspecifikus promoterhez (például az 5126-os portokspecifikus promoterhez) van kapcsolva. Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás növények egyedfejlődésének módosítására, melynek során előnyösen a következő lépéseket végezzük:
(i) egy növényt metilázgént és megfelelő promotert tartalmazó genetikai konstrukcióval transzformálunk; és (ii) a növényt olyan környezetben neveljük, amelyben a metilázgén expresszálódik, miáltal - promotere metilálása révén - módosítjuk egy adott fejlődési folyamat szempontjából kulcsfontosságú gén (vagy gének) expresszióját.
Hímsteril növény előállítása céljából olyan promotert alkalmazunk, amely a génexpressziót csak specifikus szövetben - előnyösen a pollenképződés vagy -működés szempontjából kulcsfontosságú szövetben, például a tapetumban, a portokban vagy a korai mikrospórákban. A találmány szerinti konstrukció a pollenképződés vagy -működés gátlására képes génterméket kódoló DNS-szekvenciaként metilázgént is tartalmazhat. A találmány szerinti megoldás céljaira metilázgénként előnyösen bakteriális DAM-gént (DNSadenin-metiláz-gén) alkalmazunk, amely E. coliból származik. A metilázgének DAM-csoportjába tartozó gének a GATC nukleotidszekvenciában lévő adenint N6-helyzetben metilálják. A konstrukció magában foglal egy cél-DNS-t, és - mivel a cél-DNS révén gátolja az mRNS-szintézist - domináns negatív tulajdonságú.
Szövetspecifikus promoteren olyan promotert értünk, amely specifikus szövetben képes egy DNS-szekvencia (például egy gén) expressziójának szabályozására. Növényekben reverzibilis hímsterilitás kialakítására különösen előnyösek az olyan promoterek, amelyek a pollen szerkezetét és/vagy működését közvetlenül vagy közvetve befolyásoló szövetekben aktívak.
A szövetspecifikus promoterek kutatását elősegítette a növénygenetika új koncepciója, ami a normális növényi mRNS-ből mutáns mRNS kivonására vonatkozik; ez a mutánskivonás olyan mRNS-t eredményez, amely - a genom portokfejlődésért felelős területeiben - eltér a normálistól. A találmány szerinti megoldás céljaira előnyösen alkalmazható egy portokspecifikus promoter, például az 5126-os jelzésű új növényi promoter aktív DNS-szekvenciái.
Az alábbiakban hímsteril növényvonalak - metilázgént és megfelelő promotert tartalmazó genetikai konstrukció alkalmazásával történő - előállítására alkalmas eljárásokat és készítményeket írunk le.
A találmány szerinti genetikai konstrukció növényi sejtmaggenomba történő bejuttatása és a növény hímsteril fenotípus közötti összefüggés vizsgálata céljából a növények DNS-ét „Southern”-féle lenyomattechnikával analizáltuk, s megállapítottuk, hogy a hímsterilitás a találmány szerinti genetikai konstrukció jelenlétének köszönhető.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a szegregálódó hímfertilis növényeket úgy elimináljuk, hogy a szántóföldön ne tudjanak fejlődni. Ennek megvalósítása érdekében szelektálható markerhez konstitutív promotert kapcsolunk, és ezeket - promoter által vezérelt metilázgént tartalmazó - genetikai konstrukcióval együtt bejuttatjuk a növénybe. Ez a rendszer olyan steril beltenyésztett vonal fenntartására alkalmas, melyben egy hímfertilis beltenyésztett növényt egy azonos fajba tartozó hímsteril növénnyel keresztezünk. A nőivarú, hímsteril növényből származó magvak az alkalmazott szelektálóágensre 1:1 arányban szegregálódnak. A szelektálóágenst a növényekre permetezéssel vihetjük fel, s csak azok a növények maradnak életben, amelyek tartalmazzák a szelektálható markergént, ezek pedig azok a növények, amelyeket a metilázkonstrukcióval transzformáltunk.
Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárásokkal előállított hímsteril növények, valamint az ilyen növények magjai.
A találmány szerinti megoldás értelmében - a növényi egyedfejlődés módosítására alkalmas kaszkádmechanizmus létrehozása céljából - egy transzformáló genetikai konstrukcióban két típusba tartozó genetikai rendszert kombináltunk. Az egyik rendszer fő komponense egy szövetspecifikus promoter, amely génexpressziót vezérel (például egy transzkripciós aktivátor expresszióját). A másik rendszer olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely pollenképződést vagy pollenműködést gátló génterméket kódol; ilyen DNS-szekvencia lehet például egy domináns negatív gén, például egy metilázgén, melynek expressziós terméke gátolja a pollenműködést vagy a pollenképződést.
HU 227 303 Β1
A találmány szerinti megoldás lényeges komponense a fenti két rendszer elemeit tartalmazó transzformáló genetikai konstrukció, amely szabályozóelemeket és strukturális géneket foglal magában, melyek egymással kölcsönhatásba lépve - típusuktól függően - megfelelő fenotípus kialakulását eredményezik. Ha valamelyik szülői növényben jelen van a találmány szerinti konstrukció, a találmány szerinti megoldás számos előnye valósulhat meg. Például a hímsterilitás egy lépésben létrehozható. A találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezése során - növények hímsterilitásának létrehozásakor - olyan genetikai konstrukciót alkalmazunk, amely szövetspecifikus promotert, domináns negatív gént, valamint (a domináns negatív gén aktiválására képes transzkripciós aktivátort magában foglaló) specifikus DNS-szakaszt tartalmaz. A találmány szerinti megoldás - egyik szempontjának megfelelően - új, sejtmagi alapot biztosít a hímsterilitás genetikai manipulációjára.
Közelebbről, a találmány szerinti megoldás céljaira alkalmas genetikai konstrukció domináns negatív gént és egy specifikus DNS-szakaszt tartalmaz, amely (a domináns negatív géntől 5’-irányban elhelyezve) egy DNS-kötő génnel és - az expressziét a fejlődés specifikus stádiumában vagy stádiumaiban szabályozó - promoterrel együtt a domináns negatív gén expresszióját szabályozza.
Domináns negatív génen olyan gént értünk, amelynek expressziója a növényben domináns fenotípust eredményez. Herskowitz (1987) a „domináns negatív” kifejezést olyan gén jelzésére alkalmazta, amely mutáns polipeptidet kódol, mely polipeptid túlzott mennyiségben termelődve károsítja a vad típus gén aktivitását (vad típusú génen olyan gént értünk, amelyből a mutáns gén származik). A találmány leírásában a „domináns negatív gén” kifejezést olyan génre alkalmazzuk, amely a gént felvevő gazdasejt endogén genetikai folyamatát megszakító terméket kódol, és egyetlen kópiában is hatásos, illetve, amely a géntermék megnövekedett mennyiségű termelődése vagy a gén több kópiájának együttes expressziója révén fejti ki hatását. A domináns negatív gének jellemző képviselői a citotoxikus gének, a metilázgének és a növekedésgátló gének. A domináns negatív gének közé tartozik a diftériatoxin A-láncának génje [Czako és An, (1991)], a sejtciklus-megoszlási mutánsok, mint például kukoricában a CDC [Colasanti és munkatársai (1991)], a WT-gén [Farmer és munkatársai (1994)] és a P68-gén [Chen és munkatársai (1991)]. A találmány szerinti genetikai konstrukciókban domináns negatív génként alkalmazható gének példái közé tartoznak a DAM-metilázgének, mint például az E. coliból izolált DAM-metilázgén. Az ilyen alkalmazható gének származási környezetükre károsak vagy ártalmatlanok egyaránt lehetnek. Az alkalmasnak ítélt gén származási forrásában kulcsfontosságú szerepet tölthet be.
A találmány egy jellemző megvalósítási módja szerint a speciális növényi szövetek fejlődésének módosítása céljából DNS-metilálást eredményező domináns negatív génként DAM-metilázgént alkalmazunk. Ezt a gént a pollenképződés szempontjából kulcsfontosságú jelentőségű DNS-szakasz inaktiválására alkalmazzuk, ami hímsteril növény kialakulását teszi lehetővé.
A találmány szerinti első genetikai konstrukció komponenseit a következőkben mutatjuk be.
A konstrukcióban egy bakteriális DNS-kötő proteint (például lexA) kódoló génhez transzkripciós aktivátor van kapcsolva (például a kukorica C1 -génje). Ez a génfúzió [„lexA-C1”; Brent és Ptashne (1985)] a konstrukcióban portokspecifikus promoter (például az 5126-os promoter) szabályozása alatt áll. E genetikai konstrukciót a következőképpen jelöljük:
5126::lexA-C1
A DAM-metilázgén egy - lexA-kötőhelyet (Lex) tartalmazó - minimális 35S-promoter mögött helyezkedik el (35S-lexAop::DAM).
A „35S-lexAop::DAM” és az „5126::lexA-C1” egyetlen - előnyösen szelektálható markergént is tartalmazó
- plazmidban elhelyezkedő két különböző transzkripciós egység.
Amennyiben regenerálható növényfajt alkalmazunk, a találmány szerinti konstrukcióval transzformált tenyészetből ilyen konstrukciót tartalmazó transzgenikus növény regenerálható.
A transzformált sejtből vagy tenyészetből a találmány leírásában ismertetett, illetve szakember számára ismert eljárások alkalmazásával regenerálunk növényt. Ebben az összefüggésben a „tenyészet” kifejezésen összetapadt sejtek halmazát, kalluszt vagy ezek
- tenyésztés céljaira alkalmas - származékait értjük. A regenerálásra a növényfajtól függően más-más eljárást alkalmazunk. A magvakat a regenerált növényből vagy a regenerált növény és azzal azonos fajba tartozó, alkalmas növény - szakember számára ismert nemesítés! eljárásokkal végzett keresztezésével kapott utódnövényekből nyerjük.
Amennyiben a növényeket a találmány szerinti első konstrukcióval transzformáljuk, nagyobb mértékű expressziét kapunk mint abban az esetben, amikor a transzkripciót csak a DAM-metilázgén portokspecifikus promotere szabályozza. A fokozott expresszié a „lexAC1 transzkripciós aktivátor termelődésének köszönhető, amely specifikusan a Lex-operátorhoz kötődik, és hímsterilitást előidézve - a DAM-metilázgén expresszióját szabályozza. A találmány szerinti eljárások különösen jól alkalmazhatók olyan gének expresszáltatása (például kukoricában), amelyek mutációval módosítva domináns negatív fenotípus megjelenését eredményezik. Az ilyen gének által kódolt géntermékeknek általában nagy mennyiségben kell expresszálódni ahhoz, hogy módosítsák a vad típusú protein működését (például a kukorica CDC21-génje).
E hatás ellenkezőjének elérése céljából az első konstrukciót tartalmazó első növényt egy - az 5126promotert vagy más alkalmas promotert (például egyéb portokspecifikus promotereket, mint például az 5126-os promoter deléciós mutánsait vagy konstitutív promotereket) a csak a „lexA” DNS-kötő proteint expresszáló lexA-génhez kapcsolva hordozó - második konstrukciót tartalmazó második növénnyel keresztez9
HU 227 303 Β1 zük. A lexA-protein specifikusan kötődik a LexA-operátorhoz, de nem aktiválja a génexpressziót, hanem éppen ellenkezőleg, gátolja azt, leállítva ezáltal a DAMmetilázgén expresszióját, és hímsterillé téve az első és második genetikai konstrukciót egyaránt tartalmazó növényt.
A találmány szerinti megoldás értelmében az említett rendszer komponenseinek egy másik felhasználási lehetősége szerint az 5126-os szövetspecifikus promoterbe egy lexA-DNS-kötő helyet (azaz lexA-operátort) foglalunk, és a lexA-represszor expresszióját indukálható promoter vezérlése alá helyezzük. Az 5126-os promoter transzkripciójának következtében expresszálódó gének a lexA expresszióját indukáló reagens alkalmazásának hatására gátlás alá kerülnek (represszálódnak). A lexA represszorprotein az 5126-os promoterben lévő lexAop-régióhoz kötődik, és ennek következtében leállítja a riportergén expresszióját. Amennyiben ezt a rendszert, például, DAM-metilázgénnel alkalmazzuk, az indukálóreagens alkalmazásával visszaállítható a steril fenotípus, és a növény hímfertilissé válik.
A találmány szerinti, példaként szolgáló genetikai konstrukció a következő komponenseket tartalmazza:
(1) 5126::lexAop::DAM-metiláz;
(2) [hormonnal (auxin, szalicilsav), kémiai reagenssel és hasonlókkal indukálható promoter]::lexA; és (3) szelektálható marker, amely például herbicidvagy antibiotikumrezisztenciát biztosít, vagy kiegészíti az aminosav, illetve nukleinsavauxotrófok hiányosságait.
Az ilyen konstrukcióval transzformált növények indukálóreagens hiányában hímsteril fenotípusúak, de megfelelő időpontban indukálószer hozzáadásával hímfertilisekké tehetők, s ennek köszönhetően - a fertilitás visszaállítása céljából - nincs szükség a sterilitást biztosító konstrukciót tartalmazó növények, illetve a represszorkonstrukciót tartalmazó növények keresztezésére (lásd U. S. 07/848,465). A herbicidrezisztenciagének példái közé tartozik a BAR- és PAT-gén, melyek a glüfozináttal (bialaphos) szemben alakítanak ki rezisztenciát.
Amennyiben a találmány szerinti konstrukciót szelektálható markerrel, például herbicidrezisztencia-génnel kapcsoljuk össze, az így kapott konstrukció lehetővé teszi, hogy a hímsteril növények hímfertilis növényekből származó pollennel végzett keresztezésével kapott növényeket herbiciddel kezelve elpusztítsuk a szegregálódó hímfertilis növényeket. A herbicidkezelés után csak a hímsteril növények maradnak életben.
E rendszer komponenseinek növény transzformálására alkalmas rekombináns DNS-konstrukcióban történő alkalmazásának egy másik lehetősége, hogy egy szövetspecifikus promoterbe, például az 5126-os portokspecifikus promoterbe (amely pollentermelést vagy pollenműködést gátló génterméket kódoló DNS-szekvenciához, például egy domináns negatív génhez, így például DAM-metilázgénhez működőképesen kapcsolódik) DNS-szekvencia expressziójának szabályozására képes operátort (például lexA-operátort) építünk be.
A promoterbe történő beépítés érdekében az operátort
- szakember számára ismert eljárások alkalmazásával
- a találmány szerinti promoterek nukleotidszekvenciájába foglaljuk (5’- vagy 3’-irányban).
A hímsterilitás megszüntetése céljából egy fenti konstrukcióval transzformált növényt egy második növénnyel keresztezünk, amely 5126-os promotert vagy más, megfelelő promotert (például egyéb portokspecifikus promotert, mint például az 5126-os promoter deléciós mutációt hordozó származékát vagy egy konstitutív promotert magában foglaló második konstrukciót tartalmaz. A második konstrukció promotere - az első konstrukcióban lévő operátor megkötésére képes DNS-kötő proteint kódoló gén, például a lexA-gén expresszióját szabályozza. Közelebbről, a DNS-kötő protein az első konstrukcióban lévő operátorhoz kötődik, és expressziót elnyomó (represszáló) tulajdonsággal bír, ezáltal leállítja a pollentermelést vagy -működést gátló génterméket kódoló DNS expresszióját, s az első és második genetikai konstrukciót egyaránt hordozó növényt hímfertilissé teszi.
A találmány egy speciális megvalósítási módja értelmében a második konstrukció által kódolt LexA represszor protein az első konstrukcióban lévő 5126-os promoterbe foglalt lexA-operátorhoz kötődik, s ennek eredményeként leállítja a pollenképződést vagy -működést gátló gén (például egy domináns negatív gén, így például a DAM-metiláz) expresszióját, és a transzformáit növényt hímfertilissé teszi.
Ha egy találmány szerinti konstrukciót szelektálható markergénnel - például herbicidrezisztencia-génnel kapcsolunk össze, a kapott konstrukció lehetővé teszi, hogy a hímsteril növények hímfertilis növényekből származó pollennel végzett keresztezésével kapott növényeket herbiciddel kezelve elpusztítsuk a szegregálódó hímfertilis növényeket. A herbicidkezelés után csak a hímsteril növények maradnak életben.
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítására olyan genetikai konstrukciót alkalmazunk, amely domináns negatív génként metilázgént tartalmaz, amely működőképesen egy szövetspecifikus promoterhez (például az 5126-os portokspecifikus promoterhez) van kapcsolva. Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás növények egyedfejlődésének módosítására, melynek során előnyösen a következő lépéseket végezzük:
(i) egy növényt metilázgént és megfelelő promotert tartalmazó genetikai konstrukcióval transzformálunk; és (ii) a növényt olyan környezetben neveljük, amelyben a metilázgén expresszálódik, miáltal - promotere metilálása révén - módosítjuk egy adott fejlődési folyamat szempontjából kulcsfontosságú gén (vagy gének) expresszióját.
Hímsteril növény előállítása céljából olyan promotert alkalmazunk, amely a génexpressziót csak specifikus szövetben - előnyösen a pollenképződés vagy -működés szempontjából kulcsfontosságú szövetben, például a tapetumban, a portokban vagy a korai mikrospórákban. A találmány szerinti konstrukció a pollen10
HU 227 303 Β1 képződés vagy -működés gátlására képes génterméket kódoló DNS-szekvenciaként metilázgént is tartalmazhat. A találmány szerinti megoldás céljaira metilázgénként előnyösen bakteriális DAM-gént (DNS-adeninmetiláz-gén) alkalmazunk, amely E. coliból származik. A metilázgének DAM-csoportjába tartozó gének a GATC nukleotidszekvenciában lévő adenint N6-helyzetben metilálják. A konstrukció magában foglal egy cél-DNS-t, és - mivel a cél-DNS révén gátolja az mRNS-szintézist - domináns negatív tulajdonságú.
Szövetspecifikus promoteren olyan promotert értünk, amely specifikus szövetben képes egy DNSszekvencia (például egy gén) expressziójának szabályozására. Növényekben reverzibilis hímsterilitás kialakítására különösen előnyösek az olyan promoterek, amelyek a pollen szerkezetét és/vagy működését közvetlenül vagy közvetve befolyásoló szövetekben aktívak.
A szövetspecifikus promoterek kutatását elősegítette a növénygenetika új koncepciója, ami a normális növényi mRNS-ből mutáns mRNS kivonására vonatkozik; ez a mutánskivonás olyan mRNS-t eredményez, amely - a genom portokfejlődésért felelős területeiben - eltér a normálistól. A találmány szerinti megoldás céljaira előnyösen alkalmazható egy portokspecifikus promoter, például az 5126-os jelzésű új növényi promoter aktív DNS-szekvenciái.
Az alábbiakban hímsteril növényvonalak - metilázgént és megfelelő promotert tartalmazó genetikai konstrukció alkalmazásával történő - előállítására alkalmas eljárásokat és készítményeket írunk le.
A találmány szerinti genetikai konstrukció növényi sejtmaggenomba történő bejuttatása és a növény hímsteril fenotípus közötti összefüggés vizsgálata céljából a növények DNS-ét „Southern”-féle lenyomattechnikával analizáltuk, s megállapítottuk, hogy a hímsterilitás a találmány szerinti genetikai konstrukció jelenlétének köszönhető.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a szegregálódó hímfertilis növényeket úgy elimináljuk, hogy a szántóföldön ne tudjanak fejlődni. Ennek megvalósítása érdekében szelektálható markerhez konstitutív promotert kapcsolunk, és ezeket - promoter által vezérelt metilázgént tartalmazó - genetikai konstrukcióval együtt bejuttatjuk a növénybe. Ez a rendszer olyan steril beltenyésztett vonal fenntartására alkalmas, melyben egy hímfertilis beltenyésztett növényt egy azonos fajba tartozó hímsteril növénnyel keresztezünk. A nőivarú, hímsteril növényből származó magvak az alkalmazott szelektálóágensre 1:1 arányban szegregálódnak. A szelektálóágenst a növényekre permetezéssel vihetjük fel, s csak azok a növények maradnak életben, amelyek tartalmazzák a szelektálható markergént, ezek pedig azok a növények, amelyeket a metilázkonstrukcióval transzformáltunk.
Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárásokkal előállított hímsteril növények, valamint az ilyen növények magjai.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1. ábrán az 5126-os promoter genomi kiónjának kódolórégiójától 5’-irányban lévő régiót (az 5126-os promoter promoterelemeit tartalmazó nukleotidszekvenciát) tartalmazó nukleotidszekvenciát mutatjuk be (1. azonosító számú szekvencia). Az 5126-os klón kódolószekvenciája az 1488. helyen lévő ATG startkodonnál kezdődik.
A2. ábrán a DP5130-plazmid térképét mutatjuk be. Ez a plazmid a kukorica - Nhel-deléciót tartalmazó - 5126-os promoterét a szentjánosbogár-luciferáz-génhez kapcsolva tartalmazza.
A 3. ábrán az 5126-os promoter deléciós mutánsainak relatív aktivitását mutatjuk be. A deléció helyét mutató számok a transzlációs startkodonhoz viszonyítva értendők.
A 4. ábrán az 5126-os promoter és deletált fragmenseinek szövetspecifitását mutatjuk be.
Az 5. ábrán grafikonon mutatjuk be a DP5814-plazmidban alkalmazott -503 P5126 deléciós mutáns fejlődési stádium specifitását. A rövidítések jelentése a következő: Pre=premeiotikus stádium; Mei1=meiózis I; Mei2=meiózis II; «kvartett: QR=kvartettfelszabadulás; EU=korai egymagvú stádium; EMU=korai-közép egymagvú stádium; LMU=kései-közép egymagvú stádium.
A 6. ábrán az E. coli DAM-metilázhoz kapcsolt deléciós 5126-os promotert, valamint dupla CaMV-3S-promotert, BAR-génhez fuzionált ADHI-intront és pinll-terminátort tartalmazó DP5814-plazmid térképét mutatjuk be.
A 7. ábrán az E. coli lexA202-gént tartalmazó P87BspHI-plazmid térképét mutatjuk be. A lexA202-gén egy új BspHI-helyen belül mutagenizált ATG-kodont tartalmaz.
A 8. ábrán az L121-plazmid térképét mutatjuk be.
Ez a plazmid dupla CaMV-35S-promotert, a kukorica C1-génjének hibridjéhez (lexA202) fuzionált ADHI-intront és pin I l-terminátort tartalmaz.
A 9. ábrán a DP5817-plazmid térképét mutatjuk be. Ez a plazmid dupla CaMV-35S-promotert, lexA202-génhez fuzionált ADHl-intront és pinIl-terminátort tartalmaz.
A 10. ábrán a DP6232-plazmid térképét mutatjuk be. A DP6232-plazmid - lexA-kötőhelyet tartalmazó - minimális méretű CaMV-35S-promotert (-33), ADH1-intront, szentjánosbogár-luciferázt és pinIl-terminátort tartalmaz.
A 11. ábrán a DP6509-plazmid térképe látható, mely plazmid minimális méretű CaMV11
HU 227 303 Β1
35S-promoterrel (-33) együtt lexA-kötőhelyet, ADH1-intront, DAM-metilázgént és pinll-terminátort, továbbá lexA202-C1-génhez fuzionált 5126-os promotert és szelektálható markerkonstrukciót (CaMV-35S::BAR) tartalmaz.
A 12. ábrán oszlopgrafikonon mutatjuk be az embriogén kukoricasejtek szuszpenziójában
- különböző DNS-dózisok jelenlétében
- megfigyelt lexA202-C1-gén aktiválást és a lexA-közvetítette repressziót. Az x tengely alatt feltüntetett számok a DNS relatív mennyiségét jelzik.
A 13. ábrán a PHP6522-plazmid térképét mutatjuk be. Ez a plazmid az £ co//'lexA-génhez fuzionálva az 5126-os promoter deléciós mutánsát, továbbá dupla CaMV35S-promotert, BAR-génhez fuzionált kukorica-ADH1-intront, valamint pinllterminátort tartalmaz.
A 14. ábrán a PHP6555-plazmid térképe látható.
Ez a plazmid £ coli lexA-génhez fuzionált kukorica ubikitinpromotert és -intront, valamint dupla CaMV-35S-promotert, BAR-génhez fuzionált kukoricaADH1-intront és pinll-terminátort tartalmaz.
A 15. ábrán a PHP6520-plazmid térképét mutatjuk be, mely plazmid minimális méretű CaMV-35S-promoterrel (-33) együtt lexA-kötőhelyet, ADH1-intront, corynebakteriofág diftériatoxin A-alegységet és gén-7 terminátort, továbbá lexA202C1-génhez fuzionált 5126-os promotert és szelektálható markerkonstrukciót (CaMV-35S::BAR) tartalmaz.
A 16. ábrán a PHP8036-plazmid térképét mutatjuk be. Ez a plazmid deléciós 5126-os promotert, minimális méretű CaMV-35Spromoterrel (-33) együtt lexA-kötőhelyet, £ coli DAM-metilázgént és pinllterminátort, valamint szelektálható markerkonstrukciót (ubikitin:PAT) tartalmaz.
A 17. ábrán a PHP8037-plazmid térképét mutatjuk be. A PHP8037-plazmid 5126-os promotert, minimális méretű CaMV-35Spromoterrel (-33) együtt lexA-kötőhelyet, £ coli DAM-metilázgént és pinllterminátort, valamint szelektálható markerkonstrukciót (ubikitin:PAT) tartalmaz.
A 18. ábrán az 5126-os cDNS nukleotidszekvenciáját (23. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be. A cDNS feltételezett transzlációs startkodonja a 73. nukleotidnál van.
A találmány tárgyát egy genetikai konstrukció alkalmazási eljárása képezi, mely konstrukció - egy DNSkötő helyen domináns negatív gént aktiválva működőképes - transzkripciós aktivátort és gént; domináns negatív gént; valamint megfelelő promotereket (például, DNS-kötő helyen működőképes - növényi egyedfejlődés módosításában, például hímsterilitás kialakításában hatásos - gént vezérlő szövetspecifikus promotereket) tartalmaz. A transzgenikus növényekben alkalmas domináns negatív gének közé citotoxingének, metilázgének és növekedésgátló gének tartoznak. A domináns negatív gének közé tartozik a diftériatoxin A-láncának génje [Czako és An, (1991)], a sejtciklus-megoszlási mutánsok, mint például a CDC a kukoricában [Colasanti és munkatársai (1991)], a WT-gén [Farmer és munkatársai (1994)] és a P68-gén [Chen és munkatársai (1991)]. A találmány egy jellemző megvalósítási módja szerint domináns negatív génként DAM-metilázgént alkalmazunk, amelynek expressziós terméke a növény DNS-ében lévő adeninek metilálását katalizálja. A metilált adeninek nem befolyásolják a sejtek életképességét, s csak azokban a szövetekben találhatók meg, amelyekben a DAM-metilázgén expresszálódott, mivel a növényi DNS normális esetben nem tartalmaz metilált adenineket. A DNS-kötés céljára alkalmas egyik rendszer a lexA-C1-rendszer. Általában a konstrukció exogén, és megfelelő promotereket tartalmaz.
A hímsteril növények kialakítása érdekében különösen hasznos az egyedfejlődés módosítása. A hímsteril növények előállítási eljárása szerint egy növényi sejtet metilázproteint kódoló szensz gént tartalmazó - rekombináns molekulával (genetikai konstrukcióval) transzformálunk. A konstrukcióban a fejlődés szabályozásának módjától függően kiválasztott promotert alkalmazunk. Az egyik ilyen stratégia szerint a metilázgént - portokspecifikus promoter alkalmazásával - specifikusan portokszövetben expresszáltatjuk. Hímsteril növény előállítása céljából a transzformált sejtet - hagyományos eljárások alkalmazásával (lásd az „Anyagok és eljárások” szakaszt) - teljes növénnyé regeneráljuk.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint úgy állítunk elő hímsteril növényt, hogy egy metilázgént olyan promoter vezérlése alá helyezzük, amely specifikusan a pollenképződés és/vagy -működés szempontjából kulcsfontosságú sejtekben expresszálódik.
A találmány leírásában az „exogén kifejezésen olyan anyagot értünk, amely környezetében idegennek minősül; esetünkben ez a kifejezés elsősorban olyan genetikai konstrukciókra vonatkozik, amely a gazdanövény normális genetikai rendszerében nem található meg, vagy amely nagyobb mennyiségben expresszálódik, mint endogén állapotban.
A „megfelelő promoter kifejezésen olyan szövetvagy sejtspecifikus promotert értünk, amely a génexpressziót a pollenképződés vagy -működés szempontjából kulcsfontosságú sejtekben (így például tapetumsejtekben, pollenanyasejtekben és korai mikrospórákban) vezérli.
A találmány egyik - pollenképződés vagy -működés szempontjából kulcsfontosságú sejtek szelektív módosítását célzó - megvalósítási módja értelmében egy DNS-kötő proteint kódoló gén vagy egy metiláló
HU 227 303 Β1 szensz gén szabályozására olyan promotert alkalmazunk, amely a génexpressziót specifikus sejtben vagy szövetben, például tapetumsejtben vezérli.
Ebben a vonatkozásban megfelelő promoteren olyan szövetspecifikus szabályozóelemet értünk, amely csak a tapetumszövetben teszi lehetővé az expressziót. Az ilyen promoterek közé tartozik az 5126-os klónból származó, fentebb említett 5126-os promoter, amely csak a portokszövetben teszi lehetővé az adott DNSszekvencia expresszióját. Az 5126-os promoter az 5126-os genomi klón (lásd 1. ábra) kódolórégiójától 5’-irányban lévő nukleotidszekvenciákat tartalmaz, melyek képesek egy DNS-szekvencia expresszióját portokszövetben szabályozni vagy vezérelni. Az 5126-os promoter deléciós mutánsai, valamint e promoter nukleotidszekvenciájának specifikus - portokszövetben a kívánt szelektív expressziót eredményező - régiói (jellemzésüket lásd az 1. példa B szakaszában) szintén alkalmasak a találmány szerinti megoldás céljaira. Szintén alkalmazható a G9-, SGB6- és TA39-promoter. A TA39-promoterek izolálását és alkalmazását az „Anyagok és eljárások” szakaszban ismertetjük részletesen.
A találmány leírásában egy növény „hímsterilitása” 100%-os sterilitást jelent, amit az életképes pollen felszabadulásának hiánya okoz. A hímsteril állapot szakember számára ismert eljárásokkal állapítható meg, például a pollenkibocsátás meghatározásával, illetve csíráztatási tesztekkel.
A „portokspecifikus promoter” olyan DNS-szekvencia, amely egy hozzákapcsolódó gén transzkripcióját a portokszövetben nagyobb mennyiségben biztosítja, mint a növény néhány más vagy összes szövetében. Az ilyen promoter előnyösen csak a portokokban vezérli a gén expresszióját. Például, az 5126-os promoter csak portoksejtekben expresszálódik. Egy gén portokspecifikus promotere a gén expresszióját csak a portokszövetben vezérli, más szövetekben (így például gyökérben vagy coleoptilban) nem. Az ilyen specifitású promoterek leírása megtalálható, például, a 93810455.1 számú európai közzétételi iratban.
Az „operátor” (vagy „DNS-kötő hely”) kifejezésen olyan DNS-molekulát értünk, amely egy struktúrgén 5’-vége felé helyezkedik elő, és olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amelyet egy - aktiváló vagy represszáló funkciójú - DNS-kötő protein felismer és megköt. A represszorprotein rokon operátorával történő kötődése a struktúrgén transzkripciójának gátlását eredményezi. Például, a lexA-gén olyan represszorproteint kódol, amely a lexA-operátorhoz kötődik.
Az „izolált DNS-molekula” kifejezés olyan DNSfragmensre vonatkozik, amely nincs egy organizmus genomi DNS-ébe integrálódva. Az izolált DNS-molekulák kémiai eljárásokkal szintetizálhatók.
Az „expresszió” kifejezés valamilyen géntermék bioszintézisét jelenti. Például, egy struktúrgén esetében az expresszió a struktúrgén mRNS-sé történő átírását (transzkripcióját) és az mRNS egy vagy több polipeptiddé történő transzlációját jelenti.
A „klónozóvektor” olyan DNS-molekula (így például plazmid, kozmid vagy bakteriofág), amely egy gazdasejtben önálló replikációra képes. A klónozóvektorok jellemzően tartalmaznak egy vagy néhány restrikciós felismerési helyet, melyeknél előre meghatározható módon - a vektor kulcsfontosságú biológiai funkciójának elvesztése nélkül - idegen DNS-szekvenciák inszertálhatók. A klónozóvektorok tartalmaznak továbbá markergént is, amely az ilyen vektorral transzformált sejtek azonosítására és szelektálására alkalmazható. A markergének jellemzően olyan gének, amelyek tetraciklin- vagy ampicillinrezisztenciát biztosítanak.
Az „expressziós vektor” olyan DNS-molekula, amely egy gazdasejtben expresszálódó gént tartalmaz. Az ilyen vektorban a gén expresszióját rendszerint bizonyos szabályozóelemek, így például konstitutív vagy indukálható promoterek, szövetspecifikus szabályozóelemek és erősítőszekvenciák vezérlik. Az ilyen szabályozóelemekkel együtt jelen lévő génről azt mondjuk, hogy „működőképesen kapcsolódik” a szabályozóelemekhez.
A találmány szerinti megoldás előnyös megvalósítási módjait az alábbiakban kísérleti példákon keresztül szemléltetjük. A találmány leírása alapján szakember számára kézenfekvő, hogy az általunk feltárt speciális megvalósítási módokban számos olyan változtatás hajtható végre, melyekkel továbbra is azonos vagy hasonló eredmények nyerhetők. Nyilvánvaló, hogy az ilyen megoldások nem térnek el a találmányi gondolat lényegétől és az igényelt oltalmi körön belül maradnak.
1. példa
Az 5126-os promoter izolálása és karakterizálása
A) Eljárások
A portokspecifikus promoter izolálására alkalmazott eljárás kukorica esetében újnak számit. A génizolálás kivonási eljárása csak azon fejlődési stádium meghatározása után alkalmazható, amelyben a megfelelő portokspecifikus gén expresszálódhat, s így - a megfelelő gén izolálása céljából - a fejlődési küszöb előtt és után mRNS gyűjthető.
A hímfertilis kukoricából, illetve a hímsteril kukoricából származó portokok részletes összehasonlítása azt mutatta, hogy a portok-mRNS - közvetlenül a mikrospóra degenerációja előtti - kivonása kizárólag portokspecifikus mRNS-eket eredményez. Hímsteril növények portokjaiból közvetlenül a mikrospórák leépülése előtt - össz-RNS-t izoláltunk. Az „Ms44” domináns hímsteril mutáns esetében ez a mikrosporogenezis kvartett stádiumában vagy ahhoz közeli stádiumban lévő portokok összegyűjtését jelenti. A fertilis testvérnövények portokjait ugyanilyen fejlődési stádiumban gyűjtöttük össze. Az mRNS forrásaként hímfertilis és hímsteril növényeket gyűjtöttünk össze.
(1) RNS-izolálás
Az RNS izolálását a szakember számára ismert guanidin-izotiocianátos eljárással végeztük.
(2) mRNS-izolálás
Az mRNS izolálását az Invitrogentől származó oligo-dT oszlop alkalmazásával hajtottuk végre.
HU 227 303 Β1 (3) cDNS-könyvtárak előállítása
A cDNS-könyvtárakat az „Ms44” domináns hímsteril mutáns törzs, illetve annak hímfertilis testvértörzsének [ms44; mindkét törzs a „Maize Stock Center’-től (University of Illinois) szerezhető be] hímivarú virágzataiból (kukoricacímer) származó mRNS-ből az Invitrogen állította elő (pCDNAII-vektor alkalmazásával, BstXI-helyekre történő kétirányú klónozási eljárással).
(4) Kivonás
A kivonást az Invitrogen 2.3 változatának „The Subtractor I” ismertetőjében leírtak szerint, „driver”-ként a hímsteril domináns könyvtárból származó jelölt cDNS, „tester”-ként pedig jelöletlen hímfertilis könyvtárat alkalmaztunk (lásd „Anyagok és eljárások” részt). Ezt az új könyvtárat 5-ös könyvtárnak neveztük el, s várakozásaink szerint egyedi hímfertilis cDNS-eket tartalmazott.
(5) Egyedi kiónok
Az 5-ös könyvtárból véletlenszerűen kiónokat izoláltunk, a kapott inszerteket géltisztítottuk, P32 alkalmazásával random hexamerjelölést végeztünk, és nitro-cellulózon „slot-blot lenyomatokat készítettünk. Az azonos kiónokat kereszthibridizációval küszöböltük ki. Az 5126-os klón az 5-ös kivont könyvtárból szelektált kiónok egyike volt. Ezt a kiónt - portokspecifitásának biztosítása céljából - nem kukoricacímerből származó cDNS-sel hibridizáltattuk.
(6) Teljes hosszúságú cDNS izolálása
A teljes hosszúságú 5126-os klón kinyerése céljából egy részleges 5126-os cDNS-klónt izoláltunk, s ezt az m13-as univerzális láncindító (M13 UP; 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’; 2. azonosító számú szekvencia) és az „m13” reverz láncindító (M13 RP; 5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’) alkalmazásával szekvenáltuk. A részleges 5126-os klón 594 bázisos 27 nukleotidból álló poliA+-farkat is magában foglaló inszertet tartalmaz. A könyvtár előállítása érdekében teljes RNS-t és mRNS-t izoláltunk. A cDNS-könyvtárat „Uni-Zap XR” irányított klónozórendszer (EcoRI->Xhol) alkalmazásával a Stratagene állította elő. A teljes hosszúságú 5126-os cDNS kinyerése érdekében a részleges 5126-os cDNS-ből származó Eagl-fragmenssel 1*106 plakk-képző egységet („plaque forming unit”; PFU) szkríneltünk [gazdabaktériumként az ER1647törzset (NEB) alkalmaztuk]. Tíz pozitív kiónt homogén állapotúvá tisztítottunk. A pBluescript SK(-) fágemid „Uni-2ap XR” vektorból történő in vivő kivágásával plazmidokat állítottunk elő („Stratagene Lambda Zap Instruction Manual 14. oldal). A p5126—5-klónt a „United States Biochemical Company” szekvenálta; a kapott szekvenciát a 18. ábrán mutatjuk be. Mindkét DNS-szál teljes szekvenálása a részleges cDNS-ével azonos szekvenciát eredményezett. A részleges cDNS-sel „northern biot” analízist végeztünk, melynek eredményeként körülbelül 1,5 kb-os transzkriptumhosszúságot állapítottunk meg. A p5126—5-klón hosszúsága 1,485 kb, ami azt mutatja, hogy teljes vagy majdnem teljes hosszúságú cDNS-ről van szó.
(7) Genomi kiónok izolálása
A B73-as beltenyésztett kukoricavonalból genomi DNS-könyvtárat készítettünk; ennek során a DNS-t részlegesen Sau3A1-endonukleázzal emésztettük, és a ,,λ DASH II” (Stratagene) BamHI-helyére klónoztuk. A részleges 5126-os cDNS Eagl-fragmensével 1 *106 plakk-képző egységet szkríneltünk [gazdabaktériumként az ER1647-törzset (NEB) alkalmaztuk]. Három szkrínelési ciklust követően három kiónt homogén állapotban izoláltunk. E λ-klónok DNS-ét a Bellomy és Record által leírt eljárással [Bellomy és Record (1989)] izoláltuk, és a restrikciós helyeket feltérképeztük. Mindhárom klón azonosnak bizonyult, s hosszúságuk körülbelül 18 kb volt.
B) Az 5126-os promoter karakterizálása (1) „Northern”-analízis
A hatnapos csíranövényekből származó elsárgult levelekből, gyökerekből és zöld levelekből, valamint premeiotikus stádiumú portokokat tartalmazó címerekből, meiotikus stádiumú portokokat tartalmazó címerekből, kvartettől az egymagvú mikrospórastádiumig terjedő stádiumba tartozó portokokat tartalmazó címerekből és kukoricacső-hajtásokból származó kukorica poliA+ mRNS-t tartalmazó „Northern”-membránok teszteléséhez próbaként a részleges 5126-os cDNS Eaglfragmensét alkalmaztuk. Az Eagl-fragmenst - „Enhanced Chemiluminescense” rendszer (ECL; Amersham) alkalmazásával - tormaperoxidázzal jelöltük. A próba hibridizálását és a membrán mosását az a gyártó ECLrendszerhez mellékelt útmutatásai szerint végeztük. A cDNS-próba a hozzávetőleg 1,6 kb-os - csak a kvartettől az egymagvú mikrospóra stádiumig terjedő stádiumba tartozó portokokat tartalmazó címerekből származó mRNS-ek között megtalálható (hozzávetőleg 1,6 kb-os) transzkriptumokhoz hibridizálódott.
(2) Szekvenciavizsgálat
A lambda-DASHII-ben három olyan genomi kiónt izoláltunk, melyek az 5126-os cDNS-hez hibridizálódtak. A három kiónt 5125.4-nek, 5126.5-nek és 5126.8nak neveztük el.
Az 5126.8-as kiónból hozzávetőleg 5 kb-os Hindlllfragmenst izoláltunk, s ezt a „Bluescriptll KS+ vektor (Stratagene) Hindlll-helyére szubklónoztuk, miáltal két plazmidot állítottunk elő (DP4769 és DP4770), melyek a Hindlll-fragmenst ellenkező orientációban tartalmazták. A kapott két plazmid egy-egy szálát az m13-as univerzális láncindító, az m13-as reverz láncindító és a DO776-oligonukleotid (5’-CCTTCATCAGCTTCTGGCAG-3’; 4. azonosító számú szekvencia) alkalmazásával szekvenáltuk. A DO776 szekvenciája az 5126-os cDNS-inszert 5’-oldali szakaszából származik. A DP4770-plazmid kettős szálú szekvenciáját úgynevezett „láncindító-sétáltatással” („primer walking”) kaptuk, melynek során a következő oligonukleotidokat alkalmaztuk: DO990: 5’-AGATCTCGGCCAGGCCCTTG-3’ (5. azonosító számú szekvencia); CWG4770: 5-GAGTTGATGAAGTGA-3’ (6. azonosító számú szekvencia); PG2-2: 5-GAGATCAATCAGCTAGAGG-3’ (7.
HU 227 303 Β1 azonosító számú szekvencia); és PG2-3: 5-TAAACCTAAGGCC-3’ (8. azonosító számú szekvencia).
A DP4770-plazmid Hindlll-helytől a DO990-szekvenciával szomszédos régióig terjedő szakaszának szekvenciája 1594 bázisból áll.
Az 5126.8-as genomi klónból hozzávetőleg 6 kb-os Sacl-fragmenst izoláltunk, s ezt a „Bluescriptll KS+” vektor (Stratagene) Sacl-helyére inszertáltuk, miáltal két plazmidot kaptunk, melyek a Sacl-fragmenst ellenkező orientációban tartalmazták. A Sacl-fragmens 1207 bázis hosszúságban átfedő a DP4769- és DP4770-plazmidban lévő Hindlll-fragmenssel. Ez az átfedés a DP4769- és DP4770-plazmid - 5126-os cDNS-inszerttel homológiát mutató - régiójától 5’-irányban található. A DP5053-plazmid 2106 bázisból álló szekvenciáját úgynevezett „láncindító-sétáltatással” („primer walking”) kaptuk, melynek során a következő oligonukleotidokat alkalmaztuk:
PG2-4: 5’-AATAGCCTAATTTATTAG-3’ (9. azonosító számú szekvencia); PG2-5: 5’-ACATGTTTCAAGTTCAA-3’ (10. azonosító számú szekvencia); PG2-5C: 5’-CTTGTCAGAAGTTGTC-3’ (11. azonosító számú szekvencia); és PG2-6C: 5’-CAACCATTACCGATGAA-3’ (12. azonosító számú szekvencia).
Az 5126-os gén további kódolószekvenciáinak kinyerése céljából 5’RACE-láncindító-hosszabbítást végeztünk. A kukorica hímivarú virágzatából származó poliA-RNS-sel végzett láncindító-hosszabbításhoz - a DP4770-plazmid szekvenciájából származó DO1168oligonukleotid (5’-ACGAGCGGACGCACGACAG-3’; 13. azonosító számú szekvencia) felhasználásával az 5’RACE-rendszert (Gibco BRL) alkalmaztuk. A Taql-DNS-polimerázzal (Perkin-Elmer) végzett polimeráz-láncreakcióhoz a DP4770-plazmidból származó, 5’-TCCGTCGCCATCTGCGTCAC-3’ szekvenciájú (14. azonosító számú szekvencia) beillesztett („nested”) láncindítót és a DO805 horgony („anchor”) láncindítót (5’-CACGCGTCGACTAGTACGGGIIGG GIIGGGIIG-3’; 15. azonosító számú szekvencia) alkalmaztuk. Az 5’RACE-terméket a pT7Blue(R)-vektorba (Novagen) szubklónoztuk. A PCR-terméket tartalmazó egyik kiónt CGR3B-nek neveztük el. Ezt a plazmidot a DO805, a DO1398 és az m13-as univerzális láncindítókkal szekvenáltuk. Az 5’RACE-PCR-inszert 412 bázis hosszúnak bizonyult. Az új A632-könyvtár majdnem teljes hosszúságú cDNS-e, illetve a B73-könyvtár genomi kiónja és az eredeti klón között polimorfizmus figyelhető meg.
A CGR3B-klónból származó szekvencia a DP4770plazmid 586 bázisával megegyező, és a genomi szekvenciában 123 bázisos intron van jelen. Az intron nagymértékben konzervált intron-„splice”-hely motívumokat (5’-GT és 3’-AG) tartalmaz. A szekvencia többi részével azonos leolvasási keretben egy feltételezett startkodon található, amely egy startkodonmotívumban (CGATGG) helyezkedik el. A CGR3B szekvenciája a feltételezett startkodontól közvetlenül 5’-irányban viszonylag sok AT ismétlődést tartalmaz, ami az 5’-oldali nem transzlálódó cDNS-szekvenciák jellemzője. A CGR3B-szekvenciában a feltételezett startkodontól
5’-irányban 90 nukleotid található, ami növényekben az 5’-oldali nem transzlálódó régiók jellemző hosszúsága. Ezen túlmenően, a CGR3B-szekvencia homológ szakaszának 5’-vége a DP4770-plazmidban egy valószínű TATA-„box” (TATATA) 3’-irányban 35 bázis távolságra helyezkedik el. Az 5126-5-szekvencia átfedő a CGR3B-szekvenciával; a CGR3B 5’-irányban további 43 bázist tartalmaz.
Ez a méret jó egyezést mutat a transzkriptum „northern”-hibridizáció alapján becsült - hozzávetőleg 1,6 kb-os hosszúságával.
(3) Helyspecifikus mutagenezis
A DP5053-plazmidban a feltételezett startkodonnál Ncol-hely kialakítása céljából helyspecifikus mutagenezist [Su és El-Gewely (1988)] végeztünk, melynek során a DO1398-oligonukleotidot (5’-GCTGCTCACCATGGCAAAGCAAC-3’; 16. azonosító számú szekvencia) alkalmaztuk. A mutagenezis eredményeként a DP5055-plazmidot kaptuk.
(4) Riporterkonstrukciók
A DP5055-plazmidból - az 5126-os kódolórégiótól 5’-irányban - hozzávetőleg 4 kb-os Scal-Ncol-fragmenst izoláltunk, és ezt a fragmenst a DP1672-plazmid - vektort, szentjánosbogár-luciferázt kódolórégiót és a proteináz-ll-gén (pinll) nem transzlálódó régióját tartalmazó - Smal/Ncol-fragmensével kapcsoltuk össze, miáltal a DP5062 jelzésű riporterkonstrukciót kaptuk. A DP5062-konstrukció 5126-promoter-fragmensének 5’-végén a sok felismerési helyet tartalmazó klónozórégióban lévő Hindlll-helytől az ATG startkodontól 5’-irányban 587 bázis távolságra lévő Hindlll-helyig terjedő szekvencia eltávolításával a DP5121-konstrukciót, a sok felismerési helyet tartalmazó régió Pstl-helyétől az ATG startkodontól 5’-irányban 170 bázistávolságra lévő Pstl-helyig terjedő szekvencia eltávolításával pedig a DP5122-konstrukciót hoztuk létre. A promoterfragmens további delécióit a transzlációs startkodontól 5’-irányban 855 bp távolságra lévő Sphl-hely; a startkodontól 5’-irányban 503 bp távolságra lévő Ndel-hely; illetve a startkodontól 5’-irányban 216 bp távolságra lévő Kpnl-hely alkalmazásával hoztuk létre. A DO5062-oligonukleotidot Sphl-gyel vagy Ndel-gyel emésztettük, T4-DNS-polimeráz alkalmazásával tompa végűvé alakítottuk, és a polimeráz inaktiválása után Ncol-gyel emésztettük. A kapott promoterfragmenseket a DP1672-plazmid - a luciferáz-riporter vektorát és a pinll 3’-régióját tartalmazó Smal/Ncol-fragmenséhez klónoztuk, miáltal a DP5131-konstrukciót (Sphl-deléció), illetve a DP5130-konstrukciót (Ndel-deléció) kaptuk (lásd 2. ábra). A Kpnl-deléciót hordozó konstrukciót (DP5164) a promotert és a luciferázgént tartalmazó fragmens; a Clal/AlwNI-luciferáz/Pinll-37vektor fragmens; és a DP5062-plazmid megmaradt részének AlwNI/Kpnl-fragmensének ligálásával állítottuk elő.
(5) Az átmeneti expresszió vizsgálatai
A 3. ábrán a teljes hosszúságú 5126-os promotert és luciferázgént tartalmazó konstrukcióval (DP5062), il15
HU 227 303 Β1 letve ennek deléciós promotereket tartalmazó származékaival transzformált - kvartettől a korai egysejtmagvú stádiumig terjedő fejlődési stádiumba tartozó - portokokban megfigyelt specifikus luciferázaktivitást mutatjuk be. Lényegében teljes aktivitást tapasztaltunk azon konstrukciók esetében, amelyek promoterében a deléció a transzlációs startkodontól 5’-irányban 503 bp távolságra lévő Ndel-helyig húzódott, azonban csaknem a teljes aktivitás elveszett azon konstrukciók esetében, amelyek promoteréből a transzlációs startkodontól 5’-irányban 216 bp távolságra lévő Kpnl-helyig távolítottuk el a nukleotidszekvenciát. A startkodontól 5’-irányban 170 bp távolságra lévő Pstl-helyig húzódó deléció az aktivitás teljes megszűnését eredményezte. Ezen eredmények alapján arra következtethetünk, hogy a promoterműködés szempontjából kulcsfontosságú elem a transzlációs startkodontól 5’-irányban a 170. és 503. bp között helyezkedik el.
A 4. ábrán az eredeti 5126-os promotert tartalmazó riporterkonstrukcióval (DP5062), illetve a két kritikus deléciót hordozó promotert tartalmazó konstrukcióval (DP5130 és DP5164) transzformált portokokban, hajtáscsúcsokban, gyökerekben és embriogén sejtszuszpenziós tenyészetekben megfigyelt specifikus luciferázaktivitást mutatjuk be. Az ábrán összehasonlításként bemutatjuk a - konstitutív CaMV-35S-promoter által vezérelt luciferáz-riportergént tartalmazó - DP1528konstrukcióval (pozitív kontroll), valamint - SGB6 portokspecifikus promoter által vezérelt luciferáz-riportergént tartalmazó - DP2516-konstrukcióval (szövetspecifikus kontroll) kapott eredményeket is. Az Ndel-deléciós promoter alkalmazása esetén megmaradt a teljes hosszúságú promoterfragmensre jellemző szövetspecifitás.
Az 5. ábrán az 5126 (-503) promoter portokaktivitásának időzítését mutatjuk be. Ez a deléciós promoter a korai egysejtmagvú mikrospórastádiumokban a legaktívabb, bár bizonyos mértékű aktivitás megfigyelhető a meiózisos stádiumban és a középső egysejtmagvú mikrospóra stádiumban is.
2. példa
DAM-metilázgént tartalmazó plazmidok előállítása
DAM-metilázgént £ coliból izoláltunk, de bármilyen növényből származó metilázgén alkalmazható.
A DAM-metilázgént [a Brooks és munkatársai (1983) által leírt szekvencia 195-1132. nukleotidjai] helyspecifikus mutagenezissel [Su és ElGewley (1988)] módosítottuk, és a 186. nukleotidnál - az ATG kezdőkodontól 5’-irányban kilenc nukleotidnyi távolságban - Smal-helyet iktattunk be. A DP5814-plazmid (6. ábra) olyan - kukorica transzformálására alkalmas
- plazmid, amely cisz-orientációban portokspecifikus DAM-metilázgént, valamint konstitutívan expresszálódó BAR-gént tartalmaz. Ezt a plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a DP5130-plazmid (2. ábra) - 5126-os portokspecifikus promoterrégió Ndel-Ncol-delécióját tartalmazó - 500 bp-os Xhol/Ncol-fragmensét - fentebb leírt módosított DAM-metiláz-szekvenciákat tartalmazó
- 1,0 kb-os Smal/BamHI-fragmenshez ligáltuk. Az
5126-os promoter Xhol/Ncol-fragmensében lévő Ncolhelyet - T4-DNS-polimeráz (Boehringer-Mannheim) és dNTP-k alkalmazásával - hagyományos eljárásokkal [Sambrook és munkatársai (1989)] feltöltöttük, hogy a klónozáshoz tompa végeket biztosítsunk. A promoter/gén kapcsolódás három N-terminális aminosavat eredményezett, melyet a következő szekvencia kódol [az eredeti DAM-metilázgén kezdő metioninját kódoló nukleotidokat - amelyek a Brooks és munkatársai (1983) által leírt szekvencia 195-197. nukleotidjainak felelnek meg - aláhúzással jelöljük:
5’-CCATGGGGACAATG-3’ (17. azonosító számú szekvencia).
A DAM-metiláz expressziójának leállítását úgy oldottuk meg, hogy a konstrukcióhoz a burgonya proteinázinhibitor-ll-génjéből származó 3’-oldali Pinll-szekvenciákat [az An és munkatársai (1989) által leírt szekvencia 2-310. nukleotidjai] tartalmazó 320 bp-os BamHI/Notl-fragmenst ligáltuk. Ezt a kiméragént (amely egy 1,6 kb-os Xhol/Notl-fragmensben helyezkedik el) egyszikűekben alkalmazható expressziós plazmid Xhol- és Notl-helye közé klónoztuk. Ez az expressziós plazmid - pBluescript vektorgerincben (Stratagene) - a karfiol-mozaikvírus erősített 35S-promoterét [a -421-es nukleotidtól a +2-es nukleotidig terjedő szekvencia, amely a —421 -estől a -90-es helyig tandem ismétlődésű; Gardner és munkatársai (1981)]; a dohánymozaikvírus (TMV) vezetőszekvenciáját [79 bp-os Hindlll/Sall-fragraens; Gallie és munkatársai (1987)]; a kukorica alkohol-dehidrogenáz-génje [Dennis és munkatársai (1984)] Adh-S-alléljéből származó 1-es intront tartalmazó 579 bp-os fragmenst; a foszfinotricin acetiltranszferázt kódoló BAR-gént [a Thompson és munkatársai (1987) által leírt szekvencia 160-704. nukleotidjai, ahol a 160. guanint - metionint kódoló kezdőkodon létrehozása céljából - adeninre cseréltük]; és burgonya proteinázinhibitor-ll-génből származó terminációs szekvenciákat [2-310. nukleotidok; An és munkatársai (1989)] tartalmaz.
3. példa
Hímsteril növény előállítása
A DP5814-konstrukcióval növényeket transzformáltunk. Ez a konstrukció az £ coli DAM-metilázgénhez és a Pinll-terminátorhoz kapcsolva az 5126-os promoter Ndel-deléciós származékát, valamint a BAR-génhez kapcsolva dupla CaMV-35S-promotert tartalmaz [Thompson és munkatársai (1987)].
A PHP6522-konstrukció (13. ábra) azonos a DP5814-konstrukcióval, azzal a különbséggel, hogy a DAM-metilázgén kódolószekvenciái helyett a lexA 1-202. aminosavait kódoló lexA-kódolószekvenciáit tartalmazza [Golemis (1992)].
A PHP6555-konstrukció (14. ábra) azonos a PHP6522-konstrukcióval, azzal a különbséggel, hogy az 5126-os promoter helyett a kukorica ubikitinpromoterét és egy - 1,9 kb-os Pstl-fragmensben elhelyezkedő - intront tartalmaz.
A DP5184-konstrukciót mikrolövedékes bombázással „Hí Type II” (B73xA188) kalluszsejtvonalakba
HU 227 303 Β1 [Armstrong (1991)] juttattuk, és a kalluszokból bialaphosrezisztens növényeket regeneráltunk. A hímfertilitás kontrolljaként nem transzformált növényeket is létrehoztunk. A transzgenikus és kontrollkalluszokat polimeráz-láncreakció alkalmazásával vizsgáltuk.
A szóban forgó konstrukcióval transzformált tenyészetből metilázgén-konstrukciót tartalmazó transzgenikus növény regenerálható, feltéve, hogy az alkalmazott növényfaj- és tenyészettípus alkalmas a regenerálásra. A „tenyészet” kifejezés ebben az összefüggésben sejthalmazt, kalluszt vagy ezek tenyésztés céljára alkalmas származékait jelenti.
A transzformált sejtből vagy tenyészetből szakember számára ismert eljárásokkal regenerálható teljes növény. A regenerálási eljárások az egyes növényfajok esetében eltérőek lehetnek. A vetőmagvakat a regenerált növényből vagy - a regenerált növény és azonos fajba tartozó másik alkalmas növény (ismert eljárásokkal végzett) keresztezésével kapott - utódnövényekből nyerjük.
4. példa
Az 5126::DAM-metiláz-konstrukció hatása a kukorica fertilitására
A DP5814-konstrukcióval transzformált, regenerált kukoricanövényeket polimeráz-láncreakció alkalmazásával a DAM-metiláz kódolórégiójának jelenlétére vizsgáltuk, s értékeltük a növények fertilis pollent képző tulajdonságát is.
Az £ coli DAM-metilázgén jelenlétének meghatározására a jól ismert polimeráz-láncreakciót (PCR) alkalmaztuk. A
PCR során a DO1266- és D01267-láncindítót használtuk, melyek szekvenciája a következő:
DO1266: 5’-ATG AAG AAA AAT CGC GCT TTT TTG AAG TGG GC-3’ (18. azonosító számú szekvencia);
D01267: 5’-TCA CCC AGG CGG GCA AAA TCA GCC GAC A-3 (19. azonosító számú szekvencia).
Összesen huszonöt - a DAM-metilázgénre PCRpozitív - primer transzgenikus kukoricanövényt vizsgáltunk. E növények közül 22 hímsterilnek bizonyult. A hímsteril növényekkel végzett „Southern”-analízis eredményeként egy kópiástól sok kópiásig terjedő inszerciós események jelenlétét mutattuk ki. A hímsteril növények pollenfejlődésének mikroszkópos megfigyelésével (összehasonlításul PCR-negatív, illetve nem transzformált növények pollenjeit vizsgálva) megállapítottuk, hogy valamennyi növényben premeiózisos és meiózisos stádiumú mikrospórák vannak jelen, míg kvartett stádiumú mikrospórákat egyik PCR-pozitív és hímsteril növényből származó portokban sem figyeltünk meg. A mikrospórák fejlődésének ilyen leállása összefüggésben áll azzal a megfigyeléssel, hogy - amennyiben az expresszié az 5126-os promoter Ndel-deléciós származékának vezérlése alatt történik - a luciferázaktivitás először szintén a fenti fejlődési stádiumban detektálható, ami arra utal, hogy a DAM-metilázgén korai mikrospórafejlődési stádium folyamán történő expressziója gátolja a normális pollenképződést.
A hímsteril kukoricanövényeket nem transzformált kukoricanövények pollenjével poroztuk be, s a kapott magvak kicsíráztatásával kapott növényeket - a metilázgén jelenléte és a hímsterilitás közötti összefüggés megállapítása érdekében - 35S:Bar/5126:DAM-metiláz-konstrukciót tartalmazó, herbicidrezisztens, hímsteril növények koszegregációjára teszteltük. A 13 független hímsteril TO-eseményből származó T1-populációk „Southern”-analízisével kimutattuk, hogy valamennyi hímsteril, bialaphosrezisztens növény tartalmazta mind az £ coli DAM-metilázgént, mind a BARgént, ugyanakkor, a hímfertilis, bialaphosszenzitív szegregánsok nem tartalmazták egyik gént sem.
A T1-populációba tartozó növényekben a mikrospórafejlődés - a TO-növényekkel kapcsolatos megfigyelésekhez hasonlóan - az I. meiózis stádium és a kvartett stádium között állt le.
5. példa
Egy növény hímsteril fenotípusa és a metilálásra alkalmas genetikai konstrukció inszerciója közötti összefüggés megállapítása „Southern-blot”analízissel
300 mg liofilizált levélszövethez 9 ml CTAB-kivonópuffert [100 mM Tris (pH=7,5); 1% hexadecil-trimetilammónium-bromid; 0,7 M nátrium-klorid; 10 mM EDTA] adtunk, az elegyet vortexeztük, majd 65 °C-on 1 óra hosszat inkubáltuk. Az elegyhez 5 ml kloroform/etanol (24:1) oldatot adtunk, s öt percig kevertük. Az extraktumokat 30 percig 2500-as percenkénti fordulatszámmal centrifugáltuk. A felső réteget eltávolítottuk, másik kémcsőbe helyeztük, majd 11 ml CTAB-kicsapópuffert (NaCI nélküli CTAB-kivonópuffer) adtunk hozzá, és a kémcsövet megfordítva 30 percig állni hagytuk. A mintát 10 percig 2000-es percenkénti fordulatszámmal centrifugáltuk. Az üledékhez - újraszuszpendálása céljából 100 mM Tris (pH=7,5), 10 mM EDTA és 0,7 M NaCI 2 ml térfogatú oldatát adtuk, majd 15 percig 60 °C-on melegítettük. A szuszpenzióhoz 10 μΙ (10 mg/ml koncentrációjú) RN-áz-A-t adtunk, és 37 °C-on 30 percig inkubáltuk. A kémcsőbe 5 ml 100%-os hideg etanolt adtunk, óvatosan összekevertük a szuszpenzióval, majd a DNS-t 9” (22,5 cm-es) hajlított Pasterur-pipettával kiemeltük, majd 76%-os etanolt és 0,2 M nátrium-acetátot tartalmazó kémcsőbe tettük, és 20 percig állni hagytuk. Ezután a DNS-t egy percre 76%-os etanolt és 0,2 M nátrium-acetátot tartalmazó kémcsőbe helyeztük, majd szárazra töröltük, és 300 μΙ TE-pufferben [10 mM Tris (pH=7,5); 1 mM EDTA] újraszuszpendáltuk. 5 pg - restrikciós endonukleázokkal emésztett - genomi DNS-t Tris-acetát-puffert tartalmazó 0,8%-os agarózgélen elektroforizáltuk. A membránra történő másolás céljából úgy készítettük elő a gélt, hogy 20 percig 500 ml 0,25 M sósavban, 40 percig 500 ml 0,4 M NaOH és 0,6 M NaCI oldatában, majd 30 percig 0,5 M Tris-puffer (pH=7,5) és 1,5 M NaCI oldatában inkubáltuk. A gélt 25 mM nátriumfoszfát-puffer (pH=6,5) alkalmazásával „Amersham Nylon FP membránra másoltuk, majd azt vákuum alatt 80 °C-on szárítottuk. A membránt felhasználása előtt 64 °C-on 0,1xSCP-t (1xSCP: 0,1 M NaCI, 16 mM nát17
HU 227 303 Β1 rium-foszfát, pH=7,0) és 0,1% SDS-t tartalmazó oldatban 30 percig inkubáltuk. 32P-dCTP-vel jelölt DNS-próbákat random primerjelölő reagenskészlet (Amersham) alkalmazásával, a gyártó útmutatásai szerint állítottuk elő. DAM-metiláz-specifikus próba előállítása céljából a DP5814-plazmidból 635 bp-os BamHI-fragmenst izoláltunk, s az izolált fragmenst jelöltük. BAR-specifikus próba előállítása érdekében a DP5814-plazmidból 560 bp-os Ncol/BamHI-fragmenst izoláltunk, és az izolált fragmenst jelöltük. A jelölt próbát 95 °C-on 10 percig denaturáltuk, majd 20 ml hibridizálópufferben (0,1-szeres koncentrációjú dextrán-szulfátot tartalmazó 0,1*SCP) felvittük a membránra, és 65 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk. A membránt 0,1 % SDS-t tartalmazó 0,1xSCP-oldatban 65 °C-on háromszor mostuk, majd erősítőernyő (DuPont) alkalmazásával -70 °C-on röntgenfilmre exponáltuk.
6. példa
Az átmeneti expresszié vizsgálatára alkalmas plazmidok előállítása
A LexA202-gént tartalmazó HindlII/Xhol-fragmenst [a Golemus és Brent (1992) által leírt pEG202-plazmid 734-1406. nukleotidjai] pBluescriptSK+-vektorba (Stratagene) klónoztuk, miáltal az L87-plazmidot kaptuk. E plazmid - DP2326-oligonukleotiddal (20. azonosító számú szekvencia; 5’-CCGTTAACGCTTTCATGACGCCCGGAATTAAGC-3’) alkalmazásával végzett helyspecifikus mutagenezisével [Su és El Gewley (1988)] a LexA-202 leolvasási keretének kezdő ATG kodonjához [754. nukleotid, Golemis és Brent (1992)] BspHI-helyet iktattunk be, s így az L87BspHI-plazmidot (7. ábra) kaptuk. Az 1-202. aminosavat kódoló LexAszekvenciát tartalmazó kiméragént (amely az L87BspHI-plazmid BspHI/EcoRI-fragmensében helyezkedik el) - a fentebb leírt kukorica C1-gén EcoRI/Hpalfragmensével (144-273. gyökök) egy leolvasási keretben - egyszikűekben alkalmazható expressziós plazmidba klónoztuk, mely plazmid - pBluescript vektorgerincben (Stratagene) - a karfiol-mozaikvírus erősített 35S-promoterét [a -421-es nukleotidtól a +2-es nukleotidig terjedő szekvencia, amely a -421-estől a -90-es helyig tandem ismétlődésű; Gardner és munkatársai (1981)]; a dohány-mozaikvírus (TMV) vezetőszekvenciáját [79 bp-os HindlII/Sall-fragmens; Gallie és munkatársai (1987)]; a kukorica alkohol-dehidrogenáz-génje [Dennis és munkatársai (1984)] Adh-S-alléljéből származó 1-es intront tartalmazó 579 bp-os fragmenst; és burgonya proteinázinhibitor-ll-génből származó terminációs szekvenciákat [2-310. nukleotidok; An és munkatársai (1989)] tartalmaz. A klónozás eredményeként az L121-plazmidot (8. ábra) kaptuk.
A DP5817-plazmid (9. ábra) erősített CaMV-promotert, TMV-vezetőszekvenciát, Adh-intront és Pinll-terminátorszekvenciákat tartalmaz. Az L87BspHI-plazmid BspHI/Smal-fragmensében elhelyezkedő - a LexAprotein 1-202. aminosavait kódoló - szekvenciát {a pEG202-plazmid [Golemis és Brent (1992)] 754-1382. nukleotidjai} az L121-plazmidban a LexA-C1-kiméragént helyettesítő Adh-introntól 3’-irányban klónoztuk.
A DP6232 riporterplazmid (10. ábra) három tandem ismétlődésű lexA-DNS-kötő helyet tartalmaz, melyek két komplementer oligonukleotidon (DO2448 és DO2449) helyezkednek el.
Az oligonukleotidok szekvenciája a következő:
DO2448: 5’-GATCTACTGCTGTATATAAAACCAGTGGTTATATGTACAGTACTGCTG TATATAAAACCAGTGGTTATATGTACAGTACGGATG-3’ (21. azonosító számú szekvencia);
DO2449: 3’-ACGACATATATTTTGGTCACCAATATACATGTCATGACGACATATATT TTGGTCACCAATATACATGTCATGCCGATG-5’ (22. azonosító számú szekvencia).
Az oligonukleotidokat hibridizáltattuk egymással és BglII/Ndel-fragmensként a pBluescript-vektorgerincben egy rövidített CaMV-promotertől [a -33-as helytől a +2-es helyig terjedő nukleotidok; lásd Gardner és munkatársai (1981)], a TMV-vezetőszekvenciától, ADH-introntól, a szentjánosbogár-luciferázgén kódolórégiójától [53-1708. nukleotidok; deWet és munkatársai (1987)] és a Pinll-terminátorszekvenciáktól 5’-irányba klónoztuk.
A DP6509-konstrukció (11. ábra) olyan plazmid, amely három - kukoricanövényben történő expresszáltatás céljára kialakított - kiméragént tartalmaz. Ez a plazmid a rövidített CaMV-promotertől, a TMV-vezetőszekvenciától, az ADH-introntól és a Pinll-terminátortól 5’-irányban - hasonlóan a DAM-metilázgént tartalmazó DP6232-plazmidhoz - lexA-kötőhelyeket is tartalmaz, megtartva a 9 bp-os addíciót (a luciferáz kódolószekvenciája helyett). Az 5126::LexA-CI portokspecifikus transzkripciós aktivátort kódoló génszekvencia a fentebb leírt DAM-metiláz-riportergéntől közvetlenül 3’-irányban helyezkedik el. Ez a gén a DP5130-plazmidból származó - 5126-os promotert hordozó Xhol/Ncol-fragmenst, valamint az L121-plazmid ismertetésénél leírt LexA202-C1-kiméragént és a Pinll-szekvenciát tartalmazza. A plazmid által hordozott harmadik gén pBluescript-vektorgerincben - erősített CaMVpromotert, TMV-vezetőszekvenciát, Adh-intront, BARkódolószekvenciát és Pinll-terminátort tartalmaz (hasonlóan a DP5814-plazmidhoz).
A PHP6520-konstrukció (15. ábra) azonos a PHP6509-konstrukcióval, azzal a különbséggel, hogy a DAM-metilázgén kódolószekvenciája és a pinll-terminátor diftériatoxin-kódolórégióval, illetve a 7-es gén terminátorával [Czako és An (1990)] van helyettesítve.
A PHP8036-konstrukció (16. ábra) az 5126-os promoter -503-as helytől -134-es helyig terjedő szakaszát tartalmazza, amely a minimális (-33)CaMV-promotertől, a TMV-vezetőszekvenciától, az ADH1-introntól, a DAM-metiláz kódolórégiójától és a pinll-terminátortól 5’-irányban lévő lexA-kötőhelyhez van kapcsolva. A PHP8036-plazmid „Ubi-Pat” szelektálható markerkonstrukciót is tartalmaz, amelyet úgy állítottunk elő, hogy egy 1,9 kb-os kukorica-ubikitinpromotert és intront a Streptomyces viridochromagenesből származó foszfinotricin-N-acetil-transzferáz-génhez (Pat) és a nopalin-szintetáz-génhez [Drogé és munkatársai] kapcsoltunk.
HU 227 303 Β1
A PHP8037-konstrukció (17. ábra) azonos a PHP8036-konstrukcióval, azzal a különbséggel, hogy a 650 bp-os Sall/BamHI-fragmensben lévő kukoricaAdhl-intront eltávolítottuk a plazmid 5126:lexA:DAMmetiláz-szakaszából.
7. példa
LexA-kötőhelyet tartalmazó luciferáz-riportergén expresszáltatása lexA-C1, lexA vagy mindkettő együttes átmeneti expressziójával Arra a két kérdésre kerestük a választ, hogy a „lexA” bakteriális DNS-kötő protein növényi sejtekben elősegíti-e és fokozza-e a génexpressziót, illetve, hogy a lexA-protein - „lexA-C1” transzkripciós aktivátorral együttes - expressziója gátolja-e az aktivátor közvetítette génexpressziót.
A lexA-protein képes olyan DNS-régióhoz kötődni, amely lexA-DNS-kötő helyet („lexA-operátor”) tartalmaz, azonban nem képes aktiválni az mRNS-szintézishez szükséges növényi eredetű transzkripciós komponenseket. Korábban kimutatták, hogy a DNS-kötő proteinekre transzkripciós aktivátorként ható proteinrégiók egymás mellé történő helyezése a riportergén fokozott mértékű expresszióját eredményezi [Ruden és munkatársai (1991)]. AlexA-gén kukoricanövény-sejtekben riportergén-expressziót elősegítő hatásának tesztelése céljából a kukorica-CI-gén [Goff és munkatársai (1991)] - transzkripciós aktiválódomént kódoló - régióját egy leolvasási keretben a DNS lexA-proteinnek megfelelő régiójával kapcsoltuk össze, miáltal a LexA202-C1 hibridgént kaptuk. A hibridgént a konstitutív 35S-promoter transzkripciós szabályozása alá helyeztük, miáltal az L121-plazmidot (8. ábra) kaptuk.
A kapott konstrukció különböző mennyiségeit lexA-kötő helyet tartalmazó - luciferáz-riportergén (DP6232-plazmid) állandó mennyiségével együtt embriogén kukoricasejt-szuszpenzió mikrolövedékes bombázásos transzformálására alkalmaztuk. Ahogy a 12. ábrán látható, a riportergén egymagában nagyon alacsony luciferázaktivitást eredményez (14 fotométeregység/pg összprotein; 14 lu/pg), azonban magas luciferázaktivitást (>9000 lu/pg) detektáltunk, ha a lexAC1-transzaktivátort lövedékenként 5 ng-nál nagyobb mennyiségben alkalmaztuk.
Annak meghatározása céljából, hogy a lexA-protein csökkenti-e a luciferázexpresszió nagyságát, a 35S:lexA-konstrukciót tartalmazó - DP5817-plazmidot (lásd 9. ábra) a DP6232- és L121-plazmiddal együttesen alkalmaztuk a mikrolövedékes bombázásos transzformálásra (változtatva az L121 és a DP5817 mennyiségét). Ahogy a 12. ábrán látható, a DP5817-plazmid lexA-C1-konstrukcióval és riporterkonstrukcióval együttes alkalmazása csökkent mértékű luciferázaktivitást eredményez. A kapott eredmények együttesen arra utalnak, hogy embriogén kukoricasejtszuszpenzióban a lexA-DNS-kötő helyet tartalmazó gén fokozott mértékű expressziója mutatható ki abban az esetben, ha az expresszió a lexA-C1 fúziós proteinnel együttesen történik. Ez az expresszió lexA-proteinnel represszálható.
8. példa
Hímsteril növény fertilitásának visszaállítása
A találmány szerinti megoldás értelmében több módszer is alkalmazható a hímsteril növények fertilitásának visszaállítására. Az egyik eljárásban egy olyan kaszkádeffektus érvényesül, amelyben egy promoter például az 5126-os tapetumspecifikus promoter - a LexA-C1 transzkripciós aktivátor génhez van kapcsolva (5126::LexA-C1); a LexA-C1-gén LexA-része a DNS - LexA-operátornak (LexAop) nevezett régiójához kötődő bakteriális LexA-proteint kódolja, míg C1-része - a kukorica transzkripciós gépezetével kölcsönhatásba lépve a (minimális promoterelemmél, például minimális 35S-promoterrel együtt LexA-operátort tartalmazó) gének transzkripciós aktiválását elősegítő - kukorica-C1-proteint kódolja.
Hímsteril kukoricanövény előállítása céljából a DAM-metilázgént minimális CaMV-35S-promoterrel kapcsolt LexA-operátor szabályozása alá helyezzük. Az így előállított konstrukció tartalmazza az 5126::LexA-C1-régiót és a 35S::Bar szelektálható markert is (DP6509-plazmid, lásd 11. ábra). E konstrukció növénybe történő bejuttatása a növényt - a DAM-metilázgén portokban bekövetkező expressziójának köszönhetően - hímsterillé teszi. A LexA-C1-gént az 5126-promoter vezérli.
Az 5126::LexA-C1- és LexAop::Dam-metilázkonstrukciót tartalmazó hímsteril növény fertilitásának helyreállítása érdekében az ilyen növényeket olyan növényekkel keresztezzük, amelyek az 5126-os promotert (vagy más alkalmas promotert) csak a LexA-DNSszakaszhoz kapcsolva tartalmazzák. Az 5126:LexA-régiót tartalmazó genetikai konstrukció jelenléte összefüggést mutat a hímfertilitással. A LexA-operátorhoz kötődő, de a DAM-metilázgén transzkripcióját nem aktiváló proteint expresszáló gén jelenlétében a DAMmetiláz-protein szintézise gátlás alá kerül, s így a növény h ímfertilissé válik.
A fentebb leírtak szerint olyan transzgenikus kukoricanövényeket állítottunk elő, amelyek a PHP6522-, PHP6555- és PHP6520-plazmidot tartalmazták. A hímsterilitást előidéző PHP6520-konstrukciót tartalmazó transzgenikus kukoricanövényeket létrehozó transzgenikus események közül a T0-generációban öt eredményezett hímsteril növényt, míg három transzgenikus eseményből hímfertilis növények keletkeztek. A hímsteril növényeket eredményező események közül hármat a T1-generációban - „lgnite”-rezisztencia alapján - hímsteril fenotípus együttes szegregációjára teszteltünk. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.
1. táblázat
| Esemény | „lgnite”-rezisztens hímsteril növények | „lgnite”-szenzitív hímfertilis növények |
| 937.59.35.2 | 17 | 13 |
| 937.63.25.1 | 2 | 28 |
| 937.59.35.1 | 1 | 0 |
HU 227 303 Β1
A hímsteril események (937.59.35.2 és 937.63.25.1) eredményeként kapott növényeket olyan növényekkel kereszteztük, amelyek a lexA-gént az ubikitinpromoter, illetve a portokspecifikus promoter szabályozása alatt tartalmazták (PHP6555, illetve PHP6522). A kereszte- ί zés eredményeként a sterilitásért felelős konstrukciót (PHP6520) és a represszorkonstrukciót (PHP6522 vagy PHP6555) egyaránt tartalmazó növények hímfertilisek lettek, míg a PHP6520-konstrukciót önmagában tartalmazó növények hímsterilek maradtak. 1
A fentebb leírtak szerint további transzgenikus növényeket állítottunk elő, olyan konstrukciók alkalmazásával, amelyek az 5126-os promoter módosított változatát (az 1488. helyen lévő startkodonhoz viszonyítva a -503-as nukleotidtól a -134-es nukleotidig terjedő 1 szekvenciát; lásd 1. ábra) a minimális CaMV-promoter mellé helyezett lexA-kötőhelybe foglalva tartalmazzák (PHP8036 és PHP8037). E konstrukciók bevitele a létrejött növényeket - a DAM-metilázgén expressziójának köszönhetően - hímsterillé teszi. A PHP8036- vagy PHP8037-konstrukciót tartalmazó hímsteril növényeket olyan növényekkel kereszteztük, amelyek a lexA-represszort konstitutív (PHP6555) vagy szövetspecifikus módon (PHP6522) expresszálják. A keresztezés eredményeként a sterilitásért felelős konstrukciót (PHP8036 vagy PHP8037) és a represszorkonstrukciót
Kivonási próba előállítása
A mRNS-állomány (eltérő módon expreszált géneket tartalmaz) ''P-izotóppal jelölt cDNS-próba
I_ hibridizáció
A mindkét állományban hibridizálódnak, a kivont (PHP6522 vagy PHP6555) egyaránt tartalmazó növények hímfertilisek lettek, míg a sterilitásért felelős PHP8036- vagy PHP8037-konstrukciót önmagában tartalmazó növények hímsterilek maradtak.
Anyagok és eljárások
Kivonási próba előállítási eljárása (az ,,lnvitrogen”-től)
A kivonási cDNS-próba előállítását a kivonási könyvtár előállítási eljárásához hasonlóan végeztük. A következőkben az eljárás vázlatos bemutatását ismertetjük. Az indukált („message +”) mRNS-állományból először jelölt cDNS-t szintetizálunk, majd a kapott cDNS-RNS-hibridet - a templát mRNS eltávolítása céljából - lúggal kezeljük, és a „B” állományból („message -”) származó fotobiotinilált mRNS feleslegével hibridizáltatjuk. A fotobiotinilált RNS-cDNS-hibridekből szabad sztreptavidinnel komplexeket képzünk, és a komplexeket szelektív fenol/kloroform extrakcióval eltávolítjuk a hibridizációs elegyböl. A kivonási könyvtár előállítási eljárásához hasonlóan a fotobiotinilált nukleinsavhibrid sztreptavidinnel alkotott komplexét vontuk ki, miáltal a nem hibridizálódott (indukált) cDNS-ek maradtak vissza. A kivont cDNS-próba közvetlenül hibridizációs lenyomatvizsgálatokra vagy könyvtárak szkrínelésére alkalmazható.
B mRNS-állomány Φ
Biotinilálás megtalálható cDNS-szekvenciák próba-cDNS hibridizálatlan állapotban marad
A biotinilált szekvenciák eltávolítása a sztreptavidinnel képzett komplexek fenol/kloroform extrakciójával
Kivonási próba
HU 227 303 Β1
A kivonási cDNS-próba alkalmazása növeli a szövetspecifikus, ritka transzkriptumoknak megfelelő cDNS-klónok azonosításának esélyét. Egy jellemző cDNS-próbában a reprezentálás mértéke arányos az mRNS gyakoriságával. A cDNS-próba eltérő expresszálódó génre specifikus szekvenciákra történő feldúsításával a próba specifikusabbá válik a megcélzott kiónra, ami leegyszerűsíti a könyvtárak szkrínelését. A kivonási cDNS-könyvtár a kivont próbával együtt alkalmazható az egy bizonyos szövetre vagy indukált sejtállapotra jellemző ritka mRNS-eket reprezentáló cDNS-klónok azonosítására. A nem kivont cDNSkönyvtár helyett kivont cDNS-könyvtár alkalmazásának előnye, hogy kevesebb klón szkrínelésére van szükség.
Az átmeneti expresszié vizsgálati eljárásai
Az embriogén kukoricasejtek szuszpenziós tenyészetét éretlen embriókból hoztuk létre. A sejteket Bowen (1992) leírása szerint folyadékszuszpenzióban tartottuk, s három-négy naponta átoltva friss tenyészeteket hoztunk létre. A sejteket az átoltás után két nappal összegyűjtöttük, és a mikrolövedékes bombázás előtt egy éjszakán át - 0,25 M mannitolt tartalmazó szaporító tápközegben kezeltük (50 mg/ml sűrűségben). Minden egyes bombázáshoz 25 mg sejtet - előzetesen 1 ml szaporító tápközeggel benedvesített szűrőpapírra helyeztünk. 1,8 pm átmérőjű volfrámszemcséken (0,75 mg) 3 pg riporterplazmid-DNS-t (DP6232) és különböző mennyiségű (0,01-3 pg) DP5817- és/vagy L121-plazmidot precipitáltunk, és a sejteket - PDS1000 típusú héliumágyú alkalmazásával, a gyártó (DuPont) útmutatásai szerint - a mikrolövedékelegy egyhatodával bombáztuk. 24 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük, 1,5 ml-es csavaros tetejű mikrocentrifugálócsövekbe helyeztük, és a továbbiakban 4 °C-on tartottuk. A mintákat 0,1 ml GUS-lízispufferben [Rao és Flynn (1990), a detergensek kihagyásával módosítva] homogenizáltuk, és centrifugálással leülepítettük. A luciferázaktivitás vizsgálatát Callis és munkatársai (1987) leírása szerint, 10 másodperces integrációs idővel, luminométer (2010-es modell; Analytical Luminescene, San Diego, CA) alkalmazásával végeztük. A proteinkoncentrációt BioRad reagenskészlet alkalmazásával határoztuk meg. A kivonatok jellemzően 0,75-1,5 pg proteint tartalmaztak. A specifikus luciferázaktivitást (1 p/pg) a kivonat 25 pl-ben a luciferáz által kibocsátott fotométeregység mérésével határoztuk meg, és a kapott értéket a kivonat pl-ére vonatkoztatott proteinkoncentrációnak megfelelően korrigáltuk. Az 1. táblázatban megadott luciferázaktivitási értékek minden egyes kezelésnél három bombázás eredményeinek átlagát jelentik.
A mikrospóraspecifikus mRNS-sel homológ szekvenciákat tartalmazó TA39-genomklónok izolálása; TA39-promoterek
A következőkben valamilyen mikrospóraspecifikus mRNS-sel (melyhez nukleinsav-próba áll rendelkezésre) homológ szekvenciákat tartalmazó genomi DNSklónok izolálási eljárásait mutatjuk be. Az itt leírt eljárások olyan növényfajokból származó mikrospóraspecifikus vezérlőszekvenciák izolálására alkalmazhatók, mely növényfajok a rendelkezésre álló próbával homológ mikrospóraspecifikus mRNS-t tartalmaznak.
Dr. Róbert Goldbergtől (UCLA) kaptunk egy dohány portokspecifikus cDNS-klónt, a TA39-et, amely több tapetumspecifikus transzkriptum esetében megfigyelt időbeli mintázathoz hasonló mintázattal hibridizálódik a portokokból származó mRNS-hez [Kultunow és munkatársai (1990)]. Az in situ hibridizációk azt mutatták, hogy a TA39 a -1-es stádiumtól a +1-es stádiumig kis mennyiségben van jelen a mikrospórákban és a kötőszövetben, majd az 1-től a 6. stádiumig nagyobb mennyiségben található a tapetumban [Goldberg és munkatársai (1993)].
Egy kiválasztott növényből származó genomkönyvtárat, például az N. tabacumvar. NK326-ból származó - Mbol-endonukleázzal részlegesen emésztett és EMBL-3-plazmidba klónozott - DNS-könyvtárat (Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, California; katalógusszám: FL1070D) a TA39-cDNS-klónnal homológ kiónok jelenlétére szkrineltük. A szkrínelés során hagyományos hibridizációs eljárásokat alkalmaztunk [Sambrook és munkatársai (1989)]. A kiválasztott kiónok tisztítása érdekében a plakkokat háromszor vagy többször átoltottuk, s az átoltott plakkokat TA39-cDNS-inszerttel újrateszteltük.
A genomi eredetű dohány-DNS-klónok két különböző - TA39-cDNS-klónnal rokon - családját azonosítottuk, melyeket két egymással átfedő klón reprezentál. A két családból részletes karakterizálás céljából kiválasztottunk egy-egy kiónt (8B3 és 14B1). E genomi kiónok TA39-klónnal homológ régióját, valamint a homológ régióktól 5’- és 3’-irányban lévő régiókat restrikciós enzimes analízissel és DNS-hibridizációval térképeztük.
Ezeket a kódolószekvenciákat és a hozzájuk kapcsolódó feltételezett 5’-vezérlőrégiókat szubklónokként izoláltuk, majd a szekvenáláshoz tovább szubklónoztuk. A Stratagenetől származó, exolll és „mung bean” nukleázokat tartalmazó reagenskészlet alkalmazásával az egyes genomi kiónok egymásba illesztett delécióinak sorozatait állítottuk elő. Az egymásba illesztett deléciókat a Sanger-féle didezoxi-láncterminációs eljárással az lowa State University „Nucleic Acids Facility” intézetében szekvenáltuk. Összehasonlítás céljából a TA39 cDNS-inszertjét is megszekvenáltuk. Egy mikrospóraspecifikus mRNS TA39-cDNS-sel homológ régióján belül a 8B3-klón teljesen homológ a TA39-cDNSsel, míg a 14B1 -klón hasonló része körülbelül 90%-ban homológ a TA39-cDNS-sel.
Láncindító-hosszabbítási kísérletekkel megállapítottuk, hogy a 14B1- és 8B3-klón transzkripciójának kezdőpontja a feltételezett transzlációs starthelytől 5’-irányban 83 bázisnyi távolságra található. Mindkét kiónban a térképezéssel megállapított transzkripciós starthelytől 5’-irányban 31 bázistávolságra tökéletes „TATA-box” található, és a starthelytől 3’-irányban (a transzkripciós starthelyhez viszonyítva a +83-as hely21
HU 227 303 Β1 nél) 110 aminosavat kódoló teljes nyitott leolvasási keret helyezkedik el. Ezen túlmenően, mindkét klón tartalmaz (a 14B1 -klón a transzlációs stopkodontól 29 bp távolságra, míg a 8B3-klón 37 bp távolságra) poliadenilációs felismerési helyet.
Transzformálási eljárások
A kétszikű növények transzformálására számos különböző, jól ismert közvetlen DNS-beviteli eljárás alkalmazható. Ezen eljárások közül előnyösen alkalmazható a levélexplantátumok biolisztikus bombázása. Szintén alkalmazható az Agrobacterium közvetítette bevitel; a protoplasztok Agrobacteriumma\ együttes tenyésztése; az elektroporáció; a protoplasztokba történő polietilénglikolos vagy más közvetlen DNS-bevitel; stb. Az egyszikűek - például kukorica - esetében előnyös a mikrolövedékes bombázással történő DNS-bevitel, de egyéb módszerek, így például az elektroporáció is alkalmazható.
A növényi sejteket a találmány szerinti idegen DNSszekvenciával hagyományos módon transzformáltuk. Amennyiben a transzformálni kívánt növény fogékony az Agrobacterium-fertőzésre, előnyös az idegen DNSszekvenciát tartalmazó vektor - például karjaitól megfosztott Ti-plazmid - alkalmazása. Az ilyen vektorokkal végzett transzformálásra, például az EP 0116718 és EP 0270822 számú európai szabadalmi leírásokban ismertetett eljárások alkalmazhatók. Az előnyös Ti-plazmidvektorok az idegen DNS-szekvenciát szegélyezőszekvenciák között tartalmazzák, vagy legalább a jobb oldali szegélyezőszekvenciától 3’-irányban. Növényi sejt transzformálására egyéb vektortípusok is alkalmazhatók, például, többek között, közvetlen génbeviteli eljárással (lásd például EP 0237356 számú szabadalmi leírás; WO 85/01856 számú nemzetközi közzétételi irat és EP 0275069 számú szabadalmi leírás); in vitro protoplaszttranszformációval (lásd például 4,684,611 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); növényi vírus által közvetített transzformációval (lásd például EP 0067553 számú európai szabadalmi leírás és 4,407,956 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); valamint liposzóma közvetítette transzformációval (lásd például 4,536,475 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás).
Amennyiben a transzformálni kívánt növény kukorica, olyan újabb fejlesztésű transzformációs eljárások is alkalmazhatók, mint a bizonyos kukoricavonalakra Fromm és munkatársai (1990) és Gordon-Kamm és munkatársai (1990) által leírt eljárások.
Ha a transzformálni kívánt növény rizs, olyan újabb transzformációs eljárásokat alkalmazhatunk, mint például a Shimamoto és munkatársai (1990), Datta és munkatársai (1990), Christou és munkatársai (1991) és Lee és munkatársai (1991) által leírt, különböző rizsvonalakra kifejlesztett eljárások.
Amennyiben a transzformálni kívánt növény búza, a kukoricára és rizsre kifejlesztett fenti eljárások alkalmazhatók. Az egyszikű növények, különösen a gabonanövények (így a rizs, búza, kukorica) transzformálására előnyösen közvetlen DNS-beviteli eljárást, például biolisztikus transzformációt vagy elektroporációt alkalmazunk. Amennyiben közvetlen génbeviteli eljárást alkalmazunk, előnyös a találmány bejuttatni kívánt DNS méretét a lehető legkisebbre csökkenteni, hogy lényegében csak a találmány szerinti DNS-szekvencia, a kukorica-QM-gén és a kapcsolódó szabályozórégiók integrálódjanak a növény genomjába. Ennek megfelelően, ha egy találmány szerinti DNS-szekvenciát állítunk elő, és azt egy plazmidban bakteriális gazdaszervezetben sokszorosítjuk, előnyös, ha azokat a plazmidszekvenciákat, amelyek a baktériumban végzett sokszorosításhoz szükségesek (például replikációs kezdőhely, antibiotikumrezisztencia-gén stb.) a növény szóban forgó DNS-szekvenciával történő - transzformálása előtt elválasztjuk a plazmid idegen DNS-t tartalmazó részétől.
Volfrámrészecskéken precipitált DNS alkalmazásával, DuPont héliumágyúval végzett biolisztikus mikrolövedékbombázás 60 mg össztömegű, 1,8 μίτι átmérőjű volfrámrészecskéket 15 ml-es centrifugálócsőbe tettünk, majd 2 ml 0,1 M salétromsavat adtunk hozzá, és jégen hűtve 20 percig ultrahangoztuk. A salétromsavat eltávolítottuk, majd a csőbe 1 ml steril ioncserélt vizet tettünk, és a mintát 2 ml-es „Sarstedt”-csőbe öntöttük át. Rövid ultrahangos kezelés után az elegyet a szemcsék leülepítése céljából centrifugáltuk. A centrifugálás után a vizet eltávolítottuk, a szemcsékhez 1 ml 100%-os etanolt adtunk, rövid ultrahangos kezelést végeztünk, majd az elegyet centrifugáltuk. A víz ismételt eltávolítása után a szemcsékhez 1 ml 100%-os etanolt adtunk, rövid ultrahangos kezelést végeztünk, s az elegyet centrifugáltuk. A centrifugálás után az etanolt eltávolítottuk, a szemcsékhez 1 ml steril ioncserélt vizet adtunk, majd ultrahangoztuk. A szuszpenzió 250-250 μΙ-t négy darab 2 ml-es csőbe pipettáztuk, s mindegyik csőhöz 750 μΙ steril ioncserélt vizet adtunk. A volfrámmintát felhasználásig lefagyasztottuk. 1,5 ml-es kémcsőbe 50 μΙ volfrám/víz szuszpenziót tettünk, ultrahangoztuk, majd 10 pg DNS-t adtunk hozzá, s összekevertük. A kapott elegyhez 50 μΙ 2,5 M kalcium-klorid-oldatot adtunk, összekevertük, majd 20 μΙ 0,1 M spermidint adtunk hozzá, s ismét összekevertük. Rövid ultrahangos kezelés után az elegyet 10 másodpercig 10 000-es percenkénti fordulatszámmal centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, majd az üledékhez 250 μΙ 100%-os etanolt adtunk. Rövid ultrahangos kezelés után az elegyet 10 000-es percenkénti fordulatszámmal centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, majd az üledékhez 60 μΙ 100%-os etanolt adtunk.
Kukorica transzformálása
A B73-as vonal pollenjeivel megtermékenyített A188-növényekből izolált 1-2 mm-es zigótikus embriókból II. típusú morzsalékos embriogén kalluszt [Armstrong (1991)] hoztunk létre, s a kalluszt Register és munkatársai (1994) leírása szerint tartottuk fenn. A kalluszt a transzformálás előtt 4-6 hónapig kéthetente friss táptalajra helyeztük. A transzformáláshoz a
HU 227 303 Β1 kalluszt folyékony tenyésztő tápközegben szuszpendáltuk, 710 pm-es szűrőn átszűrtük, majd 40 mg/ml sűrűséggel újraszuszpendáltuk. Üvegszálas szűrőn 200 mg kalluszsejtet egyenletesen elterítettünk, és a mikrolövedékes bombázást Register és munkatársai (1994) leírása szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy aranyszemcsék helyett 1,0 pm-es volfrámszemcséket alkalmaztunk. A transzformánsok szelektálását és a növények regenerálását Register és munkatársai leírása szerint végeztük, de a bialaphos koncentrációját valamennyi tápközegben 3 mg/l értékre növeltük.
Kukorica transzformálása, stabil transzgenikus növények kinyerése
Az 1. napon a sejteket folyékony tápközegbe helyezzük és 710 pm pórusméretű szűrőn leszűrjük.
5.5 cm2-es üvegszálas szűrőlapon 100-200 mg sejtet
3.5 cm2 területen összegyűjtünk, majd a sejteket a szűrőlappal együtt tápközegbe helyezzük és egy éjszakán át inkubáljuk.
A 8. napon a szűrőlapot és a sejteket kivesszük a tápközegből, megszárítjuk, és mikrolövedékes bombázással kezeljük. Ezután a szűrőt és a sejteket visszatesszük a tápközegbe.
Az 5. napon a szűrőlapon lévő sejteket 3 mg bialaphost tartalmazó - szelektáló tápközegbe helyezzük.
A 12. napon a szűrőlapon lévő sejteket friss szelektáló tápközegbe visszük át.
A 19. napon a sejteket lekaparjuk a szűrőlapról, és 8,6% alacsony olvadáspontú agarózt tartalmazó 5 ml szelektáló tápközegben diszpergáljuk. A sejteket és a felélt tápközeget két 100 mmx15 mm-es - géllel szilárdított tápközeget tartalmazó - lemez felületére kenjük.
A 40. napon a feltételezett transzformánsokat leemeljük a lemezről.
A 61. napon a lemezeken ellenőrizzük az új telepek megjelenését.
Hivatkozások jegyzéke
An, G., Mitra, A., Choi, Η. K., Costa, M. A., An, K., Thornburg, R. W., and Ryan, C. A. (1989). Functional analysis of the 3’ control region of che potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene. Plánt Cell 1:115-122.
Armstrong, C. L., Green C. E., and Phillips, R. L., (1991). Development and availability of germplasm with high type II culture formation response. Maize Genetics Cooperative Newsletter. 65:92.
Bellomy, G. and Record, M. Jr. (1989) Biotechniques 7:1.
Brooks, J. E., Blumenthal, R. M., and Gingeras, T. R., (1993). The isolation and characterization of the Escherichia coli DNA adenine methylase (DAM) gene. Nucl Acids Rés. 11:837-851.
Bowen, B. (1992). Anthocyanin genes as visual markers in transformed maize tissues. In GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Plánt Gene
Expression, S. R. Gallagher, ed. (New York: Academic Press, Inc.), pp. 163-177.
Brent, R. and Ptashne, M. (1985) A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor, Cell 43; 729-736.
Chen, J. J., Pál, J. K., Petryshyn, R., Kuo, I., Yang, J. M., Throop, M. S., Gehrke, L. and London, I. M. (1991). Eukaryotic translation initiation kinases. PNAs 88, 315-319.
Colasanti, J., Tyers, M. and Sundaresan, V., 199! Isolation and Characterization of cDNA clones encoding a functional P34 cdc2 homologue from Zca mags PNAs 88, 3377-3381.
Czako, M. and An, G. (1991) Expression of DNA coding fór Diptheria toxin Chain A is toxic to plánt cells. Plánt Physiol. 95 687-692.
Dennis, E., Gerlach W., Pryor, A., Bennetzen, J., Inglis, A., Llewellyn, D., Sachs, M., Feri, R., and Peacock, W. (1994). Molecular characterization of the maize Adhl gene. Nucl. Acids Rés. 12:3983-3990.
DeWet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., and Subramani, S. (1987). Firefly luciferase gene: Structure and expression in mammalian cells. Mól. Cell. Bioi. 7:25-737.
Drogé, W., Broer, I., and Puhler, A. (1992) Transgenic plants containing the phoshinothricin-N-acetyltransferase gene metabolize the herbicide L-phosphinothricin (glufosinate) differently from untransformed plants. Planta 187:142-15!
Farmer, A. A., Loftus, T. M., Mills, A. A., Sato, K. V., Neill, J., Yang, M., Trón, T., Trumpower, B. L. and Stanbridge, E. G. (1994) Hűm. Mól. Génét. 3, 723-728.
Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833.
Gallie, D. R., Sleat, D. E., Watts J. W., Turner P. C., and Wilson, T. M. A. (1987). The 5’-leader sequence of tobacco mosaic vírus RNA enhances the expression of foreign gene transcripcs in vitro and in vivő. Nucl. Acids Rés. 15:3257-3273.
Gardner, R. C., Howarth, A. J., Hahn, P., Brow-Luedi, M., Shepherd R. J., and Messing, J. C. (1981). The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic vírus by M13mp7 shotgun sequencing. Nucl. Acids Rés. 9:2871-2888.
Goff, S. A., Cone, K. C., and Fromm, Μ. E., (1991). Identification of functional domains in the maize transcriptional activator Cl: Comparison of wild-type and dominant inhibitor proteins. Genes Dev. 5, 289-309.
Goldberg, R. B., Beals, T. P. and Sanders, Ρ. M., (1993). Anther development: basic principles and practical applications. Plánt Cell 5:1217-1229.
Golemis, E. A., and Brent, R. (1992). Fused protein domains inhibits DNA binding by LexA. Mól. & Cell Bioi. 12:3006-3014.
Gordon-Kamm ef al. (1990) Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants, The Plánt Cell 2:603-618.
Herskowitz, J. (1987). Functional inactivation of genes by dominant negative tnutations, Natúré
329:219-222.
HU 227 303 Β1
Invitrogen, Subtractor™ I Subcraction Kit fór cDNA Probe Generation, Instruction Manual, version 2.3.
Koltunow ef al. (1990) „Different temporal and spatial gene expression patterns occur during anther development.” Plánt Cell 2:1201-1224.
Register, J. C., Peterson, D. J., Bell, P. J., Bullock, W. P., Evans, I. J., Frame, B., Greenland, A. J., Higgs, N. S., Jepson, I., Jiao, S., Lewnau, C. J., Süliek, J. M., and Wilson, Η. M. (1994). Structure and function of selectable and non-selectable transgenes in maize after introduction by partiele bombardment. Plánt Mól. Bioi. 25:951-961.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press.
Shimamoto ef al. (1990) Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts, Natúré 338:274.
Su, T. Z., and El-Gewely, M. R., (1988). A multisitedirected mutagenesis procedure using T7 DNA polymerase: Application fór reconstructing a mammalian gene. Gene 69:81-89.
Thompson, C. J., Movva, N. R., Tizard, R., Crameri R., Davies, J. E., Lauwereys, M., and Botterman, J. (1987). Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. EMBO J. 6:2519-2523.
EP0116718
EP 0 270 822 EP 0 237 356 EP 0 275 069 EP 0 067 553
WO/85/01856
U.S. Patent No. 4,684,611 U. S. Patent No. 4,407,956 U. S. Patent No. 4,536,475
Szekvencialista
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1490 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
| TTT i' I'ATCTT TCTGATTTCA | ACCATTACCG | ATGAATTTCT | ATTTGGATTA | GTTCATTTTC | 60 | |
| GTCTTCCCTG | TCTGATCCTG | TTTTCGACAA | TTCTGATCCC | GAATCCGTTT | TTGAATTAAA | 120 |
| ATATAAAAAA | TAAAAACAAG | AAATGGTTTA | TCTCGGTCAA | TTTCGTTTTT | CGCGAGGAAC | 180 |
| ATATTCGGTG | TACATGAGCC | TTTGGTGCAC | ATGAACTAAC | AAAGTTCACA | AAAAATTCTG | 240 |
| AAAAAAAATC | ATACATATTC | TTTGCATCGC | TACTCCTATT | ATATATAAAA | TTTCATGTTC | 300 |
| AAATTTGTTA | TATTTTACCT | GTAATAAAAA | GAGTATTTTT | AGCCGATTTT | CTAATTTAAA | 360 |
| CTTGTCAGAA | GTTGTCTTTT | TTTATTACAA | CTAAGTTTAA | TGAATTTGAA | CTTGAAACAT | 420 |
| GTATATAATT | AGAGTAAGAT | GAAAAGAATA | TGTATGGATT | TTTTCAAAAA | AATTGTAAAC | 480 |
| CTTTTTTAGT | TCATGTGCAC | CATATGTGAA | TCAAAGGTTC | ATATACACCG | GATATGTTTC | 540 |
| ctttttcacg | AACCTAATCT | GGCCTAGCCA | GTATGTTGTG | GACTTGGCTC | CTAAGTGTGA | 600 |
| acctggcagt | GATGGGCAAC | AAAGCAGGCA | TGCCTTATGT | GTGATGAATA | ATTGACACAT | 660 |
| GTACCGAGAG | GTTTGGGGTT | TTTTTGTATT | GCATAGCAAA | ACATGGTGAA | ATTCTTAGGG | 720 |
| TATTTTTGAG | ATTACATTTA | GGGCATGTTT | GTTTCCCTTC | ATTTTGAGGA | ATTGGAATCT | 780 |
| AACTAATAAA | TTAGGCTATT | TTTTTAGAAT | GTGACATTCC | CAACTTTCTA | AAGTGTACAT | 8*40 |
| ATAAGTCTAT | CTTAAATAAT | TTATAGGGTG | GAAGATGTAA | ATTGATTATA | TAGATTTATA | 900 |
| AGCTTCTTTT | ctaatgtaaa | ATTTAAAGCT | CACTCTTCTA | CTTGCTTCTC | TATAACATAA | 950 |
| TATAGTTTAT | AACTACCTCT | CTCATATGAT | T7AGAATAAT | ATACAAATAT | ATTACATAAA | 1020 |
| AAATATATTA | ATTGAATTAG | TGTTGTCTAA | TTTATAATTA | TTAGAATGTA | ATTCAATTCC | 1080 |
| AACGAAACAA | CGGGGCCTTA | GGTTTAATAT | CTTCCTTACA | CTGCGAAAAT | GTTGTTACAC | 1140 |
| TTGCCAAAAA | AAATCAATCG | CATATTTACC | TTACAAGGAC | ATATTTTAGC | AAAATGCTAT | 1200 |
| AGACATGAAT | CCAACGTAAT | CAATAGAGTG | AGATTTACTG | GTAAACTACC | AATTGCTCAT | 1260 |
| CTGCTCGGTA | CCAACCAGCC | TTTCCTATTA | ccatgcacat | GTTGCCTCTC | AACTGCAGCA | 1320 |
| TCTTTCAAGC | CGTGAGCAGA | CATGTTGCAG | ATCGAAGTAA | GGTATATATG | TGCATAGTCT | 1380 |
| CCTAATTCTT | CATCTTCAAC | CTCTAGCTGA | TTGATCTCTG | GTATTTACCA | CÍCTTTCCTT | 1440 |
| CCTTCCTTCC | TTCAATTCTA | AATACCACAA | ATCAAAGTTG | CTTTGCGATG | 1490 |
HU 227 303 Β1
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGTAAAACGA CGGCCAGT
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGGAAACAG CTATGACC
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCTTCATCAG CTTCTGGCAG
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEIRASA:
AGATCTCGGC CAGGCCCTTG
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 15 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAGTTGATGA AGTGA 15
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 13 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAGATCAATC AGCTAGAGG 19
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 13 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
HU 227 303 Β1
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TAAACCTAAG GCC 13
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATAGCCTAA TTTATTAG 18
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACATGTTTCA AGTTCAA 17
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 16 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTTGTCAGAA GTTGTC 16
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAACCATTAC CGATGAA 17
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 19 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACGAGCGGAC GCACGACAG
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCCGTCGCCA TCTGCGTCAC
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár
HU 227 303 Β1
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
SAJÁTSÁG:
NÉV/KULCS: miscjeature
ELHELYEZKEDÉS: csoport (21 ...22, 26..27, 31 ...32)
EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés=„N l-t jelent
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CACGCGTCGA CTAGTACGGG NNGGGNNGGG NNG 33
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCTGCTCACC ATGGCAAAGC AAC 23
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 14 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCATGGGGAC AATG 14
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 32 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGAAGAAAA ATCGCGCTTT TTTGAAGTGG GC 32
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 28 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCACCCAGGC GGGCAAAATC AGCCGACA 28
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCGTTAACGC TTTCATGACG CCCGGAATTA AGC 33
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 84 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HU 227 303 Β1
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCTACTGC TGTATATAAA ACCAGTGGTT ATATGTACAG TACTGCTGTA TATAAAACCA 60
GTGGTTATAT GTACAGTACG GATG 84
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 78 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
ANTISZENSZ: igen
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTAGCCGTAC TGTACATATA ACCACTGCTT TTATATACAG CAGTACTGTA CATATAACCA 60
CTGGTTTTAT ATACAGCA 78
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1485 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
| GGAATTCGGC | ACGAGCTCGG | TGCCGCCTTC | CTTCCTTCAA | TTCTAAATAC | CACAAATCAA | 60 |
| AGTTGCTTTG | CGATGGTGAG | CAGCAGCATG | GACACGACGA | GTGACAAGCG | TGCGTCATCC | 120 |
| ATGCTGGCCC | CTAACCCTGG | CAAGGCCACG | ATCCTCGCCC | TTGGCCACGC | CTTCCCGCAG | 180 |
| CAGCTTGTCA | TGCAGGACTA | CGTCGTCGAC | GGCTTCATGA | AGAACACCAA | CTGTGACGAC | 240 |
| CCGGAGCTCA | AGGAGAAGCT | CACCAGACTC | TGCAAGACGA | CGACCGTGAG | GACTCGGTAC | 300 |
| GTGGTGATGT | CGGATGAGAT | CCTCAAGAAC | TACCCGGAGC | TGGCCCAGGA | GGGGCTGCCG | 360 |
| ACGATGAACC | AGCGTCTGGA | CATCTCGAAC | GCGGCGGTGA | CGCAGATGGC | GACGGAGGCG | 420 |
| TCCCTGTCGT | GCGTCCGCTC | GTGGGGCGGC | GCGCTCTCGT | CCATTACCCA | CCTGGTGTAC | 480 |
| GTCTCGTCGA | GCGAGGCGCG | CTTCCCGGGC | GGCGACCTGC | ACCTGGCGCG | CGCGCTGGGG | 540 |
| CTGAGCCCGG | ACGTCCGCCG | CGTCATGCTG | GCCTTCACCG | GCTGCTCGGG | CGGCGTGGCG | 600 |
| GGGCTCCGCG | TGGCCAAGGG | CCTGGCCGAG | AGCTGCCCGG | GCGCGCGCGT | GCTGCTGGCC | 660 |
| ACCTCCGAGA | CCACCATCGT | GGGGTTCCGC | CCGCCCAGCC | CCGACCGCCC | CTACGACCTC | 720 |
| GTGGGCGTGG | CGCTCTTCGG | CGACGGCGCG | GGCGCCGCCG | TCATCGGCAC | CGACCCCGCC | 780 |
| CCCGCCGAGC | GCCCGCTCTT | CGAGCTCCAC | TCGGCGCTCC | AGCGCTTCCT | CCCGGACACG | 840 |
| GAGAGGACCA | TCGAGGGCCG | GCTGACGGAG | GAAGGCATCA | AGTTCCAGCT | GGGGCGGGAG | 900 |
| CTGCCCCACA | TCATCGAGGC | GCACGTGGAG | GACTTCTGCC | AGAAGOTGAT | GAAGGAGCGG | 960 |
| CAGAGCGGCG | AGGACGCCGA | CGGTGGCGGC | CCCGAGCCGA | TGAGCTACGG | GGACATGTTC | 1020 |
| TGGGCGGTCC | ACCCCGGCGG | GCCGGCCATC | CTAACCAAGA | TGGAGGGGCG | CCTGGGCCTC | 1080 |
| GGCGCCGACA | AGCTCCGCGC | CAGCCGGTGC | GCGCTCCGGG | ACTTCGGCAA | CGCCAGCAGC | 1140 |
| AACACCATCG | TGTACGTGCT | GGAGAACATG | GTGGAGGACA | CCCGGCGGAG | GAGGCTGCTG | 1200 |
HU 227 303 Β1
GCTGCTGACG ACGGTGGAGA GGACTGCGAG TGGGGTCTCA TCCTCGCGTT CGGGCCGGGG 1260
ATCACGTTCG AGGGCATCCT AGCCAGGAAC TTGCAGGCAA CCGCGCGCGC CTCAGCCCAG 1320
CTCTGATCAC CTCTTGCTGT GTTGCTTTTC TGCTTGCTCT GCACCTCTGC TTCCGTGTGA 1380
TTGCTGCTTT GAGGGAGAAT GCTGAGCATC AACATTGCTC ATGAGCATCA ATGAAATAAG 1440
GGGCCCCGAA ATTCACTGCT CAAAAAAAAA AAAAAAAAAC TCGAG 148 5
Claims (13)
1. Eljárás hímsteril növény előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) rekombináns DNS-molekulát tartalmazó transzformáit növényt állítunk elő, amely rekombináns DNS- 15 molekula pollenképződést vagy pollenműködést gátló génterméket kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, és a rekombináns DNS-molekula expressziós szabályozó szekvenciája 1. ábrán bemutatott nukleotidszekvenciájú 5126-os promotert tartalmaz; és 20 (b) a transzformált növényt olyan feltételek mellett neveljük, melyek a DNS-szekvencia expressziója eredményeként elősegítik a hímsterilitás kialakulását.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-molekulaként olyan molekulát 25 alkalmazunk, amelyben az 5126-os promoter az 1. ábrán bemutatott szekvencia 1488. nukleotidjánál lévő startkodontól 5’-irányban legalább 503 bázispárnyi nukleotidszekvenciát tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 30 hogy rekombináns DNS-molekulaként olyan molekulát alkalmazunk, amelyben az 5126-os promoter az 1. ábrán bemutatott szekvencia 1488. nukleotidjánál lévő startkodonhoz viszonyítva 5’-irányban a -503-as helytől a -1-es helyig terjedő nukleotidszekvenciát tártál- 35 mázzá.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-molekulaként olyan molekulát alkalmazunk, amelyben az 5126-os promoter az 1. ábrán bemutatott szekvencia 1488. nukleotidjánál lévő 40 startkodonhoz viszonyítva 5’-irányban a -587-es helytől a -1-es helyig terjedő nukleotidszekvenciát tartalmazza.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-molekulaként olyan molekulát 45 alkalmazunk, amelyben az 5126-os promoter az 1. ábrán bemutatott szekvencia 1488. nukleotidjánál lévő startkodonhoz viszonyítva 5’-irányban a -890-es helytől a -1-es helyig terjedő nukleotidszekvenciát tartalmazza. 50
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-molekulaként olyan molekulát alkalmazunk, amelyben az 5126-os promoter az 1. ábrán bemutatott szekvencia 1488. nukleotidjánál lévő startkodonhoz viszonyítva 5’-irányban a -503-as helytől a -134-es helyig terjedő nukleotidszekvenciát tartalmazza.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan rekombináns DNS-molekulát alkalmazunk, amely géntermékként citotoxint kódol.
8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan rekombináns DNS-molekulát alkalmazunk, amely exogén metilázgént tartalmaz.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan rekombináns DNS-molekulát alkalmazunk, amely exogén metilázgénként DAM-metilázgént tartalmaz.
10. Növény, amely az 1. igénypont szerinti eljárással lett előállítva, és pollenképződést vagy pollenműködést gátló génterméket kódoló DNS-szekvenciát és az 1-6. igénypontok bármelyikében definiált 5126-os promotert tartalmazó expressziós szabályozószekvenciát tartalmaz.
11. Rekombináns DNS-konstrukció, amely az alábbi komponenseket tartalmazza:
(a) DNS-szekvencia, amely egy növényben expresszálódva pollenképződést vagy pollenműködést gátló génterméket kódol; és (b) 1-6. igénypontok bármelyikében meghatározott promoter, amely irányítja a DNS-transzkripciót pollenképződés vagy pollenműködés szempontjából kulcsfontosságú sejtekben vagy szövetekben, és amely működőképesen kapcsolva van a génterméket kódoló DNS-szekvenciához.
12. A 11. igénypont szerinti rekombináns DNSkonstrukció, amelyben a géntermék exogén metilázgén.
13. A 11. igénypont szerinti rekombináns DNSkonstrukció, ahol a géntermék lexA és C1 közötti fúziós fehérjét kódol.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/351,899 US5750868A (en) | 1994-12-08 | 1994-12-08 | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
| US08/474,556 US5689051A (en) | 1994-12-08 | 1995-06-07 | Transgenic plants and DNA comprising anther specific promoter 5126 and gene to achieve male sterility |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU0301904D0 HU0301904D0 (en) | 2003-09-29 |
| HU227303B1 true HU227303B1 (en) | 2011-02-28 |
Family
ID=26997302
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9701839A HU226920B1 (en) | 1994-12-08 | 1995-12-07 | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
| HU0301904A HU227303B1 (en) | 1994-12-08 | 1995-12-07 | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9701839A HU226920B1 (en) | 1994-12-08 | 1995-12-07 | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US5795753A (hu) |
| EP (3) | EP1731614A1 (hu) |
| JP (2) | JP3370677B2 (hu) |
| AR (1) | AR000291A1 (hu) |
| AT (1) | ATE329040T1 (hu) |
| AU (1) | AU698286B2 (hu) |
| DE (1) | DE69535040T2 (hu) |
| ES (1) | ES2267105T3 (hu) |
| HU (2) | HU226920B1 (hu) |
| MX (1) | MX9704270A (hu) |
| NZ (1) | NZ297303A (hu) |
| PT (1) | PT797675E (hu) |
| WO (1) | WO1996017945A1 (hu) |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8901677D0 (en) | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Hybrid seed production |
| US5837850A (en) * | 1994-04-21 | 1998-11-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Regulatory element conferring tapetum specificity |
| US5750868A (en) * | 1994-12-08 | 1998-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
| US5795753A (en) * | 1994-12-08 | 1998-08-18 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
| US5962769A (en) * | 1995-06-07 | 1999-10-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin |
| US7154024B2 (en) * | 1997-06-23 | 2006-12-26 | Pioneer Hi-Bred, Inc. | Male tissue-preferred regulatory sequences of Ms45 gene and method of using same |
| US6037523A (en) * | 1997-06-23 | 2000-03-14 | Pioneer Hi-Bred International | Male tissue-preferred regulatory region and method of using same |
| IL137972A0 (en) | 1998-02-20 | 2001-10-31 | Zeneca Ltd | Hybrid seed production |
| AU3040200A (en) * | 1998-12-21 | 2000-07-12 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Novel mads-box genes and uses thereof |
| DE69942650D1 (de) * | 1998-12-22 | 2010-09-16 | Dow Agrosciences Llc | Verfahren zum limitieren des herauskreuzens und unerwünschten genflusses in nutzpflanzen |
| WO2000055315A1 (en) | 1999-03-16 | 2000-09-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Sf3 promoter and methods of use |
| AU747939B2 (en) * | 1999-03-26 | 2002-05-30 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Promoter sequences expressed in anthers and pollens |
| AU5640200A (en) * | 1999-06-29 | 2001-01-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Gene affecting male fertility in plants |
| EP1255825A2 (en) * | 2000-02-15 | 2002-11-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Male tissue-specific regulatory region and method of using same |
| EP1301609A2 (en) * | 2000-07-13 | 2003-04-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Zmaxig1-specific polynucleotides and methods of use |
| EP1319081A2 (en) * | 2000-09-18 | 2003-06-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Rice mlh1 ortholog and uses thereof |
| US7612251B2 (en) | 2000-09-26 | 2009-11-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
| US7517975B2 (en) | 2000-09-26 | 2009-04-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
| WO2002026789A2 (en) | 2000-09-26 | 2002-04-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
| US20020129399A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-09-12 | Marc Albertsen | Biotin-binding compounds for induction of sterility in plants |
| US7230168B2 (en) * | 2001-12-20 | 2007-06-12 | The Curators Of The University Of Missouri | Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase |
| CA2499375A1 (en) * | 2002-09-17 | 2004-04-01 | Ceres, Inc. | Biological containment system |
| US7476777B2 (en) * | 2002-09-17 | 2009-01-13 | Ceres, Inc. | Biological containment system |
| CA2442521A1 (en) * | 2002-10-03 | 2004-04-03 | Derek Lydiate | Repressor-mediated selection strategies |
| US20040133944A1 (en) * | 2003-01-08 | 2004-07-08 | Delta And Pine Land Company | Seed oil suppression to enhance yield of commercially important macromolecules |
| US20050044596A1 (en) * | 2003-03-19 | 2005-02-24 | Smith Alan G. | Methods to confer enhanced floral properties to plants |
| US20070169224A1 (en) * | 2003-04-07 | 2007-07-19 | Nippon Paper Industries Co., Ltd | Novel vector and method of constructing transformant plant using the vector |
| KR100537955B1 (ko) | 2003-10-29 | 2005-12-20 | 학교법인고려중앙학원 | 꽃가루 특이적 유전자 발현 프로모터 |
| US20070169227A1 (en) | 2003-12-16 | 2007-07-19 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same |
| EP2333075B1 (en) | 2003-12-16 | 2018-07-04 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Dominant gene suppression transgenes and methods of using same |
| WO2006080598A1 (en) * | 2005-01-31 | 2006-08-03 | Dongbu Hitek Co., Ltd. | Anther-specific genes derived from malus x domestica, promoters thereof and a method for preparing transformed plant using the same |
| AU2006226863B2 (en) | 2005-03-21 | 2011-02-10 | Technion Research And Development Foundation | Drought-resistant plants |
| US7550579B2 (en) | 2005-04-29 | 2009-06-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Pericarp-preferred regulatory element |
| WO2006125678A2 (en) * | 2005-05-23 | 2006-11-30 | Nunhems Netherlands Bv | Reversible male-sterile plants |
| US7919676B2 (en) | 2007-08-03 | 2011-04-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same |
| BRPI0722195B1 (pt) | 2007-08-03 | 2018-01-30 | Pioneer Hi-Bred Internacional, Inc | Métodos de manutenção de um estado homozigoto recessivo de uma planta |
| US7910802B2 (en) | 2007-08-03 | 2011-03-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | MSCA1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same |
| US7915478B2 (en) | 2007-08-03 | 2011-03-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same |
| WO2010046422A2 (en) | 2008-10-22 | 2010-04-29 | Basf Se | Use of auxin type herbicides on cultivated plants |
| WO2010046423A2 (en) | 2008-10-22 | 2010-04-29 | Basf Se | Use of sulfonylurea herbicides on cultivated plants |
| MX2013015174A (es) | 2011-06-21 | 2014-09-22 | Pioneer Hi Bred Int | Metodos y composiciones para producir plantas esteriles masculinas. |
| WO2013138309A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
| CN104703998B (zh) | 2012-03-13 | 2020-08-21 | 先锋国际良种公司 | 植物中雄性育性的遗传减少 |
| CN104768378A (zh) | 2012-10-01 | 2015-07-08 | 巴斯夫欧洲公司 | N-硫代-邻氨基苯甲酰胺化合物在栽培植物上的用途 |
| WO2014079820A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections |
| US9803214B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Breeding pair of wheat plants comprising an MS45 promoter inverted repeat that confers male sterility and a construct that restores fertility |
| CN105143248A (zh) | 2013-03-14 | 2015-12-09 | 先锋国际良种公司 | 玉蜀黍胁迫相关转录因子18及其用途 |
| CA2903555A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides |
| US10428348B2 (en) | 2014-01-02 | 2019-10-01 | Exalt State Holdings Limited | Reproduction of female sterility lines and its application in hybrid seed production |
| EP3028573A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-08 | Basf Se | Use of a triazole fungicide on transgenic plants |
| WO2016091674A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Basf Se | Use of cyclaniliprole on cultivated plants |
| WO2016100309A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Restoration of male fertility in wheat |
| BR112017021450B1 (pt) | 2015-04-07 | 2021-12-28 | Basf Agrochemical Products B.V. | Métodos de controle de pragas, método de melhoria da saúde vegetal e semente revestida |
| JP2018512878A (ja) | 2015-04-20 | 2018-05-24 | ネオゲノミクス ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | 次世代シークエンシングの感度を高めるための方法 |
| US10227657B2 (en) | 2015-07-01 | 2019-03-12 | Neogenomics Laboratories, Inc. | Method for high sensitivity detection of MYD88 mutations |
| WO2017031230A1 (en) | 2015-08-17 | 2017-02-23 | Neogenomics Laboratories, Inc. | High-sensitivity sequencing to detect btk inhibitor resistance |
| DE102016015741A1 (de) | 2016-04-12 | 2017-11-30 | Kws Saat Se | Kernkodierte männliche Sterilität durch Mutation in Cytochrom P450 Oxidase |
| DE102016106656A1 (de) | 2016-04-12 | 2017-10-12 | Kws Saat Se | Kernkodierte männliche Sterilität durch Mutation in Cytochrom P450 Oxidase |
| EP3338552A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-27 | Basf Se | Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4407956A (en) * | 1981-03-13 | 1983-10-04 | The Regents Of The University Of California | Cloned cauliflower mosaic virus DNA as a plant vehicle |
| CA1192510A (en) * | 1981-05-27 | 1985-08-27 | Lawrence E. Pelcher | Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom |
| NL8200523A (nl) * | 1982-02-11 | 1983-09-01 | Univ Leiden | Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna. |
| US4536475A (en) * | 1982-10-05 | 1985-08-20 | Phytogen | Plant vector |
| EP0116718B2 (en) * | 1983-01-13 | 1996-05-08 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Process for the introduction of expressible genes into plant cell genomes and agrobacterium strains carrying hybrid Ti plasmid vectors useful for this process |
| WO1985001856A1 (en) * | 1983-11-03 | 1985-05-09 | Johannes Martenis Jacob De Wet | Method for the transfer of exogenous genes in plants using pollen as a vector |
| NZ219531A (en) * | 1986-03-14 | 1991-10-25 | Exxon Research Engineering Co | Anti-fouling fuel compositions and additives containing amines and amine oxides |
| EP0265556A1 (en) * | 1986-10-31 | 1988-05-04 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Stable binary agrobacterium vectors and their use |
| EP0275069A3 (en) * | 1987-01-13 | 1990-04-25 | DNA PLANT TECHNOLOGY CORPORATION (under the laws of the state of Delaware) | Pollen-mediated gene transformation in plants |
| GB8901677D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Hybrid seed production |
| CA1339684C (en) * | 1988-05-17 | 1998-02-24 | Peter H. Quail | Plant ubquitin promoter system |
| WO1992004454A1 (en) * | 1990-09-06 | 1992-03-19 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Compounds and constructs for producing male sterile plants |
| US5409823A (en) * | 1992-09-24 | 1995-04-25 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for the production of hybrid seed |
| CA2146113A1 (en) * | 1992-10-15 | 1994-10-15 | Adrianus Johannes Van Tunen | Genetic moderation of restoration or plant phenotypes |
| US5795753A (en) * | 1994-12-08 | 1998-08-18 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
| US5750868A (en) * | 1994-12-08 | 1998-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
| US7848465B2 (en) | 2007-04-02 | 2010-12-07 | Broadcom Corporation | Joint decoding of ISI (inter-symbol interference) channel and modulation codes |
-
1995
- 1995-06-07 US US08/479,383 patent/US5795753A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/479,041 patent/US5837851A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/479,382 patent/US5763243A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-06 AR AR33452095A patent/AR000291A1/es unknown
- 1995-12-07 HU HU9701839A patent/HU226920B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-12-07 HU HU0301904A patent/HU227303B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-12-07 EP EP06011502A patent/EP1731614A1/en not_active Withdrawn
- 1995-12-07 JP JP51762796A patent/JP3370677B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-07 AT AT95940806T patent/ATE329040T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-12-07 ES ES95940806T patent/ES2267105T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-07 PT PT95940806T patent/PT797675E/pt unknown
- 1995-12-07 WO PCT/US1995/015229 patent/WO1996017945A1/en not_active Ceased
- 1995-12-07 AU AU42436/96A patent/AU698286B2/en not_active Expired
- 1995-12-07 EP EP95940806A patent/EP0797675B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-07 EP EP02016942A patent/EP1273662B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-07 MX MX9704270A patent/MX9704270A/es unknown
- 1995-12-07 NZ NZ297303A patent/NZ297303A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-12-07 DE DE69535040T patent/DE69535040T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-03-17 US US08/819,646 patent/US6281348B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-11-19 US US09/195,716 patent/US6399856B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-03-11 JP JP2002066072A patent/JP2002354954A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU698286B2 (en) | 1998-10-29 |
| EP1273662A2 (en) | 2003-01-08 |
| EP1273662B1 (en) | 2010-12-01 |
| HU0301904D0 (en) | 2003-09-29 |
| PT797675E (pt) | 2006-10-31 |
| US5837851A (en) | 1998-11-17 |
| JP3370677B2 (ja) | 2003-01-27 |
| EP1273662A3 (en) | 2004-09-22 |
| NZ297303A (en) | 1998-09-24 |
| AU4243696A (en) | 1996-06-26 |
| EP0797675A1 (en) | 1997-10-01 |
| DE69535040T2 (de) | 2007-01-04 |
| EP0797675B1 (en) | 2006-06-07 |
| ES2267105T3 (es) | 2007-03-01 |
| US5763243A (en) | 1998-06-09 |
| US5795753A (en) | 1998-08-18 |
| HUT77110A (hu) | 1998-03-02 |
| EP1731614A1 (en) | 2006-12-13 |
| MX9704270A (es) | 1997-09-30 |
| DE69535040D1 (de) | 2006-07-20 |
| US6399856B1 (en) | 2002-06-04 |
| AR000291A1 (es) | 1997-06-18 |
| JP2002354954A (ja) | 2002-12-10 |
| US6281348B1 (en) | 2001-08-28 |
| WO1996017945A1 (en) | 1996-06-13 |
| HU226920B1 (en) | 2010-03-01 |
| JPH10510983A (ja) | 1998-10-27 |
| ATE329040T1 (de) | 2006-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU227303B1 (en) | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants | |
| KR100278819B1 (ko) | 형질전환식물에서웅성불임성을위한가역적핵유전시스템 | |
| US5929307A (en) | Method for the production of hybrid plants | |
| US5760190A (en) | Plant QM proteins | |
| RU2170255C2 (ru) | Полинуклеотид, способы получения растений, геном растения, клетки, плоды, семена, способы получения семян, применения олигонуклеотида, плазмида, микроорганизм | |
| EP1000164B1 (en) | Induction of male sterility in plants by expression of high levels of streptavidin | |
| CN107072165A (zh) | 小麦Ms1多核苷酸、多肽以及使用方法 | |
| AU6149396A (en) | Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin | |
| WO1999046396A2 (en) | Glyphosate as a gametocide | |
| US6603064B1 (en) | Nuclear male sterile plants, method of producing same and methods to restore fertility | |
| US7078587B1 (en) | Tapetum-specific promoters | |
| CA2200496C (en) | Genetic transformation using a parp inhibitor | |
| MXPA00008850A (en) | Glyphosate as a gametocide | |
| MXPA97009731A (en) | Induction of male sterility in plants through the expression of high levels of avid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |