CN105111305B

CN105111305B - 酰化胰岛素的色谱纯化方法

Info

Publication number: CN105111305B
Application number: CN201510651298.7A
Authority: CN
Inventors: 刘海峰; 周祥山; 方喆; 张元兴; 田守生; 解福生; 应欢; 黄菁; 庞甲佩; 史兆松
Original assignee: SHANDONG EHUA BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd; East China University of Science and Technology; Dong E E Jiao Co Ltd
Current assignee: Huarun Onde Biopharmaceutical Co ltd; East China University of Science and Technology
Priority date: 2015-10-10
Filing date: 2015-10-10
Publication date: 2018-12-14
Anticipated expiration: 2035-10-10
Also published as: CN105111305A

Abstract

本发明公开了一种酰化胰岛素的色谱纯化方法，属于重组胰岛素或胰岛素类似物的制备领域。本发明酰化胰岛素的色谱纯化方法以高级硅胶载体(如C4、C8和C18等烷烃为配基的反相填料)作为层析填料，利用高压色谱系统对酰化胰岛素进行精细分离纯化，在pH为6.5‑8.0的碱性洗脱液环境下，可一步将粗样品纯度由50‑60％提高至99.0％以上，纯化后样品收率稳定在90％以上。另外，本发明方法粗样样品上样量大，极大的节省了纯化成本；色谱纯化过程中线性流速高，可做到对胰岛素类似物的快速纯化。本发明方法操作简单、稳定可靠，具有较强的可放大性，适合作为工业化制备胰岛素类似物的色谱纯化方法。

Description

酰化胰岛素的色谱纯化方法

技术领域

本发明涉及一种酰化胰岛素的反相色谱纯化方法，属于重组胰岛素或胰岛素类似物的制备领域。

背景技术

糖尿病是一种常见的代谢内分泌疾病，严重危害人类健康。酰化胰岛素是一种中性的、可溶的、长效胰岛素类似物，例如地特胰岛素，即赖氨酸B29N(ε-十四酰)去(B30)人胰岛素，是第一个采用化学修饰的方法，用能与血液中的白蛋白可逆结合的脂肪酸酰化肽链上的氨基酸而产生。酰化的脂肪酸可稳定胰岛素分子的自身聚集，且与白蛋白可逆性结合，使酰化胰岛素从皮下注射部位吸收缓慢，作用持续时间延长，在控制血糖的同时能减少低血糖的风险。

在胰岛素的发展史中，制备型高效液相技术的引入为胰岛素质量的提升起到十分关键的作用，使得从动物中提取的胰岛素和利用基因重组技术制备的人胰岛素的纯度从90％左右提升到98％甚至更高，包括脱氨产物在内的性质与胰岛素十分接近的相关物质的含量也得到很好的控制，胰岛素的安全性进一步得到保障。目前主要的色谱纯化工艺有两种：一是通过选用有机聚合物填料进行胰岛素或胰岛素类似物的纯化，如中国专利CN103275210A中采用Source 15RPC、Source 30RPC有机聚合物填料，在洗脱液pH 2-4环境下可有效的对一种脂肪酸单酰化胰岛素进行纯化，纯化后样品纯度可达到98％，样品收率为71.9％；二是通过选用高级硅胶载体填料进行胰岛素或胰岛素类似物的纯化，如中国专利CN1171742A中采用C4填料在50mm制备柱上进行酰化后胰岛素的纯化，纯化后样品纯度未知，样品收率为40.2％。

有机聚合物填料一般采用中低压设备，而高级硅胶载体一般采用高压层析设备。比较来看，虽然采用有机聚合物填料进行纯化的设备维护成本较低，但是具有许多明显的缺点：第一，有机聚合物填料的粒径(一般在30微米以上，大至几百微米)比普通高级硅胶载体填料粒径(一般在5-20微米之间)大很多，由于介质自身的耐压性能差，装柱过程承压能力有限，装填好的柱子内部介质不会致密均匀，测定的理论塔板数一般不会超过20000，新装填的层析柱柱效不高，从而导致样品分离度较低，纯化后样品纯度较难达到98％以上且收率较低，这将明显增加产品的生产成本；第二，有机聚合物填料粒径一般在5-300μm之间，颗粒均一度较差，耐压性较低，在装填层析柱和纯化过程中都会造成填料的破碎，从而导致层析柱内部产生塌陷造成柱效下降，分离度降低，进一步造成收率下降。

相比来看，高级硅胶载体填料装填的柱子，柱效一般可以达到40000以上，且填料能够耐受10MPa压力，不易碎，长期纯化试验后柱效较稳定，不会降低；且在较高的耐受压力下，纯化过程中的线性流速可以更高，可做到对胰岛素类似物的快速纯化，更好的避免在色谱纯化过程中目的产物发生不利反应，如脱氨反应等，从而影响样品纯度和收率。

因此，建立一种方法简捷，产品的纯度及收率高，具有较强的可放大性、适合作为工业化纯化酰化胰岛素或其类似物的色谱纯化方法，将具有重要的价值和应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种酰化胰岛素的色谱纯化方法，该方法可一步将粗样品的纯度由50-60％提高至99.0％以上，且纯化后样品收率稳定在90％以上，具有较强的可放大性、适合作为工业化纯化酰化胰岛素或其类似物的色谱纯化方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种酰化胰岛素的色谱纯化方法，包括以下步骤：(1)以高级硅胶载体作为层析填料，将色谱柱用平衡液进行平衡，将待纯化的酰化胰岛素粗品上样，用平衡液平衡色谱柱；(2)用洗脱用流动相进行洗脱，收集主峰，得到目的产物酰化胰岛素纯品；其中，洗脱用流动相包括A相和B相；所述洗脱用流动相A相的pH为6.5-8.0，优选的，所述洗脱用流动相A相的pH为7.0-8.0，最优选为pH 7.0。

其中，所述A相为磷酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液中的任意一种或多种，优选为磷酸盐缓冲液。本发明通过调节磷酸盐缓冲液中磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的比例，达到A相所述pH；或者通过加入盐酸或者氢氧化钠调节A相的pH值。

所述B相包括有机溶剂和水；其中所述有机溶剂为乙腈或碳原子数为C1-C4的醇中的任意一种或多种，优选为乙腈或乙醇；更优选的，所述B相由乙腈和水按体积比9：1组成；或者，由乙醇和水按体积比9：1组成。

本发明色谱纯化方法，步骤(1)所述高级硅胶载体(即层析填料)的配基为C4-C18的烷烃，优选为C8烷烃；其中，所述配基是在高级硅胶载体的表面所键合的烷烃。本发明所述高级硅胶载体填料的装填压力为7-10MPa。所述层析填料的平均粒度为5-30μm，优选为5-10μm。填料粒度越小，柱效越高，样品纯化分离度越高。步骤(1)所述平衡液包括A相和B相，与洗脱用流动相中的A相和B相相同；按照体积比计，步骤(1)所述平衡液由75％-90％的A相和10％-25％的B相组成，优选为由80％的A相和20％的B相组成。

按照体积比计，步骤(2)所述洗脱用流动相由50％-60％的A相和40％-50％的B相组成，优选为由55％的A相和45％的B相组成。步骤(2)所述洗脱的方式为等度洗脱方式(即在洗脱过程中A相与B相的比例不变)或者线性梯度洗脱方式的任意一种。

本发明考察了层析填料的不同配基对酰化胰岛素分离效果的影响，结果表明C4、C8、C18三种配基都可以达到较好的纯化效果，纯化后样品纯度达97.89％-99.28％，纯化收率为85.5％-91.5％；其中C8配基对于酰化胰岛素的纯化效果优于另外两种填料配基，且具有统计学意义上的显著性差异。

本发明进一步考察A相不同的pH洗脱条件下对样品分离效果的影响，结果表明，在A相偏碱性(pH7.5)的洗脱条件下对目的蛋白的纯化效果明显好于偏酸性(pH3.5)洗脱条件，纯化后样品纯度更高，达99.25％，且纯化收率也更高，达90.9％。因此，本发明认为对于采用高级硅胶载体填料纯化酰化胰岛素，采用偏碱性的洗脱条件更容易得到纯度和收率都更高的样品。同时，本发明围绕A相pH7.5的洗脱条件对pH条件又进行优化，结果表明当A相pH6.5至8.0时，目的蛋白纯化后的纯度和收率都较高，分别达98.89％-99.55％和88.1％-93.9％，尤其当A相pH为7.0时，洗脱下来的目的蛋白纯度最高，且纯化收率也最高。

本领域一般认为高级硅胶载体填料在酸性洗脱条件下可以达到最好的纯化效果。中国专利CN 1313866A公开了采用高级硅胶载体填料在酸性(pH3.5)洗脱条件下可以达到最好的纯化效果，纯化后样品纯度大于98.5％，产率68％；而采用有机聚合物为固定相，在碱性(pH9.0)条件下洗脱，纯化后样品纯度大于98.5％，产率64％-73％。采用色谱的方式纯化酰化胰岛素粗品时，当纯度达到98％以上时，在不影响收率的前提下，即使将纯度提高0.5个百分点也是十分困难的。与已公开的相关中国专利在主要工艺参数及纯化效果相比较，本发明酰化胰岛素的色谱纯化方法，通过采用高级硅胶载体填料(配基为C4-C18的烷烃的反相硅胶填料)，在碱性(pH 6.5-8.0)洗脱液环境下，可一步将酰化后粗样的纯度由50-60％提高至99.0％以上且纯化后样品收率稳定在90％以上，纯化后样品纯度和收率都远高于现有技术所获得的成果。另外，本发明粗样样品的上样量大，超过16克/升床层体积，远大于已公开的专利或技术中提到的胰岛素类似物色谱纯化上样量；色谱纯化过程中线性流速高达250cm/h，可做到对胰岛素类似物的快速纯化。

本发明所述待纯化样品是由去B30的人胰岛素(即将人胰岛素B链上天然排列在第30位的苏氨酸去掉)和选自以下任意一种的脂肪酸酯反应制得的酰化胰岛素溶液：棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯、辛酸N-琥珀酰亚胺基酯或肉豆蔻酸N-琥珀酰亚胺基酯。反应后的目的产物(即酰化胰岛素)为脂肪酸酯与去B30的人胰岛素的B29-Lys的ε-氨基反应并以酰胺键相连形成的产物，同时在反应溶液中还存在许多杂质，如非目的位点修饰的产物和未完全反应的原料(脂肪酸酯与去B30的人胰岛素)等。人胰岛素是由51个氨基酸组成的酸性小分子蛋白质，分子式为C₂₅₇H₃₈₃N₆₅O₇₇S₆，分子量5807.69。而本发明所述人胰岛素包括：有机合成的人胰岛素或通过基因工程制备的重组人胰岛素；其中，有机合成的人胰岛素是根据人胰岛素的结构人工合成；重组人胰岛素是利用基因工程生物发酵(如大肠杆菌、酵母菌)表达人胰岛素。

合成酰化胰岛素的方法在本领域内是已知的，例如可以参见中国专利CN1171742A，或论文《重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究》，刘海峰，华东理工大学，博士学位论文(2013)中公开的方法。

本发明酰化胰岛素的色谱纯化方法是利用酰化后样品中目的产物酰化胰岛素与其他杂质在特定的固定相和流动相中相对疏水性差异来进行纯化的。本发明方法简单可行，粗样样品上样量大，纯化后样品纯度高且收率高，纯化成本低，且工艺稳定可靠，适于工业化的放大性生产。

本发明方法适用于分析色谱、半制备色谱，特别是制备型色谱。

本发明技术方案与现有技术相比，主要有以下几方面的有益效果：

(1)通过采用高级硅胶载体作为层析填料，在碱性(pH7.0)洗脱液环境下，可一步将酰化后粗样纯度由50-60％提高至99.0％以上，且纯化后样品收率稳定在90％以上，纯化后样品纯度和收率都远高于现有技术所获得的成果。

(2)本发明中待纯化的粗样样品的上样量大，超过16克/升床层体积，远大于已公开的专利或技术中提到的胰岛素类似物色谱纯化上样量，极大的节省了纯化成本。

(3)本发明色谱纯化过程中线性流速高达250cm/h，可做到对胰岛素类似物的快速纯化，更好的避免在色谱纯化过程中目的产物发生不利反应，如脱氨反应等，从而影响样品纯度和收率。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“反相硅胶”为表面涂覆有憎水基质的氧化硅材料，其中憎水基质的可以是烷烃；所述“涂覆”即利用硅胶表面的Si-OH基团键合不同的官能团，成为适用于不同分离模式的色谱填料；一般可以通过三种途径对硅胶进行化学修饰以制备硅胶键合相：涂层法、整体修饰法和表面Si-OH的化学修饰法。在本发明中，术语“反相硅胶”与术语“高级硅胶载体”的含义相同，二者可以互换。

术语“制备色谱”应理解为在工业规模上制备纯产品。

附图说明

图1为实施例1中采用填料的酰化胰岛素的色谱纯化图谱；

图2为实施例1中采用填料的酰化胰岛素的色谱纯化图谱；

图3为实施例1中采用填料的酰化胰岛素的色谱纯化图谱；

图4为实施例2中采用pH7.5的A相进行洗脱的酰化胰岛素的色谱纯化图谱；

图5为实施例2中采用pH3.5的A相进行洗脱的酰化胰岛素的色谱纯化图谱；

图6为实施例3中酰化胰岛素的色谱纯化图谱；

图7为实施例4中酰化胰岛素的色谱纯化图谱；

图8为实施例5中酰化胰岛素的色谱纯化图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、试验材料及仪器

三羟甲基氨基甲烷(Tris)等缓冲剂物质购自Amresco公司，无水硫酸钠(Na₂SO₄)、盐酸(HCl)和氢氧化钠(NaOH)购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈(CH₃CN，HPLC级和制备色谱级)等其他有机溶剂购自J&K Chemical公司；半制备型色谱柱(50mm×250mm)，填料都购自瑞典Kromasil公司；分析型色谱柱(4.6mm×150mm)填料为购自Kromasil公司；分析型高效液相仪器为安捷伦1260，制备型高效液相仪器为大连依利特P270。

样品纯度检测方法：

采用反相层析方法对粗样和纯化收集的样品进行检测，仪器为安捷伦 1260分析型高效液相，柱子采用Kromasil C4-3.5μm色谱柱(4.6mm×150mm)。流动相A相：10mM无水硫酸钠-乙腈(按体积比75：25混合)，采用盐酸调节pH至3.5；流动相B相：乙腈-水(按体积比55：45混合)。流速为1.0ml/min，柱温为40℃，检测波长为214nm。25-50％B相梯度洗脱35min。保留时间在27-29分钟的主峰即为目的产物。纯度计算采用面积归一法。

预备实施例1酰化胰岛素的制备

酰化胰岛素溶液的制备方法参见中国专利CN 1171742A中公开的方法。

将生物合成的人胰岛素(BHI)结晶(71.9mg)溶于6.58mL DMSO。将溶液在室温下搅拌至晶体全部溶解(肉眼观察)。将20mg活性酯固体加入2mL DMSO中并剧烈搅拌至所有的活性酯颗粒全部溶解(肉眼观察)，制得活性酯(棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯)的溶液。此时，将1,1,3,3-四甲基胍(26.8μl)加入5mL BHI溶液中，随后加入DMSO(94.4mL)和预先制备的活性酯溶液(400μl)。反应在室温下(20至25℃)进行大约60分钟。15分钟后取样，用1N乙酸稀释20倍并用HPLC进行分析。用终止样品中的B²⁹-N^ε-棕榈酰人胰岛素的量除以最初的BHI的量，计算出反应产率为67.1％。

实施例1考察不同配基填料对分离效果的影响

所述的粗样样品为预备实施例1由去B30的人胰岛素和棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯一步反应制得的酰化胰岛素溶液，粗样纯度为55％；色谱纯化方法采用不同的硅胶填料( )在半制备型色谱柱(50mm×250mm)上进行，装填压力为7-10MPa；洗脱用流动相A相：20mmol/L磷酸盐缓冲液，调节缓冲液中磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的比例，使A相pH为7.0；洗脱用流动相B相：乙腈-水 (按体积比9：1混合)；保持柱子温度为20-25℃；洗脱流速为82.5ml/min；检测波长为280nm。

(1)采用20％B相(即A相为80％，体积比)作为平衡液平衡柱子至基线稳定。

(2)8.1g酰化胰岛素粗样样品上样柱子，然后采用平衡液平衡柱子至基线稳定。

(3)采用45％的B相(即A相为55％，体积比)的等度洗脱方式将吸附在柱子上的各种物质洗脱下来，280nm UV检测仪监测出峰后对主峰进行收集。

试验结果见表1。

表1不同填料对分离效果(纯度和收率)的影响

从实验结果可以看出，填料对于酰化胰岛素的纯化效果最好，表现在纯化后样品纯度较高，达到99.28％，且纯化收率也较高，因此优选C8填料作为酰化胰岛素的纯化用填料。

实施例2考察A相不同的pH洗脱条件下对样品分离效果的影响

粗样样品为由去B30的重组人胰岛素和棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯一步反应制得的酰化胰岛素溶液，制备方法同预备实施例1，粗样纯度为56％；色谱纯化方法采用高级硅胶载体()在半制备型色谱柱(50mm×250mm)上进行，装填压力为7-10MPa；洗脱用流动相A相：20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，采用盐酸或者氢氧化钠调节pH分别为3.5和7.5；洗脱用流动相B相：乙腈-水(按体积比9：1混合)；保持柱子温度为20-25℃；洗脱流速为82.5ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤同实施例1，采用线性梯度洗脱方式将吸附在柱子上的各种物质洗脱下来，280nm UV检测仪监测出峰后对主峰进行收集。

试验结果见表2。

表2A相不同pH洗脱条件对样品分离效果(纯度和收率)的影响

从实验结果可以看出在A相偏碱性(pH7.5)的洗脱条件下，对目的蛋白的纯化效果明显好于偏酸性(pH3.5)洗脱条件下的结果，主要表现在A相为pH7.5的洗脱条件下，纯化后样品纯度更高，达到99.25％，且纯化收率也更高，达90.9％。因此，本发明认为对于采用高级硅胶载体填料纯化酰化胰岛素，采用偏碱性的洗脱条件更容易得到纯度和收率都更高的样品。

本发明进一步围绕A相pH7.5的洗脱条件对pH条件又进行优化，选择pH6.5、7.0、7.5和8.0四个pH条件开展纯化试验，试验过程与以上一致。

试验结果见表3。

表3A相不同pH洗脱条件下对样品分离效果(纯度和收率)的影响

从表3试验结果看，当A相pH6.5至8.0时，目的蛋白纯化后的纯度和收率都较高，尤其当A相为pH7.0时，洗脱下来的目的蛋白纯度最高，达99.55％，且纯化收率也最高，且具有统计学意义上的显著性差异。因此，可认为A相pH7.0为最佳的pH条件。

实施例3分段收集样品确定纯化后样品纯度及得率

粗样样品为由去B30的重组人胰岛素和棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯一步反应制得的酰化胰岛素溶液，方法同预备实施例1；色谱纯化方法采用高级硅胶载体填料()在半制备型色谱柱(50mm×250mm)上进行，装填压力为7-10MPa；洗脱用流动相A相：20mmol/L磷酸盐缓冲液，调节缓冲液中磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的比例，使A相pH为7.0，洗脱用流动相B相：乙腈-水(按体积比9：1混合)；保持柱子温度为20-25℃；洗脱流速为82.5ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤同实施例1，采用等度洗脱方式将吸附在柱子上的各种物质洗脱下来，280nm UV检测仪监测出峰后分段收集，按每分钟收集一个样品。

试验结果见表4。

表4按每分钟分段收集样品的收峰情况和各样品分析检测结果汇总

样品粗样进行分析检测，纯度为57％，将2#至6#样品混合，进行分析检测，纯度为99.49％。同时，根据表4结果可知，2#至6#样品的总收率为92.4％。说明根据实施例3的方法，纯化后纯度达到99.49％的样品收率为92.4％。同时，根据表4结果还可知，1#至8#样品的总收率为99.5％，说明几乎所有的目的蛋白都被洗脱下来，收率结果准确。

实施例4酰化胰岛素的制备型色谱纯化方法

粗样样品为预备实施例1由去B30的重组人胰岛素和棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯一步反应制得的酰化胰岛素溶液，方法同预备实施例1；色谱纯化方法采用高级硅胶载体层析填料()在半制备型色谱柱(50mm×250mm)上进行，装填压力为7-10MPa；洗脱用流动相A相：40mmol/L Tris缓冲液，采用盐酸和氢氧化钠调节A相pH为8.0，洗脱用流动相B相：乙醇-水(按体积比9：1混合)；保持柱子温度为20-25℃；洗脱流速为82.5ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤同实施例1，采用等度洗脱方式将吸附在柱子上的各种物质洗脱下来，280nm UV检测仪监测出峰后对主峰进行收集。

试验结果为：样品粗样进行分析检测，纯度为54％，纯化后样品纯度为99.17％，收率为91.3％。

实施例5酰化胰岛素的制备型色谱纯化方法

粗样样品为由去B30的重组人胰岛素和棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯一步反应制得的酰化胰岛素溶液，方法同预备实施例1；色谱纯化方法采用高级硅胶载体层析填料()在半制备型色谱柱(50mm×250mm)上进行，装填压力为7-10MPa；洗脱用流动相A相：200mmol/L硼酸-硼砂缓冲液，采用盐酸和氢氧化钠调节A相pH为7.5；洗脱用流动相B 相：乙腈-水(按体积比9：1混合)；保持柱子温度为20-25℃；洗脱流速为82.5ml/min；检测波长为280nm。

试验结果为：样品粗样进行分析检测，纯度为56％，纯化后样品纯度为99.11％，收率为90.8％。

试验例1本发明与相关中国专利在主要工艺参数及纯化效果的比较

本发明酰化胰岛素的色谱纯化方法与已公开的相关中国专利在主要工艺参数及纯化效果的比较见表5。

表5主要工艺参数及纯化效果的比较结果

本发明通过采用高级硅胶载体填料，在碱性(pH7.0-8.0)洗脱液环境下，可一步将酰化后粗样纯度由50-60％提高至99.0％以上，且纯化后样品收率稳定在90％以上，纯化后样品纯度和收率都远高于现有技术所获得的成果。

另外，本发明粗样样品的上样量大，超过16克/升床层体积，远大于已公开的专利或技术中提到的胰岛素类似物色谱纯化上样量，极大的节省了纯化成本；色谱纯化过程中线性流速高达250cm/h，可做到对胰岛素类似物的快速纯化，更好的避免在色谱纯化过程中目的产物发生不利反应，如脱氨反应等，从而影响样品纯度和收率。

Claims

1.一种酰化胰岛素的色谱纯化方法，包括以下步骤：（1）以硅胶载体作为层析填料，将色谱柱用平衡液进行平衡，将待纯化的酰化胰岛素粗品上样，用平衡液平衡色谱柱；（2）用洗脱用流动相进行洗脱，收集主峰，得到目的产物酰化胰岛素；其中，洗脱用流动相由A相和B相组成；其特征在于：所述A相的pH值为7.0-8.0；

按照体积比计，步骤（1）所述平衡液由75%-90%的A相和10%-25%的B相组成；

所述层析填料选自C4-5µm-100Å，C8-5µm-100Å或C18-5µm-100Å中的任意一种；所述A相为磷酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液中的任意一种；所述B相由乙腈或乙醇与水组成；

所述待纯化的酰化胰岛素粗品是由去B30的人胰岛素和选自以下任意一种的脂肪酸酯反应制得的酰化胰岛素溶液：棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯、辛酸N-琥珀酰亚胺基酯或肉豆蔻酸N-琥珀酰亚胺基酯。

2.按照权利要求1所述的色谱纯化方法，其特征在于：所述A相的pH值为pH 7.0。

3.按照权利要求1所述的色谱纯化方法，其特征在于：所述B相由乙腈和水按体积比9：1组成；或者由乙醇和水按体积比9：1组成。

4.按照权利要求1所述的色谱纯化方法，其特征在于：所述层析填料的平均粒度为5-30μm。

5.按照权利要求4所述的色谱纯化方法，其特征在于：所述层析填料的平均粒度为5-10μm。

6.按照权利要求1所述的色谱纯化方法，其特征在于：所述平衡液由80%的A相和20%的B相组成。

7.按照权利要求1所述的色谱纯化方法，其特征在于：按照体积比计，步骤（2）所述洗脱用流动相由50%-60%的A相和40%-50%的B相组成；

所述洗脱的方式为等度洗脱方式或者线性梯度洗脱方式。

8.按照权利要求7所述的色谱纯化方法，其特征在于：步骤（2）所述洗脱用流动相由55%的A相和45%的B相组成。

9.按照权利要求1所述的色谱纯化方法，其特征在于，所述人胰岛素包括：有机合成的人胰岛素或重组人胰岛素。