HU218831B - Eljárás megnövelt hatású, katalitikus helyre irányuló trombin inhibitorok és ezeket tartalmazó gyógyszer-, és diagnosztikai készítmények előállítására - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új, (I) általános képletű, megnövelt hatású, katalitikus helyre irányuló trombininhibitorok és ezeket tartalmazó gyógyszer- és diagnosztikai készítmények előállítására.

Ezek a molekulák tartalmaznak egy katalitikus helyre irányított csoportot (catalytic site directed moiety=CSDM), és az (I) képletben

X hidrogénatom vagy 1-100 atomos vázból álló lánc; Rí szubsztituálatlan, mono-, di- vagy triszubsztituált, telített gyűrűszerkezetű csoport;

R₂ kötés vagy 1-5 atomos vázból álló lánc;

R₃ kötés vagy 1-3 atomos vázból álló lánc;

R₄ valamely aminosav;

R₅ valamely L-aminosav, amely guanidinium- vagy aminocsoportot tartalmazó oldallánccsoporttal rendelkezik;

R₆ nem amid kötés; és

Y kötés vagy 1-9 atomos vázból álló lánc.

A találmány szerint előállított trombininhibitorokat kívánt esetben módosíthatjuk.

Előnyösek azok a módosított trombininhibitorok, melyek egy aniont megkötő külső helyhez kapcsolódó részt/anion binding exosite associating domain=ABEAM) és egy 18-42 Á hosszúságú összekötő részt (linker) tartalmaznak, amely az Y-t és az ABEAM-ot köti össze.

A találmány tárgyát képezik továbbá a gyógyászati, megelőzési vagy diagnosztikai célokra használható készítmények és kombinációk előállítására szolgáló eljárások.

Az akut érbetegségek, így a szívizominfarktus, gutaütés, tüdőembólia, mély vénás trombózis, perifériás artériás elzáródás és más vérrendszeri trombózisok, képezik az egészségre a fő rizikófaktorokat. Ezeket a betegségeket az okozza, hogy egy vérrög, amely fibrint és trombocitákat tartalmaz, egy véredényt részben vagy teljesen elzár.

A trombin a természetben előforduló protein, amely a fibrinogénnek fibrinné való átalakulását, a vérrög képződésének utolsó fázisát katalizálja. Azonkívül, hogy a fibrinrög képződését katalizálja, a trombin aktiválja a trombociták aggregációját és felszabadítási reakcióikat. Ez azt jelenti, hogy a trombin központi szerepet játszik mind az akut, a trombocitáktól függő (artériás) trombózisban [S. R. Hanson and L. A. Harker, „Interruption of Acute Platelet-Dependent Thrombosis by the Synthetic Antithrombin D-Phenyalanyl-L-Prolyl-LArginylcloromethylketone”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3184-88 (1988)], mind pedig a fibrintől függő (vénás) trombózisban.

A trombinnak több más, biológiai szabályozó szerepe is van [J. W. Fenton, II, „Thrombin Bioregulatory Functions”, Adv. Clin. Enzymol., 6, 186-93 (1988)]. így például a trombin közvetlenül tud aktiválni egy gyulladásos reakciót, a trombocitákat aktiváló faktor (PAF) szintézisét az endoteliális sejtekben stimulálva [S. Prescott et. al., „Humán Endothelial Cells in Culture Produce Platelet-Activating Factor (l-alkyl-2acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine) When Stimulated With Thrombin”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,

3534-38 (1984)]. A PAF az endoteliális sejtek felületén helyezkedik el, és ligandumként szolgál a neutrofil adhézióhoz és a későbbi degranulációhoz (szemcsevesztés) [G. M. Vercoletti et al., „Platelet-Activating Factor Primes Neutrophil Responses to Agonists: Role in Promoting Neutrophil-Mediated Endothelial Damage”, Blood, 71,1100-07 (1988)]. A trombin elősegítheti a gyulladást úgy is, hogy a vaszkuláris permeabilitást növeli, ami ödémához vezethet [P. J. Del Vecchio et al., „Endothelial Monolayer Permeability To Macromolecules”, Fed. Proc., 46, 2511-15 (1987)]. Azok a reagensek - így a hirudin -, amelyek a trombin aktív helyét blokkolják, megszakítják a trombociták és az endoteliális sejtek aktiválását [C. L. Knupp, „Effect of Thrombin Inhibitors on ThrombinInduced Release and Aggregation”, Thrombosis Rés., 49, 23-36 (1988)].

A trombinnak szerepe van a rák előmozdításában is, ami azon alapszik, hogy közvetlen emésztési terméke, a fibrin, szubsztrátumként szolgálhat, a tumomövekedéshez [A. Falanga et al., „Isolation and Characterization of Cancer Procoagulant: A Cysteine Proteinase írom Malignant Tissue”, Biochemistry, 24, 5558-67 (1985);

S. G. Gordon et al., „Cysteine Proteinase Procoagulant From Amnion-Chorion”, Blood, 66, 1261-65 (1985); és A. Falanga et al., ,,Α. New Procoagulant In Acute Leukémia”, Blood, 71, 870-75 (1988)]. A trombin szerepet játszik a neurodegeneratív betegségekben is, azon képessége alapján, hogy neurit-/idegnyúlvány/-reakciót okoz [D. Gurwitz et al., „Thrombin Modulates and Reverses Neuroblastoma Neurite Outgrowth”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3440-44 (1988)]. Ezért a trombin in vivő hatásának a szabályozási lehetősége számos fontos klinikai jelentőséggel bír.

Az akut érbetegségek sikeres kezelésének vagy megelőzésének egyik módja a trombin gátlása. A szakterületen már számos típusú trombininhibitor ismeretes. A heparint, a trombinnak egy indirekt inhibitorát, széles körben használják vénás trombózis kezelésére. A heparin, bár hatásos a fibrintől függő rögképződés ellen, kevéssé hatásos a trombociták trombin által előidézett aktiválására. Ezért ezt a gyógyszert az artériás trombózis kezelésére nem használják. A heparin ezenkívül több nemkívánatos mellékhatást idéz elő, beleértve a vérzést és a trombocitaszám csökkenését.

A hirudin a természetben előforduló polipeptid, amit a vérszívó pióca, a Hirudo medicinalis termel. Ez a vegyület, amely a pióca nyálmirigyében képződik, a leghatásosabb ismert természetes inhibitora a koagulálásnak. A hirudin azzal gátolja meg a vér koagulálását, hogy szorosan kapcsolódik a trombinhoz (K_d=2x 10-·¹ M) 1:1 sztöchiometrikus arányú komplexben [S. R. Stone and J. Hofsteenge, „Kinetics of the Inhibition of Thrombin by Hirudin”, Biochemistry, 25, 4622-28 (1986)]. így a hirudin meggátolja, hogy a trombin katalizálja a fibrinogén át alakulását fibrinné (rög) és gátolja valamennyi más, a trombin által közvetített folyamatot [J. W. Fenton, II, „Reguládon of Thrombin Generation and Functions”, Sémin. Thromb. Hemost. 14, 234-40 (1988)].

HU 218 831 Β

A hirudin úgy gátolja a trombint, hogy utóbbihoz két különböző helyen kapcsolódik. Először a hirudin C-terminális része a trombinnak egy aniont megkötő külső helyével (anion binding exosite=ABE) reagál [J. W. Fenton, II et al., „Thrombin Anion Binding Exosite Interactions with Heparin and Various Polyanions”, Ann. New York Acad. Sci., 556,158-65 (1989)]. Ezt a kis affinitásu kötést követően a hirudin-trombin-komplex szerkezeti változáson megy át, és a hirudin aminoterminális része a trombin katalitikus helyéhez tud kapcsolódni. [S. Kono et al., „Analysis of Secondary Structure of Hirudin and the Conformational Change Upon Interaction with Thrombin”, Arch. Biochem. Biophys., 267,158-66 (1988)].

A hirudin izolálása, tisztítása és aminosav-szekvenciája a szakterületen ismert [P. Walsmann and F. blarkwardt, „Biochemical and Pharmacological Aspects of the Thrombin Inhibitor Hirudin”, Pharmazie, 36, 653-60 (1981); J. Dodt et al., „The Complete Covalent Structure of Hirudin: Localization of the Disulfide Bonds”, Bioi. Chem. Hoppe-Seyler, 366, 379-85 (1985); S. J. T. Mao et al., „Rapid Purification and Revised Amino Terminál Sequence of Hirudin: A Specific Thrombin Inhibitor of the Blood-Sucking Leech”, Anal. Biochem. 161, 514-18 (1987); and R. P. Harvey et al., „Cloning and Expression of a cDNA Coding fór the Anti-Coagulant Hirudin from the Bloodsucking Leech, Hirudo Medicinalis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,1084-88 (1986)].

A hirudin, piócákból tisztítva, állatkísérletekben hatásosnak bizonyult vénás trombózis, érelágazások eltömődése és a trombin által előidézett dissziminált intravaszkuláris (éren belüli) koagulálás megelőzésére. Ezenkívül a hirudin alacsony toxicitást mutat, és a keringésből igen rövid idő alatt kiválasztódik [F. Markwardt et al., „Pharmacological Studies on the Antithrombotic Action of Hirudin in Experimental Animals”, Thromb. Haemost., 47,226-29 (1982)].

A hirudint újabban klónozták és kifejezték E. coliban [158 564,168 342 és 171 024 számú európai közrebocsátási iratok] és élesztőben [200 655 számú európai közrebocsátási irat]. Dacára ezeknek az előnyöknek, a hirudin előállítása még elég költséges, és a kereskedelemben nem kapható széles körben.

Az utóbbi időkben igyekeztek azonosítani a természetes hirudinnak és származékainak peptid-íragmentumait, amelyek ugyancsak hatásosak a rögképződés idejének elnyújtására. Ilyen vegyületeket ismertetnek a 276 014, 291 982, 333 356, 341 607 és 372 670 számú európai közrebocsátási iratok. Az ezekben a szabadalmi bejelentésekben leírt molekulák eltérő hatásúak voltak a rögképződés meggátlásában, de valamennyi

2-4 nagyságrenddel kevésbé volt hatásos mint a hirudin. így ezek a peptid-fragmentumok nem teljesen kielégítők a vérrögök feloldására folyamatos terápiás kezeléseknél.

Legutóbb ismertettek olyan vegyületeket, amelyek a hirudin működéséhez hasonlóan, kapcsolódnak mind az aniont megkötő külső helyhez, mind a trombin katalitikus helyéhez [395 482 és 549 388 sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések]. Ezek a vegyületek a természetes hirudinéval azonos vagy annál nagyobb trombininhibitor hatást mutatnak. Ezek a vegyületek kisebbek is mint a hirudin, és ezért kevésbé antigének. Ezek az inhibitorok szintetikusan is előállíthatok, ami lehetővé teszi kereskedelmileg megfelelő mennyiségek előállítását elfogadható áron.

A fejlődés ellenére, ami a mai napig végbement, folyamatos igény van még hatásosabb trombininhibitorokra, amelyek kis költséggel és kereskedelmileg megfelelő mennyiségekben előállíthatok. Az ilyen inhibitorok nemcsak az érbetegségek kezelésére és megelőzésére lennének hatásosak, de terápiásán alkalmazhatók a rák, neurodegeneratív betegségek és gyulladások kezelésére.

A találmány tárgyát olyan molekulák előállítása képezi, amelyek a trombinnak hatásos inhibitorai. Ezeket a molekulákat egy trombininhibitor-komplex háromdimenziós röntgen-krisztallográfiai szerkezete alapján terveztük meg. Ezért a találmány szerinti inhibitorok térbelileg úgy vannak kialakítva, hogy a legjobb illeszkedést biztosítják a háromdimenziós térbe, a trombin katalitikus helyén és körülötte. Ez optimális trombininhibitor hatású molekulákat eredményez.

A találmány tárgyát képezi továbbá azoknak a trombininhibitoroknak az előállítása, amelyek tartalmaznak még egy olyan csoportot, amely a trombin aniont megkötő külső helyéhez kapcsolódik. Ezek az inhibitorok minőségileg a hirudin hatását utánozzák. Mivel ezeket a molekulákat optimális térbeli konfigurációra terveztük meg, ezek hatásosabbak mint a hirudin. A találmány szerinti inhibitorok nagy hatása lehetővé teszi, hogy ezeket a betegeknél olyan dózisokban alkalmazzuk, amelyek többé-kevésbé alacsonyabbak, mint a hirudinalapú terápiás kezeléseknél használtak.

A találmány szerinti molekulák alkalmazhatók készítményekben és eljárásokban, bármely, a trombin által közvetített vagy a trombinnal kapcsolatos fünkció vagy folyamat gátlására. A molekulákat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása, amelyek érbetegségek, gyulladásos reakciók, rákbetegségek és neurodegeneratív betegségek kezelésére és megelőzésére szolgálnak, ugyancsak a találmány tárgyát képezik. Ezek a molekulák alkalmazhatók készítményekben és eljárásokban ex vivő kimutatásra, extrakorporális vér tárolására és kezelésére és invazív eszközök bevonására. A találmány szerinti molekulákat beadhatjuk a betegeknek fibrinoldó szerekkel kombinálva, hogy a szer egy adott dózisának a hatását növeljük, vagy hogy a szemek egy adott hatáshoz, így egy vérrög feloldásához szükséges dózisát csökkentsük.

Annak a ténynek a következtében, hogy a találmány szerinti molekulák kémiai szintézises eljárásokkal előállíthatok, kereskedelmileg megfelelő mennyiségben nyerhetők alacsony költségek mellett. Ezenkívül, mivel a találmány szerinti molekulák lényegesen kisebbek, mint az orvosi gyakorlatban jelenleg használatos trombininhibitorok, előbbiek kevésbé hajlamosak arra, hogy egy nemkívánatos immunválaszt stimuláljanak az ezekkel kezelt betegekben. Ennek megfelelően ezeknek a

HU 218 831 Β trombininhibitoroknak a használata nem korlátozódik akut betegségek kezelésére. A molekulák használhatók krónikus trombus-embóliás betegségek, így az ateroszklerózis és az érplasztikát követő restenosis gyógyítására is. A találmány szerinti molekulák használhatók továbbá számos más alkalmazásban az ismert trombininhibitorok, elsősorban a heparin vagy a hirudin helyett.

Amint az az alábbiakból nyilvánvaló lesz, a találmány szerinti molekulák, készítmények és eljárások használhatók különböző, a trombin nemkívánatos hatásaival kapcsolatos betegségek kezelésére és megelőzésére, valamint diagnosztikai célokra.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1. ábra a hirulog-8-trombin-komplex térbetöltő modelljének az ábrázolása.

A 2. ábra a hirulog-8 1-helyzetű D-fenil-alaninja és 2helyzetű prolinja közötti kölcsönhatást, és a trombin katalitikus helye mellett lévő hidrofób „zsebet” („pocket”) szemlélteti vázlatosan.

A 3. ábra a hirugén, a rekombináns hirudin, a hirulog8 és a D-Cha-hirulog antikoaguláns hatásainak összehasonlítása.

A leírásban és az igénypontokban az aminosavakra a következő szokásos rövidítéseket alkalmazzuk:

Om - omitin Ala - alanin Leu - leucin Pro - prolin Trp - triptofán Ser - szerin Cys - risztéin Asn - aszparagin Asp - aszparaginsav Lys - lizin His - hisztidin Npa - naftil-alanin Hyp - hidroxi-prolin

Gly - glicin

Val - valin

Ile - izoleucin

Phe - fenil-alanin

Met - metionin

Thr - treonin

Tyr - tirozin

Gin - glutamin

Glu - glutaminsav

Arg - arginin

Nle - norleucin

Cha - ciklohexil-alanin

TPro - tioprolin

Suc - szukcinil

Tos - p-toluolszulfonil

Inp - izonipekotinsav

Ac - acetil

Boc - terc-butoxi-karbonil Cbz - benzil-oxi-karbonil

3.4- dehidroPro - 3,4-dehidroprolin

Tyr(OSO₃H) - tirozin-O-szulfát

Sár - szarkozin (N-metil-glicin)

Tyr(SO₃H) - 3-szulfo-tirozin

3.5- dijód Tyr - 3,5-dijód-tirozin.

A leírásban használt „valamely aminosav” kifejezés a természetben előforduló aminosavak L-izomeijeit foglalja magába, valamint más „nem-protein” a-aminosavakat, amelyeket általában használnak a peptidkémiában, ha a természetben előforduló amino-peptidek szintetikus analógjait állítják elő. A természetben előforduló aminosavak a glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, szerin, metionin, trsonin, fenil-alanin, tirozin, triptofán, cisztein, prolin, hisztidin, aszparaginsav, aszparagin, glutaminsav, glutamin, γ-karboxi-glutaminsav, arginin, omitin és lizin. „Nem protein” α-aminosavak például a norleucin, norvalin, alloizoleucin, homoarginin, tioprolin, dehidroprolin, hidroxi-prolin (Hyp), izonipekotinsav (Inp), homoszerin, ciklohexil-glicin (Chg), aamino-n-vajsav (Aba), ciklohexil-alanin (Cha), amino10 fenil-vajsav (Pba), fenil-alaninok, szubsztituálva a fenilcsoport orto-, méta- vagy para-helyzetében egy vagy több következő szubsztituenssel: 1-4 szénatomos alkil-, 1 -4 szénatomos alkoxi-, halogén vagy nitrocsoportokkal vagy egy metilén-dioxi-csoporttal; β-2- és 3tienil-alanin, β-2- és 3-fiiril-alanin, β-2-, 3- és 4-piridilalanin, β-(όεηζοΰεηί1-2- és 3-il)-alanin, β-(1- és 2naftil)-alanin; a szerin, treonin vagy tirozin O-alkilezett származékai, S-alkilezett cisztein, S-alkilezett homocisztein, a tirozin Ο-szulfát-, O-foszfát- és O-karboxilát-észterei, 3- és 5-szulfo-tirozin, 3- és 5-karboxi-tirozin, 3- és 5-foszfo-tirozin, a tirozin 4-metánszulfonsavésztere, a tirozin 4-metánfoszfonsav-észtere, 4-fenilecetsav, 3,5-dijód-tirozin, 3- és 5-nitro-tirozin, ε -alkillizin, δ-alkil-omitin és bármely fenti aminosav D-izomerje. Ha nem jelezzük specifikusan, akkor a leírásban előforduló valamennyi aminosav L-formában van.

A vegyületek, amelyeket a leírásban mint tirozin-Oszulfátot, Tyr(OSO₃H)-t és tirozin-O-szulfát-észtert említünk, azonosak, és a (II) képletnek felelnek meg.

Azok a vegyületek, amelyeket a leírásban mint Tyr(SO_sH)-t, 3-szulfo-tirozint és 5-szulfo-tirozint említünk, azonosak, és a (III) képletnek felelnek meg.

A leírásban a „beteg” kifejezés bármely emlősre, elsősorban emberekre vonatkozik.

A leírásban használt „anionos aminosav” kifejezés méta-, para- vagy orto-helyzetben mono- vagy -diszubsztituált fenil-alanint, ciklohexil-alanint vagy tirozint tartalmazó negatív töltésű csoportot jelent, valamint S-alkilezett ciszteint, S-alkilezett homociszteint, γ-karboxi-glutaminsavat, ε-alkil-lizint, δ-alkil-omitint, glutaminsavat és aszparaginsavat. Anionos aminosavak például a tirozin-O-szulfát-, -O-foszfát- és -O-karboxilát-észterek, a

3- és 5-szulfo-tirozin, 3- és 5-karbo-tirozin, 3- és 5foszfo-tirozin, tirozin-4-metánszulfonsav-észter, tirozin4- metán-foszfonsav-észter, 4-fenil-ecetsav, 3,5-dijódtirozin, és a 3- és 5-nitro-tirozin.

A leírásban használt „katalitikus hely”, „aktív hely” és „aktív hely zseb” kifejezések mindegyike a trombin valamely vagy összes következő helyére vonatkozik:

a szubsztrátumot megkötő vagy „S,” helyre; a hidrofób kapcsolódó vagy „olajos” helyre; és arra a helyre, ahol egy szubsztrátum hasadása éppen végbemegy („charge relay site”).

A leírásban használt, bizonyos atomszámú vázból álló lánc (backbone chain) a kémiai szerkezet olyan részére vonatkozik, amely az egymás után következő kötések azon legkisebb számát definiálja, amely a kémiai szerkezet egyik végétől a másikig nyomon követhető. Az atomos komponensek, amelyek egy vázból álló láncot képeznek, bármely atomot jelenthetnek, amely legalább két másik atommal kötéseket tud képezni.

így például a (IV), (V), (VI) és (VII) képletű kémiai szerkezeteket 7 atomos vázból álló lánc jellemzi.

A leírásban a „számított hosszúság” kifejezés egy előre megállapítható méretre vonatkozik, ami abból adódik, hogy a láncot alkotó atomok közötti kötések hosszát összegezzük. A kötések hosszai bármely két adott atom között a szakterületen jól ismertek [például: CRC Handbook of Chemistry and Physics, 65th

HU 218 831 Β

Edition R. C. Weist, ed. CRC Press, Inc; Boca Raton, FL, pp. F-166-170 (1984)].

E találmány bejelentői analizálták a trombin/hirulog-8 komplex szerkezetét háromdimenziós röntgenkrisztallográfiával. A hirulog-8 egy inhibitor, amely a trombinnak mind az aniont megkötő külső helyéhez, mind a katalitikus helyéhez kapcsolódik. Képlete: (DPhe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)₄-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-GluIle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu. Ennek a vegyületnek a szintézisét a jelen bejelentés 1. példája ismerteti. A krisztallográfiai adatok több szerkezeti jellegzetességet feltártak a trombin aktív helyén és e körül, ami döntő volt a találmány szerinti javított trombininhibitorok megtervezésében.

Az egyik ilyen szerkezeti jellegzetesség a hidrofób „zseb” a trombinban, annak katalitikus centruma mellett. A hirulog-8-nál az N-terminális D-Phe-csoport, specifikusan az aminosav fenilgyűrűje, foglalja el ezt a helyet. A telítetlen gyűrűt telített gyűrűre cserélve, növelni lehet a trombinnal való lipofil kölcsönhatásokat, így növelve az inhibitorhatást.

A találmány egyik kiviteli alakja szerint a megszintetizált trombininhibitor az (I) képletnek felel meg, a képletben

X hidrogénatom vagy 1 -100 atomos vázból álló lánc; Rí szubsztituálatlan, mono-, di- vagy triszubsztituált, telített homociklusos vagy heterociklusos gyűrűszerkezetű csoport;

R₂ kötés vagy 1-5 atomos vázból álló lánc;

R₃ kötés vagy 1-3 atomos vázból álló lánc;

R₄ valamely aminosav;

R₅ valamely L-aminosav, amely guanidinium- vagy aminocsoportot tartalmazó oldallánccsoporttal rendelkezik;

R₆ nem amid kötés; és

Y 1-9 atomos vázból álló lánc.

L-aminosavak, amelyek guanidinium- vagy aminocsoportot tartalmazó oldallánccal rendelkeznek, az arginin, lizin és omitin.

A telített homociklusos vagy heterociklusos gyűrűszerkezet D-ciklohexil-alanin (D-Cha), monoszubsztituált D-Cha, diszubsztituált D-Cha vagy triszubsztituált D-Cha csoport [vagyis X aminocsoport; R! szubsztituálatlan, mono-, di- vagy triszubsztituált hexán; R₂ -CH₂-.CH-;

I és R₃ -C(=0)-]. A legelőnyösebben X aminocsoport; Rj hexán; R₂ -CH₂-.CH-, R₃ -C/=O/-; R₄ prolin; R₅ arginin és Y prolin. I

Az R₆ nem amid kötés jelenléte késlelteti vagy megakadályozza az inhibitor hasítását a trombin által. A nem amid kötésű komponens egy amidkötés kémiai módosításával képezhető. Ez a szakirodalomból jól ismert eljárásokkal elvégezhető [M. Szelke et al., „Potent New Inhibitors of Humán Renin”, Natúré, 299,555-57 (1982); D. H. Coy et al., „Facile Solid Phase Preparation of Proteins containing the CH₂-NH Peptide Bond Isostere and Application to the Synthesis of Somatostatin (SRIF) Ocatpeptide Analogues”, Peptides 1986, D. Theodropoulos, Ed., Walter Gruyter and Co., Berlin, pp. 143-146 (1987)]. Ha ily módon képezünk nem amid kötést, akkor előnyös, ha a kémiai módosítást azelőtt végezzük el, mielőtt a molekulának ezt a kötést tartalmazó részét a trombininhibitor többi részéhez hozzáadnánk. Ily módon a nem amid kötést tartalmazó részt egyetlen szintézisműveletben, egyszerre adhatjuk az inhibitor többi részéhez.

A legelőnyösebb kiviteli alakban R₅ Arg és Y Pro. Ennél a kivitelezésnél R₆ a természetben előforduló imidkötés, amit a trombin lassan hasít. Ez elkerülhetővé teszi a nem amid kötés előzetes kialakításának a szükségességét, és lehetővé teszi, hogy az Y-t és R^-ot az inhibitor többi részéhez, inkább egymás után mint egyszerre, hozzáadjuk.

A hirulog-8/trombin krisztallográfiai szerkezetének további vizsgálata kimutatta, hogy a hirulog-8 D-fenilalaninjához kapcsolódó prolin 3,46 Á távolságra volt a trombin Tyr76 hidroxicsoportjától. Mivel ez a távolság éppen elég ahhoz, hogy hidrogénkötések létesüljenek, egy olyan oldallánccsoporttal rendelkező aminosav behelyettesítése, amelyre jellemző, hogy hidrogénkötést tud felvenni körülbelül 5,5-9,5 pH-értéken a Pro-hoz ebben a helyzetben, növeli az inhibitor kötési affinitását.

A találmány egy előnyös kiviteli alakja szerint a megszintetizált trombininhibitor az (la) képletnek felel meg, a képletben

Rf szubsztituálatlan, mono-, di- vagy triszubsztituált gyűrűszerkezetű csoport;

R₂ kötés vagy 1-5 atomos vázból álló lánc;

R₃ kötés vagy 1-3 atomos vázból álló lánc;

R₄’ valamely aminosav, olyan oldallánccsoporttal, amelyre jellemző, hogy körülbelül 5,5-9,5 pHértéken hidrogénkötést tud felvenni;

R₅ valamely L-aminosav, amely guanidinium- vagy aminocsoportot tartalmazó oldallánccsoporttal rendelkezik;

R_fi nem amid kötés; és

Y 1-9 atomos vázból álló lánc.

Az oldallánccsoportot tartalmazó aminosavak, amelyekre a jellemző, hogy körülbelül 5,5-9,5 pH-értéken hidrogénkötést tudnak felvenni, a szakterületen jól ismertek. Ilyen például a hisztidin (amely imidazóliumnitrogént tartalmaz), a tioprolin (amely tiolcsoportot tartalmaz) és az izonipekotinsav (amely karboxilát-oldalcsoportot tartalmaz), amelyek mindegyikéről ismert, hogy 5,5-9,5 pH-értéken hidrogénkötés-akceptorok.

A találmány szerint előállított még előnyösebb trombininhibitorok az Rf helyzetben szubsztituálatlan, mono-, di- vagy triszubsztituált hexánt tartalmaznak. A legelőnyösebben X aminocsoport, Rf hexán, R₂ -CH₂-.CH-,

R₃-C(=O)-, és az X, Rf, R₂ és R₃ által képezett aminosav D-konfigurációban van (vagyis D-Cha).

A találmány szerint előállított trombininhibitorok egy másik előnyös kiviteli alakban tartalmaznak még egy, a trombin aniont megkötő külső helyéhez kapcsolódó csoportot (anion binding exosite associating moiety=ABEAM) és egy összekötő részt (linkért),

HU 218 831 Β amely egyik végén az Y-hoz, a másikon az ABEAMhoz kapcsolódik.

Ebben a kivitelezésben az inhibitor összekötő része (linker) hidat képez a CSDM és az ABEAM között. Ennek megfelelően inkább a linker hossza, mint a szerkezete elsőrendű fontosságú. A láncváz számított hosszának - ami jellemző a linkerre - legalább körülbelül 18 Á-nek kell lenni - ez a távolság a trombin katalitikus helye és az aniont megkötő külső helye között -, de kevesebbnek, mint körülbelül 42 Á.

A linker láncváza tartalmazhat bármely atomot, amely legalább két másik atomhoz tud kapcsolódni. A láncváz előnyösen az oxigén-, szén-, nitrogén- és kénatomok kémiailag megfelelő bármely kombinációjából áll. A szakember tudja, hogy a fenti váz atomjainak mely kombinációja esik a különböző kötések közötti ismert távolságokon alapuló kívánt hosszba [például: R.

T. Morrison and R. N. Boyd, Organic Chemistry, 3rd Edition, Allyn and Bacon, Inc., Boston, Massachusetts (1977)]. Egy előnyös kiviteli alakjában a linker egy peptid, amelynek aminosav-szekvenciája: Gly-GlyGly-Asn-Gly-Asp-Phe. Az ABEAM komponenshez kapcsolódó aminosav előnyösen a fenil-alanin.

Ezeknek az előnyös trombininhibitoroknak a harmadik része az ABEAM, amely a trombin aniont megkötő külső helyéhez kapcsolódik. Az ABEAM előnyösen a (VIII) általános képletnek felel meg, a képletben

W kötés;

Bj anionos aminosav;

B₂ valamely aminosav;

B₃ Ileu, Val, Leu, Nleu vagy Phe;

B₄ Pro, Hyp, 3,4-dehidroPro, tiazolidin-4-karboxilát,

Sár, valamely N-metil-aminosav vagy D-Ala;

B₅ anionos aminosav;

B₆ anionos aminosav;

B₇ lipofíl aminosav, így Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile,

Val, Cha, Pro vagy egy dipeptid, amely egy fenti lipofíl aminosavat és valamely más aminosavat tartalmaz;

B₈ kötés vagy peptid, amely 1-5 aminosavcsoportot tartalmaz; és

Z hidroxicsoport vagy 1-6 atomos vázból álló lánc.

Azt találtuk, hogy azok a peptidek, amelyek a hirudin karboxi-terminális végének homológjai, a trombinon az aniont megkötő külső helyhez kapcsolódnak [314 756 sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés; és J. M. Maraganore et al., „Anticoagulant Activity of Synthetic Hirudin Peptides”, J. Bid. Chem., 264,8692-98 (1989); amelyeket a leírásba referenciaként beépítünk].

Egy találmány szerinti előnyös kiviteli alaknál az ABEAM azonos a hirudin 56-64. aminosavaival, vagyis: B,=Glu; B₂=G1u; B₃=Ile; B₄=Pro; B₅=G1u; B₆=G1u; B₇=Tyr-Leu, Tyr(SO₃H)-Leu, Tyr(OSO₃H)Leu vagy (3,5-dijód-Tyr)-Leu; B₈ kötés; és Z hidroxilcsoport. Meg kell jegyeznünk, hogy a természetes hirudin a 63. helyen Tyr(OSO₃H) csoportot tartalmaz. Azok a karboxi-terminális csoporttal rendelkező hirudin-peptidek azonban, amelyek Tyr(SO₃H) csoportot tartalmaznak, ugyanolyan antikoaguláns hatást mutatnak, mint azok, amelyek a természetes Tyr(OSO₃H) csoportot tartalmazzák [314 756 sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés].

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott más ABEAM komponensek tartalmazhatják bármely molekulának azon részeit, amelyekről tudott, hogy a trombin aniont megkötő helyéhez kapcsolódnak. Ezek a Faktor V. 1675-1636 aminosavai, a trombocita glikoprotein lb 272-285 aminosavai, a trombomodulin 415-428 aminosavai, a protrombin 2. fragmentum 245-259 aminosavai és a fibrinogén Aa-lánc 30-44 aminosavai. Ezenkívül az ABEAM komponens lehet bármely hirudinpeptid-analóg, amelyek a szakirodalomból ismertek [J. L. Krstenansky et al., „Development of MDL28,050 A Small Stable Antithrombin Agent Based On A Functional Domain of the Leech Protein, Hirudin”, Thromb, Haemostas., 63, 208-14 (1990)], elsősorban azok, amelyek az Asp-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-GluGlu-Ala-Cha-(D-Glu) szekvenciát tartalmazzák.

A találmány szerinti trombininhibitorok a szakterületen jól ismert különböző eljárásokkal szintetizálhatok. Ezek szerves kémiai szintézisek, szilárd fázisú peptidszintézisek, oldatfázisú peptidszintézisek vagy ezeknek a módszereknek a kombinációi. Némely találmány szerinti inhibitor részei szintén előállíthatok egyéb módszerekkel, így a természetes vagy rekombináns hirudin enzimatikus hasításával vagy rekombináns DNS-technikákkal. Ezek a részek azután az inhibitor szintetikus úton előállított részeihez kapcsolhatók, s így kapjuk a találmány szerinti végterméket. A szintézises eljárás megválasztása természetesen függ a speciális inhibitor összetételétől.

A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint a trombininhibitort vegyes, heterolog/szilárd fázisú eljárással szintetizáljuk. Ez az eljárás magába foglalja a molekula egész peptidrészének vagy legnagyobb részének a szilárd fázisú szintézisét, majd a nem aminosavkomponensek hozzáadását, amelyeket oldatfázisú eljárásokkal szintetizálunk. A nem aminosavat, a peptidrészhez szilárd fázisú vagy oldatfázisú eljárásokkal kapcsolhatjuk. Hasonlóképpen, bármely visszamaradó peptides rész bevihető szilárd fázisú vagy oldatfázisú módszerekkel. Ez képezi ezeknek a molekuláknak kereskedelmi mennyiségekben való előállításánál a leginkább költségkímélő eljárásokat.

Ha a találmány szerinti trombininhibitor „nemprotein” aminosavakat tartalmaz, akkor ezeket közvetlenül hozzáadhatjuk a hosszabbodó lánchoz a peptidszintézis alatt vagy pedig ezeket a komplett, szintetizált peptid kémiai módosításával állítjuk elő, attól függően, hogy milyen jellegű a szükséges „nem-protein” aminosav. A kémiai szintézisek területén gyakorlott szakember tudni fogja, hogy mely „nem-protein” aminosavak adhatók közvetlenül a lánchoz és melyeket kell szintetizálni a komplett peptid kémiai módosításával a peptidszintézis után.

A találmány szerinti molekulák erős antikoaguláns hatással rendelkeznek. Ez a hatás in vitro vizsgálható, a szokásos eljárásokat használva. Az antikoaguláns hatás

HU 218 831 Β vizsgálata előnyösen magába foglalja a molekula trombininhibitor hatásának közvetlen meghatározását. Ezek az eljárások mérik kolorimetriás szubsztrátumok trombin által katalizált hasításának gátlását, vagy még előnyösebben a humán plazma trombinidőinek növekedését vagy az aktivált parciális tromboplasztinidőknek a növekedését. Az utóbbi vizsgálat méri a faktorokat a koagulálás valódi útján. Az alkalmazott vizsgálathoz használhatunk tisztított trombint és fibrinogént, az A vagy B fibrinopeptidek felszabadulásának gátlását radioimmunoassay-vel (RIA) vagy ELISA-val mérve.

A találmány szerinti molekulák trombocitaromboló hatását szintén mérhetjük a számos hagyományos trombocitavizsgálat egyikével. A vizsgálat előnyösen méri a trombociták aggregációs fokának változását vagy egy trombocitakiválasztó komponens felszabadulásának változását trombin jelenlétében. Az elsőt aggregométerben mérhetjük. Az utóbbit a kiválasztott komponensre specifikus RIA vagy ELISA technikákkal mérhetjük.

A találmány szerinti molekulák használhatók készítményekben, kombinációkban és eljárásokban, a trombin által közvetített és a trombinnal kapcsolatos funkcióknak és folyamatoknak tulajdonítható különböző betegségek kezelésére és megelőzésére. Ilyen betegségek a szívizominfarktus, gutaütés, tüdőembólia, mélyvénás trombózis, perifériás artériás elzáródás, restenosis artériás sérülés vagy invazív kardiológiai folyamatok után, akut vagy krónikus ateroszklerózis, ödéma és gyulladások, különféle sejtszabályozó folyamatok (például kiválasztás, alakváltozások, burjánzás), rák és metasztázisok és a neurodegeneratív betegségek.

A találmány szerinti trombininhibitorokból készítmények állíthatók elő, a gyógyszerkészítmények előállításához szokásos hagyományos eljárásokat használva, így egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozó hozzáadásával. A készítményeket és az ezeket alkalmazó módszereket használhatjuk betegeknél trombózisos betegségek kezelésére és megelőzésére.

A találmány egy másik kiviteli módja szerint a trombininhibitorok alkalmazhatók kombinációkban, készítményekben és eljárásokban, trombózisos betegségek kezelésére, és a trombolitikus szer dózisának a csökkentésére, ami reperfuzió létesítéséhez vagy az újbóli elzáródás megelőzésére szükséges a betegnél.

A találmány szerinti trombininhibitorok használhatók továbbá kombinációkban, készítményekben és eljárásokban a reperfúziós idő csökkentésére vagy az újraelzáródás időpontjának a kitolására trombolitikus szerrel kezelt betegeknél. Ezek a kombinációk és készítmények egy találmány szerinti trombininhibitor gyógyszerészetileg hatásos mennyiségét és egy trombolitikus szer gyógyszerészetileg hatásos mennyiségét tartalmazzák.

Ezekben a kombinációkban és készítményekben a trombininhibitor és a trombolitikus szer egymást kiegészítve hatnak a vérrögök feloldására, s így csökkentik a reperfúziós időt és növelik az újraelzáródás beállásának idejét az ezekkel kezelt betegekben. Specifikusan, a trombolitikus szer feloldja a rögöt, míg a trombininhibitor megakadályozza, hogy az újra felszabaduló, rög által befogott vagy röghöz kötött trombin regenerálja a rögöt.

A trombininhibitor használata a találmány szerinti kombinációkban és készítményekben előnyösen lehetővé teszi egy trombolitikus reagens beadását olyan dózisokban, amelyeket eddig túl alacsonynak tartottak ahhoz, hogy magában trombuszoldó hatású legyen. így elkerülhetők a trombolitikus szerek használatával járó bizonyos nemkívánatos mellékhatások, például a vérzéses komplikációk.

A találmány szerinti kombinációkban és készítményekben alkalmazható trombolitikus szerek a szakterületen ismertek. Ilyen szerek például - nem korlátozó jelleggel - a szöveti plazminogén aktivátor, természetes forrásokból tisztítva, rekombináns szöveti plazminogén aktivátor, sztreptokináz, urokináz, prourokináz, anizolozott sztreptokináz plazminogén aktivátor komplex (ASPAC), állati nyálmirigy plazminogén aktivátor és a fenti anyagok bármelyikének ismert, biológiailag aktív származékai.

A leírásban használt „kombináció” kifejezés egyszeri dózisformát jelent, amely legalább egy találmány szerinti trombininhibitort és legalább egy trombolitikus szert tartalmaz; vagy többszörös dózisformát, amelynél a trombininhibitort és a trombolitikus szert külön adjuk be, de egyidejűleg; vagy egy olyan többszörös dózisformát, amelynél a két komponenst külön adjuk be, de egymás után. Az egymás utáni beadásnál a trombininhibitort a betegnek beadhatjuk körülbelül 5 órával korábbi vagy körülbelül 5 órával későbbi időtartam alatt mint a trombolitikus szert. A trombininhibitort a betegnek előnyösen a trombolitikus szer beadását megelőző vagy ezt követő 2 órás időtartam alatt adjuk be.

A trombininhibitor és a trombolitikus szer lehet egyetlen konjugált molekula formájában is. A két komponens összekapcsolását a szakterületen jól ismert standard térhálósító eljárásokkal végezhetjük. Az egyetlen molekula lehet egy rekombináns fúziós protein formájában is, ha mind a trombininhibitor, mind a trombolitikus szer peptides.

A találmány szerinti készítmények és kombinációk beadásához különböző dózisformákat alkalmazhatunk. Ez vonatkozik - korlátozás nélkül - a parenterális, orális és helyi beadásra. A találmány szerinti készítmények és kombinációk a betegeknek beadhatók bármely gyógyszerészetileg elfogadható dózisformában, beleértve az intravénás beadást, a bolust vagy a folyamatos infúziót, beadhatók továbbá intramuszkulárisan - beleértve a gerincoszlop melletti és az ízületek körüli beadást -, bőr alá vagy bőrbe adva, intraartikulárisan (ízületbe), intraszinoviálisan (ízületi nedvbe), intratekálisan (gerincvelőburokba), intralaesionálisan (sérülésbe), a periosteumba (csonthártyába), orálisan, nazálisán vagy helyileg. A találmány szerinti készítményeket és kombinációkat előnyösen helyi, nazális, orális vagy parenterális beadásra alkalmazzuk, de a legelőnyösebben parenterális beadásra.

A parenterális készítményeket a legelőnyösebben intravénásán, bolus formájában vagy mint folytonos in7

HU 218 831 Β fúziót adhatjuk be. Ha a trombininhibitort mint trombocitaromboló vegyületet akarjuk használni, akkor a folytonos infúzió az előnyös. Ha a trombininhibitort mint antikoagulánst akarjuk használni, akkor a bőr alá adott vagy intravénás bolus injekció az előnyös. A parenterális beadáshoz folyékony egységdózisformákat készítünk, amelyek egy találmány szerinti trombininhibitort és egy steril vivőanyagot tartalmaznak. A trombininhibitort szuszpendálhatjuk vagy feloldhatjuk, a vivőanyag és a speciális trombininhibitor jellegétől függően. Parenterális készítményeket általában úgy állítunk elő, hogy a trombininhibitort oldószerben feloldjuk, adott esetben más komponensekkel együtt, az oldatot szűréssel sterilizáljuk, majd megfelelő fiolákba vagy ampullákba töltjük és lezárjuk.

Az oldószerben előnyösen adjuvánsokat, így helyi érzéstelenítőket, konzerválószereket és pufferanyagokat is feloldunk. A készítményt a stabilitás növelése céljából megfagyaszthatjuk és liofilizálhatjuk.

Parenterális szuszpenziókat lényegileg hasonló módon állítunk elő, azzal az eltéréssel, hogy a hatóanyagot a vivőanyagban nem feloldjuk, hanem szuszpendáljuk. A készítmények sterilizálását előnyösen úgy végezzük, hogy azokat etilén-oxiddal kezeljük, mielőtt a steril vivőanyagban szuszpendálnánk. A készítménybe előnyösen bekeverünk egy felületaktív vagy nedvesítőszert, ami a komponensek egyenletes eloszlását megkönnyíti.

Az orális beadásra szolgáló tabletták és kapszulák tartalmazhatják a szokásos segédanyagokat, így kötőanyagokat, töltőanyagokat, hígítókat, tablettázószereket, síkosítószereket, a szétesést elősegítő szereket és nedvesítőszereket. A tablettákat a szakterületen jól ismert eljárásokkal bevonattal láthatjuk el. Megfelelő töltőanyagok, amelyek alkalmazhatók, a cellulóz, mannit, laktóz, és más hasonló anyagok. A szétesést elősegítő megfelelő anyagok - korlátozás nélkül - a keményítő, polivinil-pirrolidon és keményítőszármazékok, így a nátrium-keményítő-glikolát. Megfelelő síkosítóanyag például a magnézium-sztearát. Megfelelő nedvesítőszer a nátrium-lauril-szulfát.

A folyékony orális készítmények lehetnek vizes vagy olajos szuszpenziók, oldatok, emulziók, szirupok vagy elixírek formájában vagy lehetnek szilárd termékek, amelyeket felhasználás előtt vízben vagy más megfelelő vivőanyagban feloldunk vagy szuszpendálunk. A folyékony készítmények tartalmazhatják a szokásos adalékokat. Ilyen adalékok a szuszpendálószerek, így a szorbit, szirup, metil-cellulóz, zselatin, hidroxi-etil-cellulóz, karboxi-metil-cellulóz, alumínium-sztearát gél vagy hidrogénezett étkezési zsírok; emulgeálószerek, így a lecitin, szorbitán-monooleát, polietilén-glikolok vagy akácmézga; nemvizes vivőanyagok, így a mandulaolaj, ffakcionált kókuszdióolaj és olajos észterek; és konzerválószerek, így metil- vagy propil-p-hidroxi-benzoát vagy szorbinsav.

A helyi beadásra szolgáló készítmény lehet például vizes zselé, olajos szuszpenzió vagy emulgeált kenőcs formájában.

A trombininhibitor dózisa és dózisaránya különböző faktoroktól függ, így a beteg nagyságától, az alkalmazott specifikus gyógyszerkészítménytől, a kezelés tárgyától, vagyis, hogy terápiáról vagy megelőzésről van szó, a kezelésre szoruló trombózisos betegség jellegétől és a kezelő orvos megítélésétől.

A találmány szerint a találmány szerinti trombininhibitor gyógyszerészetileg hatásos, előnyös napi dózisa a kezelésre szoruló betegnél körülbelül 0,5 nmol/kg testtömeg és körülbelül 2,5 pmol/kg testtömeg között van. Olyan kombinációknál, amelyek tartalmaznak egy trombolitikus szert, a trombolitikus szer gyógyszerészetileg hatásos napi dózisa a szokásos dózistartománynak körülbelül 10-80%-a. A trombolitikus szer „szokásos dózistartománya” a napi dózis, amit akkor alkalmaznak, ha a szert monoterápiában adják be [Physician’s Desk Reference 1989, 43rd Edition, Edward R. Bamhart, publisher]. Ez a szokásos dózistartomány természetesen függ az alkalmazott trombolitikus szertől. A szokásos dózistartományok például a következők: urokináz 500 000-6 250 000 egység/beteg; sztreptokináz 140 000-2 500 000 egység/beteg; tPA (szöveti plazminogén aktivátor) 0,5-5,0 mg/kg testtömeg; ASPAC 0,1-10 egység/kg testtömeg.

A találmány szerinti terápiás és profilaktikus készítmények a legelőnyösebben a trombininhibitor körülbelül 5-250 nmol/kg testtömeg dózisát tartalmazzák. A legelőnyösebb kombinációk ugyanezt a trombininhibitor mennyiséget tartalmazzák és a trombolitikus szer szokásos dózistartományának körülbelül 10-70%-át. Meg kell jegyeznünk, hogy mind a találmány szerinti trombininhibitor, mind a kombinációkban jelen lévő trombolitikus szer gyógyszerészetileg elfogadható napi dózisa lehet kisebb vagy nagyobb a fent említett specifikus tartományoknál.

Ha a beteg állapotában javulás állt be, akkor szükség esetén egy találmány szerinti kombináció vagy készítmény fenntartó dózisát adjuk be. Ezután a dózis vagy a beadás gyakorisága vagy mindkettő a szimptómáktól függően csökkenthető egy olyan szintre, amelynél a javuló állapot megmarad. Ha a szimptómák a kívánt szintre csökkentek, a kezelést abbahagyhatjuk. A betegeknek azonban szükségük lehet közbeeső kezelésre, ha a betegség szimptómái újra jelentkeznének.

A találmány egy másik kiviteli módja szerint a trombininhibitorokat használhatjuk készítményekben és eljárásokban invazív eszközök felületének bevonására, ami csökkenti a rögképződés kockázatát az ilyen eszközöket kapó betegeknél. Az eszközök, amelyek felülete a találmány szerinti készítményekkel bevonhatók, például a protézisek, mesterséges billentyűk, értranszplantációk, horgok és katéterek. Ezeknek az eszközöknek a bevonására szolgáló eljárások és készítmények a szakember számára ismertek. Ezek az eljárások a trombininhibitort tartalmazó készítmények kémiai térhálósrtását vagy fizikai adszorpcióját jelentik az eszközök felületén.

A találmány egy következő kiviteli módja szerint a trombininhibitorok alkalmazhatók trombusok ex vivő kimutatására, a betegben. Ebben az esetben a trombininhibitort radioizotóppal jelezzük. A radioizotóp megválasztása számos jól ismert faktoron alapszik, ilyenek

HU 218 831 Β például a toxicitás, a biológiai félidő és a kimutathatóság. Előnyös radioizotópok - nem korlátozó értelemben - a ¹²⁵I, ¹²³I és ^1HIn. A trombininhibitor jelzésére szolgáló eljárások a szakterületen jól ismertek. A radioizotóp legelőnyösebben a ¹²³I, és a jelzést a ¹²³I-Bolton-Hunter reagens alkalmazásával végezzük. A jelzett trombininhibitort beadjuk a betegnek és hagyjuk, hogy az a rögben lévő trombinhoz kapcsolódjék. Ezután a rögöt megfigyeljük, jól ismert kimutatási eszközöket használva, mint amilyenek egy computeres leképezőrendszerhez kapcsolt, a radioaktivitást mérni tudó kamera. Ez az eljárás képeket ad a trombocitákhoz kapcsoló trombinról és meizotrombinról is.

A találmány szerint előállított trombininhibitorokat tartalmazó gyógyszerkészítményeket felhasználhatjuk tumor-metasztázisok kezelésében is. A találmány szerinti trombininhibitorok hatásosságát tumor-metasztázisok kezelésében a metasztázisok növekedésének a gátlása igazolja. Ez azon alapszik, hogy bizonyos rákos sejtekben jelen van egy prokoaguláns enzim. Ez az enzim aktiválja az X faktor át alakulását Xa faktorrá a koagulációs folyamatban, ami a fibrin lerakódását eredményezi, és ez szubsztrátumként szolgál a tumomövekedéshez. A fibrin lerakódására a trombin gátlásával inhibitorhatást gyakorolva, a találmány szerinti molekulák hatásos metasztázisos tumorok elleni szerek. A találmány szerinti trombininhibitorokkal kezelhető metasztázisos tumorok - korlátozás nélkül - az agyrák, májrák, tüdőrák, csontrák és a daganatos plazmasejtrák.

A találmány szerint előállított trombininhibitorokat tartalmazó gyógyszerkészítményeket felhasználhatjuk az endoteliális sejtek trombin által előidézett aktiválásának gátlására. Ez az inhibitorhatás a trombocitákat aktiváló faktor (PAF) szintézisének az endoteliális sejtek által történő visszaszorítását jelenti. Ezeknek a készítményeknek és eljárásoknak fontos szerepe van a trombin által előidézett olyan gyulladás betegségek és ödéma kezelésében, amelyeket valószínűleg a PAF közvetít. Ilyen betegségek - korlátozás nélkül - a felnőttkori légzési elégtelenség szindróma, szeptikus sokk, szepszis és reperfuziós ártalom.

A szeptikus sokk korai fázisai magukba foglalják a különálló, akut gyulladásos és koagulopátiás (a véralvadás zavara) reakciókat. Korábban megmutatkozott, hogy babuinoknak élő E. coli halálos dózisát injekcióban beadva, ez jelentősen csökkenti a neutrofilek számát, a vérnyomást és a hematokritot. A vérnyomás és a hematokrit változásai részben a disszeminált intravaszkuláris koagulopátia,létrejöttének a következményei, és megmutatkoznak a fibrinogén párhuzamos fogyásában [F. B. Taylor et al., „Protein C Prevents the Coagulopathic and Lethal Effects of Escherichia coli Infusio in the Baboon”, J. Clin. Invest., 79, 918-25 (1987)]. A neutropénia annak a súlyos gyulladásos reakciónak a következménye, amit a szeptikus sokk idéz elő, és aminek eredménye a tumor nekrózis faktor szintek jelentős növekedése. A találmány szerinti trombininhibitorok használhatók készítményekben és eljárásokban a disszeminált intravaszkuláris koagulopátia kezelésére és megelőzésére, szepszis és más betegségek esetében.

A találmány szerint előállított trombininhibitorok vagy az ezeket tartalmazó készítmények alkalmazhatók továbbá antikoaguláns szerekként extrakorporális vérhez. A leírásban az „extrakorporális vér” kifejezés jelenti a páciensből közvetlenül levett vért, amit extrakorporális kezelésnek vetünk alá, majd a betegbe visszavezetjük, mint például a dialízises műveletekben, vérszűrésnél vagy vér „bypass” esetén sebészeti beavatkozásoknál. A kifejezés vonatkozik a vértermékekre is, amelyeket extrakorporálisan tárolunk a betegeknek való esetleges beadásra és a betegből különféle vizsgálatok elvégzésére levett vérre. Ezek az anyagok magukba foglalják a teljes vért, a plazmát vagy bármely vérfrakciót, amelyben a koagulálást meg akarjuk gátolni.

A trombininhibitor mennyisége vagy koncentrációja az ilyen típusú készítményekben a vér térfogatán alapszik, amit kezelni fogunk vagy előnyösebben annak trombintartalmán. A találmány szerinti trombininhibitor hatásos mennyisége extrakorporális vér koagulálásának megelőzésére előnyösen körülbelül 0,5 nmol/60 ml extrakorporális vér és körülbelül 2,5 pmol/60 ml extrakorporális vér között van.

A találmány szerint előállított trombininhibitorok használhatók a röghöz kapcsolódó trombin gátlására is, ami valószínűleg hozzájárul a rög összenövéséhez. Ez kiváltképpen fontos azért, mert az általában használt trombin elleni szerek, így a heparin és a kis molekulasúlyú heparin a röghöz kapcsolódó trombin ellen hatástalanok.

Végül, a találmány szerint előállított trombininhibitorok alkalmazhatók neurodegeneratív betegségek kezelésére alkalmas készítményekben és eljárásokban. Ismeretes, hogy a trombin neurit-reakciót okoz, ez a folyamat az agysejtek alakváltozásaiban a legömbölyödést stimulálja, és ez neurodegeneratív betegségeket okoz, így az Alzheimer-kórt és a Parkinson-kórt.

Az ismertetett találmány teljes megértésére szolgálnak az alábbi példák. A példák szemléltető jellegűek, a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. példa

Trombininhibitor modell, amely blokkolni tudja a trombin katalitikus helyét és a kapcsolódást az aniont megkötő külső helyhez

A karboxi-terminális hirudin-peptidek hatásosan blokkolják a trombin által katalizált fibrinogén-hidrolízist, de nem a kromogén szubsztrátum hidrolízisét [J. M. Maraganore et al., J. Bioi. Chem., 264, 8692-98 (1989)]. Ezenkívül a hirudin-peptidek nem semlegesítik az V. és VIII. faktor trombin által katalizált aktiválását [J. W. Fenton, II, et al., „Hirudin Inhibition by Thrombin”, Angio. Archív. Bioi., 18,27 (1989)].

A hirudin-peptidek, így a Tyr_ö-O-szulfát-N-acetilhirudin53_₆₄ („hirugén”) erős inhibitorhatást mutatnak in vitro a trombociták trombin által előidézett aktiválására [J. A. Jakubowski and J. M. Maraganore, „Inhibition of Thrombin-Induced Piatelet Activities By A Synthetic 12 Amino Acid Residue Sulfated Peptide (Hirugen)”, Blood, 1213 (1989)]. Mindamellett egy trombininhibitomak, amely képes blokkolni az aktív helyet, gátolni

HU 218 831 Β kell a trombocita-trombózist in vivő, ha az V. és VIII. faktorok aktiválása kritikus és a sebességet korlátozó folyamatok. Ez a konklúzió azokból az eredményekből származik, amelyeket a (D-Phe)-Pro-Arg-CH₂C1 irreverzíbilis trombininhibitorral [S. R. Hanson and L. A. Harker, „Interruption of Acute Platelet-Dependent Thrombosis by the Synthetic Antithrombin D-Phenylalanyl-LProlyl-L-Arginyl-Chloromethyl ketone”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3184-88 (1988)] és más reverzibilis trombininhibitorokkal [J. F. Eidt et al., „Thrombin is an Important Mediator of Piatelet Aggregation in Stenosed Canine Coronary Arteries with Endothelial Injury”, J. Clin. Invest., 84,18-27 (1989)] értek el.

Felhasználva azt a fenti kutatási eredményt, hogy a hirudin-peptidek amino-terminálisa a Lys-149 mellett van, a trombinnak egy háromdimenziós modelljét [B. Fürié et al., „Computer-Generated Models of Blood Coagulation Factor Xa, Factor IXa, and Thrombin Based Upon Structural Homology with Other Serine Proteases”, J. Bioi. Chem. 257, 3875-82 (1982)] alkalmaztuk egy olyan szer kialakítására, amely: 1) a trombin aniont megkötő külső helyéhez kapcsolódik; és 2) blokkolni tudja a trombin aktív helyének „zsebét” és gátolni az ebben lévő katalitikus csoportok funkcióját.

Megállapítottuk, hogy a Lys-149 ε-aminocsoportjának minimális távolsága a Ser-195 β-hidroxilát-csoportjától 18-20 Á. Egy aminosavcsoport hosszúságát 3 Á-nek véve, úgy számítottuk, hogy legalább körülbelül 4-7 aminosavnak kell összekötni egy hirudin-peptidet, így a Tyr₆₃-O-szulfát-hirudin_{53 64}-et, egy olyan résszel, amely aktívhely-inhibitor szerkezetű. Összekötő részként (linker) a glicint terveztük be. Azért választottuk a glicint, hogy ezekhez az előkészítő kísérletekhez a linker legnagyobb flexibilitását biztosítsuk. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy más, kevésbé rugalmas biopolimer linkerek szintén használhatók.

A (D-Phe)-Pro-Arg-Pro szekvenciát választjuk mint aktívhely-inhibitort, mivel a trombin specifitást mutat az argininre mint P₃ aminosavra a szubsztrátum hasításánál. Az arginint (P,’ aminosav) követő prolin kötést létesít, amit a trombin nagyon lassan hasít. Terveztünk más peptideket is, a prolim szarkozil- vagy Nmetil-alanin-aminosavval helyettesítve vagy egy könnyen hasítható Arg-Gly kötést kémiailag redukálva.

2. példa

A hirulog-8 szintézise

A hirulog-8 szerkezete: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro(Gly)₄-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GluTyr-Leu-OH. A hirulog-8-at a szokásos szilárd fázisú peptid-szintézissel szintetizáltuk, Applied Biosystems 430 A peptid-szintetizálót használva. A pepiidet BOCL-Leucin-O-divinil-benzol gyantát alkalmazva szintetizáltuk. További terc-BOC-aminosavak, amelyeket használtunk (Peninsula Laboratories, Belmont, CA) a BOC0-2,6-diklór-benzil-tirozin, BOC-L-glutaminsav (γbenzil-észter), BOC-L-prolin, BOC-L-izoleucin, BOCL-fenil-alanin, BOC-L-aszparaginsav (β-benzil-észter), BOC-glicin, BOC-L-aszparagin, BOC-D-fenil-alanin és BOC-L-arginin. A szintézisnél nagyobb kitermelések elérése céljából a (Gly) linker szegmentumot két ciklusban, kézzel végezve kapcsoltuk a BOC-glicilglicinhez (Beckman Biosciences, Inc. Philadelphia, PA). A szintézis befejezése után a peptid összes védőcsoportját eltávolítottuk, és a divinil-benzol gyantától vízmentes hidrogén-fluorid(p-krezol) etil-metil-szulfát 10:1:1 térfogatarányú keverékével végzett kezeléssel elválasztottuk. A gyanta eltávolítása után a peptidet liofilizálással szárítottuk.

A nyers hirulog-8 tisztítását fordított fázisú nagynyomású folyadék-kromatográfíával végeztük, Applied Biosystem 151A folyadék-kromatográfiás rendszert és Vydac C₁₈ oszlopot (2,2x25 cm) használva. Az oszlopot 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó vízben egyensúlyba hoztuk, és a 0,1 %-os trifluor-ecetsavban 0-80%, növekvő acetonitril koncentrációt tartalmazó lineáris gradienssel eluáltuk, 4,0 ml/perc átfolyási sebesség mellett, 45 perc alatt történt az elválasztás. A távozó folyadék abszorpcióját 229 nm-en mértük, és a frakciókat összegyűjtöttük. 25-30 mg nyers hirulog-8-at tisztítottunk nagynyomású folyadék-kromatográfíával, így 15-20 mg tiszta peptidet kaptunk.

A tisztított hirulog-8 szerkezetét aminosav- és szekvenciaanalízissel igazoltuk. A peptidet vákuumban, 110 °C-on, 24 órán át 6n sósavval kezelve, aminosavhidrolizátumokat készítettünk. Ezután a hidrolizátumokat ioncserélő kromatográfiával analizáltuk, majd Beckman 6300 automata analizátort használva ninhidrines derivatizálást/kimutatást végeztünk. A szekvenciaanalízist ismert készülékek alkalmazásával végeztük (automated Edman degradation on an Applied Biosystems 470A gas-phase sequencer equipped with a Model 900A data system). A fenil-tiohidantoin (PTH) aminosavak analízisét az Applied Biosystems 120A PTH-analizátorral és PTH-C₁₈-oszloppal (2,1 χ 220 mm) végeztük.

3. példa

1- és 2-helyzetben szubsztituált hirulog modellek

A hirulog-8/trombin-komplex röntgenkrisztallográfiai szerkezetét a következő műveletekkel állapítottuk meg. Először előállítottunk megfelelő minőségű hirulog-8/trombin-komplex kristályokat, nagy felbontású diffrakciós minta készítése céljából. Ezután ezeket a kristályokat használva összegyűjtöttük a diffraktométer adatait. Végül meghatároztuk a hirulog-8/trombinkomplex háromdimenziós szerkezetét, molekuláris helyettesítési rotációs/transzlációs módszereket alkalmazva, a PPACK/trombin [W. Bode et al., „The Refined 1,9 Á Crystal Structure of Humán α-Thrombin: Interaction With D-Phe-Pro-Arg-Chloromethylketone and Significance of the Tyr-Pro-Pro-Trp Insertion Segment”, EMBO J., 8, 3467-75 (1989)] és a hirudin/trombin [T. J. Rydel et al., „The Structure of a Complex of Recombinant Hirudin and Humán aThrombin”, Science, 249, 277-80 (1990)] komplexek koordinátáit használva. Amint azt az 1. ábra mutatja a hirulog-8 trombinhoz kapcsolódó szerkezetét úgy oldottuk meg, hogy a CSDM (katalitikus helyre irányuló csoport) D-Phe-Pro-Arg szekvenciáját és az ABEAM (ani10

HU 218 831 Β ont megkötő külső helyhez kapcsolódó rész) Asp-PheGlu-Glu-Ile szegmentumát hagyjuk felbontani.

Az 1. ábrán a trombint fehér körök ábrázolják, kivéve az aktív helyét, amelyet sűrű pettyek jeleznek. A hirulog-8 körök ritkás pettyezésűek. A hirulog-8 bal oldali, a trombin aktív helyéhez legközelebb eső része a CSDM.

A jobb oldali része az ABEAM. A hirulog-8 többi aminosavát az 1. ábra nem mutatja, mivel az ezeknek megfelelő elektronsűrűség nem állapítható meg.

A hirulog-8/trombin szerkezet CSDM részének vizsgálata azt mutatta, hogy annak 1-helyzetű aminosava, a (D-Phe) a trombin His57, TyRóOA, TrpóOD, Leu99, Ile74 és Trp215 aminosavai által képezett hidrofób „zsebében” helyezkedik el. A D-Phe csoport szoros van dér Waals kapcsolatokat képez a Leu99, Ilel74 és Trp215 aminosavakkal (lásd 2. ábra). A 2. ábrán a trombint egybefüggő, a hirulog-8-at szaggatott vonalak jelzik. A D-Phe csoport elhelyezkedése a „zsebben” valószínűvé tette, hogy a szubsztitúciók az 1-helyzetben, amelyek elősegítik a liofil kapcsolódásokat, a CSDM csoport megnövekedett kötési affinitásához vezetnek a találmány szerinti trombininhibitorokban. Ezért a hirulog-8 D-Phe csoportját D-naftil-alaninnal (D-Npa) vagy D-ciklohexil-alaninnal (D-Cha) helyettesítettük, s így D-Npa-hirulog-8-át, illetve D-Cha-hirulog-8-at állítottunk elő.

Azt találtuk, hogy a hirulog-8 CSDM csoportjának kapcsolódása a trombin katalitikus helyéhez, magába foglal apoláros kölcsönhatásokat is, az inhibitor első prolinja (a D-Phe mellett) és a trombin „zsebét” képező His57, TyróOA és TrpóOD között (2. ábra). Azt találtuk továbbá, hogy a prolin 3,46Á távolságra van a trombin TyróOA fenolos hidroxicsoportjától (2. ábra). A 2. ábrán - mint már említettük - a trombint egybefüggő, a hirulog-8-at szaggatott vonalak jelzik.

Ennek a prolinnak a közelsége a trombin TyróOA csoportjához valószínűvé tette, hogy lehetséges hidrogénkötés létrejötte a kettő között. A prolint egy olyan aminosavval helyettesítve, amely hidrogénkötéseket tud létrehozni, a CSDM kötésének stabilitása a trombin aktív helyéhez növelhető. így tehát egy ilyen molekula inhibitorhatása is növekedne. Ezért a hirulog-8 prolinját L-hisztidinnel (His₂-hirulog-8), L-tioprolinnal (TPro2-hirulog-8) vagy izonipekotinsavval (Inp₂-hirulog-8) helyettesítettük. Ezeknek a szubsztitúcióknak mindegyike hidrogénakceptort létesített a találmány szerinti trombininhibitorok 2-helyzetében (R/ komponens) (vagyis egy imidazolium-nitrogént, egy tiolt, illetve egy karboxilátot).

4. példa

Az 1-helyzetben szubsztituált hirulogok szintézise

A D-Npa-hirulog-8-at ugyanúgy szintetizáljuk, mint a hirulog-8-at (2. példa), azzal az eltéréssel, hogy a szintézis utolsó ciklusában a D-Phe helyett BOC-D-naftilalanint (Bachem Inc., Torrance, CA) alkalmazunk. A DCha-hirulog-8-at hasonló módon állítjuk elő, a szintézis utolsó ciklusában BOC-D-ciklohexil-alanint (Bachem Biosciences, Philadelphia) használva.

Mindkét 1-helyzetben szubsztituált peptidet a 2. példában a hirulog-8-ra leírtak szerint tisztítjuk. A tisztított peptideket aminosav-analízissel és tömegspektroszkópiával (FAB-MS) azonosítjuk.

5. példa

A 2-helyzetben szubsztituált hirulogszármazékok előállítása

A 2-helyzetben szubsztituált következő származékokat szintetizáltuk: (D-Cha)-X-Arg-HPro-(Gly)₄-AsnGly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu vagy (D-Phe)-X-Arg-HPro-(Gly)₄-Asn-Gly-Asp-Phe-GluGlu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu, amelyekben X jelentése hisztidin, tioprolin vagy izonipekotinsav. Ezeket a petideket lényegileg a 2. és 4. példában leírtak szerint szintetizáljuk, azzal az eltéréssel, hogy a BOC-L-prolin helyett BOC-L-hidroxi-prolim (Bachem, Inc.) építünk be a szintézis 16. ciklusában, és a BOC-L-prolin helyett Boc-N-im-Cbz-L-hisztidint, Boc-L-tioprolint vagy BOC-izonipekotinsavat (valamennyi a Bachem Inc.től) a 18. ciklusban. A 4-helyzetben HPro-t használunk, hogy az inhibitornak a trombin általi hasításának sebességét lelassítsuk. A peptideket a 2. példa szerint vizsgáljuk és tisztítjuk.

6. példa

Az 1-helyzetben szubsztituált hirulogok trombin elleni hatásának vizsgálata

Összehasonlítottuk a Spectrozyme TH (tozil-GlyPro-Arg-p-nitro-anilid; American Diagnostica, New York, NY), a hirulog-8, a D-Cha-hirulog-8 és a D-Npahirulog-8 inhibitorhatását a trombin által katalizált hidrolízisre. Specifikusan, mértük a kezdeti sebességeket mindegyik indikátor jelenlétében és anélkül, 2,2-22 μΜ szubsztrátum-koncentrációtartományon keresztül. A trombin által katalizált hidrolízis sebességét Cary 19 spektrofotométeren 405 nm-nél mértük és az idő függvényében folyamatosan regisztráltuk. A kinetikát szobahőmérsékleten (25 + 1 °C), O,1M NaCl-ot tartalmazó 0,05M nátrium-borát pufferban (pH=8,4) végeztük.

Egy tipikus enzimreakcióhoz 1,0 ml puffért adtunk mind a mintát, mind a referenciaanyagot tartalmazó küvettákhoz. A spectrozyme TH (2,2-22 μΜ) bevitele előtt a mintát tartalmazó küvettához trombint (3,2 xlO^-9 M, végső koncentráció) és hirulogot (O4χ10⁸ M) adtunk. Közvetlenül a szubsztrátum hozzáadása után a mintát tartalmazó küvetta tartalmát műanyag pipettát használva összekevertük. A reakciót spektrofotometriásán követtük 5-15 percig.

A kezdeti sebesség fokát mindegyik szubsztrátumkoncentrációnál így fejeztük ki: hidrolizált spectrozyme TH mólok/mp/mol trombin. Ezt meghatároztuk a reakció kezdeti lineáris fázisa (a szubsztrátum totális hidrolízisének <15%-a) alatt, mérve a hidrolitikus reakció hajlását.

Ennek megfelelően Lineweaver-Burke görbéket szerkesztettünk, a kezdeti sebesség reciprokát a szubsztrátumkoncentráció reciproka ellenében ábrázolva. Az alábbiakban a hirulog-8-cal és a találmány sze11

HU 218 831 Β rinti származékokkal kapott inhibitorkonstansokat mutatjuk be.

Származék	ΐς, nM
hirulog-8	1,4
C-Cha-hirulog-8	0,12
D-Npa-hirulog-8	4,3
Amint az a fenti eredményekből látható a D-Phe he-

lyettesítése a hirulog-8-ban D-Cha csoporttal, a K; egy nagyságrendű, meglepő és nem várt csökkenését eredményezi. Ez a tapasztalat azt mutatja, hogy a D-Phe helyettesítése D-Cha csoporttal növeli a CSDM kötési affinitását a találmány szerinti inhibitorokban. Az, hogy a D-Npa-hirulog-8 nem csökkenti a Kj-t, azt jelzi, hogy egy a telített gyűrűszerkezet jelenléte okozza ebben a helyzetben a megnövekedett kötési affinitást. A D-Cha tartalmaz egy ilyen telített gyűrűt, míg a D-NPA telítetlen gyűrűt tartalmaz.

A 2-helyzetben az 5. példa szerinti szubsztitúciókat tartalmazó molekulák a Kj-et hasonló, meglepő és nem várt módon csökkentik.

7. példa

A j-szubsztituált hirulogok antikoaguláns hatása

Összehasonlítottuk a Tyr₆₃-O-szulfát-N-acetil-hirudin₅₃_₆₄ („hirugén”), a rekombináns hirudin (American Diagnostica), a hirulog-8 és a találmány szerinti 1helyzetben szubsztituált hirulogok antikoaguláns hatását, kevert, normál humán plazmát (George, King Biomedical, Overland Park, KA), és Coag-A-Mate XC készüléket (General Diagnostics, Organon Technica, Oklahoma City, OK) használva. A hatást feljegyeztük, az aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT) vizsgálatot alkalmazva, a gyártótól kapott kalcium-klorid- és foszfolipid-oldatok felhasználásával. Ezután rekombináns hirudint (American Diagnostica), hirulog-8-at, DCha-hirulog-8-at vagy hirugént adtunk az APTT meghatározására szolgáló tartályokba, 10-32,300 ng/ml végső koncentrációkban. A teljes térfogat 25 μΐ volt a 100 μ plazma hozzáadása előtt.

Amint az a 3. ábrán látható, a D-Cha-hirulog8 1 pg/μΙ koncentrációban az APTT-t a kontrollértékekre számítva 470%-kal meghosszabbította. Ez a növekedés lényegesen nagyobb volt, mint az ATPP-nek a hirugén, rekombináns hirudin vagy hirulog-8 által előidézett növekedése ugyanannál a koncentrációnál. így azonkívül, hogy D-Cha-hirulog-8 a hirulog-8-nál jobb trombin elleni hatást mutat in vitro, plazmavizsgálatokban lényegesen nagyobb antikoaguláns hatással rendelkezik, mint a hirulog-8.

Az 5. példában ismertetett, a 2-helyzetben szubsztituált molekulák az APTT-t jobban növelik, mint a hirulog-8.

Claims (18)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás (I) általános képletű katalitikus helyre irányuló trombininhibitorok előállítására, a képletben X jelentése hidrogénatom vagy 1-100 atomos vázból álló lánc;

   R| jelentése szubsztituálatlan, mono-, di- vagy triszubsztituált telített homociklusos vagy heterociklusos gyűrűszerkezetű csoport;

   R₂ jelentése kötés vagy 1-5 atomos vázból álló lánc; R₃ jelentése kötés vagy 1-3 atomos vázból álló lánc; R₄ jelentése valamely aminosav;

   R₅ jelentése valamely L-aminosav, amely guanidinium- vagy aminocsoportot tartalmazó oldallánccal rendelkezik;

   R₆ jelentése nem amid kötés; és

   Y jelentése 1-9 atomos vázból álló lánc, azzal jellemezve, hogy a peptidkémiában jól ismert módszerekkel a kívánt pepiidet megszintetizáljuk, és adott esetben a peptidszintézis során vagy után módosítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan trombininhibitorokat állítunk elő, amelyek képletében X jelentése aminocsoport, Rí jelentése szubsztituálatlan, mono-, di- vagy triszubsztituált hexán, R₂ jelentése -CH₂-CH= és R₃ jelentése -C(=O)- csoport.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a D-Cha-Pro-Arg-Pro aminosavszekvenciával rendelkező trombininhibitort állítjuk elő.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan trombininhibitorokat állítunk elő, melyek képletében R₄ jelentése hisztidin, tioprolin vagy izonipekotinsav.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás módosított trombininhibitorok előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan trombininhibitorokat állítunk elő, ahol

   a) az Y csoporthoz egy, 18-42 Á számított hosszúságú láncvázból álló összekötő (linker) csoport kapcsolódik; és

   b) a linkercsoporthoz egy, a trombin aniont megkötő külső helyéhez kapcsolódó rész kötődik.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aniont megkötő külső helyhez kapcsolódó rész a (VIII) általános képletnek felel meg, a képletben

   W jelentése kötés;

   Bi jelentése anionos aminosav;

   B₂ jelentése valamely aminosav;

   B₃ jelentése He, Val, Leu, Nle vagy Phe;

   B₄ jelentése Pro, Hyp, 3,4-dehidroPro, tiazolidin-4karboxilát, Sár, valamely N-metil-aminosav vagy D-Ala;

   B₅ jelentése anionos aminosav;

   B₆ jelentése anionos aminosav;

   B₇ jelentése egy lipofil aminosav az alábbiak közül: Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha, Pro vagy egy dipeptid, amely egy ilyen lipofil aminosavból és valamely más aminosavból áll;

   B_g jelentése kötés vagy egy peptid, amely 1-5 aminosavcsoportot tartalmaz; és

   Z jelentése hidroxilcsoport vagy 1-6 atomos vázból álló lánc.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan módosított trombininhibitort állítunk elő, ahol a (VIII) képletben Bj jelentése Glu; B₂ jelentése

   HU 218 831 Β

   Glu; B₃ jelentése Ile; B₄ jelentése Pro; B₅ jelentése Glu; B₆ jelentése Glu; B₇ jelentése Tyr-Leu, Tyr(SO₃H)-Leu vagy (3,5-dijódTyr)-Leu; B_g jelentése egy kötés és Z hidroxilcsoportot jelent.
8. 8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan módosított trombininhibitort állítunk elő, melynek képletében a linkercsoport láncváza szén, nitrogén, kén vagy oxigénatomok bármely kombinációjából áll.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe aminosavszekvenciájú linkercsoportot tartalmazó trombininhibitort állítjuk elő.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a D-Cha-hirulog-8 trombininhibitort állítjuk elő.
11. 11. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, amely trombin által közvetített funkciók gátlására szolgál betegekben vagy extrakorporális vérben, azzal jellemezve, hogy egy, 1-10. igénypontok bármelyike szerint előállított trombininhibitort gyógyszerészetileg elfogadható hordozó, hígító és/vagy egyéb adalékanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás módosított, egy radioizotópot is tartalmazó trombininhibitor előállítására, azzal jellemezve, hogy a megszintetizált trombininhibitort egy radioizotóppal jelezzük.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ¹²³1, ¹²⁵I vagy ¹¹'In radioizotópot alkalmazunk.
14. 14. Diagnosztikai készítmény fibrin- vagy vérlemezketrombusok ex vivő kimutatására (leképezésére), amely egy 1-10. igénypontok bármelyike szerint előállított trombininhibitort, egy radioizotópot és egy gyógyászatilag elfogadható puffért tartalmaz.
15. 15. Készítmény betegekbe behelyezésre kerülő invazív eszközök felületének bevonására, amely legalább egy 1-10. igénypontok bármelyike szerint előállított trombininhibitort és egy megfelelő puffért tartalmaz.
16. 16. Eljárás betegekbe behelyezésre kerülő invazív eszközök felületének bevonására, azzal jellemezve, hogy az eszköz felületét egy 15. igénypont szerinti készítménnyel érintkezésbe hozzuk.
17. 17. Eljárás trombózisos betegségek kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyászatilag hatásos kombinációk előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, 1-13. igénypontok bármelyike szerint előállított trombininhibitort és egy trombolitikus szert a gyógyszerészeti technológiában szokásosan alkalmazott hordozókkal, hígítókkal és/vagy egyéb adalékanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy trombininhibitorként D-Cha-hirulog-8-at és trombolitikus szerként tPA-t alkalmazunk.