HU227309B1

HU227309B1 - Anthracycline disaccharides, process for their preparation, and pharmaceutical compositions containing the said compds.

Info

Publication number: HU227309B1
Application number: HU9600812A
Authority: HU
Inventors: Fabio Animati; Federico Arcamone; Amalia Cipollone; Paolo Lombardi
Original assignee: Menarini Farma Ind; Bristol Myers Squibb Spa
Priority date: 1993-09-30
Filing date: 1994-09-26
Publication date: 2011-03-28
Also published as: FI961423L; RU2144540C1; CN1042032C; AU688374B2; FI961423A0; ATE178901T1; CZ288462B6; KR100341166B1; NO305400B1; PL179399B1; SK281797B6; BG100466A; BR9407679A; ITFI930187A1; CN1136317A; ES2132429T3; UA41951C2; NO961061D0; ITFI930187A0; BR1100550A

Description

A találmány az (I) és (II) általános képletű vegyületekre -ahol

R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport;

R-ι jelentése hidrogénatom vagy metoxicsoport;

R₂ jelentése hidrogénatom;

R₃ jelentése hidroxilcsoport;

R₄ jelentése hidrogénatom vagy aminocsoport;

R₅ jelentése hidroxilcsoport vagy NH₂ csoport; és a kötésjel azt jelenti, hogy az R₃, R₄ és R₅ szubsztituensek mind axiális, mind ekvatoriális helyzetben lehetnek -, valamint gyógyászati szempontból elfogadható sóikra és e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítményekre vonatkozik.

E vegyületek rákellenes hatásúak.

Az (I) és (II) általános képletből látható, hogy az (I) és (II) általános képletű vegyületek egymástól kizárólag a glikozidkötésű csoportok térbeli helyzetében különböznek, tehát az (A) általános képlettel szemléltethetők, ahol a kötésjel azt mutatja, hogy a második szénhidrátmaradék (szénhidrátcsoport) az első cukormaradék 4’-pozíciójú szénatomjához axiális vagy ekvatoriális helyzetben kapcsolódhat.

A találmány továbbá a fenti vegyületek és gyógyászati szempontból elfogadható sóik előállítási eljárására is kiterjed.

A daunorubicin és doxorubicin jól ismert antibiotikumok, amelyeket jelenleg a klinikai gyakorlatban többféle szilárd tumor és leukémia kezelésére alkalmaznak [F. Arcamone „Doxorubicin: Anticancer Antibiotics”, szerk. A. C. Sartorelli, Academic Press. N. Y. (1981)].

A 457 215 számú európai szabadalmi leírás olyan termékeket ismertet, amelyek szerkezete az e leírásunkban igényelt termékekéhez hasonló, azonban csak egy glikozidos csoportot tartalmaznak.

Ismert tény azonban, hogy a jelenleg alkalmazott rákellenes hatóanyagok kiváltotta súlyos mellékhatások korlátozzák alkalmazásukat a betegeknek egy tekintélyes számán, akiken különben jótékony lehetne a kezelés hatása. Ezen túlmenően jelentős előrehaladás is szükséges néhány fontos, szilárd daganat kezelésében, például a tüdő- és petefészekrák kezelésében, amelyek a jelenlegi kezelésekre nem válaszolnak kielégítően.

Mindebből következik, hogy sürgető igény áll fenn olyan gyógyszerhatóanyagok forgalomba hozatalára, amelyek gátlóhatása a megbetegedett sejtek burjánzásával szemben - a normális sejtekével összehasonlítva - erősen szelektív.

Ennek alapján a találmány célja új rákellenes vegyületek, különösen antraciklin-analógok kifejlesztése, amelyek szénhidrát-alkotórésze egy diszacharidmaradékból áll.

Meglepő módon azt találtuk, hogy az általunk igényelt antraciklin-diszacharidok - amelyekben a közvetlenül cukorrészhez kapcsolódó ágiikon aminocsoportot nem tartalmaz - erősebb rákellenes hatással és szelektivitással rendelkeznek, mint az előzőleg ismert antraciklinszármazékok. Figyelemre méltó, hogy az ismert, hasonló szerkezetű antraciklinekben - amelyek két szénhidrátmaradékot tartalmaznak - az aglikonhoz kötődő cukorrész mindig hordoz szubsztituálatlan vagy szubsztituált aminocsoportot.

A találmány szerinti vegyületek a fentiekben meghatározott (I) és (II) általános képletű vegyületek, és azok gyógyászati szempontból elfogadható sói, ahol R, R-ι, R₂, R₃, R₄ és R₅ jelentése a fenti.

A találmány az ezen vegyületeket vagy gyógyászati szempontból elfogadható savakkal, előnyösen sósavval alkotott sóikat tartalmazó gyógyászati készítményekre is vonatkozik.

Különösen előnyösek az alábbi vegyületek:

a) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-a-Llixo-hexopirazonil)-a-L-lixo-hexopirazonil]-daunorubicinon-hidroklorid;

b) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-a-Llixo-hexopirazonil)-a-L-arabino-hexopirazonil]-daunorubicinon-hidroklorid;

e) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-a-Llixo-hexopirazonil)-a-L-arabino-hexopirazonil]-4-demetoxi-daunorubicinon-hidroklorid;

f) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-a-Llixo-hexopirazonil)-a-L-lixo-hexopirazonil]-4-demetoxi-daunorubicinon-hidroklorid;

g) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-a-Llixo-hexopirazonil)-a-L-lixo-hexopirazonil]-4-demetoxi-doxorubicinon-hidroklorid;

I) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,4,6-tetradezoxi-4-amino-a-L-eritro-hexopirazonil)-a-L-lixo-hexopirazonilj4-demetoxi-doxorubicinon-hidroklorid.

Az (I) és (II) általános képletű vegyületek az alábbi lépésekből álló eljárással állíthatók elő:

a) egy (III) általános képletű vegyületet - ahol R·, és R₂ jelentése a fenti, és R₆ jelentése hidrogénatom vagy OR₇ általános képletű csoport, amelyben R₇jelentése alkoholos funkciós csoport védőcsoportja, előnyösen acetil- vagy dimetil-terc-butil-szililcsoport, vagy p-metoxi-fenil-(difenil)-metil-csoport egy (IV) általános képletű vegyülettel kondenzálunk - ahol R₈ védett hidroxilcsoportot (előnyösen p-nitro-benzoát formájában védett hidroxilcsoportot) jelent; Rg jelentése hidrogénatom vagy védett NH₂csoport, és R₁₀ jelentése védett (előnyösen p-nitrobenzoát formájában védett) hidroxilcsoport vagy védett (előnyösen trifluor-acetamid vagy allil-karboxi-amid formájában védett) NH₂ csoport; és X a kondenzációs körülmények között stabil karbokation képzésére alkalmas csoport, amely a (III) általános képletű vegyület C-7 helyzetében lévő hidroxilcsoporthoz kötődhet, ahol az X csoport előnyösen egy glikozilezőreakciókban alkalmazott csoport, például halogénatom, így klór- vagy brómatom, előnyösen klóratom, vagy p-nitro-benzoil-oxicsoport -, s így egy (VI) általános képletű vegyületet kapunk, vagy a (III) általános képletű vegyületet egy (V) általános képletű vegyülettel reagáltatjuk, így egy (VII) általános képletű vegyületet kapunk ahol Rí, R₂, R₆, R₈, Rg, R₁₀ és a kötésjel jelentése a fenti -;

b) egy vagy több reakcióban a (VI) és (VII) általános képletű vegyületből a hidroxil- és/vagy aminocso2

HU 227 309 Β1 port(ok) védőcsoportját eltávolítjuk, s így az (I) és (II) általános képletű vegyületeket kapjuk - ahol

R, R-|, R₂, R₃, R₄, R₅ és a kötésjel jelentése a fenti

c) kívánt esetben az így kapott (I) vagy (II) általános képletű glikozidot valamely gyógyászati szempontból elfogadható sójává, előnyösen hidrokloridjává alakítjuk.

A (lll) általános képletű vegyületek (IV) vagy (V) általános képletű vegyületekkel végbemenő glikozilezésének reakciókörülményei - aminek eredményeként egy (VI) vagy (VII) általános képletű vegyület képződik - azon szubsztituensek típusától függően változhatnak, amelyek a (IV) vagy (V) általános képletű vegyületben jelen vannak.

A glikozilezést inért szerves oldószerben, kondenzálószer jelenlétében hajtjuk végre. Kondenzálószerként például ezüst-(trifluor-metánszulfonát)-ot, ezüstperklorátot, higany-oxid és higany-bromid keverékeit, bór-halogenideket, titán(IV)- vagy ón(IV)-tetrakloridot vagy ioncserélő gyantát, például Amberlitet használhatunk.

A glikozilezést előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy a reagáló anyagokat 1:1-1:3 mólarányban inért szerves oldószerben - amilyen például a benzol, toluol, dietiléter, tetrahidrofurán, dioxán, kloroform, metilén-klorid vagy diklór-etán - vagy ilyen oldószerek keverékében reagáltatjuk.

A reakció hőmérséklete -40 °C és 40 °C közötti, előnyösen -20 °C és 20 °C közötti tartományban lehet; a reakció időtartama 15 perctől 3 óráig terjed.

A reakcióelegy továbbá valamilyen dehidratálóanyagot, például aktivált molekulaszitát tartalmazhat.

A reakció folyamán vagy a reakció befejeződésekor a reakcióelegyhez valamilyen szerves bázist, például piridint, kollidint, (N,N-dimetil-amino)-piridint, trietilamint vagy 1,8-bisz(dimetil-amino)-naftalint adhatunk.

A találmány szerint az OH és/vagy NH₂ funkciós csoportok védőcsoportjainak az eltávolítását a (VI) és (VII) általános képletű vegyületekböl - aminek eredményeként az (I) általános képletű vegyületekhez jutunk az alkalmazott védőcsoport típusától függően különböző körülmények között végezhetjük.

Ha az R_g és/vagy R₁₀ csoportok - amelyek azonosak vagy különbözők - jelentése védett NH₂ csoport például trifluor-acetamid formájában - vagy védett OH csoport - például p-nitro-benzoát formájában -, és/vagy R₈ védett OH csoport (például p-nitro-benzoát alakjában) és/vagy R₆ jelentése védett OH csoport (például acetát formájában), akkor a védőcsoportok eltávolítását poláris oldószerben - például vízben, metanolban, etanolban, piridinben, dimetil-formamidban vagy ezek keverékeiben - valamilyen szervetlen bázis jelenlétében, így például nátrium-, kálium-, lítium- vagy bárium-hidroxid vagy -karbonát sztöchiometrikus mennyiségével vagy feleslegben vett mennyiségével végezzük.

A reakció hőmérséklete 0 °C és 50 °C közötti tartományban lehet, a reakció időtartama 3 órától 48 óráig terjedhet.

Ha Rg és/vagy R₁₀ jelentése - például allil-karboxiamid alakjában - védett NH₂ csoport, akkor a védőcsoport eltávolítását inért oldószerben, valamilyen fémkomplex, például tetrakisz(trifenil-foszfin)-palládium [ennek ismertetését lásd például: Tetrahedron Letters 30, 3773 (1989)] vagy tetrakarbonil-nikkel [ismertetését lásd például: J. Org. Chem. 38, 3233 (1973)] jelenlétében hajtjuk végre.

Ha R₆ jelentése védett - például dimetil-terc-butilszilil-éter alakjában védett - OH csoport, akkor annak eltávolítását inért oldószerben, (tetrabutil-ammónium)fluorid jelenlétében végezzük [ismertetését lásd például: J. of Antibiot. 37, 853 (1984)].

Ha Rg jelentése - például p-metoxi-fenil-difenil-metil-éter alakjában - védett OH csoport, akkor a védőcsoportot savas közegben, például vizes ecetsavban távolíthatjuk el [ismertetését lásd például: J. Org. Chem. 42, 3653 (1977)].

A (lll) általános képletű vegyületek ismertek, vagy a szerves kémia területén ismert módszerekkel és eljárásokkal előáll íthatók [lásd például: Gazz. Chim. Ital. 114, 517 (1984), valamint Bull. Chem. Soc. Japan 59, 423 (1986)]; vagy a bejelentő fentebb idézett, olasz szabadalmi bejelentésében közölt módszerrel előállíthatok.

A (IV) és (V) általános képletű vegyületek ismertek vagy a diszacharidok szintézisére a szerves kémia területén alkalmazott, ismert módszerekkel és eljárásokkal előállíthatok [J. Carbohydr. Chem. 10, 833 (1991); Carbohydr. Rés. 74, 199 (1979); Carbohydr. Rés. 208, 111 (1980); valamint Tetrahedron 46, 103 (1990)].

Kívánt esetben - egy más úton - az (I) és (II) általános képletű antraciklin-glikozidok — ahol R_h R₂, R₃, R₄, R₅ jelentése a fenti, és R OH csoportot jelent - olyan (I), illetve (II) általános képletű glikozidokból vagy azok gyógyászati szempontból elfogadható sóiból állíthatók elő - ahol R_h R₂, R₃, R₄, R₅ és a kötésjel jelentése a fenti, és R hidrogénatomot jelent - úgy, hogy a 14-helyzetű szénatomot kloroformban brómmal brómozzuk, majd az így kapott 14-brómszármazékot szobahőmérsékleten 43 órán át nátrium-formiáttal reagáltatva hidrolizáljuk.

Kívánt esetben az (I) és (II) általános képletű glikozidokat sósavval metanolban kezelve gyógyászati szempontból elfogadható sóvá, például hidrokloriddá alakíthatjuk.

A találmány azokra a gyógyászati készítményekre is vonatkozik, amelyek hatóanyagként egy (I) vagy (II) általános képletű vegyületet vagy azoknak valamely gyógyászati szempontból elfogadható sóját gyógyászati szempontból elfogadható hígítószerrel vagy vivőanyaggal együtt tartalmazzák.

A találmány szerint egy (I) vagy (II) általános képletű vegyület terápiás szempontból hatásos adagját inért vivőanyaggal egyesítjük.

A készítményeket a szokásos módon, az általánosan alkalmazott vivöanyagokkal alakíthatjuk ki.

Az igényelt vegyületek embereken és emlősállatokon terápiás kezelésre alkalmazhatók. Ezek a vegyüle3

HU 227 309 Β1 tek terápiásán hatásos dózisokban adagolva kedvező rákellenes hatást fejtenek ki.

A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjük.

A színképi adatokban „dd” jelentése „kettős dublett”.

1. példa [(f) jelű vegyület]

7-O-[2,6-Didezoxi4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-aL-lixo-hexopiranozil)-a-L-lixo-hexopiranozil]-4demetoxi-daunorubicinon-hidroklorid [(II) általános képletű vegyület, ahol R, R₁₍ R₂ jelentése hidrogénatom; R₃ és R₅ jelentése hidroxilcsoport; R₄ jelentése NH₂ csoport]

300 mg (0,81 mmol) 4-demetoxi-daunorubicinon [(III) általános képletű vegyület, ahol R_1; R₂ és R₆ hidrogénatomot jelent] és 600 mg (0,72 mmol) 2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-4-O-p-nitro-benzoil-3-trifluoracetamido-a-L-lixo-hexopiranozil)-3-O-p-nitro-benzoilα-L-lixo-hexopiranozil-p-nitro-benzoát [(V) általános képletű vegyület, ahol R₃ és R₅ jelentése p-nitro-benzoil-oxi-csoport, R₄ jelentése trifluor-acetamidocsoport, és X jelentése p-nitro-benzoil-oxi-csoport], 72 ml metil-klorid és 24 ml dietil-éter keverékét A4 méretű molekulaszita jelenlétében -20 °C hőmérsékleten 266 μΙ (1,44 mmol) (trimetil-szilil)-trifláttal kezeljük. A reakcióelegyet 1 órán át keverjük, majd metilénkloriddal hígítjuk, telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mossuk, és szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen kromatografálva tisztítjuk (eluálószerként metilén-klorid és etanol 99:1 arányú elegyét használjuk), így 360 mg 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-4-Op-nitro-benzoil-3-fluor-acetamido-a-L-lixohexopiranozil)-3-O-p-nitro-benzoil-a-L-lixo-hexopiranozil]-4-demetoxi-daunorubicinonhoz jutunk [(VII) általános képletű vegyület, ahol R₁₍ R₂ és R₆ jelentése hidrogénatom; R₈ és R₁₀ jelentése p-nitro-benzoil-oxi-csoport; és R_g trifluor-acetamido-csoportot jelent].

120 mg (0,117 mmol) védett diglikozid [(VII) általános képletű vegyület, ahol R_h R₂ és R@ jelentése hidrogénatom; R₈ és R₁₀ jelentése p-nitro-benzoiloxi-csoport; és Rg trifluor-acetamido-csoportot jelent] 17,6 ml 0,1 mólos bárium-hidroxid-oldattal (metanol és víz 1:1 arányú elegyében) készült szuszpenzióját szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet 0,2 mólos kálium-hidrogén-szulfátoldattal közömbösítjük, kloroformmal extraháljuk, az egyesített szerves kivonatot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, szárazra pároljuk, és a maradékot 0,002 mólos HCI-oldattal felvesszük. A savas-vizes oldatot kloroformmal mossuk, és liofilizáljuk. így 62 mg kívánt terméket kapunk (a hozam 39%) [(II) általános képletű vegyület, ahol R, R·, és R₂ hidrogénatomot, R₃ és R₅ hidroxilcsoportot, R₄ NH₂ csoportot jelent].

Alább közöljük a kapott NMR-adatokat:

¹H-NMR (DMSO-d₆), δ: 1,05 (d, 3H), 1,15 (d, 3H),

1,5-1,95 (m, 4H), 2,1 (m, 2H), 2,25 (s, 3H), 2,95 (dd, 2H), 3,55 (s, 2H), 3,8 (m, 1H), 3,95 (m, 1H),

4,15 (q, 1H), 4,35 (q, 1H), 4,6 (d, 1H), 4,9 (széles s,

2H), 5,25 (széles s, 1H), 5,35 (d, 1H), 5,55 (s, 1H),

7.95 (széles s, 2H), 8,25 (széles s, 2H).

Hasonló eljárással állítottuk elő az alábbi (I) és (II) általános képletű vegyületeket:

7-O-[2,6-Didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-aL-lixo-hexopiranozil)-a-L-lixo-hexopiranozil]-daunorubicinon-hidroklorid [(II) általános képletű vegyület, ahol R és R₂ hidrogénatomot, R·, metoxicsoportot, R₃ és R₅hidroxilcsoportot, R₄ NH₂ csoportot jelent; (a) jelű vegyület].

¹H-NMR (DMSO-dg), δ: 1,05 (d, 3H), 1,15 (d, 3H),

1,35-2,15 (m, 6H), 2,25 (s, 3H), 2,95 (dd, 2H), 3,55 (széles s, 2H), 3,8 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 4,05-4,2 (m+q, 2H), 4,35 (q, 1H), 4,9 (széles s, 2H), 5,25 (d,

1H), 7,65 (m, 1H), 7,9 (d, 2H).

7-O-[2,6-Didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-aL-lixo-hexopiranozil)-a-L-arabino-hexopiranozil]-daunorubicinon-hidroklorid [(I) általános képletű vegyület, ahol R és R₂ hidrogénatomot, R₁ metoxicsoportot, R₃és R₅ hidroxilcsoportot, R₄ NH₂ csoportot jelent; (b) jelű vegyület].

¹H-NMR (DMSO-dg), δ: 1,13 (d, 3H), 1,15 (d, 3H),

1,45-1,85 (m, 4H), 2,05 (m, 2H), 2,15 (s, 3H), 2,87 (dd, 2H), 2,98 (m, 1H), 3,5 (m, 1H), 3,6 (m, 1H),

3,85 (q, 1H), 3,9 (q, 1H), 3,9 (s, 3H), 4,84 (m, 2H),

5,13 (széles s, 1H), 5,28 (s, 1H), 5,32 (d, 1H), 5,55 (s, 1H), 7,55 (m, 1H), 7,8 (m, 2H).

7-O-[2,6-Didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-aL-lixo-hexopiranozil)-a-L-arabino-hexopiranozil]-4-demetoxi-daunorubicinon-hidroklorid [(I) általános képletű vegyület, ahol R, R₁ és R₂ hidrogénatomot, R₃ és R₅hidroxilcsoportot, R₄ NH₂ csoportot jelent; (e) jelű vegyület], ¹H-NMR (DMSO-dg), δ: 1,1 (d, 3H), 1,2 (d, 3H),

1.5- 1,95 (m, 4H), 2,05-2,2 (m, 2H), 2,25 (s, 3H),

2.95 (dd, 2H), 3,1 (t, 1H), 3,4 (m, 1H), 3,6 (széles s,

1H), 3,65 (m, 1H), 3,85-4,00 (q+q, 2H), 3,9 (m,

1H), 4,95 (d, 1H), 5,2 (d, 1H), 5,4 (széles s, 2H), 5,7 (s, 1H), 7,95 (m,2H), 8,25 (m, 2H).

A fenti eljárással állíthatók elő még az alábbi vegyületek:

7-O-[2,6-Didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-aL-lixo-hexopiranozil)-a-L-lixo-hexopiranozil]-4-demetoxi-doxorubicinon-hidroklorid [(II) általános képletű vegyület, ahol R=OH, R₁=R₂=H, R3ekv^=R5ax⁼OH, ^R4ekv^=NH2; (9) vegyület], ¹H-NMR8ppm: 1,05 (d, 3H, CH₃”), 1,15 (d, 3H, CH₃’),

1.5- 1,9 (m, 4H, H-2’ és H-2”), 2,1 (m, 2H, H-8 ax és

H-8 eq), 3,0 (bs, 2H, H-10 ax és H-10 eq), 3,45 (m,

1H, H-3”), 3,5 (bs, 1H, E-4’), 3,6 (bs, 1H, H-4”), 3,8 (m, 1H, H-3’), 4,1 (q, 1H, H-5’) 4,35 (q, 1H, H-5”),

4,55 (s, 2H, H-14), 4,6 (d, 1H, OH-3’), 4,85 (bs, 1H,

OH-14), 4,9 (m, 2H, H-7 és H-1 ”), 5,2 (d, 1H, H-1 ’),

5,3 (d, 1H, OH-4”), 5,53 (s, 1H, OH-9), 8,0 és 8,3 (2m, 4H, aromás).

7-O-[2,6-Didezoxi-4-O-(2,3,4,6-tetradezoxi-4-amino-a-L-eritro-hexopiranozil)-a-L-lixo-hexopiranozil]-4demetoxi-doxorubicinon-hidroklorid [(II) általános képletű vegyület, ahol R=OH, R₁=R₂=R₄=H, R_3ek_V=OH, ^R5ekv^=NH2; (0 vegyület].

HU 227 309 Β1 ¹H-NMR δ ppm: 1,1 (d, 3H, CH₃”), 1,2 (d, 3H, CH₃’),

1,5-2,3 (m, 6H, H-2’, H-2” és H-3”), 2,1 (m, 2H,

H-8 ax és H-8 eq), 3,0 (bs, 2H, H-10 ax és

H-10 eq), 3,35 (m, 1H, H-4”), 3,5 (bs, 1H, H4’),

3,65 (bq, 1H, H-5”), 3,8 (m, 1H, H-3’), 4,1 (q, 1H, 5

H-5’), 4,5 (s, 2H, H-14), 4,6 (d, 1 Η, OH-3’), 4,85 (bs,

1, OH-14), 4,9 (bt, 1H, H-7), 4,95 (d, 1H, H-1”), 5,2 (d, 1H, H-1’), 5,53 (s, 1H, OH-9), 8,0 és 8,3 (2m,

4H, aromás).

2. példa: Biológiai aktivitás vizsgálata

In vitro vizsgálatok

A sejtek túlélését - a tesztvegyülettel való kezelés után - növekedésgátlási teszt alapján értékeltük ki, kivéve az aprósejtes tüdőráksejtvonalat (SCLC). A logaritmikus növekedési fázisban levő sejteket összegyűjtöt10 tük és egy mikrotitrálólemez 6 mélyedésébe helyeztük. A beoltás után 24 órával a sejteket különböző ideig kezeltük a tesztvegyületekkel. Ezután a tápközeget hatóanyagmentes közegre cseréltük ki, a sejteket összegyűjtöttük, és a tesztvegyülettel való kezelés után 72 órával megszámláltuk. SCLC, MCF-7 és LOVO sejtek esetén MTT-vizsgálatot alkalmaztunk, és a sejtek túlélésének kolorimetriás kiértékelését az inkubálás végén (24 és 96 óra) végeztük. A citotoxicitási kísérletekben kapott eredményeket IC₅₀ (azaz a sejtek növekedésének 50%-os gátlása) értékekben fejeztük ki. A tesztvegyületeket desztillált vízben oldottuk, és tápközeggel hígítottuk. Az eredményeket az 1-1. és 1-2. táblázatban foglaltuk össze. A találmány szerinti vegyületek jelentős citotoxikus hatást mutatnak, ami összevethető a doxorubicin (DXR) hatásával, vagy azt meghaladja.

1-1. táblázat

In vitro citotoxikus aktivitás (IC₅₀ mg/ml)

Vegyület	Kezelés (óra)	Sejtvonal
A2780	H460
DXR	24	0,03	0,02
(a)	24	0,03	0,02
(b)	24	0,02	0,02
(e)	24	0,02	0,015
(I)	24	0,015	0,02

1-2. táblázat

In vitro citotoxicitás (IC₅₀ ng/ml)

Sejtvonal	Kezelés (óra)	DXR	(f) vegyület	(g) vegyület
LOVO (vastagbél)	24	10	6,5	10
MCF-7 (emlő)	24	10	10	5,6
A431 (méhnyak)	24	36	12	16
A2780 (petefészek)	24	30	1	5
H460 (nem aprósejtes tüdő)	24	20	15	10
POVD (aprósejtes tüdő)	96	34	15	11

In vivő vizsgálatok

Az in vivő vizsgálatokhoz tímusszal nem rendelke- 50 ző egereknek lágyékba mindkét oldalon szubkután injektálással tumorfragmenseket adagoltunk. A tumorok növekedését a hosszúság és a szélesség tolómércével hetente kétszer történő mérésével követtük. A tumor tömegét a következőképpen számoltuk (feltételezve, 55 hogy a sűrűség értéke 1): tömeg (mg)=térfogat (mm³)=szélesség²xhosszúság/2.

A tesztvegyületeket intravénásán adagoltuk optimális dózisban és adagolási rendben, különböző tumorok alkalmazásával. A kezeléssel elért hatást a tumor törne- 60 gének a kontrollegereknél mérthez képest bekövetkezett %-os csökkenésével (TWI%) fejeztük ki, amelyet az utolsó hatóanyag-adagolás után 7-10 nappal mértünk.

Az eredményeket a 2. és 3. táblázatban foglaltuk össze.

Az A2780 jelű petefészekkarcinóma-sejtvonallal szemben az (f) vegyület legalább olyan hatásos, mint a doxorubicin, míg a (g) vegyület antitumor aktivitása nagymértékben meghaladja azt, azaz 99%-ban csökkenti a tumort. A POVD jelű SCLC tumor esetén a doxorubicinnel (DXR) szemben az (f) és (g) vegyületek jelentős antitumor aktivitást mutattak.

HU 227 309 Β1

2. táblázat

Humán petefészek-karcinóma (A2780) elleni hatás (in vivő)

Vegyület	Optimális dózis (mg/kg)	Kezelés hossza (nap)	Tumorgátlás (%)	Toxicitási pusztulás
DXR	7	11, 18, 25	68	0/5
(f)	8,5	11, 18, 25	75	0/5
(g)	5	11, 15, 18, 21,25	99	0/5

3. táblázat

Humán aprósejtes tüdőkarcinóma (POVD) elleni hatás (in vivő)

Vegyület	Optimális dózis (mg/kg)	Kezelés hossza (nap)	Tumorgátlás (%)	Toxicitási pusztulás
DXR	7	10, 17, 24	44	0/5
(f)	8,5	10, 17, 24	80	0/5
(g)	5	10, 14, 17, 21,24	91	0/5

Gyógyszerkészítmények

3. példa

Fiolánként a következő anyagmennyiségeket alkalmazzuk:

(g) jelű vegyület 10,00 mg

Laktóz 50,00

A hatóanyagként alkalmazott (g) jelű vegyület pontos (HPLC-vel meghatározott) mennyiségét és a gyógyszerészeti tisztaságú laktózt keverés közben szobahőmérsékleten egymás után vízbe adagoljuk és feloldjuk. Az oldatot nitrogén átbuborékoltatásával levegőmentesítjük, és levegőmentesített injekciós tisztaságú vízzel beállítjuk a végső 5 mg/ml hatóanyag-koncentrációt.

A végső oldatot 0,22 mm-es szűrőn steril körülmények között átszűrjük.

A leszűrt oldatot 2 ml-enként fagyasztva szárításhoz megfelelő záróanyaggal (szürke butilgumi dugó, típus: V9032, Helvoet Pharma N. V., Alken, Belgium) ellátott és alumíniumzárral lezárt 10 ml-es steril színtelen üvegfiolákba (1. típus, Aluglas Β. V., Uithoorn, Hollandia) töltjük.

A fiolákat 1 óra alatt -40 °C-ra hűtjük, és 6,5 óra hosszat ezen a hőmérsékleten tartjuk. Ezután 1 perc alatt 100-200 mtorr vákuumot hozunk létre, és indítjuk a szárítás első fázisát. Ezután a hőmérsékletet 2 óra alatt -40 °C-ról 0 °C-ra emeljük. A fiolákat ezen a hőmérsékleten tartjuk 25,5 óra hosszat, majd a hőmérséklet 30 perc alatt 0 °C-ról 25 °C-ra való emelésével indítjuk a második fázist. A fiolákat ezen a hőmérsékleten tartjuk 9,5 óra hosszat. A teljes liofilizálási idő 45 óra. Ennek eltelte után a normálnyomást nitrogén bevezetésével visszaállítjuk, a fiolákat steril dugóval lezárjuk, és a dugókat steril alumíniumsapkával rögzítjük.

Az eljárás ellenőrzése során a hatóanyag-tartalmat az oldat HPLC elemzésével állapítjuk meg, a szűrés előtt és után. Az oldat pH-ját ellenőrizzük, ami 4,0 és 6,5 értékek között van.

Három fiolába Pt-100 ellenállás-hőmérőt illesztünk, a fagyasztva szárítás folyamatos ellenőrzésére.

4. példa

Fiolánként a következő anyagmennyiségeket alkalmazzuk:

(g) jelű vegyület 10,00 mg

Laktóz 250,00

A fagyasztva szárítást 50 ml-es steril üvegfiolákban (1. típus, Aluglas Β. V., Uithoorn, Hollandia) végezzük.

5. példa: Kezelés

A (g) vegyület: 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-a-L-lixo-hexopiranozil)-a-L-lixo-hexopiranozil]-4-demetoxi-doxorubicinon-hidroklorid [(II) általános képletű vegyület, ahol R=OH, R₁=R₂=H, R3ek_v-R5ax“OH, R4_ekv⁼NH₂j; meztelen egerekbe beültetett MX-1 (humán emlőrák) tumorral szembeni hatását vizsgáltuk.

Hatékonysági vizsgálat: a tumor (g) vegyületre való válaszkészségét, in vivő aktivitását 6 mg/kg dózis q3/4dx5 adagolási rendben adagolva értékeltük ki, az antitumor aktivitás optimalizálására, figyelembe véve, hogy az in vitro sejttenyészetekkel végzett kísérletekben a kapott citotoxicitási hatás a kezelési időtől függött. Referencia-hatóanyagként doxorubicint (DXR) használtunk, amelyet 7 mg/kg dózisban q7dx3 adagolási rendben találtunk optimálisnak.

Összehasonlító vizsgálatok: két hatóanyag összehasonlításához dózisok szélesebb spektrumát vizsgáltuk hetente, illetve hetente kétszer MX-1 tumorban. Ezen kísérletekben a (g) vegyület és a doxorubicin maximális tolerálható dózisát vizsgáltuk. A maximális tolerálható dózist úgy határoztuk meg, hogy kezelés alatt álló állatokat a kezelés kezdetétől legalább három hónapig figyeltünk meg.

Az in vivő vizsgálatokhoz humán tumorsejtvonalakat sorozatos szubkután passzálással fragmentáltunk kifejlett, tímusszal nem rendelkező meztelen egerek mindkét oldali lágyékában. A tumorfragmenseket rutin6

HU 227 309 Β1 vizsgálattal ellenőriztük arra nézve, hogy humán eredetűek-e, hematoxilinnel és eozinnal végzett festés után hisztológiai vizsgálattal, valamint tejsav-dehidrogenáz izoenzim elektroforetikus mintázata alapján.

Tímusszal nem rendelkező egereknek (Charles River, Calco, Olaszország) szubkután injekcióval, lágyékba, mindkét oldalon (hatékonysági vizsgálat), illetve az egyik oldalon (összehasonlító vizsgálat) tumorfragmenseket adagoltunk. A tumor növekedését hosszának és szélességének előre meghatározott időben (hetente vagy hetente kétszer) tolómércével történő mérésével határoztuk meg. A tumor tömegét (TW) 7/8 nappal a hatóanyaggal történt utolsó kezelés után a következőképpen számoltuk (feltételezve, hogy a sűrűség értéke 1): tömeg (mg)=térfogat (mm³)=szélesség²xhosszúság/2. A tumor megkettőződésének idejét (DT) az egyes tumorok esetén a kontrolltumor exponenciális növekedési görbéjéhez legjobban illeszkedő szemilogaritmikus görbe alapján számoltuk ki. A vizsgálatokban a DT átlagértékeket használtuk.

A hatóanyagot intravénásán adagoltuk a tumort hordozó egereknek, az egyes tumorok esetén különböző időpontokban kezdve. A két hatóanyag első és utolsó injektálásának időpontja azonos volt minden vizsgálatban. A (g) vegyületet naponta kétszer adagoltuk, a két injektálás között mintegy 1 óra telt el. A kísérleti csoportok legalább nyolc tumorból álltak.

A hatóanyaggal történt kezeléssel a következő elért hatásokat értékeltük ki:

- tumor tömegnövekedésének gátlási százaléka (TWI%) a kezelt és a kontrollegerek esetén, 7-10 nappal a hatóanyag utolsó adagolása után;

- logaritmikus sejtpusztulás (LCK) a kezelt egerek esetén a következő képlet alapján: T-C/DTx3,32; ahol T és C a kezelt (T) és a kontroll- (C) egerek esetén mért azon idő, amíg a tumorok átlagos tömege az egyes kísérletekben meghatározott átlagértéket el nem érte;

- toxikus pusztulás: elpusztult egerek száma, amelyeknél mérhető tumortömeg nincs, illetve azon egerek száma, amelyek a kontrollcsoportban először elpusztult egér előtt pusztultak el;

- hosszú idejű túlélés (LTS): azon egerek száma, amelyek a kísérlet végéig élve maradtak, tumorral vagy anélkül (megerősítő összehasonlító vizsgálatok).

Eredmények

Egy kezeletlen egyedtől származó MX-1 emlőkarcinóma-modellt teszteltünk, mivel ez DXR-re rezisztens volt. Ezen tumorral szemben a (g) vegyület két kísérletben, különböző dózisokban nagyon aktív volt. A kapott TWI% és LCK értékek mindig szignifikánsan meghaladták a DXR-kezeléssel kapott értékeket (lásd a 4-1. táblázatot). A második kísérlet (4-2. táblázat) azt mutatta, hogy a (g) vegyület antitumor aktivitása q(3/4)dx5 adagolási rendben kiváló volt a tumor regressziója és a hatástartam szempontjából.

4-1. táblázat

A (g) vegyület és doxorubicin (DXR) MX-1 humán emlőkarcinómára gyakorolt antitumor aktivitása (a hatóanyaggal végzett kezelés kezdetekor a tumor tömege mindkét kísérletben 50 mg)

	DXR	(9)	(g)
Dózis (mg/kg)	7	5	6
Kezelési napok	9, 16, 23	9, 13, 16, 20,23	9, 13, 16,20, 23
TWr/o	56	81	96
LCK (lg)	0,44	1,07	2,24
Toxicitás	0/5	0/4	0/4

4-2. táblázat

	DXR	DXR	(g)	(g)
Dózis (mg/kg)	7	8	5	6
Kezelési napok	10, 17, 24	10, 17, 24	10, 17, 24	10, 13, 17, 20, 24
TWI%	46	59	95	99
LCK (lg)	0,37	0,61	2,77	4,1
Toxicitás	1/5	0/5	0/5	0/5

A megerősítő összehasonlító vizsgálatokban a (g) táblázat), illetve hetente kétszer (4-3B táblázat) törtévegyületet DXR-rel hasonlítottuk össze hetente (4-3A 60 nő adagolási rendben.

HU 227 309 Β1

4-3A táblázat

Hetente végzett kezelés 7., 14., 21. napon, tumor tömege a 7. napon 50 mg

Vegyület	Dózis (mg/kg)	TWI%	LCK (lg)	Toxikus pusztulás	LTS (110 nap)
DXR	7	45	0,4	1/8	1/8
DXR	8,4	67	0,8	0/8	0/8
(9)	5x2	97	2,3	0/8	7/8
(9)	6x2	100	5,7	2/8	5/8

4-3B táblázat

Hetente kétszer végzett kezelés 7., 10., 14., 17., 21. napon, tumor tömege a 7. napon 50 mg

Vegyület	Dózis (mg/kg)	TWI%	LCK (lg)	Toxikus pusztulás	LTS (110 nap)
DXR	5,8	43	0,4	0/8	0/8
DXR	7	82	1,2	1/8	1/8
(9)	5	84	1,3	1/8	5/8
(9)	6	98	2,4	1/7	2/8

A fenti megerősítő összehasonlító kísérletek eredménye azt mutatja, hogy a (g) vegyület kiválóan gátolja a kiválasztott tumor növekedését.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. (I) és (II) általános képletű vegyületek - ahol

R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport;

R-i jelentése hidrogénatom vagy metoxicsoport;

R₂ jelentése hidrogénatom;

R₃ jelentése hidroxilcsoport;

R₄ jelentése hidrogénatom vagy aminocsoport;

R₅ jelentése hidroxilcsoport vagy NH₂ csoport; és a 'wv kötésjel azt jelenti, hogy az R₃, R₄ és R₅ szubsztituensek mind axiális, mind ekvatoriális helyzetben lehetnek és gyógyászati szempontból elfogadható sóik.
2. Az 1. igénypont szerinti (I), illetve (II) általános képletű

a) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-aL-lixo-hexopirazonil)-a-L-lixo-hexopirazonil]-daunorubicinon-hidroklorid;

b) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-aL-lixo-hexopirazonil)-a-L-arabino-hexopirazonil]daunorubicinon-hidroklorid;

e) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-aL-lixo-hexopirazonil)-a-L-arabino-hexopirazonil]-4demetoxi-daunorubicinon-hidroklorid;

f) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-aL-lixo-hexopirazonil)-a-L-lixo-hexopirazonil]-4-demetoxi-daunorubicinon-hidroklorid;

g) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,6-tridezoxi-3-amino-aL-lixo-hexopirazonil)-a-L-lixo-hexopirazonil]-4-demetoxi-doxorubicinon-hidroklorid;

I) 7-O-[2,6-didezoxi-4-O-(2,3,4,6-tetradezoxi-4-amino-a-L-eritro-hexopirazonil)-a-L-lixo-hexopirazonil]4-demetoxi-doxorubicinon-hidroklorid.
3. Eljárás az (I) és (II) általános képletű vegyületek, ahol R, R₃, R₂, R₃, R₄, R₅ és a kötésjel jelentése az 1. igénypont szerinti, valamint gyógyászati szempontból elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy

i) egy (III) általános képletű vegyületet - ahol R-| és

R₂ jelentése a fenti, és R₆ hidrogénatomot vagy

OR₇ általános képletű csoportot jelent, amelyben

R₇ alkoholos funkciós csoport védőcsoportjaként acetil-, dimetil-terc-butil-szilil- vagy (p-metoxi-fenil)difenil-metil-csoportot jelent - egy (IV) általános képletű vegyülettel - ahol R₈ védett hidroxilcsoportot jelent; Rg jelentése hidrogénatom vagy védett NH₂ csoport, és R₁₀ jelentése védett hidroxilcsoport vagy védett NH₂ csoport; és X jelentése halogénatom vagy p-nitro-benzoil-oxi-csoport - kondenzálva (VI) általános képletű vegyületet kapunk, vagy a (III) általános képletű vegyületet egy (V) általános képletű vegyülettel kondenzáltatjuk, így egy (VII) általános képletű vegyületet kapunk - ahol R-|, R₂, R₆, R₈, Rg, Ri₀ ésa kötésjel jelentése a fenti;

ii) az így kapott (VI) és (VII) általános képletű vegyületből a hidroxilcsoport és/vagy NH₂ funkciós csoport védőcsoportját egy vagy több reakció útján eltávolítva (I) és (II) általános képletű vegyületet nyerünk, ahol R, R₁₍ R₂, R₃, R₄, R₅ és a w- kötésjel jelentése a fenti; és iii) kívánt esetben az így kapott (I) vagy (II) általános képletű vegyületet gyógyászati szempontból elfogadható sójává alakítjuk.
4. Eljárás az 1. igénypont szerinti (I), illetve (II) általános képletű vegyületek - ahol R₄, R₂, R₃, R₄, R₅ jelentése a fenti, és R hidroxilcsoportot jelent - és gyógyászati szempontból elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy

i) egy (I), illetve (II) általános képletű vegyületet ahol R₃, R₂, R₃, R₄, R₅ és a kötésjel jelentése a fenti, és R hidrogénatomot jelent-vagy annak gyó8

HU 227 309 Β1 gyászati szempontból elfogadható sóját a 14-helyzetű szénatomon brómozzuk; és ii) az így kapott 14-brómszármazékot hidrolizálva kapjuk az (I), illetve (II) általános képletű vegyületeket, ahol R·,, R₂, R₃, R₄, R₅ jelentése a fenti, és R hidroxilcsoportot jelent.
5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépésben olyan (IV) vagy (V) általános képletű vegyületet alkalmazunk, ahol R₈ jelentése - előnyösen p-nitro-benzoát alakjában - védett hidroxilcsoport; Rg jelentése hidrogénatom vagy védett NH₂ csoport, és Ri₀ jelentése - előnyösen p-nitro-benzoil-csoporttal - védett hidroxilcsoport; vagy - előnyösen trifluoracetil- vagy allil-oxi-karbonil-csoporttal - védett NH₂csoport.
6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépést kondenzálószerként ezüst-triflát, ezüst-perklorát, higany-oxid és higany-bromid keveréke, (trimetil-szilil)-triflát, p-toluolszulfonsav, trifluorecetsav, bór-halogenidek, ón(IV)-tetraklorid, titán(IV)tetraklorid vagy Amberlit típusú ioncserélő gyanta jelenlétében hajtjuk végre.
7. A 3. és 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (III) általános képletű vegyületet inért szerves oldószerben oldjuk, és a kondenzációt valamilyen molekulaszita, mint dehidratálóanyag jelenlétében végezzük.
8. A 6. és 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióelegyhez a kondenzáció során szerves bázisként piridint, kollidint, (N,N-dimetiIamino)-piridint, trietil-amint vagy 1,8-bisz(dimetilamino)-naftalint adunk.
9. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ii) lépésben az NH₂ funkciós csoport védelmére alkalmazott trifluor-acetil-csoportot és/vagy a hidroxil funkciós csoportok védelmére alkalmazott p-nitro-benzoil- és/vagy acetilcsoportot szervetlen bázisként nátrium-, kálium-, lítium- vagy bárium-hidroxiddal vagy -karbonáttal távolítjuk el.
10. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ii) lépésben az NH₂ funkciós csoport allil-oxikarbonil-védőcsoportját szerves nikkel- vagy palládiumkomplexekkel távolítjuk el.
11. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ii) lépésben a hidroxil funkciós csoport védelmére alkalmazott (metoxi-fenil)-difenil-metil-csoportot valamilyen szerves savval távolítjuk el.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szerves savként ecetsavat alkalmazunk.
13. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ii) lépésben a hidroxil funkciós csoport védelmére alkalmazott dimetil-terc-butil-szilil-csoportot (tetrabutil-ammónium)-fluorid jelenlétében távolítjuk el.
14. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az iii) lépésben az (I) és (II) általános képletű vegyületeket gyógyászati szempontból elfogadható hidrokloridjaikká alakítjuk.
15. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépésben a brómozást kloroformban brómmal végezzük.
16. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ii) lépésben a hidrolízist nátrium-formiáttal hajtjuk végre.
17. Gyógyászati készítmény, amely hatóanyagként legalább egy (I) vagy (II) általános képletű vegyületet vagy annak gyógyászati szempontból elfogadható sóját - ahol R, R-|, R₂, R₃, R₄, R₅ és a jelentése az 1. igénypont szerinti - gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal vagy hígítószerrel együtt tartalmazza.
18. Az 1. és 2. igénypont szerinti vegyületek, valamint gyógyászati szempontból elfogadható sóik rákellenes hatóanyagokként történő alkalmazásra.
19. A 17. igénypont szerinti, rák ellen hatásos gyógyászati készítmény, amely hatóanyagként legalább egy 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyületet vagy annak gyógyászati szempontból elfogadható sóját gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal vagy hígítószerrel együtt tartalmazza.