HU217585B - Eljárás inzulin epszilon-aminocsoportjainak szelektív acilezésére - Google Patents
Eljárás inzulin epszilon-aminocsoportjainak szelektív acilezésére Download PDFInfo
- Publication number
- HU217585B HU217585B HU9800566A HU9800566A HU217585B HU 217585 B HU217585 B HU 217585B HU 9800566 A HU9800566 A HU 9800566A HU 9800566 A HU9800566 A HU 9800566A HU 217585 B HU217585 B HU 217585B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- insulin
- reaction
- fatty acid
- mixture
- ester
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 125
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 60
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 60
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 title claims description 37
- 230000010933 acylation Effects 0.000 title claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 90
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 45
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 30
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 25
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 25
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 25
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 21
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 20
- -1 fatty acid ester Chemical class 0.000 claims description 20
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 18
- WSXGQYDHJZKQQB-UHFFFAOYSA-N 3-pyridin-4-ylpropanoic acid Chemical group OC(=O)CCC1=CC=NC=C1 WSXGQYDHJZKQQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims description 14
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 claims description 6
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 claims description 3
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 101710114386 Insulin-like protein Proteins 0.000 abstract 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 abstract 1
- 229920001296 polysiloxane Chemical class 0.000 abstract 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 abstract 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 22
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 11
- KYVBNYUBXIEUFW-UHFFFAOYSA-N 1,1,3,3-tetramethylguanidine Chemical group CN(C)C(=N)N(C)C KYVBNYUBXIEUFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 6
- NQBRFIXRZDTIRQ-UHFFFAOYSA-N (4-methoxyphenyl)methyl n-diazocarbamate Chemical compound COC1=CC=C(COC(=O)N=[N+]=[N-])C=C1 NQBRFIXRZDTIRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 108700014273 acetylinsulin Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N (n-propan-2-yloxycarbonylanilino) acetate Chemical compound CC(C)OC(=O)N(OC(C)=O)C1=CC=CC=C1 ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZIDUCFPVYWSTCZ-SRAFPLAGSA-N CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc3cnc[nH]3)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc3ccccc3)NC(C)=O)C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc3cnc[nH]3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc3ccc(O)cc3)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc3ccc(O)cc3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccccc2)C(=O)N[C@@H](Cc2ccccc2)C(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC1=O)C(C)C Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc3cnc[nH]3)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc3ccccc3)NC(C)=O)C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc3cnc[nH]3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc3ccc(O)cc3)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc3ccc(O)cc3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccccc2)C(=O)N[C@@H](Cc2ccccc2)C(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC1=O)C(C)C ZIDUCFPVYWSTCZ-SRAFPLAGSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LINDOXZENKYESA-UHFFFAOYSA-N TMG Natural products CNC(N)=NC LINDOXZENKYESA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- KEMQGTRYUADPNZ-UHFFFAOYSA-N heptadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O KEMQGTRYUADPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- SIFCHNIAAPMMKG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) acetate Chemical compound CC(=O)ON1C(=O)CCC1=O SIFCHNIAAPMMKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XGFQVJQXCLZRFH-ZDUSSCGKSA-N (2s)-2-(dodecanoylamino)-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGFQVJQXCLZRFH-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVBJHQDHVYGQLS-UHFFFAOYSA-N 2-(dodecanoylamino)pentanedioic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O AVBJHQDHVYGQLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNIOKEMMSLHPKY-UHFFFAOYSA-N 3-hexanoyl-1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound CCCCCC(=O)C1CC(=O)N(O)C1=O BNIOKEMMSLHPKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101500025353 Homo sapiens Insulin A chain Proteins 0.000 description 1
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JWGGSJFIGIGFSQ-UHFFFAOYSA-N N-dodecanoylglycine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)NCC(O)=O JWGGSJFIGIGFSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Chemical class 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 229950004152 insulin human Drugs 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007040 multi-step synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011356 non-aqueous organic solvent Substances 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás prőinzűlin, inzűlin vagy valamelyinzűlinanalóg, amely szabad ?- aminőcsőpőrtőt és valamely szabad ?-aminőcsőpőrtőt tartalmaz, szelektív, egylépéses acilezésére telítettzsírsav alkalmazásával, melynek sőrán a prőinzűlint, inzűlint vagyinzűlinanalógőt valamely őldható, aktivált telített zsírsavészterrelpőlárős őldószerben reagáltatják, ahől a reakciót a) vízben vagy vízés szerves őldószer elegyében, 7 feletti pH-értéken, illetve b)szerves őldószerben, pH=7-nél magasabb értéken végzik. A találmányszerinti eljárás alkalmas módősítőtt inzűlin típűsú fehérjékelőállítására. ŕ
Description
A találmány tárgya proteinek acilezési eljárása. Részletesebben, a találmány tárgya egy reakciólépésből álló új eljárás, amellyel proinzulin, inzulin vagy valamely inzulinanalóg ε-aminocsoportját szelektíven acilezzük a szabad α-aminocsoport jelenlétében.
Az aminocsoportok acilezése az egyik legáltalánosabb eljárás, abból a célból, hogy proteineket kémiailag módosítsanak. Az acilezés általános eljárását írták le a Methods of Enzymology, 25:494-499. (1972) közleményben, amelynek során aktivált észtereket, savhalogenideket vagy savanhidrideket alkalmaznak. Az aktivált észterek, különösen a zsírsavak N-hidroxi-szukcinimid észterei különösen előnyösen alkalmazhatók arra a célra, hogy szabad aminosavat zsírsavval acilezzenek [Lapidot és munkatársai, J. of Lipid Rés., 8:142-145. (1967)]. Lapidot és munkatársai leírták az N-hidroxi-szukcinimid-észterek előállítását, illetve ezek alkalmazását az N-lauroil-glicin, N-lauroil-L-szerin és N-lauroil-L-glutaminsav előállításában történő alkalmazását.
Az inzulin aminocsoportjainak szelektív acilezési eljárásának kezdeti vizsgálatát írták le Lindsay és munkatársai [Biochem. J., 121:737-745. (1971)] közleményükben. Lindsay és munkatársai leírták az inzulin reaktivitását N-szukcinimidil-acetáttal szemben, amenynyiben alacsony reagenskoncentrációt és közel semleges pH-értéket alkalmaztak, és így két monoszubsztituált terméket nyertek, amelyek a PheB1-acetil-inzulin és a GlyA1-acetil-inzulin. Amennyiben pH=8,5 érték mellett végezték a reakciót, a kapott PheB1-acetilinzulin termék mennyisége csökkent, és LysB29-acetilinzulin is keletkezett. Lindsay és munkatársai azt a következtetést vonták le, hogy pH=6,9 érték mellett a reaktivitás sorrendje glicin (Al)=fenil-alanin (Bl) -> -> lizin (B29), és pH = 8,5 értéknél a reaktivitás sorrendje glicin (Al) -> fenil-alanin=lizin (B29).
A 3,869,437 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben Lindsay és munkatársai leírták a B1 aminosav acilezési reakcióját olyan acilcsoporttal, amely akár 7 szénatomot is tartalmaz, és kívánt esetben az A1- és/vagy B29-aminocsoportok blokkolási reakcióját egy olyan acilcsoporttal, amely maximálisan 4 szénatomot tartalmaz. Az N-hidroxi-szukcinimid-észterekről leírták, hogy különösen előnyösen alkalmazható acilezőszerek. Abból a célból, hogy minimális mennyiségű B1-aminocsoporton acilezett inzulinszármazékot nyerjenek, az acilezőszer alkalmazott mennyisége viszonylag alacsony (egy nem több mint két mólekvivalens acilezőszer). Ezen túlmenően, a B'-monoszubsztituált termék maximális termelését közel pH = 7 érték mellett nyerték. Amennyiben pH = 8,5-9,0 közötti értéket alkalmaztak, a kívánt B1acilezett termék hozama jelentősen csökken, és ehelyett további szubsztitúció történik az A1 és a B29 helyzetekben.
A 3,868,356 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben D. G. Smyth, valamint a 3,868,357 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben Smyth és munkatársai leírták az Nacilezett, O-szubsztituált inzulinszármazékokat, amelyekben az A1-, B1- vagy B29-aminosavcsoportok közül legalább egy blokkolt aminocsoporttá alakult. Az acilezést viszonylag kis felesleg acilezőszer alkalmazásával, például 2-3 mól acilezőszer aminocsoportonként, végezték, semleges vagy enyhén alkalikus pH, például 7-8 közötti pH-érték mellett. A reakció igen nagy termeléssel szolgáltatja a diszubsztituált származékot, amely az A1- és a B1-aminocsoportok reakciójának eredménye. Amennyiben felesleg acilezőszert alkalmaznak, például 10 mólekvivalens mennyiséget, a reakcióban ezen túlmenően a B29-aminocsoport is acileződik, és így diszubsztituált származékot nyernek.
Muranishi és Kiso az 1-254,699 számú japán szabadalmi bejelentésben leírta inzulin szelektív acilezését, és egy ötlépéses szintézist alkalmazott zsírsav-inzulinszármazékok előállítására. Az első reakciólépésben aktivált zsírsavésztert állítottak elő; a második reakciólépésben az inzulin aminocsoportjait p-metoxibenziloxi-karbonil-azid védőcsoporttal látták el (pMZ); a harmadik reakciólépésben az inzulin-pMZ-vegyületet a zsírsavészterrel reagáltatták; a negyedik reakciólépésben az inzulinról a védőcsoportokat eltávolították; és az ötödik reakciólépésben az acilezett inzulint izolálták, és tisztították. Ebben az eljárásban egy aminosav szelektív acilezését csak úgy érték el, amennyiben pMZvédőcsoportot alkalmaztak az összes többi aminocsoport védésére. A fenti eljárás alkalmazásával Muranishi és Kiso az alábbi vegyületeket állította elő: LysB29palmitoil-inzulin (az ε-aminocsoport acilezett), PheB1palmitoil-inzulin (az N-terminális α-aminocsoport a Bláncban acilezett), és a PheB1,LysB29-dipalmitoil-inzulin (az ε-aminocsoport és az N-terminális-a-aminocsoport egyaránt acilezett).
Hasonlóan a Hashimoto és munkatársai [Pharmaceutical Research, 6:171-176 (1989)] által leírt közleményükben négylépéses szintézist írtak le N-palmitoilinzulin előállítására. A szintézis védőcsoport-bevezetési és védőcsoport-eltávolítási lépést tartalmaz az N-terminális A'-glicinben, és az ε-aminocsoportban és B29lizinben, amely védőcsoport pMZ. A közleményben leírt körülmények között a fő acilezett termék a B1mono-palmitoil-inzulin és a B1,B29-dipalmitoil-inzulin.
Amint ezt fent ismertettük, a jelen találmány előtt a B29-Ns-aminocsoport szelektív acilezését védőcsoport bevezetésével, illetve annak eltávolításával végezték, és így az a-aminocsoportokat a reakció során védték.
A találmány tárgya szelektív egylépéses eljárás proinzulin, inzulin és inzulinanalógok ε-aminocsoportjának acilezésére. A vizsgálataink során meglepően azt tapasztaltuk, hogy lehetséges az egylépéses eljárásban az ε-aminocsoport szelektív acilezése igen magas termeléssel. A találmány szerinti eljárás kiküszöböli a védőcsoport bevezetésének szükségességét, illetve későbbi eltávolítási reakcióját a protein egyéb aminocsoportjain. A találmány szerinti eljárás hatásosabb és kevésbé drágább módszer ε-amino-acilezett inzulinszármazékok előállítására.
A találmány tárgya eljárás proinzulin, inzulin vagy valamely inzulinanalóg szelektív acilezésére, amely inzulinvegyület szabad ε-aminocsoportot és szabad
HU 217 585 Β α-aminocsoportot tartalmaz, és az eljárás során az acilezést zsírsavval végezzük úgy, hogy az ε-aminocsoportot oldható, aktivált zsírsavészterrel reagáltatjuk poláros oldószerben, bázikus körülmények között.
Mint korábban leírtuk, a találmány tárgya nagyon szelektív, egylépéses ε-aminocsoport acilezési eljárás proinzulin, inzulin vagy valamely inzulinanalóg esetében. A találmányban leírjuk azokat az előnyös reakciókörülményeket, amelyek során elsősorban az ε-aminocsoport acileződik, és az α-aminocsoportok sokkal kisebb mértékben acileződnek. Általában a monoacilezett-a-amino-csoport kisebb, mint 5% termeléssel keletkezik az eljárásban.
Az „inzulin” elnevezés alatt a leírásban humáninzulint, sertésinzulint vagy szarvasmarha-inzulint értünk. Az inzulin három szabad aminocsoportot tartalmaz: B'-fenil-alanin, A'-glicin és B29-lizin aminocsoportot. A szabad aminocsoportok az A1 és a B1 helyzetekben α-aminocsoportok. A szabad aminocsoport a B29 helyzetben ε-aminocsoport.
A leírásban a „proinzulin” elnevezés alatt egy megfelelően keresztkötött
B-C-A általános képletű proteint értünk, ahol az általános képletben
A az inzulin A-lánca, vagy ennek funkcionális származéka,
B jelentése az inzulin B-lánca, vagy ennek funkcionális származéka, amely ε-aminocsoporttal rendelkezik, és
C jelentése a proinzulin összekötő peptid része.
Előnyösen a proinzulin a humáninzulin A-lánca, a humáninzulin B-lánca, és egy semleges összekötő Cpeptid alkalmazásával épül fel. Amennyiben a proinzulin természetes szekvencia, a proinzulin három szabad aminocsoportot tartalmaz: B'-fenil-alanin (a-aminocsoport), C64-lizin (ε-aminocsoport) és B29-lizin (εaminocsoport).
Az „inzulinanalóg” elnevezés alatt a leírásban egy megfelelően keresztkötött
A-B általános képletű proteint értünk, ahol az általános képletben
A jelentése az inzulin A-lánc funkcionális származéka,
B jelentése az inzulin B-lánc, amely ε-aminocsoportot tartalmaz, funkcionális származéka.
Előnyös inzulinanalóg-vegyületek - az inzulint is beleértve -, ahol a B28 helyzetben található aminosavmaradék Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá, a B29 helyzetben található aminosavmaradék His vagy Asp, a B'° helyzetben található aminosavmaradék His vagy Asp, a B' helyzetben található aminosavmaradék Phe, Asp vagy elhagyott, vagy a B2 helyzetben található aminosavmaradékkal együttesen elhagyott, a B30 helyzetben található aminosavmaradék Thr, Alá vagy elhagyott, és a B9 helyzetben található aminosavmaradék Ser vagy Asp, azzal a feltétellel, hogy B28 vagy B29 helyzetek egyike Lys.
A szakember számára a szokásos biokémiai elnevezésekben az előnyös inzulinanalóg-vegyületek az alábbiak:
LysB28ProB29-humáninzulin (B28 jelentése Lys; B29 jelentése Pro);
AspB28-humáninzulin (B28 jelentése Asp);
AspB' -humáninzulin;
ArgB31 'B32-humáninzulin;
AspB 10-humáninzulin;
ArgA0-humáninzulin;
AspB 1 ,GluB 13-humáninzulin;
AlaB25-humáninzulin;
dez(B30)-humáninzulin és
GlyA2' -humáninzulin.
Az „acilezés” elnevezés alatt a leírásban azt értjük, hogy az inzulinban található szabad aminocsoportok közül egy vagy több aminocsoportra acilcsoportot vezetünk be kovalens kötés segítségével.
A „szelektív acilezés” elnevezés alatt a leírásban azt értjük, hogy az acilezés elsősorban az ε-aminocsoporton vagy csoportokon történik, és ez sokkal kisebb mértékben történik az α-aminocsoportokon. Általában szelektív acilezési reakció során a monoacilezett-c-aminocsoportot tartalmazó termék körülbelül ötszörös menynyiségű, mint a monoacilezett-a-amino-csoportot tartalmazó termék. Előnyösen ez az arány nagyobb mint 10, és legelőnyösebben nagyobb mint körülbelül 50.
A „zsírsav” elnevezés alatt 6-21 szénatomos zsírsavakat értünk. Az „aktivált zsírsavészter” elnevezés alatt olyan zsírsavat értünk, amelyet általános módszerrel aktiváltunk, amely módszereket leírtak a Methods of Enzymology, 25:494—499. (1972) és Lapidot és munkatársai, J. of Lipid Rés., 8:142-145. (1967) közleményekben. Az előnyösen alkalmazható telített zsírsavak, például a mirisztinsav (C14), pentadecilinsav (C15), palmitinsav (C16), heptadecilinsav (CI7) és sztearinsav (C18). Különösen előnyösen alkalmazható zsírsav a palmitinsav. Az aktivált zsírsavészter olyan származék lehet, amelyet például hidroxi-benzotriazid (HOBT), N-hidroxi-szukcinimid és ennek származékai segítségével képeztünk. Előnyös aktivált észter az N-szukcinimidil-palmitát.
Az „oldható” elnevezés alatt a leírásban azt értjük, hogy az észter megfelelő mennyisége oldatban található a folyékony fázisban ahhoz, hogy az inzulint, az inzulinanalóg-vegyületet vagy a proinzulint acilezze. Előnyösen a folyékony fázisban 1 mól inzulinra vonatkoztatva körülbelül 1-4 mólekvivalens aktivált észter van jelen.
A „bázikus körülmények” elnevezés alatt azt értjük, hogy a reakcióelegy 7 feletti pH-értékű.
A reakciót úgy kell végrehajtani, hogy gyakorlatilag valamennyi szabad aminocsoport deprotonált állapotú legyen. A vizes oldószerben, amely valamely oldószerkeverék, a bázikus körülmények azt jelentik, hogy a reakciót nagyobb, mint 9,0 pH-érték alkalmazásával végezzük. A nem vizes, szerves oldószer alkalmazása esetében a reakciót valamely bázis jelenlétében végezzük,
HU 217 585 Β amelynek bázicitása nagyobb vagy egyenlő mint 10,75 pKa-értékű, vízben.
A „keresztkötés” elnevezés alatt azt értjük, hogy a ciszteinmaradékok között diszulfidkötést hozunk létre. A megfelelően keresztkötött proinzulin, inzulin vagy inzulinanalóg három diszulfidhidat tartalmaz. Az első diszulfidhíd a 6 és a 11 A-lánchelyzetekben található ciszteinmaradékok között képződik. A második diszulfidhíd az A-lánc 7-helyzetében található, és a B-lánc 7helyzetében található ciszteinmaradékokat köti össze. A harmadik diszulfidhíd A-lánc 20-helyzetében található, és a B-lánc 19-helyzetében található ciszteinmaradékokat köti össze.
A találmány szerinti eljárás kidolgozása előtt az εaminocsoport szelektív acilezését védőcsoport felhasználásával végezték, többlépéses szintézisben. Az 1-254,699 számú japán szabadalmi bejelentésben Muranishi és Kiso egy ötlépéses szintézist írt le az acilezett inzulinszármazékok előállítására. Hasonlóan, Hashimoto és munkatársai, Pharmaceutical Research, 6:171-176. (1989) közleményükben négylépéses szintézist írtak le N-palmitoil-inzulin előállítására. Az inzulin szelektív acilezését mindkét esetben úgy végzik, hogy pMZ védőcsoportot alkalmaznak.
A találmány tárgya eljárás Νε-acilezett proinzulin, inzulin vagy inzulinanalóg nagy termeléssel történő előállítási eljárása szelektív, egylépéses szintézissel. A reakció lehetővé teszi Νε-acilezett fehéijék előállítását anélkül, hogy aminocsoport védőcsoportokat alkalmaznánk. Az acilezést úgy végezzük, hogy aktivált szelektív zsírsavésztert reagáltatunk a protein ε-aminocsoportjával bázikus körülmények között, poláros oldószerben. A gyengén bázikus körülmények alkalmazása esetében nem az összes szabad aminocsoport deprotonálódik, és jelentős acilezés történik az N-terminális aminocsoportokon. Vizes oldószerben, vagy félig vizes oldószerkeverékekben a bázikus körülmények alatt azt értjük, hogy a reakciót nagyobb mint 9,0 pH-érték mellett végezzük. Mivel a protein lebomlása is megtörténik 11,0 feletti pH-érték mellett, a reakcióelegy pH-értéke előnyösen
9,5-11,5 közötti, legelőnyösebben 10,5 érték. A pHmérés értéke adott reakcióelegy esetében, amennyiben szerves oldószert és vizes oldószert elegyítünk, a keverés előtt a vizes fázis pH-értéke.
Az 1. táblázatban bemutatjuk a bázicitás hatását a reakció szelektivitására. Az 1. táblázatban bemutatott adatokat humáninzulin esetében mértük, amelyet 2 mólekvivalens N-szukcinimidil-palmitáttal 50% CH3CN/víz oldószerelegyben acileztünk.
1. táblázat pH-hatás inzulin acilezésére
| Reakciótermékek | A termékek relatív mennyisége | ||
| pH=8,2 | pH=8,5 | pH=10,2 | |
| Humáninzulin | 85,2% | 12,5% | 1,6% |
| Monoacilezett A1 és B1 | 8,1% | 0,3% | 0,4% |
| Reakciótermékek | A termékek relatív mennyisége | ||
| pH=8,2 | pE=8,5 | pH=10,2 | |
| Monoacilezett B29 | 5,2% | 70,2% | 79,6% |
| Biszacilezett | 0,7% | 16,7% | 17,7% |
| Monoacilezett B29/monoacilezett Al és B1 tennék aránya | 0,64 | 234 | 199 |
Az 1. táblázat adatai azt mutatják, hogy az ε-aminocsoport acilezése a reakcióelegy bázicitásának függvénye. Nagyobb mint 9,0 pH-érték esetén a reakcióelegyben az ε-aminocsoport (B29-lizin) szelektíven acileződik.
A nemvizes oldószerben a reakciót bázis jelenlétében végezzük, amelynek bázicitása vízben mérve nagyobb vagy egyenlő mint 10,75 ρΚ,-érték. Ez biztosítja, hogy az ε-aminocsoport vagy csoportok megfelelő deprotonálódása megtörténjen. A bázis ebben az esetben legalább olyan erősségű legyen, mint a trietil-amin. Előnyösen bázisként tetrametil-guanidint (TMG), diizopropil-etil-amint vagy tetrabutil-ammónium-hidroxidot alkalmazunk.
Az alkalmazott poláros oldószer nagymértékben függ a proinzulin, az inzulin vagy az inzulinanalóg oldhatóságától, illetve a zsírsavészter oldhatóságától.
Az oldószer jelentős többségben teljesen szerves oldószer is lehet. Általában alkalmazható szerves oldószerek a dimetil-szulfoxid, dimetil-formamid és hasonló oldószerek. Alkalmazhatók továbbá vizes oldószerek, illetve vizes és szerves oldószerek keverékei is. A poláros oldószer megválasztása csak a reagensek oldhatóságának függvénye. Előnyösen alkalmazható oldószerek és oldószerelegyek a dimetil-szulfoxid, a dimetil-formamid, az acetonitril és a víz, az aceton és víz elegye, az etanol és víz elegye, az izopropanol és víz elegye, az izopropanol, etanol és víz elegye, és az etanol, propanol és víz elegye. Előnyösen alkalmazható oldószer az acetonitril és víz elegye, előnyösen 50% acetonitril/víz elegy. A szakember számára nyilvánvaló, hogy egyéb poláros oldószerek is alkalmazhatók.
A reaktánsok aránya nem döntő befolyású. Általában előnyösen az aktivált zsírsavésztert moláris feleslegben alkalmazzuk. Előnyösen a reakciót 1-4 mólekvivalens, előnyösebben 1-2 mólekvivalens észter alkalmazásával hajtjuk végre. A szakember számára nyilvánvaló, hogy igen nagy koncentrációjú aktivált észter alkalmazása esetén bisz- vagy triacilezett termék jelentős mennyisége keletkezik.
A reakció hőmérséklete nem döntő jelentőségű. A reakciót 0-40 °C hőmérséklet mellett végezzük, és általában 15 perc-24 óra időtartamon belül befejeződik.
Az acilezés befejeződésekor a reakciót leállítjuk, majd a terméket szokásos eljárásokkal, mint például reverz fázisú vagy hidrofób kromatográfia segítségével tisztítjuk. Ezt követően a terméket szokásos eljárások4
HU 217 585 Β kai, mint például fagyasztva szárítással vagy kristályosítással izoláljuk.
A proinzulin, inzulin és inzulinanalóg vegyületek számos peptidszintézis-eljárás alkalmazásával előállíthatok, amelyek lehetnek például a szokásos oldatbani eljárások, szilárd fázisú eljárások, félszintetikus eljárások, és újabban rekombinációs DNS-eljárások. Például a 383 472 számú, nyilvánosságra hozott EPO szabadalmi bejelentésben Brange és munkatársai, a 214,826 számú, nyilvánosságra hozott EPO szabadalmi bejelentésben, és az 5,304,473 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben Belagaje és munkatársai leírták különféle proinzulinok és inzulinanalógok előállítási eljárását, amely bejelentéseket referenciaként adunk meg. A találmány szerinti inzulinanalógok A- és B-láncait ezen túlmenően előállíthatjuk egy proinzulinszerű prekurzor molekulán keresztül, rekombináns DNS-eljárás alkalmazásával. Lásd például Frank és munkatársai, Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proc. Seventh Am. Pept. Symp., Eds. D. Rich és E. Gross (1981) közleményét, amelyet referenciaként adunk meg.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban részletesen bemutatjuk. A példák nem jelentik a találmány tárgykörének korlátozását.
1. példa
Inzulinacilezési eljárás N-szukcinimidil-palmitát dimetil-szulfoxidban történő alkalmazásával
71,9 mg bioszintetikus humáninzulin- (BHI) kristályokat oldunk 6,58 ml dimetil-szulfoxidban. Az oldatot a kristályok teljes feloldódásáig szemmel történő megfigyelés mellett szobahőmérsékleten keverjük. Ezt követően az elegyhez aktivált észteroldatot adagolunk (Nszukcinimidil-palmitát). Az adagolást úgy végezzük, hogy 20 mg szilárd, aktivált észtert 2 ml dimetilszulfoxidhoz adagolunk, majd az elegyet erősen keverjük mindaddig, amíg a vizuális megfigyelés értelmében az aktivált észterrészecskék feloldódnak. Ezt követően 5 ml BHI-oldathoz 26,8 pl 1,1,3,3-tetrametil-guanidint, majd 94,4 ml dimetil-szulfoxidot, és végül 400 μΐ, korábban előállított, aktivált észteroldatot adagolunk. A reakcióelegyet 20-25 °C hőmérsékleten körülbelül 60 percen át szobahőmérsékleten keverjük. 15 perc elteltével mintát veszünk, és hússzoros térfogatra hígítjuk 1 n ecetsavval, majd nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével analizáljuk. A reakció hozama a B29-NE-palmitoil-humáninzulin-termékre számítva a leállított mintában a kezdeti BHI mennyiségével osztva 67,1%.
2. példa
Inzulin acilezése N-szukcinimidil-palmitát alkalmazásával, acetonitril és víz oldószerelegyben
199,5 g bioszintetikus humáninzulint (BHI) oldunk 20 1, 50 mmol bórsavoldatban, pH=2,5 érték mellett. Az oldat pH-értékét 10%-os sósav segítségével újra 2,5 értékre állítjuk be, majd az oldatot a kristályok teljes feloldódásáig (vizuális ellenőrzés) keverjük. A kiindulási anyag mintáját az oldatból kivesszük, és 276 nm érték mellett az abszorpciót mérjük, amely 10,55 érték. Aktivált észter (N-szukcinimidil-palmitát) oldatot állítunk elő úgy, hogy 24 g szilárd, aktivált észtert adunk 2,4 1 acetonitrilbe, amelyet előzetesen körülbelül 50 °C hőmérsékletre melegítünk. Az elegyet mindaddig, amíg az észterrészecskék feloldódnak, erősen keverjük (vizuális ellenőrzés). Ezt követően a BHI-oldat pH-értékét 10%-os nátrium-hidroxid-oldat segítségével körülbelül 10,22 értékre állítjuk be. A megfelelő pH-értékű BHIoldathoz 18 1 acetonitrilt adagolunk. A reakciót ezt követően szobahőmérsékleten (20-25 °C) 110 percen át hagyjuk előrehaladni, majd 123 1 víz adagolásával leállítjuk. A kapott hígított oldat pH-értékét 10%-os sósav és 10%-os nátrium-hidroxid-oldat segítségével 2,01 értékre állítjuk be. A reakció hozamát számítjuk, mint a B29-NE-palmitoil-humáninzulin mennyiségét a leállított reakcióelegyben, osztva a BHI kezdeti mennyiségével, és ez 73%.
3. példa
LysB28-ProB29-humáninzulin acilezése N-szukcinimidil-palmitát segítségével, acetonitril és víz elegyében
2,22 g LysB28ProB29-humáninzulin kristályokat oldunk 100 ml 50 mmol bórsavban, pH=2,5 érték mellett. Az oldat pH-értékét 10%-os sósav alkalmazásával
2,5-re állítjuk be, majd az oldatot a kristályok feloldódásáig keverjük (vizuális ellenőrzés). Aktivált észter(N-szukcinimidil-palmitát) oldatot állítunk elő úgy, hogy 270 mg szilárd, aktivált észtert 27 ml, körülbelül 50 °C hőmérsékletre előmelegített acetonitrilbe adagolunk. Az elegyet a kristályok feloldódásáig erősen keverjük (vizuális ellenőrzés). Ezt követően az oldat pHértékét 10%-os nátrium-hidroxid-oldat segítségével körülbelül 10,22 értékre állítjuk be. Az oldatot 4 °C hőmérsékleten 15 percen át keverjük. Ezt követően a megfelelő pH-értékre beállított oldathoz 73 ml acetonitrilt adagolunk, majd az elegyhez adagoljuk a korábban előállított aktivált észteroldatot. A reakciót 4 °C hőmérsékleten 85 percen át végezzük, majd 1 n ecetsav (600 ml) adagolásával leállítjuk. A kapott elegy pH-értéke 2,85. A reakció hozama a LysB28ProB29-humáninzulin mennyisége a leállított reakcióelegyben, osztva a kezdeti LysB28ProB29-humáninzulin mennyiségével 72,5%.
4. példa
BHI acilezése N-szukcinimidil-palmitát segítségével, acetonitril és víz elegyében g bioszintetikus humáninzulint (BHI) oldunk 300 ml 50 mmol bórsavoldatban, pH=2,5 érték mellett. Az oldat pH-értékét - amennyiben ez szükséges 10%-os sósav segítségével 2,5 értékre állítjuk be, majd az oldatot a kristályok teljes feloldódásáig keverjük (vizuális ellenőrzés). Aktivált észter- (N-szukcinimidil-palmitát) oldatot állítunk elő úgy, hogy 400 ml szilárd, aktivált észtert 40 ml acetonitrilbe mérünk, és az oldatot erősen keverjük. A BHI-kristályok oldatának pH-értékét 10%-os nátrium-hidroxid-oldat segítségével körülbelül 10,2 értékre állítjuk be. Ezt követően a BHI-oldathoz 240 ml acetonitrilt adagolunk, majd
HU 217 585 Β hozzáadjuk az előzetesen előállított, aktivált észteroldatot. A reakciót szobahőmérsékleten (20-25 °C) körülbelül 90 percen át végezzük, majd a reakciót 1800 ml víz adagolásával leállítjuk. A kapott elegy pHértékét 10%-os sósav segítségével körülbelül 2,5 értékre állítjuk be. A reakció termelése a reakcióelegyben található B29-NE-palmitoil-humáninzulin menynyisége, osztva a kezdeti BHI mennyiségével, alapján 75,7%.
5. példa
Proinzulin acilezése N-szukcinimidil-palmitát segítségével, acetonitril és víz elegyében
28,2 mg/ml koncentrációjú humán proinzulin (HPI) vizes oldatot 50 mmol bórsavoldattal hígítunk 100 ml végső térfogatra, amelyben a HPI-tartalom 16,2 mg/ml. Párhuzamosan aktivált észteroldatot állítunk elő úgy, hogy 150 mg N-szukcinimidil-palmitátot 15 ml acetonitrilben (ACN) oldunk. Az oldást erős keverés közben végezzük. A HPI-oldat pH-értékét 10%-os nátriumhidroxid-oldat segítségével 10,2 értékre állítjuk be, majd hozzáadagolunk 88 ml acetonitrilt. A reakciót 12 ml aktivált észteroldat (a HPI mennyiségére vonatkoztatva 2 moláris felesleg) adagolásával kezdjük. A reakcióelegy végső térfogata 200 ml, és 8 mg/ml HPI-tartalmú, 50%-os, vizes acetonitrilben. A reakciót szobahőmérsékleten (20-25 °C) körülbelül 60 percen át végezzük, majd ekvivalens mennyiségű 200 ml, 50 mmol glicin adagolásával leállítjuk. pH = 10,0.
Az ε-aminocsoporton acilezett termék pontos mennyisége az α-aminocsoporton acilezett termékre vonatkoztatva nem meghatározott, az összes ε-aminocsoporton acilezett termék mennyisége a kromatogram szerint 87-90%, a teljes területre vonatkoztatva, az összes hasonló vegyületek (amelyek valószínűleg α-aminocsoporton acilezett terméket is magukba foglalnak), <7%, a teljes kromatogramterületre számítva.
6. példa
ArgB31 ,ArgB32-humáninzulin acilezése hexanoil-Nhidroxi-szukcinimid-észter segítségével
1,3 mg ArgB31,ArgB32-humáninzulint oldunk 200 μΐ, 200 mmol koncentrációjú 3-(ciklohexil-amino)-lpropán-szulfonsav pufferban, pH = 10,4 értéken. 0,3 pmol hexanoil-N-hidroxi-szukcinimid-észtert oldunk Ν,Ν-dimetil-formamidban, és ezt az oldatot keverés közben a fenti oldathoz adagoljuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten (20-25 °C) körülbelül 4 órán át keveijük, majd a reakciót körülbelül 2,5 pH-értékre savanyítjuk 0,1 n sósav segítségével, és így leállítjuk. A zselatinrészecskéket leszűijük 0,45 mikron méretű szűrő alkalmazásával, majd a kapott szűrletet HPLC nagynyomású folyadékkromatográfiás analízisnek vetjük alá. A kiindulási anyagtól a címbeli vegyületet C4 reverz fázisú analitikai HPLC-oszlopon választjuk el. A reakció termelése a B29-N£-hexanoil-ArgB31,ArgB32-humáninzulin leállított reakcióelegyben található mennyisége, osztva az ArgB31,ArgB32-humáninzulin kiindulási menynyiségével, számítás alapján 69,4%.
7. példa
LeuB26-humáninzulin acilezése N-szukcinimidil-palmitát segítségével, dimetil-szulfoxid oldószerben
1,0 mg LeuB26-humáninzulint oldunk 1 ml 95%-os dimetil-szulfoxid (DMSO), 5% trietil-amin (TEA) elegyben. 0,7 pmol N-szukcinimidil-palmitátot oldunk Ν,Ν-dimetil-formamidban, majd az oldatot keverés közben a fenti elegyhez adagoljuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten (20-25 °C) körülbelül 90 percen át keverjük, majd a reakciót 0,2 mg/ml koncentrációra hígítjuk 0,1 n sósav segítségével, és így leállítjuk. A zselatin típusú részecskéket 0,45 mikron méretű szűrőn eltávolítjuk, majd az elegyet HPLC nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével analizáljuk. A cím szerinti vegyületet a kiindulási anyagtól C4 reverz fázisú analitikai HPLC-oszlop segítségével választjuk el. A reakció hozama az Ne-palmitoil-LeuB26-humáninzulin leállított reakcióelegyben található mennyiségét osztva az NE-palmitoil-LeuB26-humán-inzulin kiindulási mennyiségével számítjuk, és ez 36,4%.
8. példa
Humán-inzulin acilezése N-szukcinimidil-palmitát segítségével, dimetil-szulfoxid oldószerben
1,0 g (0,17 mmol) bioszintetikus humáninzulin-kristályokat oldunk szobahőmérsékleten, 20 ml dimetilszulfoxidban. Párhuzamosan 0,0817 g (0,23 mmol) Nszukcinimidil-palmitát aktivált észtert 50 °C hőmérsékleten 3 ml dimetil-szulfoxidban oldunk. Az inzulinoldathoz erős keverés közben 0,432 ml (3,4 mmol) 1,1,3,3-tetrametil-guanidint, majd az aktív észteroldat teljes mennyiségét adagoljuk. A reakcióelegyet 30 percen át keveijük, majd a reakciót 0 °C hőmérsékletre hűtött 120 ml 0,05 n sósav adagolásával leállítjuk. Az elegy pH-értéke körülbelül 1,8. A leállított reakcióelegyet reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével analizáljuk, és azt tapasztaljuk, hogy a teljes eluált proteinből 72,2% B29-N£-palmitoilinzulin, és ez a teljes monoacilezettinzulin-mennyiség 95%-a.
A teljes reakcióelegyet Vydac C4 preparatív reverz fázisú oszlopra (5 χ 25 cm) visszük. Az oszlopot előzetesen 0,1% trifluor-ecetsav, 20% acetonitril vizes oldattal kiegyenlítjük. Az oszlopot ezután 500 ml hasonló oldószerrel mossuk, majd 4 ml/perc áramlási sebesség alkalmazásával 0,1% trifluor-ecetsav, acetonitril és víz elegyével eluáljuk. Az acetonitril koncentrációját ebben az elegyben 20-80% értékre emeljük, 91 térfogaton belül. Az oldószerrendszerrel eluált B29-Ne-palmitoilinzulin körülbelül 53% acetonitrilt tartalmaz. Az oldószert liofilizálással eltávolítjuk, és a kapott N£-palmitoil-inzulin mennyisége 414 mg (0,0684 mmol), vagy a kiindulási anyagra számítva 40,2% termelés.
9. példa
LysB28,ProB29-humáninzulin acilezése 1-oktanoil-Nhidroxi-szukcinimid-észter segítségével
2,0 g LysB28,ProB29-humáninzulint (KPB) oldunk 200 ml, 50 mmol bórsavpufferban, pH=2,5 érték mellett. Az oldat pH-értékét 10%-os sósav segítségével
HU 217 585 Β
2,5-re állítjuk be, majd az elegyet a kristályok teljes feloldódásáig (vizuális értékelés) keverjük. 175 mg aktivált észter (1-oktanoil-N-hidroxi-szukcinimid-észter) 25,62 ml acetonitrilbe való adagolásával aktivált észteroldatot állítunk elő úgy, hogy az elegyet az aktivált észter teljes feloldódásáig erősen keveijük (vizuális ellenőrzés). A KPB-oldat pH-értékét 10%-os nátriumhidroxid adagolásával körülbelül 10,4 értékre állítjuk be, majd az oldatot körülbelül 5 percen át szobahőmérsékleten keverjük. Ezt követően a megfelelő pH-értékű KPB-oldathoz 176 ml acetonitrilt, majd a koráb bán előállított aktivált észteroldatot adagoljuk. A reakciót 90 percen át szobahőmérsékleten végezzük, majd 5,5 ml 10%-os sósav (2,75% térfogat/térfogat) adagolásával, és háromszoros térfogatú (1200 ml) hideg dH2O adagolásával leállítjuk, és így a kapott elegy pH-értéke 2,70. A reakció hozamát úgy számítjuk, hogy a leállított reakcióelegyben található LysB29(C8)KPB menynyiségét osztjuk a BHI kezdeti mennyi5 ségével. A termelés 75,5%. Az oldatot kétszer 800 ml részletre osztjuk, és hidrofób kromatográfia (SP20SS) segítségével tisztítjuk. Az oszlopkromatográfía után a terméket ultraszűréssel és liofilizálás segítségével izoláljuk.
A 2. táblázatban bemutatjuk az inzulin, az inzulinanalógok és a proinzulin szelektív acilezésének eredményeit. A kísérleteket szobahőmérsékleten, a zsírsav N-hidroxi-szukcinimid-észtereinek alkalmazásával végezzük. A táblázatban a TMG és a TEA jelentése tet15 rametil-guanidin és trietil-amin.
2. táblázat
| Oldószer | Oldó- szer/víz arány | Fehérje | Zsírsav | Bázis/pH | Monoacilezett változat (%) Al és B1 | Monoacilezett változat (%) B29 | Diacilezett változat (%) | Monoacilezett B29 és monoacilezett A1 és B1 aránya |
| DMSO | 100/0 | inzulin | C16 | TMG | <0,1 | 70,7 | 29,3 | >700 |
| DMF | 100/0 | inzulin | C16 | TMG | 0,2 | 71,7 | 15,3 | 359 |
| acetonitril | 50/50 | inzulin | C16 | 10,2 | 1,2 | 79,9 | 14,3 | 67 |
| aceton | 50/50 | inzulin | C16 | 10,2 | 1,1 | 70,8 | 11,8 | 64 |
| etanol | 50/50 | inzulin | C16 | 10,2 | 1,6 | 45,6 | 1,9 | 29 |
| IPA | 50/50 | inzulin | C16 | 10,2 | 1,9 | 66,4 | 6,9 | 35 |
| etanol/IPA | 50/50 | inzulin | C16 | 10,2 | 1,8 | 50,3 | 2,8 | 28 |
| etanol/n- propanol | 50/50 | inzulin | C16 | 10,2 | 2,6 | 49,5 | 2,75 | 19 |
| acetonitril | 50/50 | inzulin | C6 | 10,2 | 0,48 | 80,6 | 17,7 | 167 |
| acetonitril | 50/50 | inzulin | C8 | 10,2 | 0,37 | 81,4 | 17,1 | 219 |
| acetonitril | 50/50 | inzulin | CIO | 10,2 | 0,10 | 83,4 | 14,4 | 834 |
| acetonitril | 50/50 | inzulin | C12 | 10,2 | 0,26 | 82,7 | 15,0 | 320 |
| Víz | 100 | Arg031-, Arg032- inzulin | C6 | 10,4 | <0,1 | 69,4 | nincs adat | >700 |
| DMF | 60/40 | inzulin | olein- sav | 10,4 | 1,1 | 16 | nincs adat | 14 |
| DMF | 60/40 | inzulin | C14 | 10,4 | 3,5 | 47,4 | nincs adat | 14 |
| DMF | 80/10 | inzulin | C18 | TEA | 8,7 | 59,1 | nincs adat | 7 |
| DMF | 80/10 | dez(64,65) proinzulin | C16 | TEA | 5,6 | 31,2 | nincs adat | 6 |
| DMSO | 95/05 | Leu026- inzulin | C16 | TEA | 5,8 | 36,4 | nincs adat | 6,2 |
IPA: izopropil-amin, DMF: dimetil-formamid, DMSO: dimetil-szulfoxid, TMG: tetrametil-guanidin, TEA: trietil-amin.
Claims (9)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás proinzulin, inzulin vagy valamely inzulinanalóg, amely szabad ε-aminocsoportot és valamely szabad α-aminocsoportot tartalmaz, szelektív, egylépéses acilezésére telített zsírsav alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy a proinzulint, inzulint vagy inzulinana- θθ lógot valamely oldható, aktivált telített zsírsavészterrel poláros oldószerben reagáltatjuk, ahol a reakcióta) vízben vagy víz és szerves oldószer elegyében, 7 feletti pH-értéken, illetveb) szerves oldószerben, pH=7-nél magasabb értéken végezzük.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy inzulinként humáninzulint vagy inzulin7HU 217 585 Β analógot, vagy LysB28ProB29-humáninzulint alkalmazunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált zsírsavészterként C6-C]8 zsírsav-N-hidroxi-szukcinimid-észtert alkalmazunk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált zsírsavészterként C14-C18 zsírsav-N-hidroxi-szukcinimid-észtert alkalmazunk.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált zsírsavészterként palmitinsav-N-hidroxi-szukcinimid-észtert alkalmazunk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót pH=9,5-10,5 közötti értéken hajtjuk végre.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy oldószerelegyként acetonitril és víz elegyét alkalmazzuk.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oldószerelegyként acetonitril és víz 1:1 térfogatarányú elegyét alkalmazzuk.
- 10 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy zsírsavészterként N-szukcinimidil-palmitátot vagy N-szukcinimidil-oktanoátot alkalmazunk.Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törőcsik Zsuzsanna osztályvezető Windor Bt., Budapest
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9903007A HU9903007D0 (en) | 1994-11-17 | 1995-11-14 | Process for acylation of epsilon-amino groups thereof insulin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/341,231 US5646242A (en) | 1994-11-17 | 1994-11-17 | Selective acylation of epsilon-amino groups |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT77737A HUT77737A (hu) | 1998-07-28 |
| HU217585B true HU217585B (hu) | 2000-02-28 |
Family
ID=23336740
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9903007A HU9903007D0 (en) | 1994-11-17 | 1995-11-14 | Process for acylation of epsilon-amino groups thereof insulin |
| HU9800566A HU217585B (hu) | 1994-11-17 | 1995-11-14 | Eljárás inzulin epszilon-aminocsoportjainak szelektív acilezésére |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9903007A HU9903007D0 (en) | 1994-11-17 | 1995-11-14 | Process for acylation of epsilon-amino groups thereof insulin |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5646242A (hu) |
| EP (2) | EP1227107A1 (hu) |
| JP (1) | JP4312828B2 (hu) |
| CN (1) | CN1171742A (hu) |
| AR (1) | AR003915A1 (hu) |
| AT (1) | ATE328902T1 (hu) |
| AU (2) | AU691066B2 (hu) |
| BR (1) | BR9509652A (hu) |
| CA (1) | CA2205061A1 (hu) |
| CO (1) | CO4520285A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ287731B6 (hu) |
| DE (1) | DE69535031T2 (hu) |
| DK (1) | DK0712862T3 (hu) |
| ES (1) | ES2264124T3 (hu) |
| HU (2) | HU9903007D0 (hu) |
| IL (1) | IL115972A (hu) |
| IN (1) | IN179820B (hu) |
| NO (1) | NO972185L (hu) |
| NZ (1) | NZ297256A (hu) |
| PL (1) | PL320556A1 (hu) |
| PT (1) | PT712862E (hu) |
| RU (1) | RU2155773C2 (hu) |
| SI (1) | SI0712862T1 (hu) |
| TR (1) | TR199501421A2 (hu) |
| WO (1) | WO1996015803A1 (hu) |
| YU (1) | YU71495A (hu) |
| ZA (1) | ZA959680B (hu) |
Families Citing this family (76)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9316895D0 (en) | 1993-08-13 | 1993-09-29 | Guy S And St Thomas Hospitals | Hepatoselective insulin analogues |
| US6869930B1 (en) * | 1993-09-17 | 2005-03-22 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
| US5951974A (en) * | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
| US6251856B1 (en) | 1995-03-17 | 2001-06-26 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
| US5631347A (en) * | 1995-06-07 | 1997-05-20 | Eli Lilly And Company | Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein |
| US6451970B1 (en) * | 1996-02-21 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Peptide derivatives |
| AU3255297A (en) * | 1996-07-11 | 1998-02-09 | Novo Nordisk A/S | Selective acylation method |
| US5905140A (en) * | 1996-07-11 | 1999-05-18 | Novo Nordisk A/S, Novo Alle | Selective acylation method |
| US6444641B1 (en) | 1997-10-24 | 2002-09-03 | Eli Lilly Company | Fatty acid-acylated insulin analogs |
| SV1998000125A (es) * | 1997-10-24 | 1999-05-24 | Lilly Co Eli | Composiciones de insulina insoluble ref. x-11232 |
| US5985263A (en) * | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
| US5981709A (en) * | 1997-12-19 | 1999-11-09 | Enzon, Inc. | α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same |
| US6451974B1 (en) | 1999-03-17 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Method of acylating peptides and novel acylating agents |
| AU4904800A (en) | 1999-05-27 | 2000-12-18 | Robert Z-T. Luo | Identification of compounds for modulating dimeric receptors |
| US7169889B1 (en) * | 1999-06-19 | 2007-01-30 | Biocon Limited | Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin |
| JP2003532691A (ja) * | 2000-05-05 | 2003-11-05 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 重症疾患神経障害 |
| US7316999B2 (en) | 2000-06-02 | 2008-01-08 | Novo Nordisk A/S | Glucose dependent release of insulin from glucose sensing insulin derivatives |
| CN1406131A (zh) * | 2000-12-25 | 2003-03-26 | 株式会社资生堂 | 活化交感神经的香料组合物 |
| US6867183B2 (en) | 2001-02-15 | 2005-03-15 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
| US7060675B2 (en) | 2001-02-15 | 2006-06-13 | Nobex Corporation | Methods of treating diabetes mellitus |
| US6828305B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US6713452B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-03-30 | Nobex Corporation | Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US6835802B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-28 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties |
| US6828297B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US6858580B2 (en) * | 2001-06-04 | 2005-02-22 | Nobex Corporation | Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US7713932B2 (en) | 2001-06-04 | 2010-05-11 | Biocon Limited | Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof |
| US20030082671A1 (en) * | 2001-07-24 | 2003-05-01 | Thomas Hoeg-Jensen | Method for making acylated polypeptides |
| HUP0500057A3 (en) * | 2001-07-24 | 2006-01-30 | Novo Nordisk As | Method for making acylated polypeptides |
| US7595172B2 (en) * | 2001-07-24 | 2009-09-29 | Novo Nordisk A/S | Method for making acylated polypeptides |
| AU2002355160A1 (en) * | 2001-07-24 | 2003-02-17 | Novo Nordisk A/S | Method for making acylated polypeptides |
| US7196059B2 (en) | 2001-09-07 | 2007-03-27 | Biocon Limited | Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
| EP1430082B1 (en) | 2001-09-07 | 2009-10-28 | Biocon Limited | Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| US6913903B2 (en) * | 2001-09-07 | 2005-07-05 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| US6770625B2 (en) | 2001-09-07 | 2004-08-03 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
| US7312192B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-12-25 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| US7166571B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-01-23 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| US7030082B2 (en) * | 2001-09-07 | 2006-04-18 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith |
| US20030199445A1 (en) * | 2002-02-07 | 2003-10-23 | Knudsen Lotte Bjerre | Use of GLP-1 compound for treatment of critically ill patients |
| WO2003105768A2 (en) | 2002-06-13 | 2003-12-24 | Nobex Corporation | Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus |
| ES2328687T3 (es) * | 2002-09-25 | 2009-11-17 | Novo Nordisk A/S | Metodo de producion de peptidos acilados. |
| US7273921B2 (en) | 2002-09-25 | 2007-09-25 | Novo Nordisk A/S | Method for producing acylated peptides |
| PL2107069T3 (pl) * | 2003-08-05 | 2013-06-28 | Novo Nordisk As | Nowe pochodne insuliny |
| JP2007532096A (ja) | 2003-11-14 | 2007-11-15 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | アシル化されたインスリンの製造方法 |
| PL2626368T3 (pl) | 2004-07-19 | 2017-06-30 | Biocon Limited | Koniugaty insulina-oligomer, ich formulacje i zastosowania |
| EP1917363B1 (en) | 2005-08-16 | 2011-06-22 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
| DK1969004T3 (da) * | 2005-12-28 | 2011-11-28 | Novo Nordisk As | Insulinsammensætninger og metode til at lave en sammensætning |
| US8722620B2 (en) | 2006-02-27 | 2014-05-13 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
| US8927015B2 (en) * | 2006-04-12 | 2015-01-06 | Emisphere Technologies, Inc. | Formulations for delivering insulin |
| ES2542146T3 (es) | 2006-07-31 | 2015-07-31 | Novo Nordisk A/S | Insulinas extendidas PEGiladas. |
| PT2074141T (pt) | 2006-09-22 | 2016-11-10 | Novo Nordisk As | Análogos de insulina resistentes a proteases |
| WO2008037735A1 (en) | 2006-09-27 | 2008-04-03 | Novo Nordisk A/S | Method for making maturated insulin polypeptides |
| ES2563038T3 (es) | 2007-04-30 | 2016-03-10 | Novo Nordisk A/S | Método para secar una composición proteica, una composición proteica seca y una composición farmacéutica que comprende la proteína seca |
| CN101677947B (zh) | 2007-06-13 | 2013-07-17 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 包含胰岛素衍生物的药物制剂 |
| DK2203181T3 (en) | 2007-10-16 | 2018-05-28 | Biocon Ltd | An orally administrable solid composition and a method thereof |
| CN101970477B (zh) | 2008-03-14 | 2014-12-31 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 蛋白酶稳定的胰岛素类似物 |
| PL2910570T3 (pl) | 2008-03-18 | 2017-06-30 | Novo Nordisk A/S | Stabilizowane względem proteaz, acylowane analogi insuliny |
| US8637647B2 (en) | 2008-09-12 | 2014-01-28 | Novo Nordisk A/S | Method of acylating a peptide or protein |
| US9603904B2 (en) * | 2008-10-30 | 2017-03-28 | Novo Nordisk A/S | Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency |
| MX2011008775A (es) * | 2009-02-20 | 2011-10-24 | Ipsen Pharma Sas | Analogos de neuropeptidos y con substitucion de prolina en la posicion 34. |
| BR112012012945A2 (pt) | 2009-11-25 | 2020-12-29 | Arisgen Sa | Composição de liberação mucosal, seu método de produção, complexo de peptídeo pré-formado, kit e uso de um agente ativo de peptídeo |
| BR112013010345A2 (pt) | 2010-10-27 | 2017-07-25 | Novo Nordisk As | tratamento de diabetes melitus usando as injeções de insulina administradas com intervalos de variação da injeção |
| KR20150002777A (ko) | 2012-04-11 | 2015-01-07 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 인슐린 제제 |
| WO2014177623A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Novo Nordisk A/S | Novel administration regime |
| AU2014333979B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-02-15 | Novo Nordisk A/S | Novel derivative of an insulin analogue |
| FR3013049B1 (fr) | 2013-11-14 | 2015-11-13 | You-Ping Chan | Analogue de l'insuline glargine |
| AR099569A1 (es) | 2014-02-28 | 2016-08-03 | Novo Nordisk As | Derivados de insulina y los usos médicos de estos |
| CN104558097A (zh) * | 2014-05-20 | 2015-04-29 | 广东东阳光药业有限公司 | 肽的酰化方法 |
| CN105111305B (zh) * | 2015-10-10 | 2018-12-14 | 山东阿华生物药业有限公司 | 酰化胰岛素的色谱纯化方法 |
| CN105440125B (zh) * | 2015-11-25 | 2019-09-24 | 华润昂德生物药业有限公司 | 地特胰岛素或其类似物的制备方法 |
| JP7128519B2 (ja) | 2016-05-05 | 2022-08-31 | コデクシス， インコーポレイテッド | ペニシリンｇアシラーゼ |
| EP3534962B1 (en) | 2016-11-07 | 2020-08-19 | Novo Nordisk A/S | Dchbs-active esters of peg compounds and their use |
| CN115154591B (zh) | 2016-12-16 | 2023-04-14 | 诺和诺德股份有限公司 | 含胰岛素的药物组合物 |
| CN107602437A (zh) * | 2017-08-09 | 2018-01-19 | 上海昂德生物科技有限公司 | 活化酯的制备方法 |
| US10335464B1 (en) | 2018-06-26 | 2019-07-02 | Novo Nordisk A/S | Device for titrating basal insulin |
| EP3996679B1 (en) | 2019-07-12 | 2023-09-06 | Novo Nordisk A/S | High concentration insulin formulation |
| CN116874585B (zh) * | 2023-09-06 | 2023-12-15 | 杭州湃肽生化科技有限公司 | 一种地特胰岛素的合成方法 |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1468831A (fr) * | 1965-10-05 | 1967-02-10 | Roussel Uclaf | Procédé de préparation de nouveaux composés polypeptidiques et produits en résultant |
| DE1902865A1 (de) * | 1968-02-01 | 1969-09-11 | American Home Prod | Substituierte Insulin-Derivate,Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen |
| US3591574A (en) * | 1968-05-29 | 1971-07-06 | American Home Prod | Tri-n-phenylglycyl derivatives of insulin |
| US3528960A (en) * | 1968-10-07 | 1970-09-15 | Lilly Co Eli | N-carboxyaroyl insulins |
| US3823125A (en) * | 1969-10-14 | 1974-07-09 | American Home Prod | N-aminoacyl-substituted insulins |
| US3752798A (en) * | 1969-12-02 | 1973-08-14 | G Amird | Tris-na1,nb1,nepsilonb29 - (3-x-3-oxo - 1-y-prop-1-en-1-yl)(ndelta-(4-z-6-r-pyrimidin - 2 - yl) ornithine b22)-insulins and their preparation |
| US3869437A (en) * | 1970-05-08 | 1975-03-04 | Nat Res Dev | Mono-, di, and N{HD A1{B , N{HU B1{B , N{HU B29{B -tri-acylated insulin |
| US3950517A (en) * | 1970-05-08 | 1976-04-13 | National Research Development Corporation | Insulin derivatives |
| GB1381274A (en) * | 1971-01-28 | 1975-01-22 | Nat Res Dev | Insulin derivatives |
| GB1381273A (en) * | 1971-01-28 | 1975-01-22 | Nat Res Dev | Insulin derivatives |
| US3864325A (en) * | 1971-11-18 | 1975-02-04 | Nat Res Dev | (N{HU Al{b , N{HU Bl{b , N{HU B29{B , carbamoyl)-(O{HU A14{B , O{HU B16{B , O{HU B26{B aryl) insulin derivatives |
| BE791949A (fr) * | 1971-11-27 | 1973-05-28 | Schering Ag | Derives d'insuline, leur preparation et leur utilisation |
| US3755569A (en) * | 1972-07-25 | 1973-08-28 | American Home Prod | Acyl substituted insulins |
| DE2252157C3 (de) * | 1972-10-25 | 1976-03-18 | Hoechst Ag | Zwischenprodukte zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten und verfahren zur herstellung von insulin, insulin analogen und derivaten |
| DE2253327A1 (de) * | 1972-10-31 | 1974-05-09 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten |
| NL7314766A (hu) * | 1972-10-31 | 1974-05-02 | ||
| DE2428412A1 (de) * | 1974-06-12 | 1976-01-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten |
| DE2439296A1 (de) * | 1974-08-16 | 1976-02-26 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten |
| GB1492997A (en) * | 1976-07-21 | 1977-11-23 | Nat Res Dev | Insulin derivatives |
| US4218539A (en) * | 1978-03-24 | 1980-08-19 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates and method of preparation and use |
| PH25772A (en) * | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
| JPH01254699A (ja) * | 1988-04-05 | 1989-10-11 | Kodama Kk | インスリン誘導体及びその用途 |
| NZ232375A (en) * | 1989-02-09 | 1992-04-28 | Lilly Co Eli | Insulin analogues modified at b29 |
| AU8091091A (en) * | 1990-07-26 | 1992-02-18 | University Of Iowa Research Foundation, The | Novel drug delivery systems for proteins and peptides using albumin as a carrier molecule |
| US5304473A (en) * | 1991-06-11 | 1994-04-19 | Eli Lilly And Company | A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production |
| HU217684B (hu) * | 1993-09-17 | 2000-03-28 | Novo Nordisk A/S | Acilezett inzulinszármazékok és azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények és előállításuk |
| DE4437604A1 (de) * | 1994-10-21 | 1996-04-25 | Basf Ag | Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung |
| US5905140A (en) | 1996-07-11 | 1999-05-18 | Novo Nordisk A/S, Novo Alle | Selective acylation method |
-
1994
- 1994-11-17 US US08/341,231 patent/US5646242A/en not_active Ceased
-
1995
- 1995-11-14 HU HU9903007A patent/HU9903007D0/hu unknown
- 1995-11-14 SI SI9530727T patent/SI0712862T1/sl unknown
- 1995-11-14 AR ARP950100165A patent/AR003915A1/es not_active Application Discontinuation
- 1995-11-14 CN CN95197224A patent/CN1171742A/zh active Pending
- 1995-11-14 CO CO95053590A patent/CO4520285A1/es unknown
- 1995-11-14 RU RU97110075/04A patent/RU2155773C2/ru active
- 1995-11-14 CA CA002205061A patent/CA2205061A1/en not_active Abandoned
- 1995-11-14 TR TR95/01421A patent/TR199501421A2/xx unknown
- 1995-11-14 ZA ZA959680A patent/ZA959680B/xx unknown
- 1995-11-14 ES ES95308167T patent/ES2264124T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-14 EP EP02000258A patent/EP1227107A1/en not_active Ceased
- 1995-11-14 HU HU9800566A patent/HU217585B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-11-14 IL IL11597295A patent/IL115972A/xx unknown
- 1995-11-14 AT AT95308167T patent/ATE328902T1/de active
- 1995-11-14 EP EP95308167A patent/EP0712862B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-14 IN IN1452CA1995 patent/IN179820B/en unknown
- 1995-11-14 CZ CZ19971456A patent/CZ287731B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-11-14 AU AU42372/96A patent/AU691066B2/en not_active Revoked
- 1995-11-14 DE DE69535031T patent/DE69535031T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-14 WO PCT/US1995/014872 patent/WO1996015803A1/en not_active Ceased
- 1995-11-14 PT PT95308167T patent/PT712862E/pt unknown
- 1995-11-14 YU YU71495A patent/YU71495A/sh unknown
- 1995-11-14 JP JP51696396A patent/JP4312828B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-14 DK DK95308167T patent/DK0712862T3/da active
- 1995-11-14 BR BR9509652A patent/BR9509652A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-11-14 NZ NZ297256A patent/NZ297256A/xx active IP Right Revival
- 1995-11-14 PL PL95320556A patent/PL320556A1/xx unknown
-
1997
- 1997-05-13 NO NO972185A patent/NO972185L/no not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-08-07 AU AU78854/98A patent/AU720820B2/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-07-08 US US09/351,103 patent/USRE37971E1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU217585B (hu) | Eljárás inzulin epszilon-aminocsoportjainak szelektív acilezésére | |
| US5631347A (en) | Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein | |
| Büllesbach et al. | Total synthesis of human relaxin and human relaxin derivatives by solid-phase peptide synthesis and site-directed chain combination | |
| JP2679786B2 (ja) | 非ペプチド結合を有するペプチド合成方法 | |
| US20020156234A1 (en) | Process for obtaining insulin precursors having correctly bonded cystine bridges | |
| FI79860B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin des-pheb1-humaninsulin eller derivat daerav ur svininsulin, des-pheb1-svininsulin eller derivat daerav. | |
| EP0712861A2 (en) | Acylated insulin analogs | |
| US4656249A (en) | Peptides with relaxin activity | |
| Schwartz et al. | A highly potent insulin: des-(B26-B30)-[AspB10, TyrB25-NH2] insulin (human). | |
| CN114075275A (zh) | 一种长效胰岛素类似物 | |
| JPH05308989A (ja) | インシュリン含有溶液の取得法 | |
| JP3324804B2 (ja) | インシュリン様作用を有するペプチド | |
| WO2024068827A1 (en) | Method for preparing liraglutide | |
| HK1014007B (en) | Selective acylation of epsilon-amino groups in insulin | |
| Brandenburg | Insulin-structure, function, design | |
| MXPA97003506A (en) | Selective acilacion of epsilon-am groups | |
| Bullesbach et al. | Preparation and properties of. alpha.-and. epsilon.-amino-protected porcine relaxin derivatives | |
| Brandenburg et al. | Crosslinked insulins: preparation, properties, and applications | |
| JPH07252299A (ja) | ヒルジン誘導体およびその製造方法 | |
| Paselk et al. | Preparation of several trifluoroacetyl insulin derivatives | |
| EP0266170A2 (en) | Peptide derivative and its production | |
| Vadasz et al. | Studies on epimerization-free methods for the preparation of aminosuccinyl peptides | |
| EP0370165A2 (en) | Novel calcitonin derivative and salt thereof | |
| Warnke | Studies in Peptide Synthesis | |
| CZ280690B6 (cs) | Nové analogy karboxyterminálního oktapeptidu (B23-B30) B-řetězce lidského insulinu |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |