HU226468B1

HU226468B1 - Amino-terminally truncated mcp-2-as chemokine antagonists

Info

Publication number: HU226468B1
Application number: HU0003563A
Authority: HU
Inventors: Paul Proost; Sofie Struyf; Damme Jo Van
Original assignee: Serono Lab
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2008-12-29
Also published as: CA2305017A1; CN1233415C; HK1062637A1; US7338653B2; US6977071B2; EP1439231A2; NO20001609D0; NO20001584L; BR9812565A; BG64679B1; UA73080C2; CZ20001146A3; JP2001518296A; EP1439231B1; EP1019507A1; DE69823218D1; JP4230659B2; ES2215324T3; DE69822856D1; EP0906954A1

Description

A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 4 lap ábra)

HU 226 468 Β1

A találmány tárgyát képezi olyan, aminoterminálisa felől csonkolt, humán monocita kemotaktikus fehérje 2 (MCP-2), amely kemokinantagonista aktivitású és amelyből hiányoznak a természetesen előforduló humán MCP-2 1-5. aminosavainak megfelelő aminoterminális aminosavak. A találmány tárgyát képezik továbbá a csonkolt MCP-2-ket kódoló cDNS-szekvenciák, terápiás és diagnosztikus alkalmazásuk olyan betegségekben, amelyekben a kemokinhatások antagonista aktivitása szükséges, valamint az őket tartalmazó gyógyászati készítmények.

A kemokinek a fehérvérsejtekre kemotaktikus és aktiváló tulajdonságú, kis proinflammatorikus citokinek családjához tartoznak. Az első ciszteinek helyzetétől függően a kemokincsalád C-C, C-X-C és C-X₃-C típusú kemokinekre osztható [Baggiolini, M. és munkatársai, Ann. Rév. Immunoi. 55, 97-179 (1994); Baggiolini, M. és munkatársai, Ann. Rév. Immunoi. 15, 675-705 (1997); Taub, D. és munkatársai, Cytokine & Growth Factor Reviews 7, 335-76 (1996)].

Sok C-X-C típusú kemokin, például az interleukin-8 (IL-8) a neutrofilekre kemotaktikus hatású, míg a C-C-kemokinek, például a monocita kemotaktikus fehérje 3 (MCP-3 „monocyte chemotactic protein-3”) a fehérvérsejtek számos osztályára, például a monocitákra, a limfocitákra, az eozinofilekre, a bazofilekre, az NK-sejtekre és a dendrites sejtekre fejt ki hatást.

A kemokinek aminoterminális doménje a receptorkötésben vesz részt, és az aminoterminális végek processzálása aktiválhatja vagy teljesen inaktívvá teheti a kemokineket.

A C-X-C típusú kemokin trombocita bázikus fehérje csak a 24 aminoterminális aminosav eltávolítása után válik neutrofil kemotaktikus pepiiddé (NAP-2) [Walz, A. és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 159, 969-75 (1989); Van Damme, J. és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 20, 2113-8 (1990)].

Az IL-8-ból akár 8 aminoterminális aminosav eltávolítása nagyobb kemotaktikus aktivitást eredményez, de a minden neutrofil kemotaktikus C-X-C-kemokinben az első cisztein előtt elhelyezkedő Glu-Leu-Argminta további hasítása teljes inaktivációt eredményez [Clark-Lewis, I. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 266, 23 128-23 134(1991)].

Egy másik C-X-C-kemokinnél, a granulocita kemotaktikus fehérje 2-nél (GCP-2, „granulocyte chemotactic protein-2”) hasonló aminoterminális proteolízisnek (egészen 8 aminosavig) nincs hatása a neutrofil kemotaktikus aktivitásra [Proost, P. és munkatársai, Biochemistry 32, 10 170-10 177 (1993)].

Az aminoterminális 8-9. aminosavban hiányos szintetikus C-C-kemokinek, az MCP-1, az MCP-3 és a RANTES, inaktívak monocitákon és receptorantagonistákként alkalmazhatók [Gong, J. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 271, 10 521-10 527 (1996); Gong, J. és munkatársai, J. Exp. Med. 181, 631-640 (1995)].

A RANTES egy metioninnal történő megnövelése a molekulát teljesen inaktiválja, és a Met-RANTES az eredeti RANTES antagonistájaként viselkedik [Proudfoot, A. E. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 271, 2599-2603 (1996)].

A humáneredetű MCP-2 kiónját („Monocyte Chemoattractant Protein-2) differenciális könyvtár szűrésével izolálták stimulált perifériás vérlimfocitákból (PBL, „peripherial blood lymphocyte) [eredetileg „HC14-nek nevezték, Chang, H. C. és munkatársai, International Immunology 1(4), 388-397 (1989)] származó cDNSpróbákkal a nem stimulált, nyugvó perifériás vérlimfociták cDNS-próbáival szemben. A cDNS-eredetű fehérjeszekvencia azonos volt a tisztított, természetes MCP-2-ével, bár egy feltehetőleg allélikus változatot is izoláltak, amelyben Gln46 helyettesíti Lys46-ot [Van Coillie, E. és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 231, 726-730 (1997)].

Az MCP-2 szilárd fázisú kémiai eljárással is megszintetizálható [Proost, P. és munkatársai, Cytokine 7, 97-104(1995)].

A következőkben ismertetjük a találmányt. A találmány szerinti megoldás kidolgozásával elsődleges célunk volt a természetesen előforduló MCP-2 1., 1-2., 1-3., 1-4. vagy 1-5. aminosavának megfelelő aminoterminális aminosavakban hiányos, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2 előállítása, amelynek kemokinantagonista aktivitása van.

Előnyösebben a találmány szerinti megoldás egyik célja az MCP-2(6-76), amely olyan MCP-2, amelyben az 1-5. aminoterminális aminosavak hiányoznak, mint ezt az 1. ábrán és a 3. vagy 4. azonosító számú szekvenciákban bemutatjuk.

A találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2 lehet glikozilált vagy glikozilálatlan formájú. A „kemokinantagonista” kifejezés azt jelenti, hogy antagonistaként hat az érett, teljes hosszúságú, természetesen előforduló kemokinekre.

A találmány szerinti megoldás kidolgozásával egy másik célunk volt olyan DNS-molekulák előállítása, amelyek a találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2-t kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazzák, beleértve a lényegében azonos nukleotidszekvenciákat.

A „lényegében azonos nukleotidszekvenciák” kifejezés minden más nukleinsavszekvenciát jelent, amely a genetikai kód degenerációja folytán az adott aminosavszekvenciákat kódolja.

A találmány tárgyát képezik a fenti DNS-eket tartalmazó expressziós vektorok, az ilyen vektorokkal transzformált gazdasejtek és a találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2 előállítására szolgáló eljárás a transzformált sejtek megfelelő tápközegben történő tenyésztése útján.

A találmány szerinti fehérjéket kódoló DNS-szekvencia egy alkalmas plazmidba beépíthető és ligálható. A létrehozott expressziós vektort egy megfelelő gazdasejtbe juttatjuk, amely azután expresszálja a vektor(oka)t a kívánt fehérjét eredményezve.

A találmány szerinti bármilyen rekombináns fehérje expressziója, amint ezt a leírásban ismertetjük, kivitelezhető eukarióta sejtekben (például élesztőkben, rovar- vagy emlőssejtekben) vagy prokarióta sejtekben

HU 226 468 Β1 megfelelő expressziós vektorok alkalmazásával. Bármilyen, a technika állása szerint ismert eljárás alkalmazható.

A fent leírt eljárások bármelyikével nyert fehérjéket kódoló DNS-molekulák például megfelelően elkészített expressziós vektorokba építhetők a technika állása szerint ismert technológiákkal [lásd, Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A laboratory Manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989)]. Kettős szálú cDNS-t a plazmidvektorokhoz homopolimer végkészítéssel vagy szintetikus DNS-kapcsolók alkalmazásával restrikciós kapcsolással vagy tompa végű ligálási technológiákkal kapcsolhatunk: DNS-ligázokat alkalmazunk a DNS-molekulák ligálására és a nemkívánatos kapcsolódásokat alkalikus-foszfatáz-enzimes kezeléssel kerüljük el.

A kívánt fehérje expresszálása érdekében egy expressziós vektornak transzkripciós és transzlációs szabályozó információt hordozó specifikus nukleotidszekvenciákat is tartalmazniuk kell a kívánt fehérjét kódoló DNS-hez oly módon kapcsolva, hogy lehetővé tegye a génexpressziót és a fehérje termelődését. Először is a gén átírása érdekében egy, az RNS-polimeráz által felismerhető promoter kell hogy megelőzze, amelyhez a polimeráz kötődik és így elindítja a transzkripciós folyamatot. Számos ilyen promoter alkalmazható, amelyek különböző hatékonysággal működnek (erős vagy gyenge promoterek).

Eukarióta gazdákban a gazda természetétől függően különböző transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciák alkalmazhatók. Ezek származhatnak víruseredetű forrásból, például adenovírusból, szarvasmarha papillomavírusból, Simian vírusból vagy hasonlókból, ahol a szabályozószignálok egy bizonyos, magas expressziós szintű génnel állnak kapcsolatban. Ilyenek például a Herpes vírus TK-promotere, az SV40 korai promoter, az élesztő gal4-génpromotere stb. A transzkripciós iniciációs szabályozószignálok úgy választhatók, hogy repressziót és aktivációt lehetővé tegyenek, így a génexpresszió befolyásolható legyen.

A találmány szerinti fehérjét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-molekulát, amelyhez működőképesen transzkripciós és transzlációs szabályozószignálok kapcsolódnak, beépítjük egy vektorba/vektorokba, amely(ek) a kívánt génszekvenciákat be tudják építeni a gazdasejtbe.

A bejuttatott DNS-sel stabilan transzformált sejtek egy vagy több, az expressziós vektort tartalmazó gazdasejtek kiválogatását lehetővé tevő marker bevitelével szelektálhatok. A marker egy auxotróf gazdának prototrófiát biztosíthat, biocidrezisztenciát eredményezhet, például antibiotikumokra, nehézfémekre, mint például rézre vagy hasonlók. A szelekciós markergén közvetlenül az expresszálandó génszekvenciák DNSéhez kapcsolható vagy kotranszfekcióval juttatható be ugyanabba a sejtbe. További elemek is szükségesek lehetnek a találmány szerinti fehérjék optimális szintéziséhez.

Egy bizonyos plazmid vagy vírusvektor kiválasztásában fontos tényezők például: az egyszerűség, amellyel a vektort tartalmazó recipiens sejtek felismerhetők és kiválogathatok a vektort nem tartalmazó recipiens sejtek közül, a vektor egy bizonyos gazdában kívánatos kópiaszáma, és hogy vajon kívánatos-e, hogy a vektor „közlekedtethető („shuttle”) legyen különböző fajták gazdasejtjei között.

Amikor az expresszióhoz a vektor(ok) vagy a konstrukcióba^ tartalmazó DNS-szekvencia elkészült, a DNS-konstrukció(k) megfelelő gazdasejtbe vihetők a számos alkalmas eszköz bármelyikével, például transzformációval, transzfekcióval, konjugációval, protoplasztfúzióval, elektroporációval, kalcium-foszfátos kicsapással, közvetlen mikroinjekcióval stb.

A gazdasejtek lehetnek prokarióta vagy eukarióta sejtek. Előnyösek az eukarióta gazdák, például emlőssejtek, mint például humán, majom, egér és kínai hörcsög petefészeksejtje (CHO, „Chinese hamster ovary cell”), mivel a fehérjemolekulák poszttranszlációs módosítására lehetőséget nyújtanak, például a helyes térszerkezet kialakítására vagy a megfelelő helyeken történő glikozilálásra. Az élesztősejtek is végeznek poszttranszlációs módosításokat, például glikozilálást. Rekombináns DNS-stratégiák egész sora használ erős promoterszekvenciákat és nagy kópiaszámú plazmidokat, amelyek a kívánt fehérje előállítására alkalmazhatók élesztőben. Az élesztősejtek felismerik a klónozott emlős géntermékeken lévő vezetőszekvenciákat és kiválasztanak vezetőszekvenciákat hordozó peptideket (azaz prepeptideket).

A vektor(ok) bejuttatása után a gazdasejteket szelekciós tápközegen tenyésztjük, amely a vektort tartalmazó sejtek növekedésére szelektál. A klónozott génszekvencia/génszekvenciák expressziója a kívánt fehérjék termelődését eredményezi.

A találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2 a technika állása szerinti, bármilyen jól ismert módszerrel előállítható, előnyösen jól kidolgozott kémiai szintézises módszerekkel, automatizált szilárd fázisú peptidszintetizátorok alkalmazásával, amelyet kromatográfiás tisztítás követ.

A találmány szerinti kemokinek megszintetizálhatók például Fmoc (9-fluor-enil-metoxi-karbonil), tBoc (t-butoxi-karbonil) vagy bármilyen, más, hasonló kémiai szintézissel a különböző aminosavakon megfelelő oldallánc-védőcsoportokkal vagy anélkül. A megfelelő oldallánc-védőcsoportokkal ellátott vagy anélküli aminosavakat előzetesen aktiváljuk - például HBTU-HOBt-tal [2-( 1 H-benzo-triazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uromiumhexafluoro-foszfát/1-hidroxi-benzo-triazol] - és a növekvő peptidlánchoz kapcsoljuk. A következő aminosav hozzáadása előtt a védőcsoportot (például Fmoc) eltávolítjuk az α-amino-csoportról. A szintézis után minden védőcsoportot eltávolítunk, az ép, teljes hosszúságú peptidet tisztítjuk és kémiailag vagy enzimesen hajtogatjuk (például a ciszteinek közötti diszulfidhidak kialakítása) a találmány szerinti kemokineknek megfelelően.

A természetes, szintetikus vagy rekombináns fehérjék tisztítását bármilyen, erre a célra alkalmas, ismert eljárás szerint végrehajthatjuk, azaz extrakció, kicsa3

HU 226 468 Β1 pás, kromatográfia, elektroforézis vagy hasonlók hagyományos módszerei szerint [lásd például Proost, P. és munkatársai, Methods: A companion to Methods in Enzymol. 10, 82 (1996)]. További tisztítási eljárás, amely előnyösen alkalmazható a találmány szerinti fehérje tisztítására az affinitáskromatográfia monoklonális antitesttel vagy heparinnal szembeni affinitás alapján, amelyek kötik a célfehérjét, és amelyeket egy oszlopban lévő gélmátrixon immobilizálva végezhetjük el az eljárást. A fehérjéket tartalmazó nem tiszta készítményeket az oszlopon keresztülengedjük. A fehérje az oszlophoz kötődik a heparinon vagy a specifikus ellenanyagon keresztül, míg a szennyező anyagok áthaladnak az oszlopon. Mosás után a fehérjét a gélről a pH vagy az ionerősség változtatásával oldjuk le.

A találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2 olyan betegségek terápiájában és/vagy diagnózisában alkalmazható, amelyekben a kemokinhatások antagonista aktivitása szükséges. Ilyen betegségek például: gyulladásos betegségek, ér- vagy vérképződéssel kapcsolatos betegségek, tumorok, fertőző betegségek, például HÍV, autoimmun betegségek, atherosclerosis, légzőszervi betegségek és bőrrendellenességek.

A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti fehérje alkalmazása egy gyógyszer gyártására a fent említett betegségek kezelésére.

A gyógyszert előnyösen egy gyógyászati készítmény formájában állítjuk elő, amely a találmány szerinti fehérjékből áll egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy kötőanyaggal. Az ilyen gyógyászati készítmények a találmány még egy további szempontját képezik.

A találmány egy további megvalósítási módja szerint eljárás a fent említett betegségek kezelésére, amely során a találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2 gyógyászatilag aktív mennyiségét adagoljuk a páciensnek ilyen betegségek kifejlődésének veszélye esetén vagy már tüneteket mutató páciensnek.

A találmányt a következő, a találmányt semmilyen formában nem korlátozó példák segítségével írjuk le. A példákban az alábbiakban ismertetett ábrákra utalunk.

A következőkben az ábrák leírását ismertetjük.

Az 1, ábrán az MCP-2 és ismert variánsának amminosavszekvenciáját írjuk le. A szignálszekvenciákat italic betűtípussal jelöltük, míg a C-aminosavakat félkövér betűtípussal írtuk. Nyilak jelölik a találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2(6-76) első aminosavait. Aláhúzással jelöltük azt az aminosavat, amely különbözik az MCP-2-variánsban.

A 2. ábrán az aminoterminálisa felől csonkolt MCP2(6-76) SDS-PAGE-képe látható:

1. sáv: természetes MCP-2(1-76), 100 ng/sáv,

2. sáv: természetes MCP-2(1-76), 30 ng/sáv,

3. sáv: természetes MCP-2(6-76), 30 ng/sáv,

4. sáv: szintetikus MCP-2(1-76), 60 ng/sáv

A géleket redukálókörülmények között futtattuk és a fehérjéket ezüsttel festettük.

A 3. ábrán a módosított MCP-2-formák kemotaktikus képességének összehasonlítását ábrázoljuk. Az ép, természetes (nat) és szintetikus (syn) MCP-2(1-76), az aminoterminálisa felől csonkolt, természetes MCP-2(6-76) és a karboxiterminálisan csonka szintetikus MCP-2(1-74) kemotaktikus aktivitását vizsgáltuk THP-1-sejteken. Az eredmények négy vagy több független kísérlet átlagos Cl ±SEM értékeit szemléltetik.

A 4. ábrán azt mutatjuk be, hogy a természetes MCP-2 gyengébb agonista az MCP-1nél a kalcium monocitákban történő mozgósítása tekintetében. Az ép MCP-2 (15, 50 és 150 ng/ml) dózisfüggően növeli a [Ca²⁺]i mennyiségét THP-1-sejtekben. A két kísérlet közül az egyik reprezentatív eredményeit tüntetjük fel.

A következőkben a példákat ismertetjük.

1. példa: aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2

Anyagok és módszerek

Kemokln- és immunoassay

Az MCP-2-t a fentiekben ismertetettek szerint szintetizáltuk és tisztítottuk [Proost, P. és munkatársai, Cytokine 7, 97-104 (1995)].

A specifikus, humáneredetű MCP-2 elleni ellenanyagot egérből állítottuk elő és affinitással tisztítottuk Sepharose-oszlopon, amelyhez szintetikus MCP-2-t kötöttünk a gyártó által javasolt körülmények között (CNBr aktivált Sepharose-4B, Pharmacia, Uppsala, Sweden).

Az ELISA-lemezeket affinitással tisztított, humáneredetű MCP-2-elleni ellenanyaggal fedtük, és biotinált antiMCP-2-t alkalmaztunk az ellenanyag megkötésére. A kimutatást peroxidázzal jelölt streptavidinnel és TMB-vel végeztük. A kimutatási szint az MCP-2-ELISA-eljárásban körülbelül 0,1 ng/ml.

Az MCP-2 termelése és tisztítása

A monocita kemotaktikus fehérjéket az antwerpi és leuveni Vértranszfúziós Központból beszerzett 132 vérkészítményéből származó, perifériás vér mononukleáris sejt eredetű kondicionált közegből tisztítottuk [Proost, P. és munkatársai, Methods: A companion to Methods in Enzymol. 10, 82 (1996)].

A vörösvértesteket és a granulocitákat hidroxi-etilkeményítőben történő ülepítéssel (Fresenius AG, Bad Homburg, Germany) és nátrium-metrizoát-oldatban történő gradienscentrifugálással távolítottuk el (Lymphoprep; Nyegaard, Oslo Norway).

A mononukleáris sejteket (60x10⁹ sejt) (5x10⁶sejt/ml) 10 pg/ml ConA-val és 2 pg/ml LPS-sel inkubáltuk. A kondicionált közeget 48-120 óra elteltével összegyűjtöttük és tisztításig -20 °C-on tartottuk.

HU 226 468 Β1

A természetes MCP-2-t a fentiekben leírt négylépcsős tisztítási eljárással tisztítottuk [Proost, P. és munkatársai, Methods: A companion to Methods in Enzymol. 10, 82 (1996)].

Röviden összefoglalva, a kondicionált tápközeget szabályozott pórusméretű üvegszűrőn vagy kovasavon töményítettük és affinitáskromatográfiával heparinSepharase-oszlopon (Pharmacia) részlegesen tisztítottuk.

Az MCP-2 immunológiai aktivitásával bíró frakciókat Mono S (Pharmacia) kationcserélő kromatográfiával tovább tisztítottuk, és nátrium-klorid-gradienssel eluáltuk pH=4,0-nél.

A természetes MCP-2-t homogenitásig tisztítottuk RP-HPLC-vel 0,1% trifluor-ecetsavval (TFA, „trifluoroacetic acid”) ekvilibrált C-8 Aquapore RP-300 oszlopon (Perkin-Elmer, Norwalk CT). A fehérjéket acetonitrilgradienssel eluáltuk.

Az MCP-formák biokémiai jellemzése SDS-PAGEval, aminosavszekvencia-vizsgálattal és tömegspektrográfiával

Az oszlopfrakciók tisztaságát SDS-PAGE-val ellenőriztük redukáló körülmények között Tris/tricin gélen [Proost, P. és munkatársai, Methods: A companion to Methods in Enzymol. 10, 82 (1996)]. A fehérjéket ezüsttel festettük és a következő relatív molekulamarkereket (Mr) alkalmaztuk: ÓVA (Mr 45000), carbonicanhidráz (Mr 31000), szójabab-eredetű tripszininhibitor (Mr 21500), β-laktoglobulin (Mr 18400), lizozim (Mr 14400) és aprotinin (Mr 6500).

A tisztított kemokinek aminoterminális szekvenciáját Edman-bontással határoztuk meg pulzálófolyadék 477A/120A fehérjeszekvenátorban (Perkin-Elmer) kapcsolóbázisként N-metil-piperidinnel. A védett fehérjéket aszparaginsav és prolin között hasítottuk 75%-os hangyasavban 50 órán keresztül. A hangyasavas emésztményt további tisztítás nélkül szekvenáltuk.

Az MCP-2 Mr értékét „matrix-assissted laser desorption ionization/time of flight-mass spectrometry”, MALDI/TOF-MS-spektrometria (Micromass TofSpec, Manchester, UK) alkalmazásával határoztuk meg. Alfaciano-hidroxi-cinnamiksavat, illetve citokróm C-t alkalmaztunk mátrix, illetve belső standardként.

A kemotaktikus aktivitás kimutatása

Az MCP-2 kemotaktikus képességét frissen tisztított monocitákon (2*10® sejt/ml) vagy monocitikus THP-1-sejteken (0,5*10® sejt/ml, 2 nappal a szubkultúra készítése után) mértük Boyden-mikrokamrában 5 μιτι pórusméretű, poli(vinil-pirrolidon)-nal kezelt polikarbonátmembránok alkalmazásával.

A mintákat és a sejteket 1 mg/ml humán szérumalbuminnal (Red Cross Belgium) kiegészített HBSS-ben (Life technologies/Gibco BRL, Paisley, Scotland) hígítottuk. Két órás 37 °C-on történő inkubációt követően a sejteket rögzítettük és Diff-Quick festékoldattal festettük (Harleco, Gibbstown, NJ) és a membránokon keresztülvándorolt sejteket mikroszkóposán tíz olajimmerziós mezőben 500-szoros nagyításnál megszámoltuk.

A minták kemotaktikus indexét (Cl, „chemotactic index) - mindegyik kamrában háromszoros ismétlésben

- a minta felé vándorolt sejtek számának a kontroll tápközeg felé vándorolt sejtek számán fölüli részként számoltuk [Van Damme, J. és munkatársai, J. Exp. Med. 176, 59(1992)].

A deszenzitizációs kísérletekben a sejteket biológiailag inaktív kemokinváltozattal inkubáltuk 10 percen keresztül 37 ’C-on mielőtt a Boyden-mikrokamra felső üregébe adtuk. A Cl százalékos gátlását a HBSS-sel kezelt sejteknek a minta felé irányuló kemotaktikus indexét referenciaértékként véve számoltuk.

Az intracelluláris Ca²⁺-koncentráció kimutatása

Az intracelluláris kalciumkoncentrációkat ([Ca^2t],) az előzőekben ismertetettek szerint mértük [Wuyts, A. és munkatársai, Biochemistry 36, 2716-2723 (1997)]. A tisztított monocitákat vagy a THP-1-sejteket (10⁷sejt/ml) Eagle’s Minimum Essential Médium (EMEM, Gibco) + 0,5% FCS fura-2 fluoreszcens indikátorral (fura/2AM 2,5 μιτιοΙ, Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherlands) és 0,01% Pluronic F-127 (Sigma, St Louis MO) tartalmú tápközegben inkubáltuk.

Harminc percig 37 °C-on történő inkubálás után a sejteket kétszer mostuk és 10® sejt/ml koncentrációban 1 mmol Ca²⁺-ot és 0,1% FCS-t tartalmazó (10 mmol HEPES/NaOH-val pH=7,4-re pufferolt) HBSS-ben szuszpendáltuk. A sejteket 37 °C-on 10 percen keresztül ekvilibráltuk mielőtt a fura-2 fluorescenciát LS50B luminospektrofotométeren (Perkin-Elmer) mértük.

340 és 380 nm-en történő gerjesztésnél 510 nm-en mértük a fluoreszcenciát. A [Ca²⁺]_rt a Grynkiewiczegyenletből számoltuk [Grynkiewicz és munkatársai, J. Bioi. Chem. 260, 3440 (1985)]. Az R_mgx meghatározása érdekében a sejteket 50 pmol digitoninnal emésztettük. Ezt követően a pH-t 8,5-re állítottuk 20 mmol Trisszel és az R^m-ot 10 mmol EGTA-nak az emésztett sejtekhez történő hozzáadásával kaptuk. Az alkalmazott K(/224 nmol.

A deszenzitizációs kísérletekben a monocitákat vagy a THP-1-sejteket először pufferrel, kemokinnel vagy kemokinantagonista különböző koncentrációival stimuláltuk. Egy második stimulusként MCP-2-t alkalmaztunk olyan koncentrációban, amely a pufferrel történő előzetes stimuláció után szignifikáns növekedést vált ki a [Ca²⁺]j-ben. A második stimulust 2 perccel az első stimulus hozzáadása után alkalmaztuk. A második stimulusra történő [Ca²⁺]j növekedésének százalékos gátlását a kemokinnel vagy kemokinantagonistával történő előstimuláció utáni jelnek a puffer hozzáadása utáni jellel történő összehasonlításával számoltuk.

Eredmények

A poszttranszlációsan módosított MCP-2-formák izolálása

Egy specifikus és érzékeny ELISA-módszert alkalmaztunk mitogénnel és endotoxinnal stimulált perifériás vér mononukleáris sejtek által termelt különböző MCP-2-formák kimutatására.

A ?(10.o/22.s) kondicionáló tápközeget a hagyományos izolálást eljárás szerint tisztítottuk [Proost, P. és munkatársai, Methods: A companion to Methods in Enzymol. 10, 82 (1996)], többek között szabályozott pó5

HU 226 468 Β1 rusméretű üvegszűrőhöz történő kötődéssel és heparin Sepharose-kromatográfiával.

Ezt követően FPLC Mono S kationcserélő kromatográfiás tisztítást hajtottunk végre, majd egy következő tisztítási lépésként C-8 RP HPLC-t alkalmaztunk. A molekulatömegeket SDS-PAGE-val és MALDI/TOFMS-sel határoztuk meg.

Különböző formájú MCP-2-t izoláltunk: az eredeti 7,5 kDa MCP-2(1-76)-on kívül egy, aminoterminálisa felől csonkolt 7 kDa MCP-2-formát, amelyből öt aminosav hiányzik [MCP-2(6-76)j, RP-HPLC-vel homogenitásig tisztítottunk és aminosavszekvencia-analízissel azonosítottunk (2. ábra). A MALDI/TOF-MS (I. táblázat) 8881 Da molekulatömeget eredményezett az ép MCP-2-re (az elméleti Mr 8893 Da), míg az MCP-2(6-76)-nak 8365 Da molekulatömeget mértünk, amely megerősíti az öt aminoterminális aminosav hiányát (az elméleti Mr 8384 Da). Ezeknek a természetes MCP-2-formáknak a funkcionális összehasonlítása THP-1 kemotaxis vizsgálati eljárásban kimutatta, hogy az ép MCP-2 még 5 ng/ml koncentrációban aktív, míg a csonka MCP-2(6-76) 0,6-60 ng/ml koncentrációtartományban nem mutatott kemotaktikus aktivitást (3. ábra). Az ép, természetes MCP-2-t összehasonlítottuk a szintetikus MCP-2(1-76)-tal és egy karboxiterminálisan csonka szintetikus formával [Proost, P. és munkatársai, Cytokine 7, 97-104 (1995)], amelyben két aminosav hiányzik [MCP-2(1-74)].

Ezeknek a formáknak a minimálisan hatékony kemotaktikus koncentrációja 5 ng/ml-nek bizonyult (3. ábra). A kemotaktikus vizsgálati eljárásban a természetes, ép MCP-1 és MCP-2 specifikus aktivitása összehasonlítható volt [Van Damme, J. és munkatársai, J. Exp. Med. 176, 59 (1992)], az MCP-2 kalciummozgósító képessége azonban még kérdéses.

A kalciummozgósító kísérletekben mind a természetes, mind a szintetikus MCP-2(1-76) minimálisan hatékony dózisa tízszer magasabb volt a természetes, ép MCP-1 (1-76)-énál (4. ábra), míg az MCP-2(6-76) inaktív maradt.

Az ép MCP-2 (50 ng/ml) azonban képes volt deszenzitizálni MCP-2-re (15 ng/ml) és MCP-3-ra (10 ng/ml), amely a kemotaxis 52%-os, illetve 45%-os gátlását jelenti.

A kalcium vizsgálati eljárásokban az MCP-2 ilyen alacsony specifikus aktivitása miatt az MCP-2(6-76) kemotaxisának deszenzitizációját Boyden-mikrokamrában végeztük. Mivel leírták, hogy ép MCP-2 keresztdeszenzitizál az aktív MCP-1-gyei, MCP-2-vel és MCP-3-mal a monocita kemotaxis vizsgálati eljárásban [Sozzani, S. és munkatársai, J. Immunoi. 152, 3615 (1994)], megvizsgáltuk, hogy vajon a természetes, inaktív MCP-2(6-76) szintén deszenzitizálni tud-e MCP-1-re, MCP-2-re, MCP-3-ra és RANTES-re (II. táblázat). A ΤΗΡ-1-sejtek előinkubációja 100 ng/ml inaktív MCP-2(6-76)-tal már szignifikánsan gátolta a 10 ng/ml MCP-1-gyei (63%), 5 ng/ml MCP-2-vel (75%), 30 ng/ml MCP-3-mal (62%) és 100 ng/ml RANTES-sel (75%) kiváltott kemotaxist. Továbbá a megfelelő MCP-k háromszor alacsonyabb koncentrációja által kiváltott kemotaxist teljesen (91-100%) gátolta 100 ng/ml MCP-2(6-76). Ezenkívül az MCP-2(6-76) még 10 ng/ml koncentrációban is szignifikánsan gátolni tudta az MCP-1 (3 ng/ml), az MCP-2 (1,5 ng/ml) vagy MCP-3 (10 ng/ml) és RANTES (30 ng/ml) által kiváltott kemotaktikus aktivitást, összefoglalva, az MCP-2(6-76) természetes úton jött létre, kemoattraktánsként inaktív, és számos C-C-kemokint antagonizál, legjelentősebb mértékben az MCP-3-at.

/. táblázat

Az MCP-2 természetes formáinak biokémiai jellemzése. A C-8 RP-HPLC-vel tisztított természetes MCP-izoformák aminoterminális aminosavszekvencia-analízise és kísérletes (SDS-PAGE és MALDI/TOF-MS) és elméleti Mr értékeinek összehasonlítása

MCP-forma	Aminoterminális szekvencia	Mr(Da)
elméletileg glikozilálatlan	SDS-PAGE	MALDI/TOF-MS
MCP-2(1-76)	védett	8893	7500	8881
MCP-2(2-76)	SIPITCC	8384	7000	8365

II. táblázat

MCP-2(6-76) deszenzitizálja MCP-1, MCP-2, MCP-3 és RANTES monocita kemotaktikus reakcióját mikrokamrában

Kemokin³	Koncentráció	A kemotaktikus reakció antagonizálása^b>^c	A kemotaxis százalékos gátlása
puffer	100 ng/ml MCP-2(6-76)
MCP-1	10	22,3±7,9	8,3±3,8	63±21
	3	15,0±8,0	1,3±0,3	99±1,0

HU 226 468 Β1 //. táblázat (folytatás)

Kemokin³	Koncentráció	A kemotaktikus reakció antagonizálása^b·^c	A kemotaxls százalékos gátlása
puffer	100 ng/ml MCP-2(6-76)
MCP-2	5	36,0112,6	10,816,1	7518,0
	1,5	6,711,4	1,510,3	9117,0
MCP-3	30	13,210,4	6,014,0	62131
	10	3,OH ,5	<1	10010,0
RANTES	100	6,310,8	2,611,3	75119
	30	4,0l0,8	1,510,3	77116
		puffer	10 ng/ml MCP-2(6-7 6)
MCP-1	10	12,712,3	10,513,8	2411,8
	3	7,510,0	3,010,3	6914,0
MCP-2	5	38,015,3	27,214,9	3016,0
	1,5	18,314,6	9,211,4	45123
MCP-3	30	13,211,9	8,011,0	37119
	10	7,711,4	1,710,3	9016,0
RANTES	100	5,510,6	5,8l0,9	1717,0
	30	3,210,7	2,510,5	39118

³ Az MCP-1-et, az MCP-2-t, az MCP-3-at vagy a RANTES-t adtuk kemoattraktánsként az alsó üregekbe. ^b A mikrokamra felső üregeit MCP-2(6-76)-tal vagy pufferrel előinkubált THP-1-sejtekkel töltöttük meg. ^c Három független kísérlet átlagos Cl ±SEM értékei.

Hivatkozások

Baggiolini M. et al., Ann. Rév. Immunoi., 55, 97-179, 1994. 35

Baggiolini M. et al., Ann. Rév. Immunoi., 15, 675-705, 1997.

Chang H. C. et al., International Immunology, 1(4), 388-397, 1989.

Clark-Lewis I. et al., J. Bioi. Chem., 266, 40 23 128-23 134, 1991.

De Meester I. et al., J. Immunoi. Methods 189, 99-10 526, 1996.

Deng H. etal., Natúré., 381, 661-666, 1996.

Gong J. et al. J. Exp. Med., 181, 631-640, 1995. 45

Gong J. et al., J. Bioi. Chem. 271, 10 521-10 527, 1996.

Grynkiewicz G. et al., J. Bioi. Chem., 260, 3440, 1985.

Proost P. et al., Biochemistry, 32, 10 170-10 177, 50 1993a.

Proost P. et al., J. Immunoi., 150, 1000-1010, 1993.

Proost P. et al., Cytokine, 7, 97-104, 1995.

Proost P. et al., Methods: A companion to Methods in Enzymol., 10, 82, 1996.

Proudfoot A. E. et al., J. Bioi. Chem., 271, 2599-2603, 1996.

Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Schols D. et al., J. Exp. Med., 186, 1383-1388, 1997. Sozzani S. et al., J. Immunoi., 152, 3615,1994.

Taub D. et al., Cytokine & Growth Factor Reviews, 7,

335-76, 1996.

Van Coillie E. etal., Biochem. Biophys, Rés. Commun., 231, 726-730, 1997.

Van Damme J. et al., Eur. J. Biochem., 181, 337-344,

1989.

Van Damme J. et al., Eur. J. Immunoi., 20, 2113-8,

1990.

Van Damme J. et al., J. Exp. Med., 176, 59, 1992.

Walz A. et al., Biochem. Biophys, Rés. Commun., 159, 969-75, 1989.

Wuyts A., et al., Biochemistry 36, 2716-2723,1997.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 99 aminosav

TlPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ:

HU 226 468 Β1

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: fehérje

HIPOTETIKUS: nem

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: fehérje

ELHELYEZKEDÉS: 1...76

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Lys

Val

Ser -20

Alá

Leu

Cys -15

Leu

Met

Alá -10

Alá

Thr

Phe

Ser

Pro -5

Gin

Gly

Leu

Alá

Gin 1

Pro

Asp

Ser

Val 5

Ser

Ile

Pro

Ile

Thr 10

Cys

Phe

Asn

Val 15

Ile

Asn

Arg

Lys

Ile 20

Pro

Ile

Gin

Arg

Leu 25

Glu

Ser

Tyr

Thr

Arg 30

Ile

Thr

Asn

Ile

Gin 35

Cys

Pro

Lys

Glu

Alá 40

Val

Ile

Phe

Lys

Thr 45

Lys

Arg

Gly

Lys

Glu 50

Val

Cys

Alá

Asp

Pro 55

Lys

Glu

Arg

Trp

Val 60

Arg

Asp

Ser

Met

Lys 65

His

Leu

Asp

Gin

Ile 70

Phe

Gin

Asn

Leu

Lys 75

Pro

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 99 aminosav TlPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ:

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATlPUS: fehérje HIPOTETIKUS: nem SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: fehérje

ELHELYEZKEDÉS: 1...76

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Lys

Val

Ser -20

Alá

Leu

Cys -15

Leu

Met

Alá -10

Alá

Thr

Phe

Ser

Pro -5

Gin

Gly

Leu

Alá

Gin 1

Pro

Asp

Ser

Val 5

Ser

Ile

Pro

Ile

Thr 10

Cys

Phe

Asn

Val 15

Ile

Asn

Arg

Lys

Ile 20

Pro

Ile

Gin

Arg

Leu 25

Glu

Ser

Tyr

Thr

Arg 30

Ile

Thr

Asn

Ile

Gin 35

Cys

Pro

Lys

Glu

Alá 40

Val

Ile

Phe

Lys

Thr

Gin

Arg

Gly

Lys

Glu

Val

Cys

Alá

Asp

Pro

Lys

Glu

50 55

HU 226 468 Β1

Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gin Ile Phe Gin Asn 60 65 70

Leu Lys Pro 75

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 71 aminosav

TlPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ:

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

HIPOTETIKUS: nem

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser 1

Ile

Pro

Ile

Thr 5

Cys

Phe Asn

Val 10

Ile

Asn

Arg

Lys

Ile 15

Pro

Ile

Gin

Arg

Leu

Glu

Ser

Tyr

Thr

Arg

Ile

Thr

Asn

Ile

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Lys

Glu

Alá

Val

Ile

Phe

Lys

Thr

Lys

Arg

Gly

Lys

Glu

Val

Cys

Alá

35

40

45

Asp

Pro

Lys

Glu

Arg

Trp

Val

Arg

Asp

Ser

Met

Lys

His

Leu

Asp

Gin

50

55

60

Ile

Phe

Gin

Asn

Leu

Lys

Pro

65

70

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 71 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ:

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATlPUS: fehérje HIPOTETIKUS: nem

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser 1

Ile

Pro

Ile

Thr Cys 5

Cys

Phe

Asn

Val 10

Ile

Asn

Arg

Lys

Ile 15

Pro

Ile

Gin

Arg

Leu

Glu

Ser

Tyr

Thr

Arg

Ile

Thr

Asn

Ile

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Lys

Glu

Alá

Val

Ile

Phe

Lys

Thr

Gin

Arg

Gly

Lys

Glu

Val

Cys

Alá

35

40

45

Asp

Pro

Lys

Glu

Arg

Trp

Val

Arg

Asp

Ser

Met

Lys

His

Leu

Asp

Gin

50

55

60

Ile

Phe

Gin

Asn

Leu

Lys

Pro

65

70

HU 226 468 Β1

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Aminoterminálisa felől csonkolt, humán monocita kemotaktikus fehérje 2 (MCP-2), amely kemokinantagonista aktivitású, és amelyből hiányoznak a természetesen előforduló humán MCP-2 1-5. aminosavainak megfelelő aminoterminális aminosavak.
2. Az 1. igénypont szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2, amelynek aminosavszekvenciája a 3. vagy a 4. azonosító számú szekvencia.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2, amely glikozilált formájú.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt MCP-2-t kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó DNS-molekula, vagy azzal lényegében azonos nukleotidszekvencia.
5. A 4. igénypont szerinti DNS-molekulát tartalmazó expressziós vektor.
6. Az 5. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmazó gazdasejt.
7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje előállítására szolgáló rekombináns eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti sejteket egy megfelelő tenyésztő tápközegben tenyésztjük.
8. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje gyógyszerként történő alkalmazásra.
9. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje alkalmazása kemokinhatások antagonista aktivitását igénylő betegségek terápiájára és/vagy diagnózisára szolgáló gyógyszer előállításában.
10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás gyulladásos betegségek, HIV-fertőzés, ér- és vérképződéssel kapcsolatos betegségek és tumorok kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában.
11. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval és/vagy kötőanyaggal kombináltan tartalmazó gyógyászati készítmény.