HU224831B1 - Protein with phospholipase activity - Google Patents
Protein with phospholipase activity Download PDFInfo
- Publication number
- HU224831B1 HU224831B1 HU9901640A HUP9901640A HU224831B1 HU 224831 B1 HU224831 B1 HU 224831B1 HU 9901640 A HU9901640 A HU 9901640A HU P9901640 A HUP9901640 A HU P9901640A HU 224831 B1 HU224831 B1 HU 224831B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- phospholipase
- leu
- ser
- thr
- aspergillus
- Prior art date
Links
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 title claims description 60
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 title claims description 59
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 11
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 claims description 34
- 241000892910 Aspergillus foetidus Species 0.000 claims description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 14
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 102100031415 Hepatic triacylglycerol lipase Human genes 0.000 claims 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 13
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 13
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 9
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000228251 Aspergillus phoenicis Species 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 241000228215 Aspergillus aculeatus Species 0.000 description 5
- 241000125121 Aspergillus carbonarius Species 0.000 description 5
- 241000131303 Aspergillus ellipticus Species 0.000 description 5
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 5
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 101150031651 pkc-3 gene Proteins 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 4
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 4
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 4
- 241000498303 Aspergillus heteromorphus Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 4
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 4
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 4
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000509978 Aspergillus niger NRRL3 Species 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 3
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 3
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- ZJIFRAPZHAGLGR-MELADBBJSA-N Asn-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O ZJIFRAPZHAGLGR-MELADBBJSA-N 0.000 description 2
- UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N Asp-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101100510323 Caenorhabditis elegans pkc-1 gene Proteins 0.000 description 2
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M Chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WVLZTXGTNGHPBO-SRVKXCTJSA-N Cys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WVLZTXGTNGHPBO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108010090461 DFG peptide Proteins 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- NJPQBTJSYCKCNS-HVTMNAMFSA-N Glu-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N NJPQBTJSYCKCNS-HVTMNAMFSA-N 0.000 description 2
- VGBSZQSKQRMLHD-MNXVOIDGSA-N Glu-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VGBSZQSKQRMLHD-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- QLNKFGTZOBVMCS-JBACZVJFSA-N Glu-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O QLNKFGTZOBVMCS-JBACZVJFSA-N 0.000 description 2
- KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N Gly-Thr-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(O)=O JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- JENKOCSDMSVWPY-SRVKXCTJSA-N His-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JENKOCSDMSVWPY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- VGYOLSOFODKLSP-IHPCNDPISA-N His-Leu-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 VGYOLSOFODKLSP-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- MDOBWSFNSNPENN-PMVVWTBXSA-N His-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O MDOBWSFNSNPENN-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 2
- AKOYRLRUFBZOSP-BJDJZHNGSA-N Ile-Lys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N AKOYRLRUFBZOSP-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- ZNOBVZFCHNHKHA-KBIXCLLPSA-N Ile-Ser-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N ZNOBVZFCHNHKHA-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- WCNWGAUZWWSYDG-SVSWQMSJSA-N Ile-Thr-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N WCNWGAUZWWSYDG-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N Phe-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- DVOCGBNHAUHKHJ-DKIMLUQUSA-N Phe-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DVOCGBNHAUHKHJ-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 2
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- YRHRGNUAXGUPTO-PMVMPFDFSA-N Phe-Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N YRHRGNUAXGUPTO-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 2
- QAAYIXYLEMRULP-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 QAAYIXYLEMRULP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N Pro-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- QPFJSHSJFIYDJZ-GHCJXIJMSA-N Ser-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO QPFJSHSJFIYDJZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 2
- VIBXMCZWVUOZLA-OLHMAJIHSA-N Thr-Asn-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O VIBXMCZWVUOZLA-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 2
- RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N Thr-Leu-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N)O RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- IQPWNQRRAJHOKV-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IQPWNQRRAJHOKV-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010072986 threonyl-seryl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235389 Absidia Species 0.000 description 1
- WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N Ala-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VYZBPPBKFCHCIS-WPRPVWTQSA-N Arg-Val-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VYZBPPBKFCHCIS-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- XVVOVPFMILMHPX-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XVVOVPFMILMHPX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XSGBIBGAMKTHMY-WHFBIAKZSA-N Asn-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XSGBIBGAMKTHMY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ANPFQTJEPONRPL-UGYAYLCHSA-N Asn-Ile-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ANPFQTJEPONRPL-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- ALHMNHZJBYBYHS-DCAQKATOSA-N Asn-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ALHMNHZJBYBYHS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N Asn-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- QYRMBFWDSFGSFC-OLHMAJIHSA-N Asn-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O QYRMBFWDSFGSFC-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- QRULNKJGYQQZMW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QRULNKJGYQQZMW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N Asp-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- KYQNAIMCTRZLNP-QSFUFRPTSA-N Asp-Ile-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KYQNAIMCTRZLNP-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- AITKTFCQOBRJTG-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N AITKTFCQOBRJTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241001480052 Aspergillus japonicus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 102100026031 Beta-glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001619326 Cephalosporium Species 0.000 description 1
- 241000221955 Chaetomium Species 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- ZOKPRHVIFAUJPV-GUBZILKMSA-N Cys-Pro-Arg Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O ZOKPRHVIFAUJPV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SWJYSDXMTPMBHO-FXQIFTODSA-N Cys-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SWJYSDXMTPMBHO-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KVCJEMHFLGVINV-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Asn Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KVCJEMHFLGVINV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N Glu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IOUQWHIEQYQVFD-JYJNAYRXSA-N Glu-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O IOUQWHIEQYQVFD-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- LURCIJSJAKFCRO-QWRGUYRKSA-N Gly-Asn-Tyr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LURCIJSJAKFCRO-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- LGQZOQRDEUIZJY-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN)C(O)=O LGQZOQRDEUIZJY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UEGIPZAXNBYCCP-NKWVEPMBSA-N Gly-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN)C(=O)O UEGIPZAXNBYCCP-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N Gly-His-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N Gly-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 1
- HDODQNPMSHDXJT-GHCJXIJMSA-N Ile-Asn-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HDODQNPMSHDXJT-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- OVDKXUDMKXAZIV-ZPFDUUQYSA-N Ile-Lys-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N OVDKXUDMKXAZIV-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FOEHRHOBWFQSNW-KATARQTJSA-N Leu-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O FOEHRHOBWFQSNW-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N Leu-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 description 1
- JBRWKVANRYPCAF-XIRDDKMYSA-N Lys-Asn-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N JBRWKVANRYPCAF-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- SODXFJOPSCXOHE-IHRRRGAJSA-N Met-Leu-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SODXFJOPSCXOHE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JQHYVIKEFYETEW-IHRRRGAJSA-N Met-Phe-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JQHYVIKEFYETEW-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DBMLDOWSVHMQQN-XGEHTFHBSA-N Met-Ser-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DBMLDOWSVHMQQN-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 229920000715 Mucilage Polymers 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 241000480238 Nidula Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- CGOMLCQJEMWMCE-STQMWFEESA-N Phe-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CGOMLCQJEMWMCE-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- ORPZXBQTEHINPB-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O ORPZXBQTEHINPB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- MESDJCNHLZBMEP-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MESDJCNHLZBMEP-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N Ser-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N Ser-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- FLMYSKVSDVHLEW-SVSWQMSJSA-N Ser-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLMYSKVSDVHLEW-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000223257 Thermomyces Species 0.000 description 1
- 241001494489 Thielavia Species 0.000 description 1
- NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N Thr-Cys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- UZJDBCHMIQXLOQ-HEIBUPTGSA-N Thr-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O UZJDBCHMIQXLOQ-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- WYKJENSCCRJLRC-ZDLURKLDSA-N Thr-Gly-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O WYKJENSCCRJLRC-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- YZUWGFXVVZQJEI-PMVVWTBXSA-N Thr-Gly-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N)O YZUWGFXVVZQJEI-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 1
- RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N Thr-Tyr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- CYCGARJWIQWPQM-YJRXYDGGSA-N Thr-Tyr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CYCGARJWIQWPQM-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N Thr-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- PWIQCLSQVQBOQV-AAEUAGOBSA-N Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 PWIQCLSQVQBOQV-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- ZAGPDPNPWYPEIR-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZAGPDPNPWYPEIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VBFVQTPETKJCQW-RPTUDFQQSA-N Tyr-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VBFVQTPETKJCQW-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 1
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZPFLBLFITJCBTP-QWRGUYRKSA-N Tyr-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O ZPFLBLFITJCBTP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- GAKBTSMAPGLQFA-JNPHEJMOSA-N Tyr-Thr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 GAKBTSMAPGLQFA-JNPHEJMOSA-N 0.000 description 1
- GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N Val-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004851 dishwashing Methods 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 101150023858 frpC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003232 mucoadhesive effect Effects 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000056 polyoxyethylene ether Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108010015385 valyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000002618 waking effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 235000012794 white bread Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
- A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
- A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
- A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
- A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
- A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
- A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
- A21D2/00—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking
- A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
- A21D2/24—Organic nitrogen compounds
- A21D2/26—Proteins
- A21D2/267—Microbial proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
- C11B3/00—Refining fats or fatty oils
- C11B3/003—Refining fats or fatty oils by enzymes or microorganisms, living or dead
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/913—Aspergillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/913—Aspergillus
- Y10S435/917—Aspergillus niger
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya elkülönített, kétláncú foszfolipáz hasítási termék foszfolipázaktivitással, azonban lizofoszfolipázaktivitás nélkül.
Az étkezési olaj nyálkátlanítása során a nem hidrolizálható foszfolipidek a foszfolipáz által vízoldhatóvá válnak, és így kíméletesen, olcsón és környezetbarát módon távolíthatók el az étkezési olajból. A 0 513 709 számú európai szabadalmi bejelentésben (Röhm/Lurgi) írtak le először hatékony enzimatikus nyálkátlanítási eljárást. Ennek során a vízzel előnyálkátlanított étkezési olajat foszfolipáz vizes oldatával 10 mikrométernél kisebb cseppecskékké emulgeálták. A 3 és 6 közötti pH-η és 50 és 70 °C közötti hőmérsékleten végzett hidrolízis után a vizes fázist elválasztották. Ezt az enzimatikus nyálkátlanítási eljárását a Lurgi cég „EnzyMax-eljárás”-ként vezette be az étolajiparba. A DE 43 39 556 számú német szabadalmi bejelentésben ennek az eljárásnak egy további változataként az enzim újrafelhasználását írták le, amelyet úgy végeznek, hogy az enzimet a használt, iszapot tartalmazó vizes fázisból tenzidek vagy oldáskönnyítő szerek hozzáadásával kioldják, és mint lényegében üledékmentes, enzimtartalmú oldatot újra felhasználják.
Az enzim szükséges mennyiségének rendelkezésre bocsátása nagyüzemi eljárás kivitelezéséhez csak mikroorganizmusok segítségével lehetséges. Ezért igény van olyan mikrobiális forrásra, amely lehetővé teszi a foszfolipáz enzim korlátlan mennyiségben történő termelését. A DE-OS 195 27 274,9 számon nyilvánosságra hozott, 1995. július 26-án tett (Röhm/Lurgi) német szabadalmi bejelentésben leírják, hogy az Aspergillus niger-ben alkalmas foszfolipázt találtak. Ez a lecitint lizolecitinné hasítja, de képes arra is, hogy a lizolecitint továbbhasítsa foszfatidil-kolinná. Az Aspergillusból származó tiszta lizofoszfolipázok, amelyek csak a lizolecitint képesek hasítani, a nyálkátlanítási eljárásban hatástalanok. Ez a nem acilhasító C és D foszfolipázokra is érvényes.
Ezen túlmenően a foszfolipázok mint sütési segédanyagok tészta feldolgozásának javítására is alkalmazhatók.
Az EP 575 133 számú publikált európai szabadalmi bejelentés olyan enzimkészítményt ismertet, amely foszfolipid hidrolízisével lizofoszfolipidet állít elő.
A WO 95/22615 számon publikált PCT szabadalmi bejelentés szerint javított mosó- és/vagy edénymosó hatású zsírbontó enzimeket állítanak elő. Abban az esetben, ha az enzim foszfolipáz, az előállítása foszfolipázból történik.
Az egyik utóbbi anterioritás sem utal olyan enzimre vagy eljárásra, amelynél a lizofoszfolipázaktivitás foszfolipázaktivitásra változna.
A jelen találmány alapját képező feladat egy foszfolipáz kedvező áron és nagy tisztaságban történő rendelkezésre bocsátása. A cél, hogy a foszfolipázt egy transzformált gazdaszervezettel nagy mennyiségben lehessen előállítani. Lehetővé kell tenni továbbá olyan preparátumok enzimmel történő előállítását, amelyek foszfolipidek hidrolíziséhez, így keményítőhidrolizátumok derítéséhez és sütési segédanyagok előállításához különösen jól alkalmazhatók.
A találmány ezt a feladatot egy elkülönített, kétláncú, foszfolipáz hasítási termékkel oldja meg, amely foszfolipázaktivitással rendelkezik, azonban lizofoszfolipázaktivitás nélküli. A találmány szerinti termék az Asperg/7/us-lizofoszfolipáz 2. azonosítási számú érett szekvenciájának elhasításával nyert két darabból áll, amelyeket legalább egy, redukáló körülmények között hasítható kötés kapcsol össze.
Meglepő módon azt találtuk, hogy az Aspergillus-bóí izolálható dezoxiribonukleinsavval (DNS) a DE-OS 196 20 649,9 számon nyilvánosságra hozott német szabadalmi bejelentés szerint transzformált mikroorganizmus nemcsak egy lizofoszfolipázt kódol, hanem meghatározott tenyésztési körülmények között egy foszfolipázba is processzálódik. A foszfolipáz így ugyanolyan primer struktúrával rendelkezik, mint a lizofoszfolipáz, mégis más a szekunder és a tercier struktúrája, és ezáltal eltérőek a fiziológiai tulajdonságai is. A megfelelő szekvencia a DE-OS 196 20 649,9 szerinti 1. azonosítási számú szekvencia. Egy további, foszfolipázt kódoló szekvenciát az Aspergillus niger-bő\ izoláltunk, ez az Aspergillus foetidus-bó\ származó homológ szekvenciától csak az aminosavak 6%-ában különbözik. Az Aspergillus niger-ből származó foszfolipáz és az Aspergillus foetidusból származó lizofoszfolipáz is 270 aminosavból áll, és a molekulatömegük egyaránt 36 000 Da (lásd az 1+2. azonosítási számú szekvenciát). A transzformált mikroorganizmusok előállítását illetően a DE-OS 196 20 649,9 számú német nyilvánosságrahozatali iratot kell figyelembe venni. Aspergillus-bó\ előállított foszfolipázt a technika állásához tartozó iratokban eddig még nem írtak le.
Nakaya és munkatársai az Eur. J. Biochem. 1990, 193 (1) 31-38. irodalmi helyen egy olyan fehérjét írnak le, amelynek a szekvenciája a foszfolipáz A2 szekvenciájához hasonló.
A foszfolipázok a lizofoszfolipázoktól a fehérjék kémiájában ismeretes módszerekkel elválaszthatók és nagyon tiszta állapotban nyerhetők. A tisztított foszfolipázok és lizofoszfolipázok összehasonlításakor a következő különbségeket találjuk.
Az Aspergillus foetidus-bó\ nyert foszfolipázok SDS-gél-elektroforézissel mért molekulatömege redukáló körülmények között 30 000 Da és a lizofoszfolipázoké kb. 36 000 Da, nem redukáló körülmények között azonban mindkét enzim molekulatömege kb. 36 000 Da. Redukáló körülmények között a foszfolipáz két láncra esik szét, amelyek közül a nagyobbat (30 000 Da) gélelektroforézissel ki lehet mutatni. A 6000 Da molekulatömegű kisebb darabot azonban, módszertani okokból, ugyanilyen gélelektroforézissel nem lehet kimutatni, de ezekből az adatokból arra lehet következtetni, hogy a foszfolipáz két peptidláncból áll. Ezt a feltételezést a fehérjeszekvenálás eredményei igazolják.
Az Aspergillus foetidus-bó\ nyert foszfolipáz fehérjeszekvenciája igen jó egyezést mutat a lizofoszfolipáz fehérjeszekvenciájával, mégis vannak különbségek. A foszfolipáznál 1:1 arányban két -NH2 végcsoport található, ezzel szemben a lizofoszfolipáznál csak egy. A foszfolipáz két -NH2 végcsoportja közül az egyik egy 6000 Da molekulatömegű peptidhez, míg a másik -NH2
HU 224 831 Β1 végcsoport 30 000 Da molekulatömegei pepiidhez tartozik. A kisebbik peptid az érett lizofoszfolipázfehérjének az 1-től a 44. aminosavig tartó részével egyezik meg (vő. a DE-OS 196 20 649.9 számú német nyilvánosságrahozatali irat szerinti 1. azonosítási számú szekvenciával), a 30 000 Da molekulatömegű fehérje szekvenciája a lizofoszfolipáz szekvenciájából a 45-től a 270. aminosavig tartó résznek felel meg (vő. a DE-OS 196 20 649.9 számú német nyilvánosságrahozatali irat szerinti 1. azonosítási számú szekvenciával).
Ez az észlelés arra mutat, hogy az Aspergillus foetidus-bó\ származó foszfolipáz a lizofoszfolipázfehérje processzálása révén keletkezhet, de az még nem világos, hogy a processzálás a sejtfalon kívül vagy belül játszódik-e le, és milyen módon megy végbe. A foszfolipáz és a lizofoszfolipáz közötti kapcsolatot az 1. ábra mutatja.
Eltérő a foszfolipáz és a lizofoszfolipáz izoelektromos pontja, a pH- és hőmérsékleti optimuma, és nagyon jelentős a különbség a hőstabilitásukban. A következő táblázat ezeket az értékeket egymás mellett tartalmazza.
1. táblázat
Az Aspergillus foetidus-bói származó foszfolipáz és lizofoszfolipáz tulajdonságainak összehasonlítása
| Foszfolipáz | Lizo- foszfolipáz | |
| Molekulatömeg (SDS-gél, red.) | 30 000 Da | 36 000 Da |
| Molekulatömeg (SDS-gél, nem red.) | 36 000 Da | 36 000 Da |
| Izoelektromos pont | pH 4,3 | pH 4,2 |
| Optimális hőmérséklet | 50 °C | 55 °C |
| Optimális | pH 3-4 | 4,5 |
| pH-stabilitás (1 óra 60 °C-on) | 3,5 | 4,5 |
| >75% maradékaktivitás | 10% maradékaktivitás |
Abban, hogy az adott mikroorganizmusokból lizofoszfolipáz helyett foszfolipázt kapjunk, a fermentációs körülmények lényeges szerepet játszanak. A foszfolipáz képződése szempontjából fontos, hogy a tenyésztést savas vagy gyengén bázikus közegben végezzük. A pH értéke ennek megfelelően a 2 és 9 közötti tartományban, előnyösen 3 és 8 között van. Ilyen körülmények között nagyrészt foszfolipáz képződik. Az előállítás a következőképpen történik. Először egy alkalmas gazdaszervezetet választunk ki a foszfolipáz lehetőleg egyszerű előállítására. Bár lehetséges gazdaszervezetként sokféle penészgomba, így például a termofil Humicola, Thermomyces és Mucor nemzetségek, a Rhizopus, Absidia, Chaetomium, Trichoderma, Thielavia, Penicillium és Cephalosporium nemzetségek képviselője számításba jön, előnyösen mégis az Aspergillus nemzetség fajait alkalmazzuk. A találmány szerinti plazmidokkal történő transzformáció után olyan transzformánsok izolálhatok, amelyek a gazdaszervezetekhez képest nagy mennyiségben termelnek foszfolipázt. Transzformált gazdaszervezetként előnyös egy Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus ellipticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus carbonarius vagy Aspergillus phoenicis fajhoz tartozó Aspergillus törzs vagy egy Trichoderma viride, Trichoderma longibrachiatum vagy Trichoderma reesei fajhoz tartozó Trichoderma törzs.
Egy olyan transzformánst, amelyet a gazdatörzsnek egy szelekciós plazmiddal, előnyösen pAN7-1-gyel, p3SR2-vel vagy pSTA10-zel és egy expressziós plazmiddal, előnyösen pKC3-mal, pKC9-cel, pKC12-vel vagy pKCN2-vel történő kotranszformációjával állítottunk elő, a gazdatörzs számára szokásos tápközegben tenyésztünk; ez a tápközeg legalább egy felhasználható szénforrást, így például kukoricadarát, keményítőt, keményítődextrint és legalább egy felhasználható szerves nitrogénforrást, így például feltárt kukoricáiét, élesztőautolizátumot, szójalisztet, szójafehérjét vagy -peptont önmagában vagy szervetlen nitrogénforrásokkal, így ammóniumsókkal vagy nitrátokkal kombinálva tartalmaz, és sterilizálás után a tápközeg pH-ját savasra vagy enyhén lúgos értékre állítjuk be. A tápoldatot kiegészíthetjük olyan anyagokkal, amelyek a foszfolipáz képződését nagymértékben megnövelik. A szójából származó foszfolipidek tartalmaznak ilyen anyagokat, de más jellegű anyagok, mint például polioxi-etilén-éterek is szóba jöhetnek. A sterilizált tápoldatnak a transzformáns konídiumával vagy vegetatív micéliumával történő beoltása után levegőbevezetés mellett, 20 °C és 60 °C közötti, előnyösen 25 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten a transzformáns növekszik, és a találmány szerinti foszfolipázt termeli. A tenyésztés alatt a tenyészet pH-értékét sav vagy lúg hozzáadásával korrigáljuk úgy, hogy a pH a savas és a gyengén lúgos közötti tartományban, előnyösen 3 és 8 között maradjon. 48-120 órás tenyésztési idő után a foszfolipázt úgy nyerhetjük ki, hogy az oldhatatlan táptalajmaradékot és a biomasszát elválasztjuk, ez általában szűréssel történik, majd a szűrletet szokásos módszerekkel, például ultraszűréssel koncentráljuk. A koncentrátumot (retentátumot) növényi olajok nyálkátlanítására vagy foszfolipidek kezelésére használhatjuk. A foszfolipázt továbbá élelmiszerek Teológiai tulajdonságainak javítására is alkalmazhatjuk.
A következő mikroorganizmusok vannak deponálva a Mikroorganizmusok és Sejtkultúrák Német Gyűjteményében (DSM), Németország, 38 124 Braunschweig, Mascherorder Weg 1B, a Budapesti Szerződés rendelkezéseinek megfelelően:
A. oryzae RH 3745: letétbehelyezési szám DSM 11 283 (a letétbe helyezés ideje: 1996. 11. 11.)
A. ellipticus RH 3886: letétbehelyezési szám DSM 11 284 (a letétbe helyezés ideje: 1996. 11. 11.)
A. foetidus RH 3046: letétbehelyezési szám DSM 10 652 (a letétbe helyezés ideje: 1996. 04. 24.)
E. coli DH5a pKC3: letétbehelyezési szám DSM 10 653 (a letétbe helyezés ideje: 1996. 04. 24.)
HU 224 831 Β1
E. coli DH5a pKC9: letétbehelyezési szám DSM 10 654 (a letétbe helyezés ideje: 1996. 04. 24.)
E. coli DH5a pKC12: letétbehelyezési szám DSM
655 (a letétbe helyezés ideje: 1996. 04. 24.)
E. coli DH5a pKCN2: letétbehelyezési szám DSM
352 (a letétbe helyezés ideje: 1996.12. 23.)
A. niger RH 3909: letétbehelyezési szám DMS 11 353 (a letétbe helyezés ideje: 1996.12. 23.)
A találmányt közelebbről az alábbi példák és ábrák világítják meg.
Az 1. ábra az Aspergillus-bó\ származó lizofoszfolipázgének processzálását és a foszfolipáz keletkezését mutatja.
A 2. ábrán a pKCN2 plazmid szerkezete látható.
1. példa
A dKCN2 expressziós vektor konstrukciója Lizofoszfolipázgének izolálása A. niger NRRL3-ból Az A. niger NRRL3 kromoszomális DNS-ét a Hynes
M. J. és munkatársai által a Mól. Cell. Bioi. 3, 1430-1439 (1983) irodalmi helyen leírtak szerint izoláljuk. (Az A. niger NRRL3 mikroorganizmus az Agricultural Research Service Culture Collection gyűjteményben
NRRL3 számon, az American Type Culture Collection gyűjteményben ATCC 9029 számon férhető hozzá.)
A kapott nagy molekulájú DNS-t Sau3AI-vel részlegesen hidrolizáljuk és szacharózsűrűséggradiens-centrifu5 gálással nagyság szerint frakcionáljuk. A 9-20 kb nagyságú DNS-molekulákat SamHI/EcoRI enzimekkel hidrolizált EMBL3-DNS-be inszertáljuk és in vitro bepakoljuk.
A kromoszomális lizofoszfolipázgének azonosítására egy lambda-EMBL3-génbankban a pKC1/36 plazmidból a HindWISaft cDNS-fragmentumot alkalmazzuk hibridizálási szondaként. A pKC1/36 plazmid tartalmazza az A. foetidus RH 3046-ból izolált lizofoszfolipáz-cDNS-t.
A hibridizálás és a többszörös szétválasztás után két pozitív kiónt lehet azonosítani. Az 1. számú klónból a fág-DNS-eket kipreparáljuk és BamHI-gyel hidrolizáljuk. Ez a Southern-hibridizálás szerint kb. 9 kb-nál mutat pozitív jelet. A SamHI-fragmentet pUC18-ba klónozzuk, és a kapott plazmidot, amely a teljes kromoszomális lizofoszfolípázgént tartalmazza, pKCN-nek nevezzük.
A pKCN2 expressziós vektor konstrukciója
A pKCN2 plazmidba a lizofoszfolípázgént az A. oryzae alfa-amiláz-promoter és az A. nidulans trpC-terminátor hatása alatt építjük be.
A lizofoszfolipázgén izolálása a pKCN plazmidból
PCR-módszer segítségével történik. Két oligonukleotidprimert alkalmazunk, amelyek szekvenciája a következő:
KC29:
5’-GGA ATT CAC CTG CTA ACC ATG TTC TCT GGA GGG TTT GGA GTG-3’ SspMI Met (3. azonosítási számú szekvencia)
KC43
5’-CG GGATCC AAG CTA TAG CAG ACA CTC TGA AAT TG-3’
BamHI AMB (4. azonosítási számú szekvcencia)
A polimeráz-láncreakcióhoz egy reakcióedényben 0,1 ml 20 mM trisz-HCI-ot, amelynek pH-ja 8,4, 50 mM KCI-ot, 1,5 mM MgCI2-ot, 0,2 mM dNTP-t (amely dATP-ből, dCTP-ből, dGTP-ből és dTTP-ből 40 0,2-0,2 mM-t tartalmaz), 50-50 pmol KC 29-et és KC43-at, 1 ng pKCN-t mátrixként és 2,5 U Tag-polimerázt keverünk össze. Az elegyet 20 cikluson keresztül reagáltatjuk (94 °C, 40 s; 40 °C, 1 perc; 72 °C, perc). A reakció befejezése után az amplifikált fragmentumot tisztítjuk, BspMI-gyel és BamHI-gyel hidrolizáljuk és az Λ/col/BamHI-gyel hasított plazmidba inszertáljuk. A pKE2 plazmid tartalmazza az A. oryzae alfa-amiláz-promotert és az A. nidulas frpC-terminátort.
(A pKE2 plazmidot a pKCN2 plazmidból állíthatjuk elő az ebben a példában leírt módon a foszfolipázgén kimetszésével.)
A pKCN2 plazmid szerkezetét restrikciós analízissel és az azt követő szekvenálással igazoljuk.
2. példa
Transzformációs módszer az Aspergillus és a Trichoderma reesei törzsekhez (A Trichoderma reesei törzs többek között ATCC 13 631 számon férhető hozzá.)
A transzformálandó gombatörzs kb. kéthetes Petricsésze-tenyészetéből spóraszuszpenziót állítunk elő kb. 10 ml 0,85%-os NaCI-oldatban, egy spatula segítségével történő lehalászással. Négy, 1 literes rázólombik mindegyikébe 100-100 ml, 1% keményítőextraktumot tartalmazó Czapek-Dox-minimáltáptalajt (Oxoid) mérünk, mindegyiket 1 ml spóraszuszpenzióval oltjuk be, és kb. 16 órán keresztül, 28 °C hőmérsékleten, 45 120 fordulat/perc fordulatszámú rázógépen inkubáljuk. A micéliumot mind a négy rázólombikban papírszűrőn elválasztjuk, és kb. 50 ml MP-pufferrel (1,2 M MgSO4 10 mM foszfátpufferben, pH 5,8) leöblítjük. A puffer átfolyása után a nedves micéliumot kapjuk, amelynek tö50 mege általában 3-5 g.
A nedves micéliumhoz, egy grammjára számítva, 5 ml MP-puffert, 120 mikroliter Novozym-oldatot [1 g Novozym® 234 (Novo Nordisk) 6 ml MP-pufferben] és 25 mikroliter béta-glükuronidázt (Sigma) adunk. A mi55 céliumszuszpenziót 5 percre jeges vízbe állítjuk. Ezután 60 mikroliter marhaszérumalbumin-oldatot (0,2 g marha-szérumalbumin 4 ml MP-pufferben, sterilre szűrve) adunk hozzá, majd a rendszert gyengén rázva 30 °C-on inkubáljuk. A protoplasztok képződését mik60 roszkóppal vizuálisan követjük. Amikor már nem ta4
HU 224 831 Β1 pasztaljuk a protoplasztképződés jelentős növekedését, a reakciót megszakítjuk a protoplasztok összegyűjtése céljából. Ez a helyzet általában 3-5 óra eltelte után következik be.
A protoplasztszuszpenziót a még jelen lévő durva micéliumrészek elválasztására egy MP-pufferrel átitatott üveggyapot szűrőre visszük és centrifugacsövecskékbe vezetjük. A csövecskék felső felébe 600 mM szorbitot, 100 mM trisz/HCI-ot (pH 7) rétegzünk. A csöveket 10 percig 2500 g-n centrifugáljuk. A protoplasztokat a közbenső rétegből elválasztjuk, és 1 M szorbit, 10 mM trisz/HCI (pH 7,5) oldattal felvesszük. Ezután a protoplasztokat két alkalommal STC-pufferrel (1 M szorbit, 10 mM trisz/HCI, pH 7,5, 10 mM CaCI2) 1500 g-n centrifugálva mossuk, és végül 1 ml STC-pufferrel felvesszük.
Az A. oryzae transzformálása céljából 300 mikroliter protoplasztszuszpenziót, kb. 10 mikrogramm p3SR2-t, mint szelekciós plazmidot, és az adott plazmid 10 mikrogrammját az LPL expressziója céljából 25 mikroliter 10 mM trisz/HCI, 8-as pH-jú oldathoz adjuk és 10 percig 0 °C-on inkubáljuk. Ezután ugyanebből a plazmidelegyből még egyszer 25 mikrolitert és 400 mikroliter PEG-oldatot [60% polietilénglikol 6000 (Fluka) 10 mM trisz/HCI-ban, pH 7,5, 50 mM CaCI2j adunk hozzá, a komponenseket nagyon óvatosan összekeverjük, és a reakcióelegyet 5 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. 600 mikroliter PEG-oldat hozzáadása és összekeverés után a reakcióelegyet további 20 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezt követően a reakcióelegyet kb. 9 ml acetamid-lágyagarral, (minimáltáptalaj egyetlen nitrogénforrásként 10 mM acetamiddal, 1 M szacharóz, 0,6 tömeg% agar) 45 °C-on összekeverjük és 4 Petrí-csészébe szétosztjuk ugyanezzel a táptalajjal, amely azonban 1,5 tömeg% agart (Oxoid) és 15 mM CsCI-ot tartalmaz. A csészéket 28 °C-on inkubáljuk. 6-10 nap elteltével a gyorsan növekvő kolóniákat (a transzformánsokat) szacharóz nélküli acetamidközegre átoltjuk, kétszer egyedi spóratelepek formájában tisztítjuk, és végül teljes értékű közegre, például burgonya-dextróz-agarra visszük át.
Az A. niger, az A. awamori (többek között ATCC 14 331 számon férhető hozzá), az A. japonicus (többek között ATCC 1042 számon férhető hozzá) vagy az A. foetidus törzsek transzformánsait hasonlóképpen előállíthatjuk a p3SR2 plazmiddal. A transzformációt azonban előnyösen a pAN7-1 plazmiddal végezzük. A protoplasztok előállítását és a DNS-plazmid hozzáadását a fentiekben a p3SR2-re leírtakkal analóg módon végezzük. Az acetamid-lágyagar hozzáadása helyett azonban a teljes transzformációs elegyet kb. 45 °C-ra lehűtött 100 ml Czapek-Dox-minimáltáptalajhoz (Oxoid) adjuk, amely 100 mikrogramm/ml Hygromycin B-t, 1,5 tömeg% agart (Oxoid) és 1 M szacharózt tartalmaz, majd a komponenseket óvatosan összekeverjük. Az elegyet ezután 10 ml-es adagokban Petri-csészékbe osztjuk szét, amelyek mindegyikébe előzetesen szilárd alsó rétegként 10 ml Czapek-Dox-minimáltáptalajt (Oxoid) mértünk be, amely 1,5 tömeg% agart (Oxoid) tartalmaz, de Hygromycint és szacharózt nem. A felső agarréteg megdermedése után a Petri-csészéket 30 °C és 37 °C közötti hőmérsékleten inkubáljuk. A Hygromycin B-vel szemben rezisztens transzformánsokat kb. 3-10 nap után le lehet oltani, és a rezisztencia felülvizsgálatára Czapek-Dox-minimáltáptalajra (Oxoid), amely 50 mikrogramm/ml Hygromycin B-t és 1,5 tömeg% agart (Oxoid) tartalmaz, át lehet vinni.
Az A. sojae (többek között ATCC 11 906 számon férhető hozzá) és az A. phoenicis (többek között ATCC 11 362 számon férhető hozzá) transzformációjára egy harmadik szelekciós alapelvet alkalmazunk, mivel ezeknek a törzseknek a fenti fajai fel tudják használni az acetamidot, és ugyanakkor Hygromycin B-re rezisztensek. Kloráttartalmú táptalajon szelekcióval olyan mutánsok izolálhatok, amelyeknek a nitrát-reduktáz-génjük (niaD) hibás, és ezért ezek már nem képesek egyetlen nitrogénforrásként nitrátot tartalmazó táptalajon növekedni [Cove D. J. (1976) Heredity 36, 191-203], A pSTA10 plazmiddal végzett transzformáció által [Unkles S. E. és munkatársai, (1989) Mól. Gén. Génét. 218, 99-104] amelyen a nitrát-reduktáz-génre vonatkozó intakt információ megtalálható, a hiba kiküszöbölődik, így a transzformánsok egyetlen nitrogénforrásként nitrátot tartalmazó táptalajon is növekednek, míg a nem transzformáit sejtek növekedése elmarad.
Ez a szelekciós módszer az A. sojae mellett más Aspergillus fajoknál ugyanígy alkalmazható; a niaDmutánsok előállítása azonban mindenképpen egy további műveleti lépést jelent a Hygromycin-B-rezisztencia vagy az acetamidfelhasználás alkalmazásához képest.
3. példa
A PL-t kiválasztó transzformánsok előállítása
Az A. niger, az A. Awamori, az A. foetidus, az A. carbonarius és az A. ellipticus transzformánsai Ezeknek az Aspergillus fajoknak a protoplasztjait az
1. példában leírt módszer szerint állítjuk elő a pAN7-1 plazmiddal és a pKC3, pKC9, pKC12 vagy pKCN2 plazmidok valamelyikével a 2. példa szerint végzett kotranszformálással. [Például ATCC 14 331 számon hozzáférhető A. awamori törzset és ATCC 1025 számon hozzáférhető A. carbonarius törzset alkalmazunk. A pAN7-1 plazmid a Gene, 56, 117-124 (1987) publikációból ismert.] A protoplasztok regenerálására a transzformációs elegyet a fent leírtak szerint Hygromycinre rétegezzük, a transzformánsokat a regenerációs lemezről izoláljuk, tisztítjuk, és a következő tápoldat alkalmazása mellett rázókísérletben a PL-termelés szempontjából vizsgáljuk:
Maltodextrin 3,75%
Feltárt kukoricapor 3,0%
KH2PO4 1,0%
K2HPO4 0,7%
Triton X-100 0,10% vezetékes vízben 30 percig, 121 °C-on sterilizálva. Ehhez a rázókultúra biomasszáját leszűrjük, és a kultúraszűrletben a foszfolipázaktivitást (PLU) mérjük.
HU 224 831 Β1
A transzformánsok a gazdatörzsnél lényegesen nagyobb foszfolipázaktivitást mutatnak.
Az A. oryzae és az A. aculeatus transzformánsai A protoplasztok előállítását és a transzformálást ezeknél a fajoknál is a 2. példában leírt módon végezzük. (Például az ATCC 16 872 számon deponált A. aculeatus törzset használjuk.) A protoplasztokat a p3SR2 plazmiddal és a pKC3, pKC9, pKC12 vagy a pKCN2 plazmidok valamelyikével kotranszformáljuk. [A p3SR2 plazmid az EMBO J„ 4(2), 475-479 (1985) publikációból ismert, előállításához az említett publikációban hivatkozott Mól. Cell. Bioi., 3(8), 1430-1439 (1983) publikációban leírt módszert alkalmazhatjuk.] A protoplasztok regenerálására a transzformációs elegyet a fentiek szerint az egyetlen nitrogénforrásként acetamidot tartalmazó táptalajra rétegezzük, majd a transzformánsokat a regenerációs lemezről izoláljuk, tisztítjuk, és rázókísérletben az alábbi tápoldat felhasználásával a PL termelésére vizsgáljuk:
Maltodextrin 3,75%
Feltárt kukoricapor 3,0% (NH4)2HPO4 0,5%
Triton X-100 0,10% vezetékes vízben 30 percig, 121 °C-on sterilizálva.
Az A. sojae és az A. phoenicis transzformánsai
Az A. sojae RH 3782 n/'aD22 és az A. phoenicis RH 3828 niaD törzseket, amelyek az A. sojae RH 3782 és az A. phoenicis RH 3828 törzseknek a Cove (1976) által leírt módon előállított mutánsai, az alábbi tápoldatban tenyésztjük (az A. phoenicis RH 3828 törzs azonos az ATCC 12 847 számú A. phoenicis törzzsel, az A. sojae RH 3782 törzs az ATCC törzsgyűjteményben szereplő A. sojae törzsek mutánsa):
Glükóz (MERCK) 2%
Malátaextraktum (OXOID) 0,5%
Bacto-Pepton (DIFCO) 0,025%
Ionmentes víz, a pH-értéke 5,0-re beállítva; sterilizálás: 30 percig 121 °C-on.
A micéliumból az 1. példa szerinti metodikával kinyerjük a protoplasztokat, és ezeket a pSTA10-zel, mint szelekciós plazmiddal és a pKC3, pKC9 vagy a pKC12 plazmidok egyikével kotranszformáljuk. [A pSTA10 plazmid a Gene, 78, 157-166 (1989) publikációból ismert.] A protoplasztok regenerálására a transzformációs elegyet 9 ml lágy agarral (ozmotikusán stabilizálva) keverjük össze, amelynek összetétele a következő:
0,1 M Na-foszfát-puffer pH 6 15 ml
M szacharóz (MERCK) 10,28 g
Millipore vízzel 29,1 ml-re kiegészítve
Agár (OXOID) 0,18 g (=0,6%)
Az elegyet 30 percig 121 °C-on sterilizáljuk, ezután sterilen hozzáadunk sóoldatot (7.14.2) 0,6 ml
M NaNO3-oldatot 0,3 ml és szétosztjuk négy olyan agarrétegre, amelyek összetétele ugyanilyen, azzal az eltéréssel, hogy 1% agart tartalmaznak. 6-10 napos, 37 °C-on végzett inkubálás után a transzformánsokat az agarrétegekről izoláljuk, nitrát-szacharóz-agaron kikenéssel tisztítjuk. Transzformánsok sokaságát kapjuk egyetlen nitrogénforrásként nitrátot tartalmazó táptalajon végzett szelekcióval, és az azt követő tisztítással, majd rázólombikban az alábbi tápoldatot alkalmazva a PL termelését vizsgáljuk:
Maltodextrin 3,75%
Feltárt kukoricapor 3,0%
KH2PO4 1,0%
K2HPO4 0,7%
Triton X-100 1,0% vezetékes vízben 30 percig, 121 °C-on sterilizálva.
A PL-t nem, vagy csak kismértékben termelő transzformánsok és a nem transzformált gazdatörzsek mellett olyan transzformánsokat is találunk, amelyek a tenyészet szűrletében jelentősen megnövekedett PL-aktivitást mutatnak. Ezek a kotranszformánsoknak nevezett törzsek alkalmasak az enzimek előállítására. A 2. táblázat a transzformánsok PL-termelésének jellemző eredményeit mutatja a nem transzformált gazdák PL-termelésével szembeállítva.
2. táblázat
A gazdatörzsek és transzformánsok PL-képzésének összehasonlítása
| Törzs, illetve transzformáns | Relatív PL-aktivitás |
| A. oryzae RH 3745 | 100 |
| A. oryzae RH 3745 p3SR2 pKC9 | 3000-4000 |
| A. oryzae RH 3745 p3SR2 pKCN2 | 2000-2500 |
| A. sojae RH 3782 niaD22 | 100 |
| A. sojae RH 3782 niaD22 pSTA10 pKC9 | 500-700 |
| A. foetidus RH 3046 | 100 |
| A. foetidus RH 3046 pAN7-1 pKC9 | 1000-1500 |
| A. phoenicis RH 3828 niaD | 100 |
| A. phoenicis RH 3828 niaD pSTA10pKC9 | 400-600 |
| A. ellipticus | 100 |
| A. ellipticus pAN7-1 pKC12 | 800-900 |
| A. heteromorphus niaD | 100 |
| A. heteromorphus niaD pSTA10 pKC9 | 900-1000 |
| A. carbonarius | 100 |
| A. carbonarius pAN7-1 pKC9 | 400-600 |
| A. aculeatus | 100 |
| A. aculeatus p3SR2 pKC9 | 900-1200 |
| A. niger | 100 |
| A. niger pAN7-1 pKC12 | 700-1000 |
| A. awamori | 100 |
| A. aivamori pAN7-1 pKC12 | 600-800 |
A fenti táblázatban szereplő A. heteromorphus niaD törzs az ATCC 12 064 számú A. heteromorphus törzs niaD mutánsa, amelynek a nitrát-reduktáz-génje (niaD)
HU 224 831 Β1 hibás, tehát nem csupán nitráton, mint egyedüli nitrogénforráson növekszik. A mutáns előállítása szerepel a
2. példában, és a Heredity, 36, 191-203 (1976) publikációban leírt módon történik.
4. példa
A PL tisztítása az A. foetidusból
Az A. foetidus RH 3788 2080 ml-es tenyészetretentátját az elektromos vezetőképesség megállapítása céljából 3520 ml desztillált vízzel hígítjuk, és 160 ml 1 M NaOH-oldattal a pH-t 7,0-re állítjuk. A minta térfogata 5760 ml és vezetőképessége 7,8 mS/cm. (Az A. foetidus RH 3788 törzs az A. foetidus RH 3046 törzs mutánsa, ez utóbbi DSM 10 652 számon 1996. április 24-én lett letétbe helyezve.)
A következő lépésben ioncserés kromatográfiát végzünk DEAE-fraktogélen (MERCK). Ehhez 5760 ml enzimoldatot négy részletben (mindegyik 1440 ml) egy DEAE-fraktogél-oszlopra viszünk (magassága 278 mm, átmérője 100 mm). Az oszlopot A pufferrel (20 mM foszfátpuffer Na2HPO4/KHPO4-ból készítve, amelynek a pH-értéke 7,0, ehhez hozzáadva 15 mM NaCI). Az elúciót az A puffertől a B pufferig (A puffer+1 M NaCI) folyamatosan változó összetételű gradienseleggyel végezzük. 70 ml/perc sebességgel eluálunk, és 350 ml-es frakciókat gyűjtünk.
A frakciókat a PL jelenlétére vizsgáljuk. Ez a PL-aktivitás mérésével történik. Egy PL-egység a definíció szerint az az enzimmennyiség, amely a lecitint 3,5 pH-jú vizes oldatban 40 °C-on 1 mikromól/perc sebességgel hidrolizálja.
A PL-aktivitás mérését az alábbiak szerint végezzük:
Szubsztrát: 1 g Epikuron 200-at (foszfatidil-kolin, gyártó Lucas Meyer), 100 g desztillált vizet és 5 ml 0,32 M CaCI2-oldatot Ultra Turraxszal homogenizálunk.
Analízis: 10 ml szubsztráthoz 10 ml 1%-os Triton X-100 oldatot (gyártó Fluka) és 5 ml 0,0033 M citromsav-monohidrát-oldatot adunk, és az elegyet 10 percig 40 °C-on temperáljuk; a pH 3,4 és 3,5 közé áll be. 0,1 ml enzimoldatot adunk hozzá, és a keveréket 10 percig 40 °C-on inkubáljuk. Az analizálandó minta enzimkoncentrációja nem lehet 2,5 U/g feletti. A reakcióidő elteltével az elegyet 0,01 M KOH-dal 10,0 pH-értékig visszatitráljuk, az első 5 ml-t gyorsan adjuk hozzá, majd csökkentjük a titrálási sebességet, hogy elkerüljük a túltitrálást.
A vakpróba fogyásának méréséhez (BW) az enzimet 15 percig 95 °C hőmérsékleten hevítjük és inaktiváljuk. Lehűlés után ugyanúgy hígítjuk, mint a mérendő oldatot - ennek fogyása HW -, és a továbbiakban is úgy járunk el, mint a mérendő mintával.
Számítás:
HW (ml)-BW (ml)x0,01 M*1000 =PLU/g, pH 3,5=-—-L-J—t10 perc*0,1 ml*enzimkonc. g/ml
A 195 27 274.9 számú, 1995. július 26-i német szabadalmi bejelentésben a foszfolipázt lecitázegységekben, LU/g-ban adják meg. Egy lecitázegység az az enzimmennyiség, amely 40 °C-on, 8-as pH-nál tojássárgájából 1 perc alatt 1 μΜ zsírsavat szabadít fel. 1 LU/g
8-as pH-érték mellett 108 PLU/g-nak felel meg, 3,5-es pH-érték mellett.
A PL kb. 0,11 M NaCI-nál eluálódik. A négy részlet kromatografálásakor kapott PL-tartalmú frakciókat egyesítjük (8950 ml), és egy CH2A-koncentrátorral gyártó az Amicon cég, Hollow-Fiber MG10 000 patronok - 2570 ml térfogatra töményítjük. Ehhez a mintához keverés közben 782 ml 3 M ammónium-szulfát-oldatot adunk (a minta most 0,7 M ammónium-szulfátot tartalmaz).
A következő lépésben a 3352 ml-es mintát felvisszük egy Phenyl-Sepharose 6 Fást Flow, alacsony szubsztitúciós fokú oszlopra (gyártó Pharmacia, magasság 215 mm, átmérő 100 mm). Az oszlopot C pufferrel (20 mM foszfátpuffer, pH 7,0+0,5 M ammónium-szulfát) utánamossuk, és a C puffertől a D pufferig (20 mM foszfátpuffer, pH 7,0) folyamatosan változó összetételű gradienseleggyel eluáljuk. A PL-tartalmú frakciókat egyesítjük (790 ml), a koncentrátorral (lásd fent) betöményítjük, és a D pufferrel szemben dializáljuk; a kapott minta térfogata 150 ml.
Egy további lépésben a mintát öt 30 ml-es részletben egy Mono Q (Pharmacia, 6,3 ml) anioncserélő-kromatográfiás oszlopra visszük. Az oszlopot a D pufferrel öblítjük, és a D puffertől a B pufferig folyamatosan változó összetételű gradienseleggyel eluáljuk, a PL kb. 200 mM NaCI-nál eluálódik.
A PL-tartalmú frakciókat egyesítjük, és PD-10-oszlopon (Pharmacia) E pufferrel szemben (20 mM foszfátpuffer, pH 7,1) dializáljuk. A minta térfogata 24 ml.
A PL végső tisztítása MONO P HR5/20-on (kromatofokuszálás)
A 24 ml mintát (lásd fent) MONO P-oszlopra (magasság 200 mm, átmérő 5 mm) visszük. Az oszlopot E pufferrel utánamossuk. A mintát F pufferrel (Polybuffer 74, gyártó Pharmacia, 1:10 arányban desztillált vízzel hígítva és 1 M HCI-dal pH=4-re állítva) eluáljuk. A PL az oszlopról 13-szoros oszloptérfogat F puffer áthaladása után eluálódik.
A tisztított fehérje az SDS-gél-elektroforézis során kb. 31 000 Da molekulatömegnél mutat egy egységes sávot. Az izoelektromos pont kb. 4,3-es pH-nál van. Az ily módon tisztított fehérjét használjuk szekvenálásra. Az így izolált foszfolipázt antitestek előállítására alkalmazzuk nyulakban. Az immunizálást a Harlowe és Lane által leírt standardeljárás szerint (Ed. Harlowe és Dávid Lane, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) végezzük. A kapott antiszérumot közvetlenül felhasználhatjuk a fehérjetranszferhez (a „Western blots”-hoz, amit szintén Harlowe és Lane írt le a fenti irodalmi helyen), ahol ez specifikusan a foszfolipázsávot jelzi.
5. példa
Szójaolaj nyálkátlanítása
200 g nedvesen nyálkátlanított, 160 ppm maradék foszfáttartalmú szójaolajat gömblombikban 40 °C-ra melegítünk. Hozzáadunk 10 g vizet, amely 20 mg citromsavat és 100 egység foszfolipázt tartalmaz. Az enzim egy olyan, foszfolipázt kiválasztó Aspergillus niger-transzformáns 3. példa szerinti fermentációjából
HU 224 831 Β1 származik, amely tartalmazza a foszfolipázszerkezetet.
Az aktivitást 3,5-es pH-nál határozzuk meg. Ehhez 10 ml 1%-os foszfatidil-kolint (Epikuron 200, Lucas Meyer), amely 0,5 ml 0,32 M CaCI2-ot tartalmaz, 10 ml Triton X-100 oldattal és 5 ml 0,0033 M citromsav-mo- 5 nohidrát-oldattal összekeverünk, és az elegyet 10 percig 40 °C-on temperáljuk. Ezután 0,1 ml megfelelően hígított enzimoldatot adunk hozzá, és 10 percig 40 °C-on inkubáljuk, majd 0,01 M KOH-oldattal pH
10-re titráljuk. Levonjuk a vakpróbára kapott értéket (95 °C-on 15 percig melegített enzimoldat), és a számítást a 3. példa szerint végezzük.
A gömblombik tartalmát egy külső forgószivattyúval intenzíven diszpergáljuk. Ennek során a lombik tartalmát körülbelül percenként egyszer áramoltatjuk át. A vizes fázis részecskemérete 1 μ alatti. Kétórás időközönként mintát veszünk, és megvizsgáljuk a foszfortartalmat. A következő értékeket kapjuk:
| Idő | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | (órákban) |
| Foszfortartalom (ppm-ben) | 160 | 24 | 12 | 7 | 3 |
Azokban a kísérletekben, amelyek során a fentiek szerint jártunk el, de az enzimpreparátum helyett egy megfelelő savófehérjét, tehát nem enzimatikus fehérjét vagy kereskedelmi lizofoszfolipázt (G-Zyme, gyártó Enzyme Biosystems, USA, 1000 lizofoszfolipázegység 20 200 ml szójaolajban) alkalmaztunk, a foszfortartalmat nem lehetett 80 ppm alá csökkenteni.
6. példa
A tésztaminőség javítása 25
A következő sütési kísérletet a találmány szerinti foszfolipázzal hajtottuk végre. 100 tömegrész lisztből, tömegrész sóból, 3 tömegrész sütőélesztőből, 58-60 tömegrész vízből és 40-50 ppm aszkorbinsavból (a tészta tömegére vonatkoztatva) készítettünk 30 tésztát egy spiráltésztagépen (Kemper gyártmány), percig az alacsonyabb és 6 percig a magasabb fokozaton. A tésztakészítés megkezdése előtt hozzáadtuk a vízhez az enzimet és az egyéb adalékokat. A tészta hőmérséklete 23 °C és 25 °C közötti volt.
A tésztát 20 percig pihentettük, majd szabadon szakított fehér kenyér előállítására 350 g-os darabokra osztottuk, formáztuk, 70, illetve 90 percig 32 °C-on 80% relatív nedvességtartalom mellett kelesztettük, és 32 percig 230 °C-on sütöttük. A 3. táblázatban a kenyér térfogatát adjuk meg a hozzáadott enzimmennyiség függvényében. A sütési eredmények azt mutatják, hogy a foszfolipáz hozzáadása által nőtt a sütési térfogat, és javult a kenyérbél szerkezete. A tésztára gyakorolt stabilizálóhatás a hosszabb kelesztési idő (90 perc) mellett adódó jobb sütési eredményekben mutatkozik meg.
3. táblázat Sütési kísérlet
| Adalék/100 kg liszt | Sütési térfogat% ( | 70 perc kelesztés) | Sütési térfogat% (90 perc kelesztés) | Pórusszerkezet | |
| Nincs adalék | 1000 cm3 | 100 | 1050 cm3 | 100 | egyenetlen |
| Gombaamiláz 1000 SKB | 1050 cm3 | 105 | 1130 cm3 | 107 | egyenetlen |
| Gombaamiláz 1000 SKB + Foszfolipáz 12 500 PLU | 1100 cm3 | 110 | 1225 cm3 | 117 | egyenetlen |
| Gombaamiláz 50 000 SKB | 1225 cm3 | 122 | 1275 cm3 | 121 | egyenletes |
| Gombaamiláz 50 000 SKB + Foszfolipáz 12 500 PLU | 1275 cm3 | 128 | 1365 cm3 | 130 | egyenletes |
| Gombaxilanáz 12 000 UXYL | 1325 cm3 | 133 | 1375 cm3 | 131 | egyenletes |
| Gombaxilanáz 12 00 UXYL + Foszfolipáz 12 500 PLU | 1375 cm3 | 138 | 1475 cm3 | 140 | egyenletes |
HU 224 831 Β1
Az 1. azonosítási számú szekvencia adatai (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1368 bázispár (B) Fajta: nukleotid (C) Szálforma: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula fajtája: genom-DNS (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (ix) Ismertetőjel:
(A) Név/kulcs: intron (B) Helyzete: 222...275 (ix) Ismertetőjel:
(A) Név/kulcs. intron (B) Helyzet: 442...486 (ix) Ismertetőjel:
(A) Név/kulcs: intron (B) Helyzet: 824...874 (ix) Ismertetőjel:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Helyzet: kapcsolás (140...221, 276...441, 487...823, 875...1180) (ix) Ismertetőjel:
(A) Név/kulcs: mat_peptid (B) Helyzet: 221...1180 (ix) Ismertetőjel:
(A) Név/kulcs: sig_peptid (B) Helyzete: 140...220 (xi) Szekvencialeírás: 1. azonosítási számú szekvencia
ATGGGGAATT GGGGTGGGTA ATATGATACA GGTATAAAAG GGGGCTCGGA GGTGCAGTTG 60
GATAGAAGCA TTGTGTGTGC ATTGCAGCAG TCCGTTGGTC TCACGTCTCT GGTTGCCTCG 120
ATTGTATATA TACTGCAGG ATG TTC TCT GGA CGG TTT GGA GTG CTT TTG ACA 172
Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Leu Thr
-27 -25 -20
GCG CTT GCT GCG CTG TGT GCT GCG GCA CCG ACA CCA CTT GAT GTG CGG A 221
Ala Leu Ala Ala Leu Cys Ala Ala Ala Pro Thr Pro Leu Asp Val Arg
-15 -10 -5
GTAGGTGTGC CTGATTTGAA GTGGCTGGAT AGCACTGATG AAGGTTTTGA ATAG GT 277
Ser
| GTC Val | TCG Ser | ACT Thr | TCC Ser 5 | ACG Thr | TTG Leu | GAT Asp | GAG Glu | CTG Leu 10 | CAA Gin | TTG Leu | TTC Phe | TCG Ser | CAA Gin 15 | TGG Trp | TCT Ser | 325 |
| GCC | GCA | GCT | TAT | TGC | TCG | AAC | AAT | ATC | GAC | TCG | GAC | GAC | TCT | AAC | GTG | 373 |
| Ala | Ala | Ala 20 | Tyr | Cys | Ser | Asn | Asn 25 | Ile | Asp | Ser | Asp | Asp 30 | Ser | Asn | Val | |
| ACA | TGC | ACG | GCC | GAC | GCC | TGT | CCA | TCA | GTC | GAG | GAG | GCG | AGC | ACC | AAG | 421 |
| Thr | Cys 35 | Thr | Ala | Asp | Ala | Cys 40 | Pro | Ser | Val | Glu | Glu 45 | Ala | Ser | Thr | Lys | |
| ATG Met | CTG Leu | CTG Leu | GAG Glu | TTT Phe | GAC Asp | CT I Leu | GTATGTTGCT CCAGTGAAAT GGATAGAACA | 471 |
55
HU 224 831 Β1
CAGCTGATTG AATAG G ACA AAT AAC TTT GGA GGC ACA GCC GGT TTC CTG Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Alá Gly Phe Leu
65
520
| GCC Alá | GCG Alá | GAC AAC ACC AAC | AAG Lys | CGG Arg 75 | CTC Leu | GTG Val | GTC Val | GCC Alá | TTC Phe 80 | CGA GGC | AGT Ser | ||||
| Asp 70 | Asn | Thr | Asn | Arg | Gly | ||||||||||
| AGC | ACC | ATC | AAG | AAC | TGG | ATT | GCT | GAT | CTC | GAC | TTC | ATC | CTG | CAA | GAT |
| Ser | Thr | Ile | Lys | Asn | Trp | Ile | Alá | Asp | Leu | Asp | Phe | Ile | Leu | Gin | Asp |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| AAC | GAT | GAC | CTC | TGT | ACT | GGC | TGC | AAG | GTT | CAC | ACT | GGA | TTC | TGG | AAG |
| Asn | Asp | Asp | Leu | Cys | Thr | Gly | Cys | Lys | Val | His | Thr | Gly | Phe | Trp | Lys |
| 100 | 105 | 110 | 115 | ||||||||||||
| GCA | TGG | GAA | GCC | GCT | GCA | GAC | AAT | CTG | ACG | AGC | AAG | ATC | AAG | TCC | GCG |
| Alá | Trp | Glu | Alá | Alá | Alá | Asp | Asn | Leu | Thr | Ser | Lys | Ile | Lys | Ser | Alá |
| 120 | 125 | 130 | |||||||||||||
| ATG | AGC | ACG | TAT | TCG | GGC | TAT | ACC | CTC | TAC | TTC | ACC | GGG | CAC | AGC | TTG |
| Met | Ser | Thr | Tyr | Ser | Gly | Tyr | Thr | Leu | Tyr | Phe | Thr | Gly | His | Ser | Leu |
| 135 | 140 | 145 | |||||||||||||
| GGC | GGC | GCA | TTG | GCT | ACA | CTG | GGA | GCA | ACG | GTC | TTG | CGA | AAT | GAC | GGT |
| Gly | Gly | Alá | Leu | Alá | Thr | Leu | Gly | Alá | Thr | Val | Leu | Arg | Asn | Asp | Gly |
| 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| TAT | AGC | GTT | GAA | CTG | GTGAGTGCTT CAGAGGGTGA TCATTAAACA GCCGGTTCTG | ||||||||||
| Tyr | Ser | Val | Glu | Leu |
165
568
616
664
712
760
808
863
913
ACAGTCAATA G TAC ACC TAT GGA TGT CCT CGA GTC GGA AAC TAT GCG CTG Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Tyr Alá Leu
| 170 | 175 | 180 | |
| GCC GAG CAC ATC | ACC AGC | CAG GGA TCT GGA GCG | AAC TTC CCT GTT ACA |
| Alá Glu His Ile | Thr Ser | Gin Gly Ser Gly Alá | Asn Phe Pro Val Thr |
| 185 | 190 | 195 | |
| CAC TTG AAC GAC | ATC GTC | CCC CGG GTG CCA CCC | ATG GAC TTT GGA TTC |
| His Leu Asn Asp | Ile Val | Pro Arg Val Pro Pro | Met Asp Phe Gly Phe |
| 200 | 205 | 210 | |
| AGC CAG CCA AGT | CCA GAA | TAC TGG ATC ACC AGT | GGC ACC GGA GCC AGT |
| Ser Gin Pro Ser | Pro Glu | Tyr Trp Ile Thr Ser | Gly Thr Gly Alá Ser |
| 215 | 220 | 225 | |
| GTC ACG GCG TCG | GAT ATT | GAA CTC ATC GAG GGA | ATC AAT TCG ACG GCG |
| Val Thr Alá Ser | Asp Ile | Glu Leu Ile Glu Gly | Ile Asn Ser Thr Alá |
| 230 | 235 | 240 | 245 |
| GGG AAT GCA GGC | GAA GCA | ACG GTG GAC GTT TTG | GCT CAC TTG TGG TAC |
| Gly Asn Alá Gly | Glu Alá | Thr Val Asp Val Leu | Alá His Leu Trp Tyr |
| 250 | 255 | 260 | |
| TTT TTC GCA ATT | TCA GAG | TGT CTG CTA TAGCTTGGAC AGTCCGATGA | |
| Phe Phe Alá Ile | Ser Glu | Cys Leu Leu |
265 270
961
1009
1057
1105
1153
1200
HU 224 831 Β1
AATAAGTGCG GAGAGAAAGT GTAAATAGTA ATTAAGTATA TATCAGGCAG AGAAGCAGTG GTGGTCAGAG AAGAAAGAGT GAGTCCCATT ACGTAGCAGA TAACCACGTG TGGAGGCGCT GTTCCTCCAC TTGCAGTTGC GGCCATCAAT CATATTCTTC TCCTTACT (2) A 2. azonosítási számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 297 aminosav (B) Fajta: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula fajtája: fehérje
1260
1320
1368
| (xi) A szekvencia leírása: 2. azonosítási számú szekvencia: | Alá | Leu -15 | Alá | Alá | Leu | ||||||||||
| Met -27 | Phe | Ser -25 | Gly | Arg | Phe | Gly | Val -20 | Leu | Leu | Thr | |||||
| Cys | Alá | Alá | Alá | Pro | Thr | Pro | Leu | Asp | Val | Arg | Ser | Val | Ser | Thr | Ser |
| -10 | -5 | 1 | 5 | ||||||||||||
| Thr | Leu | Asp | Glu | Leu | Gin | Leu | Phe | Ser | Gin | Trp | Ser | Alá | Alá | Alá | Tyr |
| 10 | 15 | 20 | |||||||||||||
| Cys | Ser | Asn | Asn | Ile | Asp | Ser | Asp | Asp | Ser | Asn | Val | Thr | Cys | Thr | Alá |
| 25 | 30 | 35 | |||||||||||||
| Asp | Alá | Cys | Pro | Ser | Val | Glu | Glu | Alá | Ser | Thr | Lys | Met | Leu | Leu | Glu |
| 40 | 45 | 50 | |||||||||||||
| Phe | Asp | Leu | Thr | Asn | Asn | Phe | Gly | Gly | Thr | Alá | Gly | Phe | Leu | Alá | Alá |
| 55 | 60 | 65 | |||||||||||||
| Asp | Asn | Thr | Asn | Lys | Arg | Leu | Val | Val | Alá | Phe | Arg | Gly | Ser | Ser | Thr |
| 70 | 75 | 80 | 85 | ||||||||||||
| Ile | Lys | Asn | Trp | Ile | Alá | Asp | Leu | Asp | Phe | Ile | Leu | Gin | Asp | Asn | Asp |
| 90 | 95 | 100 | |||||||||||||
| Asp | Leu | Cys | Thr | Gly | Cys | Lys | Val | His | Thr | Gly | Phe | Trp | Lys | Alá | Trp |
| 105 | 110 | 115 | |||||||||||||
| Glu | Alá | Alá | Alá | Asp | Asn | Leu | Thr | Ser | Lys | Ile | Lys | Ser | Alá | Met | Ser |
| 120 | 125 | 130 | |||||||||||||
| Thr | Tyr | Ser | Gly | Tyr | Thr | Leu | Tyr | Phe | Thr | Gly | His | Ser | Leu | Gly | Gly |
| 135 | 140 | 145 | |||||||||||||
| Alá | Leu | Alá | Thr | Leu | Gly | Alá | Thr | Val | Leu | Arg | Asn | Asp | Gly | Tyr | Ser |
| 150 | 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| Val | Glu | Leu | Tyr | Thr | Tyr | Gly | Cys | Pro | Arg | Val | Gly | Asn | Tyr | Alá | Leu |
| 170 | 175 | 180 | |||||||||||||
| Alá | Glu | His | Ile | Thr | Ser | Gin | Gly | Ser | Gly | Alá | Asn | Phe | Pro | Val | Thr |
| 185 | 190 | 195 | |||||||||||||
| His | Leu | Asn | Asp | Ile | Val | Pro | Arg | Val | Pro | Pro | Met | Asp | Phe | Gly | Phe |
| 200 | 205 | 210 | |||||||||||||
| Ser | Gin | Pro | Ser | Pro | Glu | Tyr | Trp | Ile | Thr | Ser | Gly | Thr | Gly | Alá | Ser |
| 215 | 220 | 225 |
HU 224 831 Β1
| Val 230 | Thr | Alá | Ser | Asp | Ile 235 | Glu | Leu | Ile | Glu | Gly 240 | Ile | Asn | Ser | Thr | Alá 245 |
| Gly | Asn | Alá | Gly | Glu | Alá | Thr | Val | Asp | Val | Leu | Alá | His | Leu | Trp | Tyr |
| 250 | 255 | 260 | |||||||||||||
| Phe | Phe | Alá | Ile | Ser | Glu | Cys | Leu | Leu |
265 270 (2) A 3. azonosítási számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 42 bázispár (B) Fajta: nukleotid (C) Szálforma: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula fajtája: genom-DNS (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 3. azonosítási számú szekvencia:
GGAATTCACC TGCTAACCAT GTTCTCTGGA CGGTTTGGAG TG (2) A 4. azonosítási számú szekvencia adatai (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 34 bázispár (B) Fajta: nukleotid (C) Száiforma: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula fajtája: genom-DNS (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A 4. azonosítási számú szekvencia leírása:
Claims (9)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Elkülönített kétláncú foszfolipáz hasítási termék foszfolipázaktivitással, azonban lizofoszfolipázaktivitás 40 nélkül, azzal jellemezve, hogy az Aspergillus lizofoszfolipáz 2. azonosítási számú érett szekvenciájának elhasításával nyert két hasítási darabból áll, amelyeket legalább egy, redukáló körülmények között hasítható kötés kapcsol össze. 45
- 2. Az 1. igénypont szerinti hasítási termék, azzal jellemezve, hogy a hasítási darab molekulatömege 30 kDa körüli.
- 3. Az 1. igénypont szerinti hasítási termék, azzal jellemezve, hogy a kétláncú foszfolipáz molekulatömege 36 kDa körüli.
- 4. Az 1. igénypont szerinti hasítási termék, azzal jellemezve, hogy az érett Aspergillus lizofoszfolipázfehérje hasítása a 44. és 45. aminosav között történt.
- 5. Az 1. igénypont szerinti hasítási termék, azzal jellemezve, hogy Aspergillus foetidusból kinyert, lizofoszfolipázaktivitású érett fehérjéből származik.
- 6. Az 1. igénypont szerinti hasítási termék, azzal jellemezve, hogy egy Aspergillus-tenyészetből lett elkülönítve.
- 7. A 6. igénypont szerinti hasítási termék, azzal jellemezve, hogy a tenyészet Aspergillus foetidus tenyészete.
- 8. Az 1. igénypont szerinti hasítási termék, azzal jellemezve, hogy specifikusan kötődik az Aspergillus foetidus RH 3046-ból származó tisztított foszfolipázzal szembeni antitesthez.
- 9. Az 1. igénypont szerinti hasítási termék, azzal jellemezve, hogy a 2. azonosítási számú érett szekvenciából legalább a 45. és 270. aminosav közötti részt tartalmazza.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19701348A DE19701348A1 (de) | 1997-01-16 | 1997-01-16 | Protein mit Phospholipaseaktivität |
| PCT/EP1998/000081 WO1998031790A1 (de) | 1997-01-16 | 1998-01-08 | Protein mit phospholipaseaktivität |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9901640A2 HUP9901640A2 (hu) | 1999-08-30 |
| HUP9901640A3 HUP9901640A3 (en) | 2001-09-28 |
| HU224831B1 true HU224831B1 (en) | 2006-02-28 |
Family
ID=7817548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9901640A HU224831B1 (en) | 1997-01-16 | 1998-01-08 | Protein with phospholipase activity |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6140094A (hu) |
| EP (1) | EP0904357B1 (hu) |
| CN (1) | CN1152954C (hu) |
| AR (1) | AR010099A1 (hu) |
| AT (1) | ATE348151T1 (hu) |
| AU (1) | AU6208098A (hu) |
| BR (1) | BR9805893A (hu) |
| CA (1) | CA2243476C (hu) |
| DE (2) | DE19701348A1 (hu) |
| DK (1) | DK0904357T3 (hu) |
| ES (1) | ES2275299T3 (hu) |
| HU (1) | HU224831B1 (hu) |
| MY (1) | MY117580A (hu) |
| PT (1) | PT904357E (hu) |
| TW (1) | TW565610B (hu) |
| WO (1) | WO1998031790A1 (hu) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6936289B2 (en) | 1995-06-07 | 2005-08-30 | Danisco A/S | Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products |
| PL184045B1 (pl) | 1995-06-07 | 2002-08-30 | Danisco | Sposób polepszania reologicznych właściwości ciasta z mąki oraz jakości wytworzonego z ciasta wyrobu gotowego |
| DE19620649A1 (de) * | 1996-05-22 | 1997-11-27 | Roehm Gmbh | Rekombinant hergestellte Lysophospholipase aus Aspergillus |
| EP0977869B2 (en) * | 1997-04-09 | 2008-11-12 | Danisco A/S | Lipase and use of same for improving doughs and baked products |
| DK1073339T4 (da) † | 1998-04-20 | 2008-08-18 | Novozymes As | Fremstilling af dej og bagte produkter |
| DE69904941T3 (de) | 1998-07-21 | 2008-01-31 | Danisco A/S | Lebensmittel |
| EP2302043A3 (en) | 1998-11-27 | 2011-07-20 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variants |
| US7312062B2 (en) * | 1998-11-27 | 2007-12-25 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variants |
| AU2011204998B2 (en) * | 1998-11-27 | 2013-02-14 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variants |
| ATE494366T1 (de) * | 1999-10-14 | 2011-01-15 | Novozymes As | Lysophospholipase aus aspergillus |
| EP2258853B1 (en) | 2000-04-28 | 2016-06-08 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variant |
| JP2004522435A (ja) | 2001-01-10 | 2004-07-29 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 脂肪分解酵素変異体 |
| JP2004522448A (ja) | 2001-02-23 | 2004-07-29 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 脂質分解酵素遺伝子 |
| NZ528260A (en) | 2001-05-18 | 2005-09-30 | Danisco | Method of improving dough and bread quality with the addition of an enzyme that hydrolyses a glycolipid and a phospholipid and incapable of hydrolysing a triglyceride or monoglyceride |
| US20050255544A1 (en) | 2002-01-16 | 2005-11-17 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme variants and method for their production |
| DE60333629D1 (de) * | 2002-05-21 | 2010-09-16 | Dsm Ip Assets Bv | Neue phospholipasen und deren verwendungen |
| US6773731B2 (en) * | 2002-10-18 | 2004-08-10 | James S. Campbell | Liquid egg yolk product comprising lysophospholipoprotein |
| US7955814B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-06-07 | Danisco A/S | Method |
| MXPA05007653A (es) | 2003-01-17 | 2005-09-30 | Danisco | Metodo. |
| US20050196766A1 (en) * | 2003-12-24 | 2005-09-08 | Soe Jorn B. | Proteins |
| EP1602721B8 (en) * | 2003-03-04 | 2012-03-07 | National Institute of Technology and Evaluation | Koji mold-origin phospholipase a sb 2 /sb |
| CN101319204A (zh) * | 2003-04-28 | 2008-12-10 | 诺维信公司 | 磷脂酶和其生产方法 |
| GB0716126D0 (en) | 2007-08-17 | 2007-09-26 | Danisco | Process |
| US7906307B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-03-15 | Danisco A/S | Variant lipid acyltransferases and methods of making |
| US7718408B2 (en) * | 2003-12-24 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Method |
| GB0405637D0 (en) | 2004-03-12 | 2004-04-21 | Danisco | Protein |
| EP2267108A1 (en) | 2004-07-16 | 2010-12-29 | Danisco A/S | Enzymatic oil-degumming method |
| US20070148311A1 (en) * | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Bunge Oils, Inc. | Phytosterol esterification product and method of make same |
| DE102006046857A1 (de) | 2006-10-02 | 2008-04-03 | Ab Enzymes Gmbh | Klonierung, Expression und Verwendung saurer Lysophospholipasen |
| DE102006046719A1 (de) | 2006-10-02 | 2008-04-03 | Ab Enzymes Gmbh | Klonierung, Expression und Verwendung saurer Phospholipasen |
| PL2405007T3 (pl) | 2007-01-25 | 2014-04-30 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Wytwarzanie acylotransferazy lipidowej z przekształconych komórek gospodarza Bacillus licheniformis |
| US8338133B2 (en) * | 2007-01-30 | 2012-12-25 | Mitsubishi-Kagaku Foods Corporation | DNA encoding glyceroglycolipid lipase |
| US8956853B2 (en) * | 2007-01-30 | 2015-02-17 | Bunge Oils, Inc. | Enzymatic degumming utilizing a mixture of PLA and PLC phospholipases |
| US8460905B2 (en) * | 2007-09-11 | 2013-06-11 | Bunge Oils, Inc. | Enzymatic degumming utilizing a mixture of PLA and PLC phospholipases with reduced reaction time |
| US8241876B2 (en) | 2008-01-07 | 2012-08-14 | Bunge Oils, Inc. | Generation of triacylglycerols from gums |
| EP2249156A1 (en) * | 2009-04-29 | 2010-11-10 | Aterovax | Enzymatic assay for the quantitative determination of phospholipase A1 or A2 activity in a sample based on the use of a solid phase coated with a fluorochrome-labelled substrate |
| DE102009051013A1 (de) | 2009-10-28 | 2011-06-09 | Ab Enzymes Gmbh | Klonierung, Expression und Verwendung saurer Phospholipasen |
| PL2545150T3 (pl) | 2010-03-12 | 2019-01-31 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Sposób |
| AR085251A1 (es) | 2011-02-23 | 2013-09-18 | Danisco | Proceso para tratar aceite vegetal |
| WO2013104660A1 (en) | 2012-01-13 | 2013-07-18 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Process for treating a plant oil comprising hydrolysing chlorophyll or a chlorophyll derivative and involving partial caustic neutralisation |
| WO2013160370A1 (en) | 2012-04-25 | 2013-10-31 | Novozymes A/S | Method of baking |
| MX2019009551A (es) | 2017-02-20 | 2020-01-30 | Novozymes As | Enzima lipolitica para usarse en horneado. |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW362115B (en) * | 1992-06-16 | 1999-06-21 | Sankyo Lifetech Co Ltd | Novel phospholipase A1, process for its preparation and the use thereof |
| ATE222604T1 (de) * | 1994-02-22 | 2002-09-15 | Novozymes As | Methode zur herstellung einer variante eines lipolytischen enzymes |
| DE19527274A1 (de) * | 1995-07-26 | 1997-01-30 | Metallgesellschaft Ag | Enzymatisches Verfahren zur Entschleimung von pflanzlichen Ölen mit Aspergillus-Phospholipase |
| DE19620649A1 (de) * | 1996-05-22 | 1997-11-27 | Roehm Gmbh | Rekombinant hergestellte Lysophospholipase aus Aspergillus |
-
1997
- 1997-01-16 DE DE19701348A patent/DE19701348A1/de not_active Ceased
- 1997-12-08 MY MYPI97005899A patent/MY117580A/en unknown
-
1998
- 1998-01-02 AR ARP980100020A patent/AR010099A1/es not_active Application Discontinuation
- 1998-01-08 AT AT98904046T patent/ATE348151T1/de active
- 1998-01-08 AU AU62080/98A patent/AU6208098A/en not_active Abandoned
- 1998-01-08 DK DK98904046T patent/DK0904357T3/da active
- 1998-01-08 CA CA002243476A patent/CA2243476C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-08 DE DE59813840T patent/DE59813840D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 HU HU9901640A patent/HU224831B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-01-08 CN CNB988000091A patent/CN1152954C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-08 EP EP98904046A patent/EP0904357B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 PT PT98904046T patent/PT904357E/pt unknown
- 1998-01-08 WO PCT/EP1998/000081 patent/WO1998031790A1/de not_active Ceased
- 1998-01-08 ES ES98904046T patent/ES2275299T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 BR BR9805893A patent/BR9805893A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-01-08 US US09/142,469 patent/US6140094A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-18 TW TW087111741A patent/TW565610B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AR010099A1 (es) | 2000-05-17 |
| MY117580A (en) | 2004-07-31 |
| DE19701348A1 (de) | 1998-07-23 |
| EP0904357A1 (de) | 1999-03-31 |
| CA2243476C (en) | 2009-01-06 |
| HUP9901640A2 (hu) | 1999-08-30 |
| WO1998031790A1 (de) | 1998-07-23 |
| CN1152954C (zh) | 2004-06-09 |
| CA2243476A1 (en) | 1998-07-23 |
| DE59813840D1 (de) | 2007-01-25 |
| TW565610B (en) | 2003-12-11 |
| HUP9901640A3 (en) | 2001-09-28 |
| CN1216061A (zh) | 1999-05-05 |
| US6140094A (en) | 2000-10-31 |
| AU6208098A (en) | 1998-08-07 |
| ES2275299T3 (es) | 2007-06-01 |
| HK1019074A1 (en) | 2000-01-21 |
| ATE348151T1 (de) | 2007-01-15 |
| EP0904357B1 (de) | 2006-12-13 |
| PT904357E (pt) | 2007-03-30 |
| BR9805893A (pt) | 1999-08-24 |
| DK0904357T3 (da) | 2007-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU224831B1 (en) | Protein with phospholipase activity | |
| US5306633A (en) | Bacterial xylanase, method for its production, bacteria producing a xylanase, DNA fragment encoding a xylanase, plasmid containing the DNA fragment, baking agents containing a xylanase, and method for producing bread and baked goods using the xylanase | |
| JP3824174B2 (ja) | ホスホリパーゼの使用による高い量の非水和性リンを含む食用油中のリン含有成分の減少、ホスホリパーゼａおよび／またはｂ活性を有する糸状菌からのホスホリパーゼ | |
| AU718990B2 (en) | Lysophospholipase produced from Aspergillus by recombinant methods | |
| JP4040677B2 (ja) | アミノペプチダーゼ活性を有する酵素 | |
| KR100319442B1 (ko) | 플루라나아제, 이를 제조하는 미생물, 이플루라나아제의 제조방법과 이의 용도 | |
| CN100415889C (zh) | 阿拉伯木聚糖降解酶 | |
| KR20000005277A (ko) | 신규피타제 및 이 피타제를 코드하는 유전자 | |
| US5612208A (en) | Ascorbate oxidase, gene encoding the same, process for producing the same, and reagent composition using the same | |
| JPH08280388A (ja) | 繊維状菌類中に発現する異種ポリペプチドの製造方法 | |
| JP2002511746A (ja) | プロリルピペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードする核酸 | |
| US20170137788A1 (en) | Saccharide oxidase, and production method for same and use of same | |
| JPH08507221A (ja) | アルカリ耐性キシラナーゼ | |
| JP2002514920A (ja) | アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれをコードする核酸 | |
| JP3117997B2 (ja) | アスペルギルス発現システム | |
| US7109014B1 (en) | Diglycosidase isolated from microorganisms | |
| US9322003B2 (en) | Cloning, expression and use of acid phospholipases | |
| US5783414A (en) | Expression system, integration vector and cell transformed by this integration vector | |
| JP2003516112A (ja) | 相同又は非相同タンパク質生産のための組換えペニシリウム フニクロスム | |
| US6228632B1 (en) | Leucine aminopeptidases produced recombinantly from Aspergillus soyae | |
| JPH09505481A (ja) | アスペルギルス・フェティダス発現系 | |
| CN101233232B (zh) | 新型二糖苷酶以及编码该二糖苷酶的基因 | |
| US20060240509A1 (en) | Myrothecium sp transformation and expression system | |
| JP2002360287A (ja) | 優れたグルコース耐性を具えたβ−グルコシダーゼ | |
| JPH0965883A (ja) | アスコルビン酸酸化酵素をコードする遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |