WO2004060404A1

WO2004060404A1 - 薬物担体

Info

Publication number: WO2004060404A1
Application number: PCT/JP2004/000004
Authority: WO
Inventors: Tsuyoshi Shimoboji; Teruo Nakamura; Hajime Miyamoto; Rie Shiokawa
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2004-01-05
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2005-06-27

Abstract

　本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体中のグルクロン酸のカルボン酸への置換基の導入率を変化させること、さらに、ＨＡ誘導体の分子量を変化させることによる、ＨＡ誘導体の消失速度の調節方法を提供する。また、本発明は、薬物の血中半減期を延長または制御するために、消失速度が調節されたヒアルロン酸誘導体をキャリアに用いた薬物コンジュゲートを提供する。

Description

明細書

薬物担体技術分野

本出願は、薬物の血中半減期を延長、制御し、十分な薬効を維持することを可能にするヒアルロン酸 (HA) 誘導体薬物担体、これを用いた薬物とのコンジユゲート、および生体内における当該薬物の動態制御技術に関する。背景技術

一般に、タンパク質製剤の血中滞留性、安定性向上のためにタンパク質と水溶性ポリマ一とのコンジュゲートが試みられている。特に、ポリエチレングリコ一ル（ PEG) は、その不活性 (i ne r t) な性質と、' タンパク質吸着を防ぐ効果により、広く用いられており、医薬品として実用化の段階に入っている。しかし、 PE Gは生分解性ポリマーではない為、腎排泄による排泄性、蓄積した場合の安全性等の問題が懸念される。

ヒアルロン酸 (HA) は、 1934年、 K. Me ye rによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細マトリックスの主成分として古くから知られている。 HAは、 D—グルクロン酸と N—ァセチルダルコサミンとが /3 (1→3) グリコシド結合により連結された二糖単位から成るダルコサミドグリカンの一種である（式（I I I) ) 。

HAは、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトも代謝系を持っており、免疫性、毒性といった面でも最も安全な医用生体材料 (B i oma t e r i a 1) である。近年、その、細胞の接着、増殖、移動の誘導といった生理活性物質としての側面が報告され、注目されてきており、また、微生物による高分子量 HAの大量生産が可能となり、変形性軟骨治療薬、化粧品等の分野でも実用化されている。

そんな中、薬物を HAとコンジュゲートすることによる、薬物の癌組織（国際公開第 92/06714号参照）、肝臓（特開 2001— 81103号参照）への夕 —ゲッティング、抗原性の低減（特開平 2— 273176号参照）、血中滞留性の延長（特開平 5— 85942号公報、国際公開第 01Z05434号、国際公開第 01/60412号参照）等の報告がある。

薬物コンジユゲート担体としての H Aは、これまで広く検討されている P E Gに比較して、より安全であり、巨大なサイズ化が可能、さらに、 1分子中に多くの反応点を持っため、複数の、あるいは異なる種類の薬物を 1分子中に担持できる。従つて HAは、 PEGに比較して、タ一ゲッティング、徐放等、より高度な薬物動態制御機能を持つコンジユゲートを設計開発するための薬物コンジユゲート担体として格段に大きい潜在的可能性を有すると考えられる。また、 HAは、生分解性であり、その化学的構造に種差が無いことから安全性という点で最も優れた担体の 1つと言える。

一方で、 HA自体の血中消失速度は速ぐ静脈内投与 (I. V. ) した場合で半減期は 2分と報告されている（J. I n t e r. Me d. 第242巻、第27— 3 3頁、 1997年参照）。本発明者の検討でも、 B隹単に H Aをタンパク質にコンジユゲートすれば血中滞留性が延長され、薬効の持続性向上に繋がるといったものではないことを確認している。しかしながら、 H Aを薬物担体として使用する上で重要な、 H Aの体内動態をコントロールするための主要因は知られておらず、また、 HA誘導体自体の動態、並びにその血中滞留性を増加させる為の誘導体が備えるベき必須条件に関する報告は全く無い。上述した如く、 HAを薬物担体として使用する上で重要な、 HAの体内動態をコントロールするための主要因は知られていない。また、 HA修飾体自体の動態報告、並びに血中滞留性を増加させる為の修飾方法に関する報告は全く無く、 HAの体内代謝系を回避し、血中滞留性を制御する方法は知られていない。

本発明者は、力かる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、ヒアルロン酸（HA) 中のグルクロン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率を変ィ匕させることにより、 H Aの消失速度を調節できることを見出した。さらに、 H Aの分子量を変ィ匕させることでも、 H Aの消失速度を調節できることを見出した。すなわち、本発明は、 HAの消失速度の調節方法、及び該 HAを用いた薬理作用を有する物質とのコンジュゲートの製造方法に関する。

すなわち本願発明の一つの側面によれば、ヒアルロン酸誘導体中のダルク口ン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率を変化させることにより、ヒアルロン酸の消失速度を調節する方法が提供される。ここで、当該置換基の導入率の変ィ匕は、増加または減少のどちらでもよく、当該消失速度は低下または向上のどちらでもよいが、当該置換基の導入率を増加することにより、当該消失速度を低下させることが好ましい。

また、前記ヒアルロン酸誘導体は、グルクロン酸部分のカルボン酸への置換基が導入されていれば特に限定されないが、好ましくは、式（I ) ：

(式中、 X。は、一〇一、一 N (— ―、一 S—、 -N (-R^ N (-R₂) ―、 -N (-R_x) N (-R₂) CO—、または単結合であり、

X は、直鎖または分枝 — アルキル基、直鎖または分枝 C — アルコキシ基、直鎖または分枝 C₂_₁₂アルケニル基、 C₆_₁₈ァリール基、 C₃— ₈シクロアルキル基または複素環基であり、各置換基は、保護基を導入されたまたは遊離のヒドロキシル基、アミノ基、ヒドラジド基、メルカプト基、マレイミド基、力ルポキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基を 1つ以上有していてもよく、また上記官能基を有する置換基の重付加体あるいは重縮合体も含み、

および R₂は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝 Ci- ヒドロキシアルキル基、アルキレンォキシド基またはポリアルキレンォキシド基である。）

で表される繰り返し構造を、分子内に 1またはそれ以上有するヒアルロン酸誘導体である。

ここで、式（I) において、好ましくは X₀は、 _N (-Ri) N (_R₂) —、または _N (-Ri) N (_R₂) CO—であり、好ましくは X₂は、アミノ基またはヒドラジド基で置換された直鎖または分枝アルキル基であり、好ましくはおよび R₂は、水素原子である。

また、前記ヒアルロン酸誘導体は、薬理作用を有する物質とのコンジュゲートを形成していてもよい。また、消失速度とは、特に限定されないが、好ましくは血中消失速度である。

本願発明の別の側面によれば、前記方法により消失速度が調節されたまたは低下したヒアルロン酸誘導体に、薬理作用を有する物質が結合しているコンジユゲートが提供される。

ここで、薬理作用を有する物質は、特に限定されないが、好ましくはタンパク質又はペプチドである。

本願発明のさらに別の側面によれば、式（I I) ：

(式中、 X。は、 _〇_、 — N (-R_x) ―、一 S―、一 N (_R N (― R₂) ―、 ― N (-Ri) N (-R₂) CO—または単結合であり、

X₂は、直鎖または分枝。 ₁₂アルキル基、直鎖または分枝 (^— ₁₂アルコキシ基、直鎖または分枝 C₂_₁₂アルケニル基、（：₆_₁₈ァリール基、 C₃— ₈シクロアルキル基または複素環基であり、各置換基は、保護基を導入されたまたは遊離のヒドロキシル基、アミノ基、ヒドラジド基、メルカプト基、マレイミド基、力ルポキシル基

、アルデヒド基、スルホン酸基を 1つ以上有していてもよく、また上記官能基を有する置換基の重付加体あるいは重縮合体も含み、

および R₂は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C — アルキル基、直鎖または分枝 —^ヒドロキシアルキル基、アルキレンォキシド基またはポリアルキレンォキシド基である。 )

で表される繰り返し構造を、分子内に 1またはそれ以上有する、ヒアルロン酸誘導体に薬理作用を有する物質が結合しているコンジユゲート作製における、前記ヒアルロン酸誘導体の使用が提供される。

ここで、式（I I) において、好ましくは X₀は、 —N (-R_x) N (― R₂) - または一N (~R_X) N (― R₂) CO—であり、好ましくは X₂は、アミノ基またはヒドラジド基で置換された直鎖または分枝アルキレン基であり、好ましくはおよび R₂は、水素原子である。

本願発明のさらに別の側面によれば、以下の工程、すなわち、 (a) ダルク口ン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率が異なる 2つ以上のヒアル口ン酸誘導体に、それぞれ薬理作用を有する物質を結合させる工程、

(b) (a) で作製したコンジュゲートの消失速度を測定する工程、

(c) 測定結果を基に、目的の消失速度に対応する置換基の導入率を算出するェ程、

(d) (c) で算出された導入率を有するヒアルロン酸誘導体を作製する工程、を含む、ヒアルロン酸誘導体と薬理作用を有する物質のコンジユゲートの作製方法が提供される。

また、当該コンジュゲートの作製方法は、以下の工程、すなわち：

(a) グルクロン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率が異なる 2つ以上のヒアル口ン酸誘導体の消失速度を測定する工程、

(b) 測定結果を基に、目的の消失速度に対応する置換基の導入率を算出するェ程、

(c) (b) で算出された導入率を有するヒアルロン酸誘導体に薬理作用を有する物質を結合させる工程、

を含んでいてもよい。

ここで、消失速度は、特に限定されないが、好ましくは血中消失速度である。本願発明のさらに別の側面によれば、以下の工程、すなわち：

( a ) ダリレク口ン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率が異なる 2つ以上のヒアル口ン酸誘導体、またはダルク口ン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率が異なる 2つ以上のヒアルロン酸誘導体に薬理作用を有する物質を結合させたコンジュゲートの消失速度を測定する工程、

(b) (a) で測定した結果を基に、置換基の導入率と消失速度の相関関係を得る工程、

(c) (b) で得た相関関係を基に、置換基の導入率から消失速度を予測するェ程、

を含むヒアルロン酸誘導体の消失速度を予測する方法が提供される。

ここでも、消失速度は、特に限定されないが、好ましくは血中消失速度である。本願発明のさらに別の側面によれば、ヒアルロン酸誘導体の分子量の調整と、ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率の調整とを組み合わせることにより、ヒアルロン酸誘導体の消失速度を調節する方法が提供される。図面の簡単な説明

図 1は、 HA誘導体 (a 0-a 3) を投与したラットから採取した血漿サンプルにおける、当該 HA誘導体の濃度の経時変化を示すグラフである。

図 2は、 HA誘導体（b 0— b 3) を投与したラットから採取した血漿サンプルにおける、当該 HA誘導体の濃度の経時変化を示すグラフである。

図 3は、 HA誘導体 (c 0-c 3) を投与したラッ卜から採取した血漿サンプルにおける、当該 H A誘導体の濃度の経時変化を示すグラフである。発明を実施するための好ましい形態

以下、本発明を更に具体的に説明する。

本発明者らが、ヒアルロン酸 (HA) の血中半減期制御に重要と考えた要素は、カルボン酸修飾率、 HA分子量の 2要素である。これらの要素が異なる H A誘導体を合成、さらに H A誘導体にタンパク質をコンジュゲートする事で、 H Aのタンパク質コンジユゲートキャリァ一としての有用性、およびその効果を最適化するパラメ一ターを明らかにした。

H Aの主代謝部位は肝臓、リンパ腺であり、その代謝は、主に CD 44、 RHA MM、 HARE等の HAに特異的に結合する細胞膜局在レセプ夕一を介した（Rece ptor Mediated) 細胞内への取り込みと、それに引き続くヒアルロニダーゼ（hy a l u r on i d a s e) による分解によるものである。これらの分子は共に、 H Aの連続した遊離のカルボン酸（6糖）を主な認識部位にしていることが報告されている（Exp. Ce l 1 Re s. , 第 228巻、第 2 1 6— 228頁、 1 99 6年参照）。本発明者らは、ここに着目し、代謝系分子に認識され難いように ¾tにカルボン酸を修飾することで血中滞留性を制御、延長できることを見出した。尚、カルボン酸の修飾率は、プロトン NMRで定量される。

また、本発明の HA誘導体の分子量もその体内動態に重要な要因である。本発明の HA誘導体の血中滞留性は HAの分子量にも依存し、分子量の大きな HA程その血中半減期は長い。従って、 H Aの分子量と H Aのカルボン酸の修飾率を変化させることで、 H A誘導体の血中半減期を制御できる。ヒアルロン酸重量平均分子量の測定方法については、光散乱法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することがでさる。

本発明において HAの消失速度の調節とは、 HAの消失速度を大きくし、または小さくすることにより変ィ匕させることであり、通常、目的とする消失速度になるように変化させる。一般的に、置換基の導入率を高くした場合には H Aの消失速度は小さくなり、逆に、置換基の導入率を小さくした場合には H Aの消失速度は大きくなる。また、置換基の導入率の変化は、通常、導入率が 0 · 0 0 1 %〜 9 9 . 9 9 9 %の間で変化させ、好ましくは 1 %〜9 9 %の間で変化させ、さらに好ましくは 1 0 %〜 9 0 %の間で変化させる。

本発明において、 HA中のダルク口ン酸のカルボン酸に導入される置換基としては、特に制限されず、導入可能な置換基であればどのような置換基でも用いることが可能である。しかし、導入された官能基が疎水性の場合は、 HA誘導体の溶解度が下がる為、親水性の官能基が好ましい。

当該置換基の導入方法としては、当業者が通常なし得る方法であれば特に制限されないが、例えば、力ルポキシル基をアミド基、エステル基、ヒドラジド基に変換し、アミド基およびヒドラジド基の窒素原子上の置換基として、またはエステル基の酸素原子上の置換基として導入することができる。置換基の具体的な例としては、直鎖もしくは分岐したアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、ァリール基、アルキレンォキシド基、シクロアルキル基、複素環基などを挙げることができ、各置換基は、例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、ヒドラジド基、メルカプト基、力ルポキシル基、アルデヒド基などの官能性置換基から選ばれる 1つまたはそれ以上の置換基を有していてもよい。また、当該官能性置換基は、場合によっては保護基を有していてもよい。

ここでアルキル基は、炭素数 1〜1 2のものであり、好ましくは炭素数:！〜 6である。また、アルコキシ基は、炭素数 1〜1 2のものであり、好ましくは炭素数 1 〜6である。また、アルケニル基は、炭素数 2〜1 2のものであり、好ましくは炭素数 2〜6である。また、ァリール基は炭素数 6〜1 8のものであり、好ましくは 6〜1 2である。また、アルキレンォキシド基は、 ― （CH (— R) CH (― R ' ) 〇） _n-H (式中、 Rおよび R ' は水素原子、または — 5アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンォキサイド基であり、また好ましくは nは、 1〜2 0の整数である。また、シクロアルキル基は、炭素数 3〜 8のものであり、好ましくは炭素数 3〜 6である。また、複素環基は、例えば、窒素原子、酸素原子、硫黄原子から選ばれるヘテロ原子を 1つまたはそれ以上有する 5〜 6員環複素環基であり、不飽和、飽和、または部分的に飽和していてもよい。

また、官能基を有する置換基の重付加体あるいは重縮合体は、特に限定されないが、ポリ (オリゴ) C ₆アルキレングリコール、ポリ (オリゴ) アミノ酸、ジァミンとジカルポン酸の組み合わせなどが挙げられる。

また、置換基が導入された HA誘導体の電荷に関しては、導入された置換基が、カチオン性であった場合、トータルの電荷がプラス側に振れ、血中滞留性の短縮に繋がるため、ヒアルロン酸の消失速度を遅くする場合には修飾電荷は非イオン性か、ァニオン性であることが好ましい。

本発明において H A誘導体消失速度とは、 HAが i n v i v o又は i n v i t r oで消失される速度である。本発明の調節方法は i n V i v oにおいて特に効果が高いので、 i n v i v oでの消失速度、特に血中滞留性（血中消失速度）を指標に消失速度を測定することが好ましい。

消失速度の測定は特に制限されず、当業者に公知の方法で測定することができる。例えば、 HAの血中滞留性を指標に HAの消失速度を測定する場合、血中濃度の経時的変化を測定し、この動態解析を行うことで血中からのクリアランスを定量し、これを消失速度と定義する。消失速度を i n V i t r oで測定する場合には、例えば、ヒアルロニダ一ゼを添加し、経時的にゲル浸透クロマトグラフィー（ge 1 pe rme a t i on chr oma t og r aphy、 GPC) にて HA誘導体の消失速度を測定すればよい。

本発明に用いられる HAは HA骨格を有していれば特に限定されず、例えば、 H Aの一部を修飾した修飾 HAや、 HA及び修飾 HAの塩（ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、等）なども含まれる。本発明に用いられる HAは、どのようにして得られた HAでもよく、動物糸纖から抽出された HA、発酵法で得られた HA、化学合成で得られた HAなど、その由来は限定されない。

薬理作用を有する物質は特に限定されず、低分子化合物、タンパク質、ペプチド等を用いることが可能である。

低分子化合物の例としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代諭抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤、等）、抗リウマチ剤、抗鋪 J ( -ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤、等）などを挙げることができる。

タンパク質、ペプチドの例としては、例えば、エリスロポエチン（EP〇）、グラニュ口サイトコロニー剌激因子（G—CSF) 、インタ一フエロン一、 βゝ r 、（INF—ひ、 β、 r) 、トロンポポェチン（TPO) 、シリアリ一ニュートロフイクファクター (CNTF) 、チューマーネクロ一シスファクタ一 (TNF) 、チュ一マーネクローシスファクタ一結合タンパク質（TNFbp) 、インターロイキン一 10 (I L— 10) 、 FMS類似チロシンカイネース（F 1 t— 3) 、成長ホルモン（GH) 、インシュリン、インシュリン類似成長因子 _1 (I GF— 1) 、血小板由来成長因子（PDGF) 、インターロイキン一 1レセプ夕一アンタゴニスト（I L— 1 r a) 、ブレイン由来ニューロトロフイクファクター（BDNF) 、ケラチノサイト成長因子 (KGF) 、幹細胞因子 (SCF) 、メガカリオサイト成長分化因子 (MGDF) 、ォステオプロテゲリン（OPG) 、レブチン、副甲状腺ホルモン（PTH) 、塩基性フイブロブラスト成長因子（b— FGF) 、骨形成タンパク質（BMP) 、グルカゴン様ペプチド一 1 (GLP— 1) 、抗体、ダイァボディー等を挙げることができる。なお、ここでいうタンパク質、ペプチドは、それぞれ構成するアミノ酸の 1または 2以上の置換、欠失、もしくは 1または 2以上のアミノ酸を付加した改変体あるいは共有結合的に化学修飾した修飾体を含む。

HA誘導体の調製方法は、既知のカルボン酸修飾方法を用いることができる。例えば、 HAのカルボン酸をエチレンジァミン（EDA) やアジピン酸ジヒドラジド (ADH) を 1—ェチルー 3— (3—ジメチルァミノプロピル)カルポジイミド（E DC) で縮合させ、アミノ基、あるいはヒドラジド基を有する HA (HA— AM、 HA— HZ) を合成する。この際、 AM、 HZは、例えば無水コハク酸等で処理、カルボン酸に戻してトータル電荷をァニオンにした方が血中滞留性の延長に好ましレ^ あるいは、同様の方法で、アミノ酸、ペプチド等のアミノ基で修飾しても良い本発明の HA誘導体と薬理作用を有する物質のコンジユゲー卜を作製する場合、 H Aの消失速度の調節と薬理作用を有する物質のコンジュゲートの順番は限定されず、例えば、消失速度を調節した HA誘導体に薬理作用を有する物質をコンジュゲ一トしてもよいし、薬理作用を有する物質をコンジユゲートした後に HAの消失速度を調節してもよい。

さらに、こうして得られた血中消失速度を制御された H A誘導体と薬利作用を持つタンパク質とからなるコンジュゲートの調製方法は、既知のポリマーとタンパク質のコンジュゲートで使用されている方法を用いることができる。例えば、上述のアミノ基、あるいはヒドラジド基修飾された HA (HA— AM、 HA-AZ) を合成、この一部を N—スクシンィミジル 3— [2—ピリジルジチォ] プロピオネート（N-Succinimidyl 3- [2-pyr i dy 1 d i t h i o] r o i onat e, SPDP) と反応させ、メルカプト基を導入、 HA—SAを調製する。この際、余剰の AM， HZは、例えば無水コハク酸等で処理し、 — NHCOCH₂CH₂C〇OHまたは一 NHNHCOC H₂ CH₂ C OOHなどのカルボキシル基を有する基に変換してトータル電荷をァ二オンにした方が好ましい。一方で、タンパク質にマレイミド基、ピニルスルフォン基等チオールと特異的に反応する官能基を導入する。例えば、マレイミドブチリロキシスルフォサクシンエーテルでタンパク質のァミノ基にマレイミド基を導入、これを H A— S Hと反応させコンジュゲートを調製すればよい。

ここで、このコンジユゲートにおいて、コンジユゲートの生物活性を有効に保つために、タンパク質と H A誘導体主鎖間のスぺーサ一の長さを調節したり、部位特異的なコンジュゲ一トとすることもできる。

H Aの消失速度を調節する為の具体的な方法としては、置換基の導入率の異なる複数の HAの消失時間を測定し、その中から目的の消失時間となる HAを選択する方法や、導入率の異なる複数の H Aの消失時間を測定し、その結果から置換基の導入率と HAの消失時間の相関関係を導きだし、その相関関係をもとに目的の消失時間となる置換基の導入率を算出する方法などを挙げることができる。

置換基の導入率と消失速度の相関関係は、例えば、最小二乗法などの公知方法を用いて求めることができる。最小二乗法は、測定結果とモデルとなる関数から得られる値の差の二乗和が最小となるようなモデルのパラメ一夕を決定する方法である。モデル関数がパラメ一夕に対して線形の塲合、連立一次方程式を解くことにより最小二乗解を得ることが可能となる。モデル関数がパラメ一夕に対して非線形線形の場合には、反復改良によってそのパラメータを決定する必要があり、最急降下法、 Marquardt法、 Gauss- Newton法などにより最小二乗解を得ることが可能となる。置換基が目的の割合で導入された HA誘導体の製造は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、 ED Cで HAのカルボン酸にエチレンジァミン（E DA) やアジピン酸ジヒドラジド（ADH) を縮合、修飾する場合は、 ED Cの H Aに対する添加量および反応溶液中ヒアルロン酸濃度で置換基の導入量を調節できる。

また、 H Aの分子量も HA消失速度に影響を与えることから、置換基の導入率を変化させるとともに、 HAの分子量も変化させて、消失速度を調節してもよい。実施例以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

NMR測定は、核磁気共鳴装置 JNM-ECA500 (日本電子株式会社製）を用いて重水を溶媒に用いて測定した。また置換基の導入率の決定は、導入した置換基特有のピークとヒアル口ン酸由来のピークの積分比より決定した。

ゲル浸透ク口マトグラフィー (GPC) 分析は、 HP LCシステム (Waters™ 600S Controller, Waters™ 616 Pump, Waters™ 717puls Autos ampler, Waters™ 474 Scanning Fluorescence Detector Aliance) を用い、以下の測定条件より行った。

GPCカラム： TSKg e 1 G6000 PW_XL

移動相：リン酸食塩水バッファー（PBS、 pH7. 4)

溶離方法：イソクラチック

流速： 0. 5mL/m i n

使用サンプル量： 40 L

検出波長：蛍光（励起 490 nm, 蛍光 5, 1 8 nm)

解析ソフト： M i 1 1 e n i um32 V e r. 3. 21

また、「ユニット」という用語は、ヒアルロン酸 (HA) 誘導体中に含まれる、 D—ダルクロン酸と N—ァセチルダルコサミンの 2糖を骨格とする繰り返し構造を意味する。

実施例 1 ：ヒアルロン酸誘導体の合成

[実施例 1 - 1 - 1] ヒアルロン酸— H Z (MW 25KDa) の合成

修飾率の異なるヒドラジド基（HZ) が導入されたヒアルロン酸誘導体 (HA- HZ) の合成を以下の手順で行った。

分子量 2. 5X 10⁴ダルトンのヒアルロン酸（HA) (電気化学工業株式会社製）を 1. 0 %濃度で蒸留水に溶解し、 5N：^でpHを4. 7〜4. 8に調整した。 3つのロットにおいて、 1ーェチルー 3— ( 3一ジメチルァミノプロピル) 力ルポジイミド（EDC) とアジピン酸ジヒドラジド（ADH) を、 HA : EDC : ADH=1 : 0. 1 : 40 (a 0) 、 1 : 1 : 40 (a 2) 、および 1 : 5 : 40

(a 3) モル比になるようそれぞれに添加し、 5N塩酸で pHを 4. 7〜4. 8に保ちながら室温で 2時間反応させた。大過剰量の 10 OmM塩化ナトリウム溶液、 25%エタノール溶液、蒸留水に対して順に透析（スぺクトラポア 7、分画分子量

(MWCO) ： 12k— 14kタレトン）し、凍糸吉乾燥して標題のヒドラジド基 ( HZ) が導入されたヒアルロン酸 (HA-HZ) を得た。

得られた HA— HZ中の HZ導入率を ADH導入率としてプロトン NMR法で定量したところ、 HAのカルボン酸の 3% (aO) 、 42% (a2) 、および 59%

(a 3) が HZ化されていた（HA由来の N—ァセチル基 (2. 1 ppm) と、ァジピン酸ヒドラジド由来のメチレン基 X 4 (1. 7 ppm, 2. 4 ppm) を比較 [実施例 1—1一 2] ヒアルロン酸—HZ (MW19 OKDa) の合成分子量 1. 9X 10⁵ダルトンの HA (電気化学工業株式会社製）を 0. 5%濃度で蒸留水に溶解したほかは前述の実施例 1-1-1と同様の方法で、標題の HZ が導入された HA誘導体 (HA-HZ) を得た。得られた HA— HZ中の HZ導入率をプロトン NMR法で定量したところ、 HAのカルポン酸の 6% (b 0) 、 49 % (b 2) 、 71% (b 3) が HZ化されていた。

[実施例 1— 1— 3] ヒアルロン酸一HZ (MW58 OKDa) の合成分子量 5. 8X 10⁵夕レトンの HA (電気化学工業株式会社製）を 0. 25% 濃度で蒸留水に溶解したほかは前述の実施例 1-1-1と同様の方法で、標題の H Zが導入された HA誘導体 (HA-HZ) を得た。得られた HA— HZ中の HZ導入率をプロトン NMR法で定量したところ、 HAのカルポン酸の 8% (c 0) 、 5 6% (c 2) , 73% (c 3) が HZ化されていた。

[実施例 1-2] 蛍光ラベル化ヒアルロン酸一 HZ誘導体の合成

実施例 1一 1で調製された 9種類の H A— H Zを蒸留水に溶解させた後，等量の 10 OmM炭酸ナトリウム（pH9. 0) を加えて終濃度を 1 mgZmLに調整した。これに HA— HZ溶液の 1/10容量のジメチルスルホキシド（DMSO) に溶解させたフルォレセイン一4—イソチオシァネート（F l uo r e s c e i n— 4- i s o t h i ocyana t e, F ITC) を、 F I TC/HAユニット = 3 . 0 (a 0, b 0, c 0) 、 0. 5 (a 2, b 2. c 2) 、 0. 3 (a 3, b 3, c 3) (mo 1 /mo 1) の仕込比で，添加し，室温， «下に 1時間反応させた。反応溶液 25 mLを予め 5 OmM炭酸ナトリウム（pH9. 0) で平衡化した PD-10 (10本）に投入し，未反応の F ITCを余去した。精製した溶液に S A/HZ (TNBS) =250 (a 0, b 0, c 0) 、 80 (a 2, b 2. c 2) , 40 (a 3, b 3, c 3) (mo 1/mo 1) の仕込比で、 3. 5mLの DM SOに溶解させた無水コハク酸（SA) を添加し同様に反応させた。反応混合物を大過剰量の蒸留水に対して透析精製し，得られた水溶液を凍結乾燥した。

得られた各試料を所定濃度に溶解させ、 0. 25mgZmLに希釈した試料溶液の 494 nmにおける吸光度から F I TC濃度を定量し，以下の式に従って各ュニットの濃度を算出した。さらに，モル分率への変換，誘導体中 HA由来の重量分率算出を行った。

各試料について、トリニトロベンゼンスルホン酸 (TNBS) によるァミノ基の定量を行った。当該定量は、「学会出版センター生物化学実験法 12 蛋白質の化学修飾く上〉初版」 37ページに記載の方法（TNBS法）に従った。ただし、 TNBS溶液は 0. 5 Mに調製し、ヒドラジド基を定量するために 500 nmの吸光度を測定した。

修飾を受けていない（非修飾） HAユニット： X nmo 1 /mL

残存 HZ基に無水コハク酸が導入されたュニット： y nmo 1 ZmL

-式 1 ： (379.3 X x) + (635.57 X y) + (924.88 X (FITC cone.)) = 250 mg ·式 2 : x / (y + (FITC cone.)) = (100 - HZ (¾)) HZ (%)

得られた結果を表 1. にまとめた。

表 1. 薬物導体学的パラメ一ター算出用の F I TC標識化 HA誘導体導入きれた残存 HA-FITC HA-SUC 非修飾 HA

HZ基 (%) HZ基 (%) ユニットユニットユニット HA

HA-HZ NMR TNBS (mol %) (mol %) (mol %) (weight %) a0 3 - 1.06 1.94 97.00 99.75 b0 6 - 1.35 4.65 94.00 98.24 c0 8 - 1.48 6.52 92.00 97.15 a2 42 - 1.36 40.64 58.00 79.30 b2 49 一 1.50 47.50 51.00 76.57 c2 56 - 1.77 54.23 44.00 74.14 a3 59 - 1.22 57.78 41.00 72.56 b3 71 - 1.25 69.75 29.00 68.55 c3 73 - 1.09 71.91 27.00 67.80

-：定量限界以下実施例 2 ：血中滞留性評価

H A誘導体投与ラット血漿サンプル

実施例 1の 9種類の HA誘導体を 10mg/k gの用量でラット静脈内に単回投与し、投与前、および投与後 0. 25， 1， 2, 4， 6， 8， 10， 12および 2 4時間経過時に ¾0L (へパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで一 20°Cで保存された。

測定方法

GP Cにより検量線用標準試料および測定用試料の分析を行った。

検量線用試料の調製

各蛍光標識 HA誘導体を PBS (pH7. 4) を用いて希釈し、 1， 5， 10, 50, 100, 500 gZmLおよび 0 / gZmL (対照 PBS (pH7. 4 ) ) の標準液を調製する。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。

測定用試料の調製

HA誘導体投与ラット血漿サンプルに等容量の PBS (pH7. 4) を添加して測定用試料を調製した。

血漿中 HA誘導体濃度の算出 . 解析ソフト Milleniumを用いてピーク面積を算出した。各標準試料のピーク面積から得られた検量線より血漿中 H A誘導体濃度を算出した。

HA誘導体の血中濃度推移の変化を図 1〜 3に示す。

また、 H A誘導体の血中濃度推移のデータについて、 WinNonlin Ver 2.1 (ベルギーサイエンス社）および MULTI (RUNGE) (K. Yamaoka, et al., J Pharmacobiodyn 6; 595-606, 1983) で薬物動態学的パラメ一夕一を算出した。 WinNonlinでは、各個体の最終測定点 3点のデータを用いてモデル非依存的解析を行い、半減期 (t 1 /2) 、平均血中滞留時間（MRT) 、総クリアランス（C 1) を算出した。 MULT KRUNGE)では、非線形性を考慮した解析として、式 3を基にして、分子量が同じ H A誘導体毎に、最大消失速度 (Vmax) 、定常状態分布容積 (Vds s) は共通変数とし、ミカエリス定数 (Km) は、各 H A誘導体の固有の変数とした 3つの連立微分方程式を設定し、あてはめ解析により Km、 Vmax, Vds sを算出した

dC/dt = - (Vmax I (Km I c(t))) % c(t) I Vdss

F I TC標識化 HA誘導体の薬物動態学的パラメ

( inNonlinにより算出）

HZ導入率 CI MET tl72

(%:NME) (mL/hrkg) (h) (h) a0 3 29.6 ±1.8 1.36土 0.08 0.871 ±0.068 a2 42 22.3 ±10 2.16士 0.48 1.43 ±0.30 a3 59 12.4 ±0.7 3.87土 0.63 2.40 ±0.55 b0 6 16.9 ±3.3 2.02士 0.22 1.30 ±0.20 b2 49 12.5 ±2.7 2.74士 0.27 1.41 ±0.15 b3 71 4.58 ±0.42 10.1 + 1.1 7.01 ±0.78 cO 8 14.6 ±1.7 2.19士 0.16 1.42 ±0.15 c2 56 4.97 ±0.58 5.72士 0.72 3.17 ±0.73 c3 73 2.52 ±0.41 16.3 + 3.7 11.2 ±2.9 F I TC標識化 HA誘導体の薬物動態学的パラメ

(MULTI (RUNGE) により算出）

HZ導入率 Vmax Vdss Em

(%NME) (mgmnv (mLkg) (mg/mL)

aO 3 127.2 51.7 146.9 a2 42 127.2 51.7 290.3

a3 59 127.2 51.7 523.9

cO 8 44.9 38.0 48.6 c2 56 44.9 38.0 396.7

c3 73 44.9 38.0 ' 916.5

モデル非依存的な動態解析の結果を表 2に示す。総クリアランス（C 1) 値に着目すると、 a 0は a 3の 2. 4倍、 b0«b3 3. 7倍、。 0は。 3の5. 8倍となり、 H Zの導入率が高くなるほど H A誘導体の血中からの消失が遅くなる事が示された。 HZ導入率が同程度の H A誘導体で比較すると、分子量が大きい H A誘導体の方が C 1値が小さくなつており、 H Aの分子量が増大するほど血中滞留性の改善度が大きくなることが示された。表 2に示す MRT、 t 1 2についても同様の傾向が認められた。

非線形領域を考慮した H A誘導体の動態解析の結果を表 3に示す。分子量が同じ HA誘導体では Vds sおよび Vmaxは等しく、 HAのクリアランスに関与する受容体との親和性が HZ導入率により変化すると仮定して、 aO— a3， c O— c 3について MULTI (RUNGE) によるあてはめ解析を行い、 Vds s値、 Vmax、 K mを算出した（表 3) 。 a 0— a 3の Vmaxは c 0_c 3の Vmaxの 2. 8倍となつており、分子量が小さい H A誘導体の方が血中から早く消失していく事が示された。分子量が同じ H A誘導体では、 a 3の Km値が a 0の Km値の 3. 6倍、 c 3の Km値が c 0の Km値の 18. 9倍になる等、 HZの導入率が高くなるほど Kmが大きくなる事が示された。即ち、 HZの導入率が高くなると、受容体との親和性が低下して、 H A誘導体の血中からの消失が遅くなる事があてはめ解析により示唆された。以上に示したように、モデル非依存性解析および非線形性を考慮した動態解析のいずれの結果からも、 H A誘導体のカルボン酸修飾率、 H A誘導体分子量が増大するにつれて血中半減期が延長されることが示された。

上記実施例に例示された、ヒアルロン酸誘導体を用いることで、 H A誘導体を薬物担体として使用する上で重要な、 H A誘導体の体内代謝系を回避し、最大限血中滞留性を延長することが可能である。産業上の利用の可能性

本発明のヒアルロン酸誘導体は、 HA誘導体の体内代謝速度をコントロールし、血中滞留性を制御、延長することが可能であり、これをキャリアに用いた薬物コンジユゲート製剤とすることで、薬効発現に最適な血中暴露パターンの調節を可能とする生分解性で安全な体内動態制御技術を提供する。

Claims

請求の範囲

1. ヒアルロン酸誘導体中のダルク口ン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率を変化させることにより、ヒアルロン酸の消失速度を調節する方法。

2. ヒアルロン酸中のグルクロン酸部分のカルボン酸に置換基を導入することを特徴とする、ヒアルロン酸誘導体の生体内での消失速度を低下させる方法。

3. ヒアルロン酸誘導体中のダルク口ン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率を高くすることにより、ヒアルロン酸誘導体の消失速度を低下させる方法。

4. 前記ヒアルロン酸誘導体が、式（I) ：

(式中、 X。は、一 O—、一 N (-R_x) 一、一 S―、一 N (-Ri) N (— R₂) 一、 — N (— R N (― R₂) CO—または単結合であり、

は、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝 C _₁₂アルコキシ基、直鎖または分枝 C₂_₁₂アルケニル基、 C₆_₁₈ァリール基、 C₃— ₈シクロアルキル基または複素環基であり、各置換基は、保護基を導入されたまたは遊離のヒドロキシル基、アミノ基、ヒドラジド基、メルカプト基、マレイミド基、力ルポキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基を 1つ以上有していてもよく、また上記官能基を有する置換基の重付加体あるいは重縮合体も含み、

および R₂は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C — ₁₂アルキル基、直鎖または分枝ヒドロキシアルキル基、アルキレンォキシド基またはポリアルキレンォキシド基である。 )

で表される繰り返し構造を、分子内に 1またはそれ以上有する、請求項 1または 3 に記載の方法。

5. ヒア^!レロン酸誘導体が薬理作用を有する物質とのコンジュゲ一トを形成していることを特徴とする、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

6. 消失速度が血中消失速度である、請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の方法

7. 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の方法により消失速度が調節されたまたは低下したヒアル口ン酸誘導体に、薬理作用を有する物質が結合しているコンジュゲート。

8. 薬理作用を有する物質がタンパク質又はペプチドである、請求項 7に記載のコンジュゲート。

9. 式（I I) ：

(式中、 X。は、 — O—、 — N (― R 一、一 S—、一 N (-R_x) N (― R₂) 一、 -N (― R N (― R₂) CO—または単結合であり、

X₂は、直鎖または分枝 C i ₂アルキル基、直鎖または分枝 ^— アルコキシ基、直鎖または分枝 C₂— ₁₂アルケニル基、 C₆— ₁₈ァリール基、 C₃— ₈シクロアルキル基または複素環基であり、各置換基は、保護基を導入されたまたは遊離のヒドロキシル基、アミノ基、ヒドラジド基、メルカプト基、マレイミド基、力ルポキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基を 1つ以上有していてもよく、また上記官能基を有する置換基の重付加体あるいは重縮合体も含み、

および R₂は、それぞれ独立して、水素原子、，直鎖または分枝 Ci- アルキル基、直鎖または分枝じト^ヒドロキシアルキル基、アルキレンォキシド基またはポリアルキレンォキシド基である。）

で表される繰り返し構造を分子内に 1またはそれ以上有するヒアルロン酸誘導体の、ヒアルロン酸誘導体に薬理作用を有する物質が結合しているコンジユゲート作製における使用。

10. 以下の工程を含む、ヒアルロン酸誘導体と薬理作用を有する物質のコンジュゲートの作製方法：

(a) ダルク口ン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率が異なる 2つ以上のヒアル口ン酸誘導体に、それぞれ薬理作用を有する物質を結合させる工程、

(d) (c) で算出された導入率を有するヒアルロン酸誘導体を作製する工程。

11. 以下の工程を含む、ヒアルロン酸誘導体と薬理作用を有する物質のコンジユゲー卜の作製方法：

( a ) ダルク口ン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率が異なる 2つ以上のヒアルロン酸誘導体の消失速度を測定する工程、

(c) (b) で算出された導入率を有するヒアルロン酸誘導体に薬理作用を有する物質を結合させる工程。

12. 消失速度が血中消失速度である請求項 10または 11に記載の方法。

13. 以下の工程を含むヒアルロン酸誘導体の消失速度を予測する方法：

(a) ダルク口ン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率が異なる 2つ以上のヒアル口ン酸誘導体、またはダルク口ン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率が異なる 2つ以上のヒアルロン酸誘導体に薬理作用を有する物質を結合させたコンジュゲートの消失速度を測定する工程、

(b) ( a) で測定した結果を基に、置換基の導入率と消失速度の相関関係を得る工程、

( c ) (b) で得た相関関係を基に、置換基の導入率から消失速度を予測するェ程。

1 4. 消失速度が血中消失速度である、請求項 1 3に記載の方法。

1 5. ヒアルロン酸誘導体の分子量の調整と、ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボン酸への置換基の導入率の調整とを組み合わせることにより、ヒアルロン酸誘導体の消失速度を調節する方法。