HU226598B1

HU226598B1 - Foszfatidil-inozit-4,5-biszfoszfát felhasználása resztenózis vagy rosszindulatú daganatok kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására

Info

Publication number: HU226598B1
Application number: HU9902059A
Authority: HU
Inventors: Eva Turley
Original assignee: Jagotec Ag
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1996-12-23
Publication date: 2009-04-28
Also published as: BR9612355A; ATE255411T1; KR19990072058A; WO1997024111A3; PL327542A1; ZA9610840B; HUP9902059A2; NO982935D0; EP0874624A2; AU1091297A; JP4210330B2; EP0874624B1; CA2166155A1; DE69630974D1; NO982935L; WO1997024111A2; CA2166155C; AU725478B2; HUP9902059A3; DE69630974T2

Description

A találmány új, receptor által közvetített kezeléssel kezelhető betegségek és állapotok kezelésére alkalmas kötőszerekre, és ilyen szereknek az emlős testében a kezelést igénylő helyeken a receptorokhoz való kötődésre történő alkalmazására, és emberekben resztenózis vagy rosszindulatú daganatok kezelésére vonatkozik.

A 07/675,908 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, amely a Hyal Pharmaceutical Corporation tulajdona, és a PCT/CA90/00306 számú és a WO91/04058 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben, amelyből a fenti 07/675,908 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés a nemzeti szakaszba lépett, és amely szintén a Hyal tulajdona, legalább 10 mg hialuronsavforma (HA) adagolását írják le gyógyszereknek és/vagy terápiás szereknek az emberi testben a kezelést igénylő helyekre való szállítására, hogy a kezelést igénylő helyeken a szöveteken, például a hegszöveten, minden membránon áthatoljanak a kezelendő sejtekbe.

A fenti nemzetközi szabadalmi bejelentésben a 25. oldal 17. sorában további jótékony hatásról számolnak be, amely akkor jelentkezik, amikor legalább kb. 200 mg hialuronsavformát (például nátrium-hialuronátot) alkalmaznak a gyógyszerrel és/vagy terápiás szerrel egy dózisban a gyógyszer és/vagy terápiás szer adagolásakor fellépő mellékhatások (így gyomor-bél fájdalom, idegi rendellenességek, depresszió stb., amelyek rendszerint a gyógyszer és/vagy tápszer szedésekor jelentkeznek) csökkentésére még a gyógyszernek és/vagy a terápiás szemek, például egy egyedül adagolt nemszteroid gyuiladásgátló szernek (NSAID, non-steroidal anti-inflammatory drug) az általánosan elfogadottnál magasabb dózismennyiségei esetében is.

A 08/486,328 és a 08/520,591 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és a PCT/CA95/00477 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, amely szintén a Hyal Pharmaceutical Corporation tulajdona, a hialuronsav formáinak alkalmazásával olyan szövetek és sejtek celluláris aktivitását modulálják, amelyek a hialuronsawal szemben nagy affinitású sejtfelületi receptorokat expresszálnak. Ezek a sejtfelületi receptorok ICAM-1 adhéziós molekulát, CD44 adhéziós molekulát és HARLEC [Hyaluronic Acid (hialuronán) Receptors Liver Endothelial Cells] adhéziós molekulát és szabályozó RHAMM molekulát (Receptor fór HA Mediated Motility) tartalmaznak a hialuronán megkötésére. A HARLEC a máj endoteliális sejtjeiben expresszálódík (termelődik és kerül a sejt felületére). Egy hialuronsavforma hatásos mennyiségének az adagolása a sejt felületén levő receptorokhoz való kötődés céljából modulálja azoknak a szöveteknek és/vagy sejteknek a celluláris aktivitását, amelyek a hialuronsawal szemben ilyen nagy affinitású sejtfelületi receptorokat expresszálnak (például egy adhéziós vagy szabályozómolekulát) az emberi testben.

Az egyik ok, amiért a hialuronsav a gyógyszer és/vagy terápiás szer szállítására használható, hogy szelektíven kötődik a sejtfelületen levő receptorhoz.

A test az aminosavak legalább 10²⁸ különböző kombinációját tartalmazza [Id. Identification of Recognition Sequences ofAdhesion Molecules Using Phage Display Technology, O’Neil, Karyn T. et al., Methods in Enzymology, Vol. 245 (1994), 370-386], Amikor a hialuronsavformát, a nátrium-hialuronátot (HA) a testbe visszük csaliként, az aminosavak legalább 10²⁸ összes kombinációja közül csak két kombináció kapcsolódik a HA-val.

Ez a két kombináció a HA-ra nézve nagyon specifikus.

1. Az első a következő aminosavszekvencia alkalmazását foglalja magában:

egybetűs kód: STMMSRSHKTRSHHV hárombetűs kód: Ser-Thr-Met-Met-Ser-Arg-SerHis-Lvs-Thr-Arg-Ser-His-His-Val

Az aláhúzott rész az alap-aminosavmotívum a HA-kötő fehérjéknek (Rhamm, ICAM-1, CD44, HARLEC stb.). Az aláhúzott rész a kötési tartomány.

2. A második aminosavsorozat kötési tartományt egy második aminosavszekvenciában találjuk, nevezetesen a következőben:

egybetűs kód: TMTRPHFHKRQLVLS hárombetűs kód: Thr-Met-Thr-Arq-Pro-His-PheHis-Lvs-Arg-GIn-Leu-Val-Leu-Ser

Ennek az aminosavnak kisebb a kötési tartománya. Ez a mag kötési tartománya. Ez a kisebb kötési tartomány a HA-kötő Rhamm fehérjéhez is kötődik, ez az egyetlen HA-receptor, amely a maghoz helyez át.

A betűk mindegyike más aminosavat jelent, amit a következő táblázatban adunk meg.

A fehérjékben levő 20 aminosav

Hárombetűs kód	Egybetűs kód
Glicin	GLY	G
Alanin	ALA	A
Valin	VAL	V
Izoleucin	ILE	I
Leucin	LEU	L
Szerin	SER	S
Treonin	THR	T
Prolin	PRO	P
Aszparaginsav	ASP	D
Glutaminsav	GLU	E
Lizin	LYS	K
Arginin	ARG	R
Aszparagin	ASN	N
Glutamin	GLN	Q
Cisztein	CYS	C
Metionin	MET	M
Triptofán	TRP	W
Fenil-alanin	PHE	F
Tirozin	TYR	Y
Hisztidin	HIS	H

Annak a bizonyítéka, hogy a fenti motívumok HA-kötő tartományokat jelentenek, az „Identification of a common hyaluronan binding motif in the hyaluronan binding protein RHAMM, CD44 and link protein című cikkben található [The EMBO Journal, Vol. 13, No. 2 (1994) pp. 286-296], amelynek tartalma utalás formájában ezen leírás részét képezi.

HU 226 598 Β1

A WO 96/06622 publikációs számú PCT-bejelentés 3. oldalán felvetik azt a lehetőséget, hogy léteznek a hialuronsavat utánzó molekulák, amelyek ugyanazokhoz a nagy affinitású sejtfelületi receptorokhoz tudnak kötődni, mint a hialuronsav. Példaként ezekre az utánzó molekulákra a monoklonális antitesteket, peptideket és szintetikus vegyületeket említik meg, konkrét vegyületekről azonban nem tesznek említést.

Azt találtuk a kísérletek során, hogy egy másik molekula, a PIP2 (foszfatidil-inozit-4,5-biszfoszfát, amelynek egy része a foszfoinozit-4,5-biszfoszfát) specifikusan kötődik ugyanezekhez a kötési tartományokhoz. A PIP2 szerkezeti képlete a következő:

amelynek aktív része az alábbi képletű csoport:

Ismeretes, hogy a Rhamm megköti a hialuronsavat. A kísérleteink végzésekor felismertük, hogy a Rhamm a PIP2-t is megköti. Ha a PIP2-t feleslegben alkalmazzuk, helyettesíti a HA-t. A Rhamm nagyon fontos receptor abból a szempontból is, hogy felfelé szabályozottá („upregulated”) válik a túrnod genezis és resztenózis és a reparáció más eseteiben. így a PIP2 és a HA nagyon fontos ebben a vonatkozásban. A HA-t sikeresen alkalmazták gyógyszereknek a betegség vagy állapot helyére való szállítására azon képessége alapján, hogy szelektíven kötődik a sejt felületén levő receptorokhoz (ezen belül a Rhammhoz). Ily módon a

PIP2 ugyanazon állapotok és betegségek kezelésére használható, mint a HA (vagy önmagában, vagy gyógyszerrel és/vagy terápiás szerrel együtt). Mivel a PIP2 egy kisebb molekula, hatékonyan és könnyebben használható.

Ezért a jelen találmány tárgya PIP2 felhasználása olyan betegségek és állapotok, különösen rosszindulatú daganatok vagy resztenózis kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyászati készítmény előállítására, amelyek receptor által közvetített kezeléssel kezelhetők, ahol a PIP2 az emlős testében a kezelést igénylő helyen levő receptorokhoz kötődik.

Közelebbről, a találmány tárgya foszfatidinil-inozit4,5-biszfoszfát (PIP2) felhasználása rosszindulatú daganatok vagy resztenózis kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyászati készítmény előállítására, ahol a PIP2 a betegség vagy állapot helyén az alábbi kötési tartományok legalább egy csoportjával kötődik:

(a) RSHKTRSHH (egybetűs aminosavkódok), vagy másként

Arg-Ser-His-Lys-Thr-Arg-Ser-His-His (hárombetűs aminosavkódok) és egy még további meghatározás:

CGC-TCG-CAC-AAG-ACC-AGG-TCGCAC-CAC (b) RPHFHKR (egybetűs aminosavkódok), vagy másként Arg-Pro-His-Phe-His-Lys-Arg (hárombetűs aminosavkódok), és egy még további meghatározás: CGG-CCC-CAC-TTC-CAC-AAG-CGG.

Mivel a PIP2 a fenti tartományokhoz kötődik, amelyek a hialuronánt is megkötik, a találmány minden olyan receptor által közvetített kezelésre alkalmazható, amelyre a hialuronán megfelel. Ily módon a találmány resztenózis megelőzésére és más kezelésekre a hialuronánnal azonos módon alkalmazható. így a találmány a következő publikált és nempublikált dokumentumokban tárgyalt kezelésekre és megelőző terápiákra használható:

164 260 sorozatszámú kanadai szabadalmi bejelentés (a bejelentés napja 1995. december 1., címe: „Targeting of Dosages of Medicines and Therapeutic Agents), és a 2 173 037 sorozatszámú kanadai szabadalmi bejelentés [a bejelentés napja: 1996. március 29., címe: „Targeting of Dosages of Medicines and Therapeutic Agents and other Glycosamino-glucans (GAGS)] és

PCT bejelentés	Nemzetközi közzététel	Amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés
PCT/CA90/00306	WO 91/04058	sorozatszám:07/675,908
PCT/CA93/00061	WO 93/16732	sorozatszám:08/290,840
PCT/CA93/00062	WO 93/16733	sorozatszám:08/290,848
PCT/CA93/00388	WO 94/07505	sorozatszám:07/952,095
PCT/CA94/00207	WO 94/23725	sorozatszám:08/448,504
PCT/CA95/00243	WO 95/29683	sorozatszám:08/464,769
PCT/CA94/00188	WO 95/26193	sorozatszám:08/448,503
PCT/CA95/00259	WO 95/30423	sorozatszám:08/464,768
PCT/CA95/00467		sorozatszám:08/295,390
PCT/CA95/00477		sorozatszám:08/468,328

HU 226 598 Β1 amely dokumentumok mindegyike utalás formájában a jelen leírás részét képezi. A dokumentumokra tekintettel a hialuronánformák a PIP2-vel helyettesíthetők és hasonlóképpen alkalmazhatók.

Az alkalmazásokra példaként a PCT/CA90/00306 nemzetközi szabadalmi bejelentésből (amely a WO 91/04058 számon került közzétételre) az alábbiakat idézzük:

(i) a 17. oldal 3. sorától a 18. oldal 16. soráig:

„A bejelentők felismerték, hogy kombinációk és készítmények (például injektálható készítmények) bocsáthatók rendelkezésre emlősnek történő adagolásra betegség vagy állapot kezelésére, amely kombinációk és készítmények egy gyógyászati és/vagy terápiás szer terápiásán hatásos nem toxikus mennyiségét alkalmazzák vagy foglalják magukban betegség vagy állapot kezelésére [például egy szabadgyök-befogót, így aszkorbinsavat (C-vitamint)], C-vitamint (mononukleózis kezelésére), rákellenes szert, kemoterápiás szereket, vírusellenes szereket, például nemionos felületaktív anyagot, például nonoxinol-9-et (nonil-fenoxi-polietoxi-etanolt), amely a Delfen™ fogamzásgátló krémben található, és anionos felületaktív anyagokat (például cetil-piridinium-kloridot) és kationos felületaktív anyagokat (például benzalkónium-kloridot), nemszteroid gyulladásellenes szereket (NSAID-t), például indometacint, naproxént és a (+/-)-ketoroklak-trometaminsót (amely Toradol™ néven van forgalomban) és szteroid gyulladásellenes szereket, gombaellenes szert, detoxifikáló szereket (például enémában rektális alkalmazásra), fájdalomcsillapítót, hörgőtágítót, baktériumellenes szert, antibiotikumokat, vaszkuláris ischaemia (például cukorbaj és Berger-betegség) kezelésére alkalmas szereket, antitest monoklonális szert, topikálisan alkalmazható minoxidilt hajnövekedés elősegítésére, diuretikumokat [például furoszemidet (amely Lasix™ védjegy alatt van forgalomban)], immunszuppresszánsokat (például ciklosporinokat), limfokineket (például interieukin-2-t és hasonlókat, <*- és β-interferont és hasonlókat), hialuronsav és/vagy sói (például nátriumsója) és/vagy a hialuronsav homológjai, analógjai, származékai, komplexei, észterei, fragmentumai és/vagy alegységei (előnyösen hialuronsav és sói) olyan mennyiségeivel együtt vagy mennyiségeiben adagolva, amely elegendő ahhoz, hogy a szemek a szöveten (ezen belül a hegszöveten) a kezelendő helyen a sejtmembránon történő átjutását elősegítse az egyes kezelendő sejtekbe. Amikor a betegségtől vagy állapottól szenvedő betegnek ilyen kombinációkat vagy készítményeket adunk, a betegség vagy állapot váratlan mértékben javul.

A készítmény többek között intravénásán, intraartériásan, intraperitoneálisan, intrapleurálisan, transzdermálisan, topikálisan (a bőrre), rektálisan, orálisan vagy közvetlen injektálással (például a tumorba, a tályogba vagy hasonló betegségfókuszba) vagy tapaszra felvive a beteg bőréhez erősítve adagolható. A hialuronsav és sói a betegség vagy állapot kezelésére külön is adagolhatok, de elegendő mennyiségben és egymást követően olyan időben vagy időközönként [előnyösen együttműködve vagy előnyösebben egy időben, előnyösen azonos helyen (például az egyiket intravénásán és a másikat „piggy backed” formában)] adjuk be.” (ii) A 25. oldal 18. sorától a 26. oldal 14. soráig:

„így, és a jelen találmány egy másik megvalósítási módjának megfelelően, amikor egy NSAID-t, például indometacint (N-metil-glükaminban oldva) vagy más NSAID-t 200 mg/kg testtömegnél nagyobb mennyiségű hialuronsawal adagolunk 1-2 mg/kg testtömeg NSAID (például indometacin és NMG) mellett, nem jelentkeznek a fő mellékhatások, így a gyomor-bél fájdalom, idegi rendellenességek, depresszió, még a szükséges esetben emelt mennyiségű indometacin alkalmazásakor sem. Ha a hialuronsav mennyiségét ezen mennyiség alá csökkentjük, a szokásos mellékhatások ismét megjelennek. Emellett a megfigyelt válaszok sokkal jobbak, amikor az NSAID-t (például lndocid™-ot) hialuronsawal kombináljuk, ami világosan mutatja, hogy a kombináció a patológiás szövetet veszi célba még akkor is, ha a szisztémás intravénás úton adagoljuk is. így megfigyeltük, hogy a daganatos betegségben szenvedők, amikor más kemoterápiás szerek [például aszkorbinsav (C-vitamin), floretin és rákellenes szerek], 50-200 mg NSAID-hialuronsav (nátrium-hialuronát) (például indametacin és hialuronsav) kombinációt kaptak, a fájdalmuk azonnal igen nagy mértékben csökkent. Ezt rövid időn belül a daganatos léziók felbomlása és reszorpclója, valamint a tüdő- és májfunkció javulása követte, ha a rák ezen szervekben volt jelen. Ily módon az elhalt tumoranyagot és a törmeléket és a tumortoxinokat jobban eliminálja a szervezet a makrofágok hatása révén, amelyek aktivitását a NSAID (vagy szteroid gyulladásellenes szerek) hialuronsawal vagy sójával vagy más formájával) együtt történő adagolása fokozza. A feltalálók úgy vélik, hogy az NSAID például hialuronsawal (nátrium-hialuronáttal) együtt történő adagolása megszünteti a makrofágok blokkolását azáltal, hogy megakadályozza a makrofágokat blokkoló prosztaglandin szintetáz enzimatikus termelését. így a hialuronsav (és sói és más formái) nemcsak fokozzák az NSAID aktivitását, de csökkentének bármilyen mellékhatást és toxicitást, ami a prosztaglandin szintézisgátlók alkalmazásával jár.

Kemoterápiás szerként alkalmazható megfelelő szerek a novantron (Mitoxantron), metotrexát, 5-FU (5-fluor-uracil), karboplatinum, metil-CCNU orálisan adagolva és a Mitomicin C.” (iii) A 26. oldal 32-37. sora:

„A hialuronsav és sói 10 és 1000 mg között változó, optimálisan 50-350 mg-os dózisban alkalmazhatók egy 70 kg testtömegű egyénre vonatkoztatva. Mivel nem toxikus, a hialuronsav nyilvánvalóan ennél magasabb, például 3000 mg/70 kg testtömeg dózisban is adagolható káros mellékhatások nélkül.

(iv) A 29. oldal 27. sorától a 33. oldal 31. soráig:

„A hialuronsav és/vagy sói (például nátriumsója) és a hialuronsav homológjai, analógjai, származékai, komplexei, észterei, fragmentumai és alegységei, előnyösen a hialuronsav és nátriumsói egy formája, amely

HU 226 598 Β1 megfelelő a találmány szerinti alkalmazásra, a Sterivet Laboratories Limited által rendelkezésre bocsátott frakció. Egy ilyen frakció egy 15 ml-es fiolában levő 20 mg/ml koncentrációjú nátrium-hialuronát (300 mg/fiola - Lót 2F3). A nátrium-hialuronát frakció egy 2%-os oldat, az átlagos molekulatömeg kb. 225 000. A frakció tetszés szerinti mennyiségben vizet is tartalmaz, amely háromszor desztillált és steril a USP által az injekciós készítményekre előírtaknak megfelelően. A hialuronsavat és/vagy sóit tartalmazó fiolák 1. típusú boroszilikát üvegfiolák lehetnek, amelyek butildugóval vannak lezárva, ezek a dugók nem reagálnak a fiola tartalmával.”

A hialuronsav és/vagy sóinak (például nátriumsójának) frakciói és a hialuronsav homológjai, analógjai, származékai, komplexei, észterei, fragmentumai és alegységei, előnyösen a hialuronsav és sói olyan hialuronsavat és/vagy hialuronsavsókat tartalmazhatnak, amelyek a következő jellemzőkkel bírnak:

a hialuronsav egy tisztított, lényegében pirogénmentes frakciója, amelyet természetes forrásból kaptak, és a következő csoportban felsorolt tulajdonságok legalább egyike jellemző rá:

i) molekulatömege 150 000 és 225 000 közötti;

ii) kb. 1,25%-nál kevesebb szulfátéit mukopoliszacharidot tartalmaz a teljes tömegre számítva;

iii) kb. 0,6%-nál kevesebb fehérjét tartalmaz a teljes tömegre számítva;

iv) kb. 150 ppm-nél kevesebb vasat tartalmaz a teljes tömegre számítva;

v) kb. 15 ppm-nél kevesebb ólmot tartalmaz a teljes tömegre számítva;

vi) 0,0025%-nál kevesebb glükozamint tartalmaz;

vii) 0,025%-nál kevesebb glükuronsavat tartalmaz;

viii) 0,025%-nál kevesebb N-acetil-glükozamint tartalmaz;

ix) 0,0025%-nál kevesebb aminosavat tartalmaz;

x) 257 nm-nél az UV extinkciós koefficiens 0,275nél kisebb;

xi) 280 nm-nél az UV extinkciós koefficiens 0,25-nál kisebb; és xii) pH-ja 7,3 és 7,9 közötti.

A hialuronsav előnyösen vízzel van keverve, és a hialuronsavfrakció átlagos molekulatömege 150 000 és 225 000 közötti. Előnyösebben a hialuronsavfrakció legalább egy alábbi jellemzővel rendelkezik:

i) kb. 1 %-nál kevesebb szulfátéit mukopoliszacharidot tartalmaz a teljes tömegre számítva;

ii) kb. 0,4%-nál kevesebb fehérjét tartalmaz a teljes tömegre számítva;

iii) kb. 100 ppm-nél kevesebb vasat tartalmaz a teljes tömegre számítva;

iv) kb. 10 ppm-nél kevesebb ólmot tartalmaz a teljes tömegre számítva;

v) 0,00166%-nál kevesebb glükozamint tartalmaz;

vi) 0,0166%-nál kevesebb glükuronsavat tartalmaz;

vii) 0,0166%-nál kevesebb N-acetil-glükozamint tartalmaz;

viii) 0,00166%-nál kevesebb aminosavat tartalmaz;

ix) 257 nm-nél az UV extinkciós koefficiens 0,23-nál kisebb;

x) 280 nm-nél az UV extinkciós koefficiens 0,19-nál kisebb; és xi) a pH 7,3 és 7,9 közötti.

A hialuronsavnak és sóinak más formái vagy a hia5 luronsav homológjai, származékai, komplexei, észterei, fragmentumai és alegységei más szállítóktól is választhatók, például azokból, amelyeket az előzőekben hivatkozott, a technika állásához tartozó dokumentumokban leírtak. Emellett sikeresen alkalmaztuk a Life10 Core™ Biomedical, Inc. cég által előállított és rendelkezésre bocsátott nátrium-hialuronátot, amelynek jellemzői a következők:

	Jellemzők	Leírás
	Külső megjelenés	Fehér-krémszínű
15		részecskék
	Szag A viszkozitás alapján	nincs érezhető szaga
	az átlagos molekulatömeg UV/látható szken,	<750 000 Dalton
20	190-820 nm	megfelel a referenciának
	OD, 260	<0,25 OD egység
	Hialuronidázérzékenység	pozitív válasz
	IR szken	megfelel a referenciának
	pH, 10 mg/g oldat	6,2-7,8
25	Víz	8% maximum
	Fehérje	<0,3 mcg/mg NaHy
	Acetát	<10,0 mcg/mg NaHy
	Nehézfém, maximum ppm	As Cd Co Cr Cu 2,0 5,0 10,0 10,0 10,0
30		Fe Pb Hg Ni 25,0 10,0 10,0 5,0
	Mikrobiális bioteher	nem észleltünk
	Endotoxin	<0,07 EU/mg NaHy
	Biológiai biztonsági teszt	a nyúl okuláris toxicitási
35		vizsgálatban megfelel

A következő irodalmi helyeken ismertetik a hialuronsavat, a forrásait és az előállítására és kinyerésére alkalmas eljárásokat.

A 4 141 973 számú amerikai egyesült államokbeli 40 szabadalmi leírás az alábbi jellemzőkkel rendelkező hialuronsavfrakciókat (ezen belül nátriumsókat) ismertet:

(a) átlagos molekulatömege nagyobb, mint kb. 750 000, előnyösen nagyobb, mint kb. 1 200 000, azaz egy korlátozó viszkozitás szám nagyobb, mint kb. 1400 cm³/g, és előnyösen nagyobb, mint kb. 2000 cm³/g;

(b) a fehérjetartalom 0,5 tömeg%-nál kisebb;

(c) a nátrium-hialuronát 1%-os oldatának UV-ab50 szorbanciája 257 nm hullámhosszon 3,00-nál kisebb, és 280 nm hullámhosszon 2,0-nél kisebb;

(d) a nátrium-hialuronát fiziológiás pufferrel készült, 1%-os oldatának kinematikus viszkozitása kb. 10^-3m²/s-nél, előnyösebben 10^_2m²/s-nél nagyobb;

(e) a nátrium-hialuronát fiziológiás pufferrel készült, 0,1-0,2%-os oldatának 220 nm-en mért moláris optikai forgatóképessége -11 * 10³ fok-cm²/mol (diszacharid);

(f) az üvegtestben és az elülső csarnokban nincs szignifikáns celluláris infiltráció, az üvegtestben nincs

HU 226 598 Β1 zavarosság és kidudorodás, és nincs patológiás elváltozás a szaruhártyában, lencsében, íriszben, retinában és az érhártyában az éji majom szemében, amikor egy milliliter, fiziológiás pufferrel készült 1%-os nátrium-hialuronát-oldatot implantáltunk az üvegtestbe a csarnokvíz kb. felét helyettesítve, a fenti HUA (g) steril és pirogénmentes és (h) nem antigén.

Az 1 205 031 számú kanadai szabadalmi leírás (amely technika állásaként a 4 141 973 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásra utal) olyan hialuronsavfrakciókat említ, amelyek molekulatömege 50 000-100 000; 250 000-350 000; és

500 000-730 000, és ismerteti az előállításukra alkalmas eljárásokat.

Amikor nagy molekulatömegű hialuronsavat (vagy sót vagy más formát) használunk, azt hígítani kell ahhoz, hogy lehetővé tegye az adagolást és biztosítsa, hogy intramuszkuláris koaguláció nem következik be.

(v) A 33. oldal 37. sorától a 35. oldal 30. soráig:

„(gy a feltalálók a hialuronsavat (és a nátrium-hialuronátot és/vagy más formákat) gyógyászati és/vagy terápiás szerekkel kombinálták állapotok és betegségek kezelésére, teljesen váratlan eredményekkel:

Például

Állapot/Betegség

1. Rák, növekvő makrofágaktivitás

Kémszerek és gyógyszerek szabadgyök-befogó, szuperoxid dizmutáz, aszkorbinsav (C-vitamin), rákellenes szerek, NSAID, kemoterápiás szerek, detoxikáló szerek (például (kolesztiramin)

A)A duzzanat csökkentése az agyban agysérülést szenvedett személyben

2. Hajnövekedés Topikális alkalmazás esetén több haj nő

3. Herpesz, szájban levő fekély, herpes zooster

4. Veseelégtelenség, szívelégtelenség, magas vérnyomás, ödéma

5. Fertőzés, akne, mononukleózis dimetil-szulfoxid (DMSO) minoxidil-kombináció nemionos felületaktív anyagok, például nonoxinol-9 és anionos felületaktív anyagok, (például cetilpiridinium-klorid) és kationos felületaktív anyagok (például benzalkóniumklorid) diuretikumok - furoszemid antibiotikumok, antibakteriális szerek, antimikrobiális szerek stb., aszkorbinsav és hialuronsav

6. Transzplantációk 7. Gyulladás, tumor le-	ciklosporinok
5 bomlási termékek (toxinok és törmelékek) eliminációja, mellékhatások csökkentése, fájdalomcsillapí-
tás (például hátfájás)	nemszteroid gyulladásgát-
10	lók, NSAID, például diklofenac, indometacin, piroxikám, ibuprofén, ketorolaktrometaminsó, naproxén
8. Detoxifikáció	beöntés, detoxifikáló szer,
15	peritoneális dialízis
9. Hörgőtágulat	hörgőtágítók, például beklometazondiproprionát, (nátrium-kromoglikát, noha nem speciálisan hör-
20	gőtágító), teofillin
10. Vaszkuláris ischaemia	cukorbajban, Berger-betegségben stb. a végtagok megfelelő gyógyszerrel, például trentállal való ke-
25	zelése
11. HÍV (AIDS)	DMSO, C-vitamin, NSAID (például indometacin, naproxén, ketorolaktrometamin), interferon, Vibramy-
30	cin™, (doxiciklin), tetraciklin
12. Cukorbaj	inzulin
13. Posztmenopauza 14. Topikális fertőzés	ösztrogénhelyettesítés
megelőzése	antimetabolitok (például
35 15. Duzzadás csökken-	szulfonamidok)
tése 16. Magas vérnyomás,	DMSO
szívelégtelenség	kalciumcsatoma-blokko-
40	lók, például nifedlpin, β-blokkolók, például atenolol, propranolol
17. Prosztaglandinszintézis 18. A szövet oxigénellátá-	acetil-szalicilsav gátlása
45 sának fokozása a szövet perfúziós folyadékban való fürdetése (transzplantá-
ciós célokra)	perfuzátum
így a jelen találmány értelmében a PIP2-t tartalma-

zó gyógyászati készítményt olyan betegség és/vagy állapot megelőzésére vagy kezelésére alkalmazzuk, amely betegség vagy állapot egy receptor által közvetített kezeléssel kezelhető, és PIP2 a betegség vagy állapot helyén legalább egy kötési tartományhoz kötődik az alábbiak közül:

(a) RSHKTRSHH (egybetűs aminosavkódok), vagy másként Arg-Ser-His-Lys-Thr-Arg-Ser-His-His (hárombetűs aminosavkódok) és egy még további meghatározás:

HU 226 598 Β1

CGC-TCG-CAC-AAG-ACC-AGG-TCGCAC-CAC (egy további kód) (b) RPHFHKR (egybetűs aminosavkódok), vagy másként Arg-Pro-His-Phe-His-Lys-Arg (hárombetűs aminosavkódok), vagy CGG-CCC-CAC-TTC-CAC-AAG-CGG (egy további kód), és így, a tartományhoz kötődve a receptor nem képes működni.

így például resztenózis megelőzésében a simaizomsejtek nem vándorolnak bele, és a fehérvérsejtek (makrofágok) nem infiltrálódnak a szűkületes foltba a kötőszer hatékony mennyiségének adagolása után.

A PIP2 megfelelő mennyiségei, amelyek feltehetően terápiásán hatásosak, kb. 0,1 és kb. 1,5 mg között vannak testtömeg-kilogrammonként. Például kb. 0,2-1 mg PIP2-t adunk be a kezelt betegnek testtömeg-kilogrammonként. Ez a mennyiség csökkenthető vagy nagyobb dózismennyiségekre növelhető, és hatásosan alkalmazható. Azonban a PIP2-t előnyösen nem alkalmazzuk olyan mennyiségekben, amelyek a sejtekre vagy az egyénre nézve toxikusak. Bizonyos esetekben azonban a sejtek elpusztulhatnak akkor is, ha a PIP2 hatékony, az egyedre jótékony hatást kifejtő olyan mennyiségét adjuk be, amelyet nem tekintünk toxikusnak. Az adagolás annyi ideig történik, amíg arra szükség van.

A PIP2, amint azt az előzőekben említettük, alkalmas a találmány céljaira, amikor például kb. 0,1 és kb. 1,5 mg/kg testtömeg mennyiségben, így 0,2-1 mg kötőszer/kg testtömeg mennyiségben adagoljuk. A PIP2 jótékony hatásának fokozására a PIP2-t módosíthatjuk a zsíroldhatóságának a csökkentésére, például glükuronsavhoz vagy más megfelelő nem toxikus hidrofil szerhez kapcsoljuk, ezáltal a zsíroldhatóságát csökkentjük. A reakcióterméket PIP2-ből és egy hidrofil szerből állíthatjuk elő.

A PIP2 kötőmolekula maga is módosítható a foszfátcsoportjának más, például szulfát-, karbonát-, nitrát-, szulfit-, nitrit- vagy más alkalmas csoportra való cserélésével.

A rajzok leírása

1. ábra

Egy RSHKTRSHH szekvenciát tartalmazó fág kötődése egy biotinilezett hialuronán mintához (1) biotinilezett hialuronán; (2) 5 pg/ml PIP2; (3) 50 pg/ml PIP2; (4) 250 pg/ml PIP2 és (5) 100 pg/ml jelzetlen hialuronán jelenlétében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a PIP2 hatékonyan gátolja a hialuronánnak a fenti szekvenciához való kötődését. A jelzetlen hialuronánnak a biotinilezett hialuronánnal való vetélkedés! képessége ehhez a szekvenciához való kötődésért a hialuronán és a szekvencia kölcsönhatásának specifitását mutatja.

2. ábra

A PIP2-nek a hialuronán RHAMM-hoz való kötődését gátló képessége, (a) A biotinilezett hialuronán kötődik a RHAMM-hoz (ld. Yang és munkatársai, „Identification of a common link protein [The EMBO Journal, Vol. 13, No. 2, pp. 286-296, (1994)] irodalmi helyet a részletekre és a szabályozásra vonatkozóan, a közlemény utalás formájában a jelen leírás részét képezi}; (b) 250 pg/ml PIP2 lényegében megszünteti a hialuronánnak a RHAMM-hoz való kötődési képességét. Mivel az 1. ábrán leírt RSHKTRSHH szekvencia tartalmazza a hialuronánt kötő alap-aminosavmotívumot (7 interveniáló aminosav, az alapaminosavra vonatkozóan ld. Yang és munkatársainak a fenti munkáját) és ez a PIP2-höz kötődik, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a PIP2 ugyanahhoz a motívumhoz kötődik, mint a hialuronán a RHAMM-ban.

3. ábra ³H-PIP2 kötődése RHAMM-hoz egy átszívatásos vizsgálatban. A ³H-PIP2 kötődik a RHAMM-hoz, és a kötődésért vetélkedik a jelzetlen PIP2-vel.

4. ábra

Citoplazmában és magban lokalizált RHAMM.

5. ábra

A magban és kisebb mértékben a citoplazmában elhelyezkedő FITC-HA.

Metodológia

1. ábra

RSHKTRSHH szekvenciát tartalmazó bakteriofágot biotinilezett hialuronán segítségével különítettünk el, amely sztreptavidinbevonatú gyöngyökbe volt foglalva. Ezeket a bakteriofágokat azután 5-25 pg PIP2 vagy 100 pg jelzetlen exogén hialuronán hatásának tettük ki. Azokat a fágokat, amelyek ezen eltérő körülmények között a biotinilezett hialuronán felületén megkötődtek, agarlemezen szélesztettük, és 37 °C-on 48 órán át növesztettük. A lemezekről fényképfelvételt készítettünk.

2. ábra

RHAMM 2 variánst szintetizáltunk, amihez E. coli baktériumba transzformált RHAMMv2 cDNS-t használtunk, amint azt Yang B., Yang B. L., Savani R. C. és Turley E. A. részletesen leírja [The EMBO Journal 13, 286-296 (1994)]. A RHAMM fehérjét SDS-PAGE-ban (ld. a fenti utalást) elektroforézisnek vetettük alá, és nitrocellulóz-acetátba átszívattuk. A biotinilezett hialuronánt ezután a membránnal inkubáltuk, és a kötött biotinilezett hialuronánt kemilumineszcenciával mutattuk ki a fentebb említett cikkben leírt módon. Egy másik átszívatott mintában a biotinilezett hialuronánt PIP2-vel (250 pg/ml) kevertük, és a keveréket RHAMM-ot tartalmazó membránnal inkubáltuk. A megkötött biotinilezett hialuronsavat azután a fenti módon, kemilumineszcenciával mutattuk ki.

3. ábra

Tríciummal jelzett PIP2-t (Amersham, 50 pC/10 ml) RHAMM-mal inkubáltunk, amelyet a fentebb leírt módon

HU 226 598 Β1

SDS-PAGE-on különítettünk el, és nitrocellulóz membránba szívattunk át. A radioaktív izotóppal jelzett PIP2-t RHAMM-mal 1 órán át inkubáltuk, majd mostuk, és 1 hónapon át KODAK radiográfiás filmmel érintkezésben tartottuk. A filmet ezután egy Biorad denzitométerrel szkenneltük. Az átszívatott mintát detergenssel leoldottuk, majd poliklonális anti-RHAMM antitestekkel újra RHAMM-ra vizsgáltuk, hogy ellenőrizzük, a radioaktív izotóppal jelzett sav egybeesik-e a RHAMM fehérjével.

A PIP2 mimetikum dózisának számítása

Az 5-250 pg/10 ml-es dózistartomány hatásos volt a hialuronánnal való vetélkedésben. Egy patkány vérének térfogata kb. 15 ml, és az átlagos testtömege 250 g.

Ezért a patkányonként használt PIP2 mennyisége 25-375 pg/250 g vagy 100-1500 pg/kg vagy 0,1-1,5 mg/kg testtömeg.

Egy módosított adenovírus génterápiát tartalmazó (például GMCSF - Growth in Marrow Colony Stimulating Factor - akronim) hatásos mennyiségét állítottuk elő, amely a szakember számára ismert módon adagolható. Ez a módosított adenovírus arra szolgál, hogy az adagolás után az immunrendszert a tumorra irányítsa. A korábban szokásos adagolási módtól eltérően, az adenovírust tartalmazó génterápia egy antiszensz pepiiddel való további módosítását ajánljuk, hogy így a felületen egy továbbmódosított „vírusbevonatot hozzon létre annak a felületén, amit a betegnek beadunk. (A szakemberek ismert módszerek alkalmazásával ezt könnyen meg tudják valósítani).

Megmutattuk, hogy a HA (hialuronán)-receptorok száma nő (a receptorok túlzott mértékben expresszálódnak) a mellrákban, a hasnyálmirigyrákban, a vastagbél-végbél rákban. Magas a RHAMM-expresszió (magas a HA-receptor expresszió) a metasztázisokban. Ily módon a fentebb leírt antiszensz peptidet (a kötési tartomány tükörképét) [különösen a fenti (b) antiszensz peptidet] külső bevonatként hordozó módosított adenovírus a rákos daganatok RHAMM-jához kötődik, és közvetlenül a magba jut. A tumor magját azután az adenovírus módosítja (hatékonyan előállítva azt a génterméket, amelyre tervezték), és a tumort az immunrendszer lerombolja. Ezen javaslat alapját az képezi, hogy egy RHAMM-ot expresszáló sejtben a hialuronán a sejthez megy és a RHAMM-hoz kötődik, és kb. 15 perccel később a hialuronán már átjutott a magon. Az antiszensz peptidek, például a (b) antiszensz peptid ezért közvetlenül a sejtbe és a magba hatol. A 4. és 5. ábra szemléleti ezt az eseményt. Különösen az 5. ábrán a FITC-HA (hialuronán) a magban és a citoplazmában van. Ugyanez történne a fentebb tárgyalt antiszensz peptidek esetében is.

Ld. „Nuclear Localization Signals Direct Nuclaar Proteins to the Nucleus”, The Molecular Biology of the Cell, 3rd edition, pp. 563-564 (B. Albertz, D. Brag, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J. O. Watson).

Mivel a megvalósítási módokon számos változtatás végezhető anélkül, hogy a találmány körétől eltávolodnánk, az itt bemutatott anyagok úgy tekintendők, mint amelyek a találmány szemléltetésére szolgálnak, és a találmányt nem korlátozzák.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Foszfatidinil-inozit-4,5-biszfoszfát (PIP2) felhasználása rosszindulatú daganatok vagy resztenózis kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyászati készítmény előállítására, ahol a PIP2 a betegség vagy állapot helyén az alábbi kötési tartományok legalább egy csoportjával kötődik:

(a) RSHKTRSHH (egybetűs aminosavkódok), vagy másként

Arg-Ser-His-Lys-Thr-Arg-Ser-His-His (hárombetűs aminosavkódok) és egy még további meghatározás:

CGC-TCG-CAC-AAG-ACC-AGG-TCGCAC-CAC (b) RPHFHKR (egybetűs aminosavkódok), vagy másként Arg-Pro-His-Phe-His-Lys-Arg (hárombetűs aminosavkódok), és egy még további meghatározás: CGG-CCC-CAC-TTC-CAC-AAG-CGG.
2. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, ahol a gyógyászati készítmény a PIP2 hatékony mennyiségét tartalmazza valamely gyógyszerrel és/vagy terápiás szerrel összekeverve.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti felhasználás, ahol a PIP2 mennyisége 0,1-1,5 mg/kg, a beteg testtömegére vonatkoztatva.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti felhasználás, ahol a PIP2 mennyisége meghaladja a 0,2-1 mg/kg értéket, a beteg testtömegére vonatkoztatva.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti felhasználás, ahol a PIP2 olyan vegyület, amely PIP2-t és egy hidrofil szert tartalmaz.
6. Az 5. igénypont szerinti felhasználás, ahol a hidrofil szer glükuronsav.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti felhasználás, ahol a PIP2 aktív részének legalább egy foszfátcsoportját egy, a szulfát-, karbonát-, nitrát-, szulfit- vagy nitritcsoportok közül kiválasztott csoport helyettesíti.