HU217103B - Fúziós fehérje, eljárás fúziós fehérjék IgA-proteázok alkalmazásával történő enzimes hasítására - Google Patents

Abstract

Fúziós fehérje és eljárás rekőmbináns fehérjék fúziós fehérjékenzimatikűs hasítással történő előállítására, amely abban áll, hőgy i)géntechnőlógiai eszközökkel a fúziós fehérje két részét összekötőátmeneti régiót úgy módősítják, hőgy ebben az átmeneti régióbanlegalább egy, Y–Prő·!·X–Prő aminősavszekvenciájú IgA-prőteáz-felismerőhelyet alakítanak ki, ahől X egy tetszőleges aminősav, és Y egy vagytöbb tetszőleges aminősav lehet, ii) az i) lépésben kapőtt fúziósfehérjét a felismerőhely ·!· jellel jelölt pőzíciójában IgA-prőteázzalhasítják, és iii) hasítás űtán a kívánt fehérjét kinyerik. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás biotechnológiai úton nyert fehérjék szekvenciaspecifikus hasítására IgA-proteázok (melyeket „Igase”-oknak is neveznek) felhasználásával, különösképpen eljárás rekombináns fehérjék, illetve peptidek prokariótákban történő előállítására és az N-terminális szekvencia ezt követő eltávolítására.

A fehéijék biotechnológiai előállítása előnyösen olyan mikroorganizmusok segítségével történik, amelyek könnyen tenyészthetők, és a termelt fehérjék egyszerű módon kinyerhetők. Erre a célra alkalmas mikroorganizmus például a baktériumok közül a gramnegatív Escherichia coli, a grampozitív Streptococcus camosus, valamint az élesztők közül a sütőélesztő, Saccharomyces cerevisiae. Autentikus idegen gének kifejezése az ilyen mikroorganizmusokban mégis gyakran hátrányokkal jár. E. coliban például a természetes fehéijék transzlációfüggő N-terminális metionincsoportja legtöbbször proteázok révén nagyrészt lehasad. Idegen fehérjék esetén azonban az első metionincsoportnak ez a lehasadása többnyire csak részleges. Következésképpen alkalmas útnak mutatkozik, hogy az ilyen fehérjéket egy meghatározott aminovéggel állítsák elő, elsősorban fúziós fehéijék formájában, és ezt követően egy szekvenciaspecifikus proteázzal adott helyen hasítsák.

Az ilyen fúziós fehéijék ezen túlmenően az autentikus fehérjékkel szemben azon előnnyel is rendelkezhetnek, hogy a mikroorganizmus sejtjében aggregálódnak és sűrű csapadékot („Inclusion Bodies”) képeznek, amely az egyéb sejtrészecskéktől csekély ráfordítással leválasztható, és ezáltal a kívánt fehéije izolálását és tisztítását megkönnyítik.

Másrészről a hordozófehéqék, amelyeket géntechnológiai eljárás segítségével először a tulajdonképpen előállítandó fehéijéhez fuzionálnak, különleges stabilitást biztosítanak a fúziós partnernek a nem specifikus proteolitikus lebontással szemben. A sejt számára idegen polipeptidek lebontásának problémája különösen a kis peptidek géntechnológiai előállítását érinti. Ugyanakkor más hordozófehéqék lehetővé teszik, hogy a kívánt fehéijék meghatározott sejtrészekbe irányuljanak, amelyekből különösen könnyen kinyerhetők, ahol különösen stabilak és/vagy ahol tesztcélokra hozzáférhetőek. Végül a hordozófehéqék speciális tulajdonságokkal is rendelkezhetnek, amelyek például affmitáskromatográfiával történő tisztítást tesznek lehetővé. A legtöbb felhasználási területen a fúziós fehérjéket részesítik előnyben, melyek a hordozófehérjét az aminovégen és a kívánt fehéqét a karboxivégen tartalmazzák. De bizonyos esetekben a fordított változat vagy a kívánt fehéqe két fúziós partnerrel történő összekapcsolása is kívánatos lehet. Továbbá a kívánt fehéqe reiterációja a fúzión belül is előnyös lehet.

Egy ilyen jellegű fúzióból a kívánt peptid szabad formában történő előállításához a kovalensen kötött fúziós partnerek hasítása szükséges. Ez elvileg kémiai vagy biokémiai (enzimatikus) eljárásokkal érhető el. Az eddig rendelkezésre álló eljárások limitált specifitása azonban a hasítást többnyire korlátozza, mert fontos a kívánt fehérje elnyerése céljából, hogy egy ilyen jellegű hasítás a fúziós partnerek közötti hasadószekvenciában, tehát az átmeneti régióban, de semmi esetre sem továbbmenően magán a kívánt fehérjén belül következzen be. Ezért a fúziós partnerek hasítását igen specifikusan kell elvégezni.

A fúziós fehéijék szekvenciaspecifikus szétválasztására az eddig alkalmazott kémiai eljárások például egy fehérjén belüli metionin aminosavrész bróm-ciánnal történő hasítása és az Asp ·! Pro aminosavak között savas közegben, hangyasavval történő hasítás. Ezek az eljárások azonban csak akkor alkalmazhatók, ha a kívánt fehérjében a specifikus hasítóhely, eltekintve a fúziós partnerhez vivő átmeneti régiótól, csak egyszer fordul elő. Általában a kémiai eljárásokkal szemben azonban a biokémiai eljárásokat részesítik előnyben, mivel az utóbbiak többnyire fiziológiai vagy legalábbis enyhe kémiai reakciókörülmények között kivitelezhetők, amelyek a kívánt fehéqét nem károsítják.

A fúziós fehéijék hasítására szolgáló biokémiai eljárások leginkább specifikus proteázok felhasználásán alapulnak. Például a tripszin az arginint vagy a lizint követő peptidkötéseket hasítja a fehérjéken belül. A lizin előzetes kémiai módosításával a specifitás növelhető, és ezáltal az arginin specifikus felismerése csökkenthető (redukálható). Egy további, a biotechnológiában alkalmazott proteáz a Clostripain, ez az enzim a peptidkötéseket az arginin és az ezt követő, tetszőleges aminosav között hasítja. Azon enzimes eljárásokról, amelyeket eddig a fúziós fehérjék hasítására alkalmaztak, egy áttekintés olvasható F. A. O. Marsion összefoglalójában (D. M. Glover, E.: DNA cloning III, IRL PRESS Oxford és Washington DC, 1987). Az enzimes hasító eljárások felhasználása is korlátozódik azáltal, hogy a hasítóhelyekre jellemző specifikus aminosav(ak) egyidejűleg az előállítandó fehérjében magában is előfordulhatnak.

A fehéijefüziók biokémiai hasítására ezért különösen olyan enzimek alkalmasak, amelyek a hasításhoz nemcsak egy aminosavat ismernek fel, hanem az aminosavak sorrendjét is felismerik, mert annak a valószínűsége, hogy egy bizonyos aminosavsorrend a fúziós partnerek közötti hasítóhelyen kívül magában, a kívánt fehérjében is még egyszer előfordul, annál csekélyebb, minél nagyobb a hasítószekvencia felismeréséhez és hasításához szükséges aminosavak száma.

Ismertek olyan proteázok, amelyek egy bizonyos fehérjét nagyon specifikusan hasítanak. Bár az ilyen szelektív proteázok többsége (amelyek például az emberi komplement- és véralvadásrendszerben előfordulnak) a szubsztrát egy meghatározott helyén hasít, a megfelelő hasító régió egy másik fehérjébe (például fúziós fehérje) történő átvitele esetén, az ilyen jellegű proteázok rendszerint még sincsenek abban a helyzetben, hogy hasítsanak. Ennek a jelenségnek sokféle oka van, melyek például a szubsztrát meghatározott szekunder vagy tercier struktúrájának a proteáz által történő felismerésén vagy a fúziós fehérjékben a hasítóhelyek hozzáférhetőségén alapulnak.

A szekvenciaspecifikus proteázok sora, amelyeket eddig a fúziós fehérjék hasítására feltételesen alkalmaztak, jelenleg az Xa faktorral kezdődik. Ez a proteáz

HU 217 103 Β specifikusan hasítja az Ile-Glu-Gly-Arg-! X szekvenciát, ahol ·! · a hasítóhely és X egy tetszőleges aminosav. Azonban bebizonyosodott, hogy általánosan a fúziós fehérjék - amelyek a megfelelő hasítószekvenciát az átmeneti régiójukban hordozzák - hasítására ez a proteáz sem alkalmazható. Az ilyen szubsztrátok (azaz a fúziós fehéijék, amelyekben a kívánt fehéije a hordozó fehérjében kovalensen kötött) gyakran egyáltalán nem vagy csak csekély mértékben, vagy csak oldott formában hasadnak.

A fúziós fehéijék hatékony hasításának különös jelentősége van a rekombináns fehéijék prokarióta szervezetekben történő előállításánál. Ennek során ugyanis szükséges egy olyan DNS-szekvencia klónozása, amely a tulajdonképpeni DNS-szekvencia előtt kezdő ködönként egy AUG kodont tartalmaz. Ennek következtében prokariótákban, mint például E. coliban egy olyan rekombináns fehéije fejeződik ki, amely az első aminosav helyén (1-es pozícióban) metioninrészt tartalmaz. Sok esetben azonban az szükséges, hogy az 1-es pozícióban metioninmentes rekombináns fehérjéket állítsanak elő. Az ilyen fehérjék kinyerése például egy metioninspecifikus peptidáz segítségével történhet, amely az N-terminális metionint hasítja. Ez az eljárás azonban nagyon költséges, mivel a lehasadás (mértéke) csak fehérjeszekvenálás által állapítható meg. Ezenkívül az 1-es pozícióban metionintartalmú és a metioninmentes fehéije elválasztása a majdnem azonos molekulasúlyuk miatt igen nehéz, és nem valósítható meg tökéletesen.

A 84/02351 számon nyilvánosságra hozott PCTbeli szabadalmi bejelentésből megismerhető egy Nterminális aminosav lehasítása egy fúziós fehérjéről. Az eljárás során egy exopeptidázzal, előnyösen leucin peptidázzal, lépcsőzetes hasítással távolítják el a fehérje aminosavait az N-terminálistól kezdődően egészen az X-Pro szekvenciáig. Ebből a termékből az X-Pro szekvenciát vagy két lépésben, vagy egy egylépéses reakcióban, postprolin-dipeptidál-amino-peptidáz (EC. 3.4.14) alkalmazásával távolítják el. Ez az eljárás azonban azzal a hátránnyal jár, hogy a fehéije aminosavainak N-terminálistól kezdődő, lépcsőzetes lehasítása következtében nem egységes termék, hanem minden esetben egy termékkeverék keletkezik, amely a kívánt termék mellett nem teljes fehérjéket, valamint nagymértékben lebontott fehéijéket is tartalmaz.

A 020 290 számú európai szabadalomból egy további eljárás ismert a fúziós fehérjék enzimatikus hasítására. Ezen eljárás során a fehéije fúziós részeinek hasításához a kollagenáz enzimet alkalmazzák egy meghatározott felismerőszekvencia segítségével. Majd a fúziós részek aminosavait egy ezt követő, további enzimatikus kezeléssel távolítják el. Megállapították azonban, hogy a kollagenáz és egyéb endopeptidázok is csak csekély specifitással rendelkeznek [lásd Biochim. Biophys. Acta 271, 133-144 (1972)]. Továbbá ezen túlmenően a kollagenázok csak azon fehérjék esetén aktívak, amelyek egy specifikus térbeli struktúrával rendelkeznek.

Ismert az is, hogy a fehérjék N-terminális fúziós részeinek hasításához a már említett Xa faktort is felhasználják. A hasítási hatékonyság már említett problémája mellett azonban ez az eljárás is mutat további hátrányokat, éspedig azáltal, hogy esetleg a fehéije belső szekvenciái is felismerhetők és hasadnak. Ezen túlmenően az Xa faktort marhaszérumból kell izolálni, melynek következtében a terápiásán alkalmazott fehérjék hasítását követően szükség van egy költséges tisztításra és analitikai eljárásra, hogy az esetleg előforduló patogén faktorokat, illetve vírusokat kimutassák.

Különböző patogén baktériumfajok (mint például a Neisseria gonorrhoea és Neisseria meningititis a Neisseria nemzetségből, vagy mint a Haemophilus influenzáé és H. aegypticus a Haemophilus nemzetségből), amelyek az emberi nyálkahártyán növekszenek, rokon szekvenciájú proteázokat választanak ki, amelyek a humán IgAl-re specifikusak, és ezért összefoglalóan IgAproteázoknak vagy „Igase”-oknak is nevezik őket. Az immunglobulin IgAl igen fontos komponense a kiváltott immunválasznak, amelynek az ilyen patogén organizmusok infekcióival szemben kell védelmet nyújtania. [Áttekintés: Komfeld és Plánt, Rév. Infect. Dis., 3, 521-534 (1981)]. Emellett az IgA-protáz autoproteolízis révén a saját előfehéijéjét is hasítja. A Neisseria gonorrhoea MSI 1-ből származó IgA-proteáz képződését autentikus baktériumtörzsben, valamint gramnegatív gazdasejtekben már részletesen leírták (DE 36 22 221.6).

Az IgA-proteáz a következő felismerőszekvenciákat hasítja, amelyeket például Pohlner és munkatársai [Natúré, 325,458-462 (1987)] leírtak:

1. Pro-Alá-Pro·! Ser-Pro

2. Pro-Pro ·! · Ser-Pro

3. Pro-Pro ! -Ala-Pro

4. Pro-Pro ! Thr-Pro

- ahol a ! · szimbólum az IgA-proteáz általi hasítóhelyet jelenti. Az IgA-proteáz klónozását is leírták ugyanott Pohlner és munkatársai (1987).

A jelen találmány célja tehát a fúziós fehéijék biokémiai (enzimatikus) hasítására egy javított eljárás kidolgozása, mely szerint a géntechnológiai úton előállított fúziós fehérjéket, amelyek tetszőleges fúziós partnerekből és az átmeneti régióban egy specifikus hasítószekvenciából állnak mint szubsztrátokat alkalmazzuk a kívánt fehérjék lehetőleg magasabb hozammal és reprodukálhatóan történő kinyeréséhez.

Ezt a feladatot géntechnológiai úton oldottuk meg oly módon, hogy a fúziós fehérjék átmeneti régiójába bevezettük a Pro ! - X-Pro felismerőhelyet, illetve hasítószekvenciát, és ezen hasítószekvenciát specifikusan hasítottuk egy IgA-proteázzal a ·! · szimbólummal jelölt hasítóhelyen, ahol X helyén előnyösen Ser, Thr és Alá, és különösen előnyösen Ser vagy Thr áll, de más aminosav is állhat.

A találmány tárgya tehát eljárás fúziós fehérjék enzimatikus hasítására és ezen fúziós fehérjék kívánt részének kinyerésére, amely azzal jellemezhető, hogy (l)egy átmeneti régiót - amely a fúziós fehérje két részét egymással összekapcsolja - géntechnológiai eszközökkel úgy módosítunk, hogy ebben az átmeneti régióban egy Y-Pro·! X-Pro aminosavszekvenciájú IgA-proteáz-felismerő hely keletkezzen,

HU 217 103 Β ahol X egy tetszőleges aminosav és Y egy vagy több tetszőleges aminosav lehet, (2) az (1) lépésben keletkező fúziós fehérjét a felismerőhely ·! jellel jelölt pozíciójában IgA-proteázzal hasítjuk, és (3) hasítás után a fúziós fehérje egy vagy több kívánt részét kinyerjük.

Az „IgA-proteáz” fogalmába a találmány szerint mindazon proteázok beletartoznak, amelyek az IgA-t specifikusan hasítják, amelyek például a Rév. Infekt. Dis., 3, 521-539 (1981) irodalmi helyen vannak leírva. Ugyancsak alkalmasak a rekombináns IgA-proteázok is, amelyeket például a 36 22 221 NSZK-beli közrebocsátási iratban, a Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

79, 7881-7885 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

80, 2681-2685 (1983); Natúré, 325, 458-462 (1987) és EMBO Jour., 31, 1595-1601 (1984) cikkekben írtak le.

A fúziós fehérjék átmeneti régiójának módosítása a találmány szerinti eljárással előnyösen úgy valósítható meg, hogy a fúziós fehérjék átmeneti régiójába beépítünk egy DNS-szekvenciát, amely az IgA-proteáz-felismerő helyet vagy annak egy részét kódolja, ahol ez a DNS-szekvencia előtt és/vagy után egy vagy több, a fehéijefüzió kívánt részeit kódoló DNS-szakasz van beépítve. Erre a célra előnyösen kémiai ütőn szintetizált nukleotidszakaszt alkalmazunk.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárás különösen alkalmas olyan fúziós fehérjék hasítására is, amelyek eredetileg (azaz az átmeneti régió módosítása előtt) semmilyen természetes IgAproteáz-felismerő hellyel nem rendelkeztek.

A találmány szerinti eljárásban az IgA-proteáz-felismerő hely az Y-Pro ! X-Pro konszenzus aminosavszekvenciával rendelkezik, ahol X egy tetszőleges aminosavat és Y egy vagy több tetszőleges aminosavat jelent. X jelentése előnyösen szerin, treonin vagy alanin. Y jelentésére több aminosavszekvencia állhat, amelyek Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro vagy Pro-Ala-Pro-Arg-Pro szekvenciával végződnek.

A találmány szerinti eljárás tehát magában foglalja a legalább Pro ! X-Pro konszenzus hasítószekvenciájú IgA-proteáz-felismerő hely bevezetését egy tetszőleges fúziós fehérje átmeneti régiójába, például a hordozó fehérje és a kívánt fehérje közé, majd a hasítást és a kívánt fehérje kinyerését egy IgA-proteáz felhasználása által. A Pro ! X-Pro hasítószekvenciában X helyén előnyösen Ser, Alá vagy Thr aminosav állhat. A hasítás további optimalizálásához a hasítószekvencia megjelölt helyére további speciális aminosavakat lehet beiktatni, különösen Pro-t.

Különösen előnyösek az alábbi aminosavszekvenciák:

a) Pro-Ala-Pro ! · Ser-Pro,

b) Pro-Pro ·! · Ser-Pro,

c) Pro-Arg-Pro-Pro ·! · Ala-Pro,

d) Pro-Pro ! Thr-Pro,

e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro! -Thr-Pro oder,

f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro·! Thr-Pro.

Amennyiben a találmány szerinti eljárást olyan fúziós fehéijék hasítására alkalmazzuk, amelyekben a kívánt fehérje a hordozó fehérje után következik, az IgAproteázzal történő hasítás során olyan fehérje keletkezik, amelynek aminoterminálisa az X-Pro szekvenciával jellemezhető. Ez a szekvencia lehet a kívánt fehérje része előtagként, utótagként. Ez a szekvencia általában akkor szerepel előtagként, ha a géntechnológiai úton előállított kívánt fehérje természetes formájában is tartalmazza az aminoterminálisán az X-Pro-nak megfelelő mindkét aminosavat. Az aminoterminálison X-Proval jellemzett fehérjék, amelyek a biotechnológiában fontosak, a természetben is előfordulnak.

A találmány szerinti eljárás minden más, a fúziós fehérjék hasítására szolgáló ismert eljárással szemben azon előnyökkel rendelkezik, hogy meglepő módon általánosan alkalmazható minden olyan fúziós fehérjére, amelyek a megadott hasítószekvenciát az átmeneti régiójukban hordozzák, és hogy az oldhatatlan, oldott, membránasszociált és a sejthez kötött fehérjefúzióknál is alkalmazható. Különös előnye az eljárásnak ezen túlmenően, hogy lehetőséget nyújt olyan fúziós fehérjék, illetve fehérjefúziók hasítására, amelyek a mikroorganizmusokban precipitátumok formájában keletkeznek, és amelyekből azok - mint ilyenek - könnyen dúsíthatok. Az eljárás egy további előnye abban áll, hogy az alkalmazott hasító enzim, az „Igase” nem patogén baktériumok tenyészetéből csekély ráfordítással kinyerhető.

Az „Igase” számára szükséges hasítószekvencia beépítése a fehérjefúzió átmeneti régiójába géntechnológiai eszközökkel kivitelezhető. így például a nukleotidoknak egy sorrendje, illetve egy nukleotidszekvencia, amely a hasítószekvenciát vagy annak egy részét kódolja, kémiai úton szintetizálható, és egy kívánt fehérje DNS-szakaszai közé ismert géntechnológiai eszközök segítségével beépíthető. A nukleotidok egy természetes sorrendje is ennek megfelelően, amely az alkalmas hasrtószekvenciát vagy annak egy részét kódolja, beépíthető. A fehérjefúziót kódoló gén előnyösen egy alkalmas (előnyösen indukálható) expressziós szignálszekvencia kontrollja alatt áll, úgy, hogy a követelményeknek megfelelő fúziósfehérje-termék fejeződik ki. A fehérjefúziók termelésére szolgáló gazdasejtekként alkalmas prokarióta és eukarióta (növényi, valamint állati) sejtek felhasználhatók, azonban sejtmentes rendszerek is alkalmazhatók. Az eljárás során alkalmazott hordozófehérjék bármilyen fúnkciójúak lehetnek, attól függően, milyen tulajdonságokat kell a fehérjefúzióknak kölcsönözniük, mint például meghatározott transzport funkciók, vagy funkciók, amelyek a fehérjefúziók tisztítását vagy azok stabilitását megjavítják, és még sok egyéb. Az előnyösen alkalmazott hordozófehérjéket az alábbiakban ismertetjük.

A fehéijefúziók hasítása a találmány szerinti eljárásnak megfelelően előnyösen „Igase”-okkal történik, amelyek egy túltermelődő nem patogén baktériumtörzsben képződnek, és a többlettenyészetből tisztítással kinyerhetők (lásd például DE-3622 221).

A találmány szerinti eljárás preparatív, valamint analitikai célokra is felhasználható. Preparatív alkalma4

HU 217 103 Β zás esetén az eljárás fontos fehérjék biotechnológiai előállítására szolgál, amelyek például a gyógyászatban, a kutatásban, a környezetvédelemben vagy ipari eljárásoknál, illetve termékeknél találhatnak felhasználásra. Analitikai alkalmazás esetén az eljárás - például alkalmas expressziós rendszerekkel összekapcsolva - génfúziók rutinvizsgálatára szolgálhat.

A fúziós fehérjék enzimatikus hatására és ezen fúziós fehérjék kívánt részeinek kinyerésére szolgáló találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módját az jellemzi, hogy

1) valamely sejtet egy rekombináns DNS-sel vagy egy rekombináns vektorral transzformálunk, ahol a DNS, illetve a vektor legalább egy gén kópiáját tartalmazza, amely egy fúziós fehéijét kódol, amely az átmeneti régióban legalább egy IgA-proteáz-felismerő helyet tartalmaz,

2) a transzformált sejtet egy alkalmas közegben tenyésztjük,

3) a fúziós fehérjét kódoló gént a transzformált sejtben kifejezésre juttatjuk,

4) a fúziós fehérjét IgA-proteázzal hasítjuk, és

5) a fúziós fehérjék egy vagy több kívánt részét izoláljuk.

Az eljárás során a fúziós fehéijék IgA-proteázzal történő kezelése a közegben (tenyészlében) a sejtfeltárás után és/vagy a sejtes fehérjék részleges vagy teljes elválasztása után történhet.

Egy fúziós fehérje, mindenekelőtt egy prokarióta expressziós termék kezelésére továbbá előnyös, hogy az IgA-proteázokat a szakember számára ismert módon, például a 0 141 223 vagy a 0 141 224 számú európai szabadalmakban leírtak szerint immobilizáljuk.

A találmány szerinti eljárás különösen előnyösen alkalmazható olyan rekombináns fehéijék, illetve peptidek előállítására, amelyek az N-terminálison metioninmaradékot nem tartalmaznak, olyan fúziós fehérjékből, illetve peptidekből, amelyek a Met-Y-Pro-!-X-Pro-A aminosavszekvenciával rendelkeznek, ahol X helyén egy tetszés szerinti aminosav, előnyösen Thr, Ala vagy Ser áll, Y pedig egy vagy több tetszőleges aminosavat jelent, amely előnyösen, ha X jelentése Thr vagy Ala, Pro-val végződik, vagy ha X jelentése Ser, akkor Pro-Ala vagy Pro-Pro szekvenciával végződik, és A egy tetszés szerinti aminosavszekvenciát jelent. Az eljárás folyamán a fúziós fehérjét, illetve peptidet IgAproteázzal hasítjuk, és egy X-Pro-A aminosavszekvenciájú hasítási terméket nyerünk.

Ezen eljárás például a prokarióta sejtekből származó, az N-terminálison metioninmaradék nélküli rekombináns fehérjék hasítására a következő lépéseket foglalja magában:

1) egy prokarióta sejtnek egy olyan génnel való transzformálását, amely egy Met-Y-Pro! X-Pro-A aminosavszekvenciájú fehéijét, illetve peptidet kódol, melyben X, Y és A jelentése a fentiekben megadott,

2) a transzformált sejt tenyésztését egy alkalmas közegben, és a transzformált gén kifejeződését,

3) a Met-Y-Pro-! X-Pro-A aminosavszekvenciával transzformált sejtből kifejeződött termék IgAproteázzal történő hasítását, és

4) a kapott X-Pro-A aminosavszekvenciájú, az Nterminálison metionint nem tartalmazó hasítási termék izolálását.

A találmány szerinti eljárással meglepő módon magas hozammal és jó specifitással, egy lépésben lehet az N-terminálison metioninrészt nem tartalmazó fehérjéket kinyerni, amelyek az N-terminálison az X-Pro szekvenciát hordozzák, ahol X jelentése előnyösen Thr, Ala vagy Ser.

A fúziós fehérje Y hordozó része egy legalább 1, előnyösen 1-100, különösen 1-50 tagszámú aminosavszekvenciát jelent, amely egy IgA-proteáz által felismerhető hasítószekvenciával végződik. Ha X helyén Ser áll, akkor Y előnyösen a Pro-Ala szekvenciával vagy Pro-val végződik. Ha X jelentésére Thr vagy Ala áll, akkor Y előnyösen Pro-val, még előnyösebben Arg-Pro, Pro-Arg-Pro vagy Ala-Pro-Arg-Pro szekvenciával fejeződik be.

Egy különösen előnyös kivitelezési mód esetén az Y helyén legalább 5 aminosav áll, amelyek a Pro-Ala-Pro-Arg-Pro szekvenciával végződnek. A találmány szerinti eljáráshoz azonban minden, az IgA-proteáz által felismert hasítóhely alkalmas.

Az Y hordozórész emellett még további, előnyösen 100, még előnyösebben 50-ig teqedő tetszőleges aminosavat tartalmaz. Erre előnyösen olyan aminosavszekvenciák alkalmasak, amelyek a DNS-szintjén a Met-Y-Pro-! X-Pro-A fehéije expresszióját javítják és/vagy az aminosavszinten a sejtből történő kinyerését megkönnyítik.

A Met-Y-Pro-!-X-Pro-A protein expressziója DNS-szinten például a béta-galaktozidáz gén fragmenseinek fúziója révén javítható, azaz az Y hordozórész felöleli a béta-galaktozidáz protein egy részét. Más lehetőségek a Met-Y-Pro·!-X-Pro-A protein expressziójának növelésére a szakember számára ismertek. Például egyéb - különösen hosszú - polipeptidek fúziója által [például poli(Lys, Arg)] vagy egy nagy affinitású bizonyos szubsztrátra (például sztreptavidin) való kötés által lehet az expressziós termék tisztítását és elválasztását megkönnyíteni (lásd például 0 089 626 és 0306610 számú európai közrebocsátási iratot).

A találmány tárgya továbbá egy fúziós fehéije, amely több polipeptidrészt tartalmaz, és amely a különböző polipeptidrészek közötti legalább egy átmeneti régióba beépített egy vagy több Pro·!-X-Pro szekvenciájú IgA-proteáz-felismerő hellyel rendelkezik, ahol X jelentése egy tetszőleges aminosav, előnyösen azonban Ser, Thr vagy Ala. Felismerő helyként különösen az alábbi aminosavszekvenciák előnyösek:

a) Pro-Ala-Pro ! Ser-Pro,

b) Pro-Pro·! · Ser-Pro,

c) Pro-Arg-Pro-Pro -! Ala-Pro,

d) Pro-Pro -! -Thr-Pro,

e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro -! - Thr-Pro vagy

f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro·! - Thr-Pro, ahol ! · a hasítóhelyet jelenti.

HU 217 103 Β

A jelen találmány magában foglal különösképpen egy fehérjét, illetve peptidet is, amely a Met-Y-Pro·! X-Pro-A aminosavszekvenciával jellemezhető, ahol X jelentésére előnyösen Thr, Alá vagy Ser áll, Y egy vagy több tetszőleges aminosavat jelent, és előnyösen, ha X jelentése Thr vagy Alá, Pro-val végződik, ha X jelentése Ser, akkor Pro-Alá szekvenciával vagy Pro-val végződik, és A egy tetszőleges aminosavszekvenciát jelent. Egy ilyen jellegű fehéije vagy peptid fejeződik ki a találmány szerinti eljárásban egy prokarióta sejt egy rekombináns vektorral történő transzformációja által, amely vektor legalább egy gén kópiáját hordozza, és ez a gén a fenti fehérjét, illetve peptidet kódolja.

A találmány tárgya továbbá egy rekombináns DNS, amely a találmány szerinti fehéijét, illetve peptidet kódolja, ahol a fúziós fehéije legalább egy átmeneti régiójába egy vagy több IgA-proteáz-felismerő hely, illetve hasítószekvencia van beépítve.

A találmány szerinti rekombináns DNS a molekuláris biológia területén jártas szakember számára ismert módon előállítható. Hasonlóképpen előállítható ehhez egy vektor, amely az A aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza, ezen gén 5’-végének területén restrikciós endonukleázzal vagy -nukleázokkal történő hasításával, és az oligonukleotidok, amelyek a kívánt szekvenciát tartalmazzák, újraligálásával. Az oligonukleotidnak ennélfogva egy olyan szekvenciát kell tartalmaznia, amely az IgA-proteáz hasítóhelyét vagy annak egy részét kódolja.

A találmány tárgya továbbá egy rekombináns vektor is, amely a találmány szerinti rekombináns DNS legalább egy kópiáját tartalmazza. A prokarióta szervezetekben lejátszódó fehérjeexpresszióhoz alkalmas bázisvektorok a szakember számára ismertek. Ez a vektor kedvező módon egy olyan vektor, amely lehetővé teszi a találmány szerinti rekombináns DNS magas szintű kifejeződését. Előnyösen a rekombináns DNS a vektorban egy indukálható expressziós szignál (például lambda, tac, lac vagy trp promoter) kontrollja alatt áll.

A találmány szerinti vektor lehet extrakromoszomális is (például plazmid), és a gazdasejt genomjába integrált is (például lambda bakteriofág). A találmány szerinti vektor előnyösen egy plazmid. Azok a vektorok, amelyek egy meghatározott mikroorganizmusban a génexpresszióra alkalmasak, a molekuláris biológia területén jártas szakember számára ismertek. Szóba jöhet egy eukarióta, különösen pedig egy prokarióta vektor. A találmány szerinti DNS prokariótákban történő kifejezéséhez alkalmas vektorok például a kereskedelmi forgalomban kapható pUC és pUR vektorok.

A találmány tárgya továbbá egy sejt, előnyösen egy prokarióta sejt, különösen előnyösen egy E. coli sejt, amely a találmány szerinti rekombináns DNS-sel és/vagy a találmány szerinti rekombináns vektorral van transzformálva.

A találmány szerinti eljárással egy lépésben nyerhető fehéijék, amelyek az N-terminálison az X-Pro szekvenciát hordozzák, ahol X jelentése Thr, Alá vagy Ser, például a humán eritropoietin, a humán T-sejt-receptor béta-lánca és különösen a humán granulocita stimuláló faktor (G-CSF).

A G-CSF-t mint limfokint az aktivált monociták, makrofágok és egyéb sejtvonalak egész sora szintetizálja. A limfokinek az immun-, illetőleg vérsejtes rendszer sejtjeinek érési folyamataiban vesznek részt. Stimulálják a sejtekhez diffundáló csontvelő őssejtek érését. így indukálja a G-CSF például a neutrofilek és granulociták képződését.

Mivel a G-CSF abban a helyzetben van, hogy a neutrofil sejtek populációját rövid időn belül lényegesen fokozza, ebből jelentős terápiás felhasználási terület adódik a G-CSF számára. így például a ráknál alkalmazott kemoterápia után, amikor is az immunrendszer sejtjei széttörnek, felhasználható. Továbbá alkalmazható a G-CSF csontvelő-transzplantációknál, súlyos égési sebeknél, immungyengeség által keletkező opportunista infekcióknál és leukémiánál.

A G-CSF egy szekréciós fehérjemolekula. A primer transzlációs termék ezért egy N-terminális szignálszekvenciát tartalmaz, amely a szekréció során lehasad úgy, hogy az érett G-CSF szekvenciája a +l-es és +2-es aminosavpozíciókban Thr(+l)-Pro(+2) aminosavakkal kezdődik. A prokariótákban történő G-CSF-termelődés során ez a szignálpeptid csak rosszul vagy egyáltalán nem hasad le, úgyhogy prokariótából a szignálszekvencia nélküli G-CSF előállításához az érett G-CSF-t kódoló DNS-szekvencia kezdete elé, amely fehéijeszinten Thr(+l)-Pro(+2)-vel kezdődik, iniciációs ködönként egy AUG(Met) kodont kell klónozni. Ennek következtében prokariótákban, mint E. coliban, egy olyan G-CSF fejeződik ki, amely a -1 aminosavpozícióban egy metionint tartalmaz.

A találmány szerinti eljárással egyszerű módon előállítható prokariótákból a -1 aminosavpozícióban metioninmentes G-CSF, amely a Thr(+l)-Pro(+2) aminosavakkal kezdődik.

Ez úgy történik, hogy prokariótákból egy G-CSFszármazékot nyerünk, amely az aminosavszekvencia + l-es és +2-es pozíciójában a Thr(+l)-Pro(+2) aminosavakat tartalmazza, és ez előtt a -1 pozíciótól kezdve egy olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyik az IgA-proteáz által felismerhető, és a G-CSF aminosavszekvenciájától, amely Thr(+l)-Pro(+2)-vel kezdődik, lehasítható.

Egy előnyös kiviteli mód szerint ez a származék a -1 és -2 pozíció mindegyikében Pro-t, a -3 pozíciótól a -1 pozícióig az Arg-Pro-Pro aminosavszekvenciát, a -4 pozíciótól a -1-ig a Pro-Arg-Pro-Pro aminosavszekvenciát, vagy a -5 pozíciótól a -1-ig az Ala-Pro-Arg-Pro-Pro aminosavszekvenciát tartalmazza.

Egy különösen előnyös kiviteli mód szerint ez a derivát a -6 pozíciótól a -1 pozícióig a -6 -5 -4 -3 -2 -1

Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro aminosavszekvenciát tartalmazza.

A találmány értelmében G-CSF alatt a természetes G-CSF-t, amelynek szekvenciája például a Science, 232, 61 (1986) helyen vált ismertté, valamint az ebből

HU 217 103 Β levezetett granulocita stimuláló hatású származékokat értjük, amelyek aminosavszekvenciája X(+l)-Pro(+2) aminosavakkal kezdődik. X jelentésére Thr, Ser vagy Alá, különösen előnyösen Thr áll.

A találmány szerinti G-CSF-származékok a prokariótákban történő expresszió után hasíthatok IgA-proteázokkal a +1 és -1 pozíció között [Thr( +1) és Pro(-1) között]. így egyetlen hidrolízis lépéssel egy, a -1 pozícióban metioninmentes G-CSF-t kapunk, melynek Nterminális aminosavszekvenciája a természetes G-CSF aminosavaival [Thr(+l)-Pro(+2)] kezdődik.

A G-CSF prokariótákban történő expressziója során nehezen oldódó aggregátumok (refractile bodies) képződnek, amelyek inaktívak. Mielőtt a proteint például terápiás célokra felhasználnánk, át kell alakítani aktív formájába. A szakember számára közismert eljárások (lásd például 0219874 és 0114506 számú európai közrebocsátási iratok, 84/03 711 számú PCT-beli közrebocsátási irat) során mindenekelőtt denaturálószerek hozzáadásával a proteint oldhatóvá tesszük (szolubilizáljuk), ezen lépéshez renaturálás és adott esetben további tisztítási lépések csatlakoznak. A találmány szerinti proteinek IgA-proteázzal történő kezelését véghezvihetjük a szolubilizálás előtt vagy után, vagy csak a renaturálás után. Némely esetben közvetlenül a szolubilizálás után kell az IgA-proteázos kezelést elvégezni, ekkor a szolubilizálószert (például guanidin-hidroklorid vagy karbamid) az IgA-proteáz hozzáadása előtt dialízissel el kell távolítani. Előnyösen azonban az IgA-proteázos kezelést a renaturálás után végezzük, mivel ebben az esetben különösen magas a G-CSF-kitermelés.

A G-CSF, illetve egy másik hasadó fehéije IgAproteázos kezelésének a feltételei önmagukban nem kritikusak. Előnyös mégis, ha a G-CSF-t (illetve egy másik fehérjét) az IgA-proteázhoz viszonyítva 1:1-100:1 arányban alkalmazzuk. Az átalakítást előnyösen pufferolt vizes oldatban pH=6,5-8,5 értéknél végezzük. A pufferkoncentráció előnyösen 50-300 mmol/1, adott esetben 20-100 mmol/1 nátriumklorid hozzáadása mellett. A hasítás előnyösen szobahőmérsékleten, 20-60 perc alatt megy végbe.

A szolubilizálás, a renaturálás és az IgA-proteázzal történő hasítás után az így kapott hasítási terméket előnyösen ioncserélővel és méret szerinti írakcionálással tisztítjuk. Az ilyen módon előállított és a -1 pozícióban metioninmentes G-CSF a szennyező egyéb fehérjéket 0,1% alatt, előnyösen ICE³ %-ban tartalmazza.

A -1 pozícióban metioninmentes G-CSF-t az IgAproteázos hasítással tehát gyakorlatilag kvantitatíve el lehet választani, illetve megtisztítani a metionint tartalmazó fúziós fehéij éktől.

A találmány szerinti eljárással prokariótákból egy rekombináns G-CSF-t lehet nyerni, amely kevésbé, mint 0,1%, különösen kevésbé, mint 10~³% szennyezett egyéb fehéijékkel, és kvantitatíve mentes egy olyan prokariótákból származó G-CSF-től, amely -1 pozícióban metionint tartalmaz.

A találmány tárgya továbbá egy gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként a találmány szerinti eljárással prokariótákból nyert G-CSF-t tartalmazza, adott esetben egyéb, a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó-, töltő- és segédanyagokkal együtt. Egy ilyen gyógyszerkészítmény különösen olyan terápiás kezelésekre alkalmas, ahol a granulociták, különösen a neutrofílek képződését elő kell segíteni.

A találmány szerinti gyógyászati készítményeket előnyösen injekció és infúziós oldat formájában lehet alkalmazni. Ez olyan módon történhet, hogy egy már beadásra kész oldatot állítunk össze, amely a találmány szerinti összetétellel bír. Az is lehetséges azonban, hogy a gyógyszerkészítményt liofilizátum formájában szereljük ki. Ezeket lehet aztán önmagában ismert, injekciós célra alkalmas anyagokkal vagy oldatokkal rekonstruálni. Injekciós közegként előnyösen vizet alkalmaznak, amely az injekciós oldatoknál szokásosan alkalmazott adalékokat, így stabilizálószert, oldódást elősegítő puffért és izotóniás adalékokat, például egy fiziológiás NaCl-oldatot tartalmaz. Hasonló jellegű adalékok például a mannit, tartarát- és citrátpuffer, etanol, komplexképzők, mint például az etilén-diamin-tetraecetsav és ennek nem toxikus sói, valamint nagy molekulájú polimerek, mint a folyékony polietilén-oxid a viszkozitás szabályozására. A folyékony hordozóanyagokat az injekciós oldatokhoz sterilizáljuk és előnyösen ampullákba töltjük.

Végül a jelen találmány magában foglalja a prokariótákból származó, a -1 pozícióban metioninmentes G-CSF felhasználását is a találmány szerinti gyógyászati készítmények előállítására.

Abban az esetben, ha egy tetszőleges fúziós protein találmány szerinti eljárással történő hasítása során az eljárás eredményeként egy X-Pro-A proteint kapunk (ahol X egy tetszőleges aminosavat és A egy tetszőleges aminosavszekvenciát jelent), amely az N-terminálisán azonban egy nem kívánt X-Pro dipeptidet hordoz, lehet ezt a nemkívánatos dipeptidet - a találmány szerinti eljárás részeként - egy további, dipeptidil-aminopeptidázos (DPAP) kezeléssel leválasztani. Dipeptidilamino-peptidázokat eddig egy egész sor mikroorganizmusban, rovarban, kétéltűben és különböző humán szövetben találtak. Ezek például az előfehéijék lépcsőzetes képződésére szolgálnak és részben kifejezetten specifikusak az X-Pro dipeptid aminoterminális lebontására (X-Pro-DPAPase, G. Kreil, Trends in Biochemical Sciences, 15, 23-26, 1990). Az „Igase”-nak és az X-Pro-DPAP-nek a találmány szerinti kombinációja által ezért a kívánt fehéij éket tetszőleges aminosawal lehet az aminoterminálison előállítani.

Az „Igase”-nak és az X-Pro-DPAP-nek a fent leírt kombinációjával most sikerült prokariótákból eltérő Nterminális aminosavszekvenciájú, a -1 pozícióban metioninmentes fehérjéket is előállítani. Ehhez elsősorban egy fúziós proteint kell előállítani, amely a Met-Y-Pro ! X-Pro-A aminosavszekvenciával rendelkezik, ahol ebben az esetben a kifejeződő fehéije kívánt részének A aminosavszekvenciája mindkét X-Pro N-terminális aminosavtól mentes.

A prokarióta sejtek Met-Y-Pro-!-X-Pro-A aminosavszekvenciájú expressziós termékét legelőször IgA-proteázzal hasítjuk úgy, hogy egy X-Pro-A szek7

HU 217 103 Β venciájú első hasítási hely keletkezzen. Ezt a fehéijét lehet aztán a fent leírtak szerint egy dipeptidil-aminopeptidázzal kezelni, amely specifikusan felismeri az X-Pro szekvenciát és a Pro után hasítja. Ezáltal egy második hasítási termék keletkezik, az önmagában tetszőleges A aminosavszekvenciával. A találmány szerinti eljárás ezáltal különösen hasznosnak bizonyul az N-terminálison metioninmaradékot nem tartalmazó különböző fehéijék előállítására, és nincs korlátozva csak olyan fehérjék előállítására, amelyek az N-terminálison X-Pro szekvenciájúak, ahol X előnyösen Ser, Thr vagy Alá.

Végül a találmány vonatkozik egy rekombináns DNS-re is, amely egy - a fentiekben definiált - IgAproteáz-felismerő helyet kódoló területet tartalmaz, és beépíthető egy fúziós fehérje átmeneti régiójába.

Előnyösként egy kémiai úton szintetizált DNS-ffagmens jön szóba, melynek végein kedvező módon egy vagy több alkalmas restrikciós hasítóhely található.

A fogalmak definíciói:

A találmány szerinti eljárás a kívánt fehéijék biotechnológiai úton való előállítását foglalja magában. Biotechnológiai út alatt - ezzel összefüggésben - azt értjük, hogy egy kívánt fehéije vagy ugyanannak egy köztiterméke géntechnológiai eszközök és egyéb biotechnológiai eljárások felhasználásával (például mikroorganizmusok fermentációja) keletkezik.

Egy kívánt peptid egy köztitermék vagy egy végtermék, amely például a gyógyászat, kutatás területén, a környezetvédelemben vagy az ipari eljárásoknál vagy termékeknél felhasználásra találhat.

A találmány szerinti eljárás magában foglalja egy fúziós proteinből (amit fehérjefúziónak is nevezünk) egy kívánt fehéije képződését, ahol a fúziós fehérje, illetve fehéijefúzió több, egymással kovalensen összekötött fúziós partnerből tevődik össze. A fúziós partnerek közül legalább az egyik a kívánt fehéije. A fúziós fehérjén belül a fúziós partnerek sorrendje és azok ismétlődési száma tetszőleges, mégis előnyösen a fúziós protein egy aminoterminálison lévő hordozó- és egy karboxiterminálison lévő kívánt proteinből áll.

A hordozófehéqe, illetve annak egy része arra szolgál, hogy a fúziós protein formában lévő kívánt fehérének különleges tulajdonságokat kölcsönözzön. Ilyen tulajdonságok fejeződnek ki például a fúziós fehéijék megnövekedett stabilitásában, amely a szerkezeti sajátosságokon alapul, és ezáltal nagyobb rezisztenciát biztosít a sejten belüli proteázokkal szemben, vagy pedig a fúziós proteinek egy csekélyebb proteolitikus aktivitású területre történő transzportján alapul. Továbbá a hordozó fehérjében kialakíthatók olyan tulajdonságok, amelyek a fúziós fehéije hatékony tisztítását teszik lehetővé. Ezek közé tartozik például egy meghatározott ligandum megkötése az affinitáskromatográfiás módszerekkel összefüggésben, a fúziós proteinek leválása a csekély ráfordítással leválasztható csapadékrészecskékbe és a fehérjék könnyen hozzáférhető helyekre történő transzportja.

Azokat a területeket a fúziós fehérjén belül, amelyekben a fúziós fehéije komponensei (a hordozófehérje és a kívánt fehéije) egymással összeköttetésbe lépnek, átmeneti régióknak nevezzük. Minden egyes átmeneti régió egy vagy több aminosavsorrenddel definiálható. Az aminosavsorrendeket (mint az aminosavak és fehéijék minden más sorrendjét is) az aminoterminálistól (balról) a karboxiterminális irányába (jobbra) értelmezzük és állítjuk elő.

A találmány szerinti eljárás keretébe tartozó minden olyan, az átmeneti régióban lévő aminosavsorrendet, amelyet az IgA-proteázoknak hasítaniuk kell, a találmány szerinti hasítószekvenciának, illetve felismerőszekvenciának nevezünk.

Mindazon helyet egy aminosavsorrend két aminosavrésze között, amelyen a fúziós protein, illetve fehérjefúzió hasítása végbemegy, hasítóhelynek nevezzük.

A találmány szerinti eljárás magában foglalja a fúziós fehéijék IgA-proteáz által történő enzimatikus hasítását az átmeneti régiókban. IgA-proteázok, illetve „Igase”-ok alatt a találmány szerinti eljárásban a Neisseria gonorrhoeae MSI 1 törzsből származó IgA-proteázt és minden egyéb, ezzel a proteázzal nukleotidszinten és képződési folyamatban rokon enzimet értünk. Ezek közé soroljuk különösen a Neisseria és Haemophilus nemzetség IgAproteázait.

Az E. coli ED 8654 mikroorganizmus DSM 2102 számon, a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (Griesebachstrasse 8, 3400 Göttingen) deponáló helyen lett letétbe helyezve.

A találmányt a következő példákkal - az ábrákkal együtt - világítjuk meg.

Az ábrák ismertetése:

Az 1. ábra az MS2-polimeráz hordozófehérje (99 aminosav) és az N. gonorrhoeae MSI 1-ből származó IgA-proteáz előfehérje β-doménje (aminosavpozíció 1195-1505) közötti fehérjefúziót mutatja be sematikusan.

Ezen két rész közötti átmeneti régió 12 aminosavból áll, és tartalmazza az IgA-proteáz számára a -Pro-Pro·! Thr-Pro- hasítószekvenciát. A hasítóhely megkonstruálására az EcoRI és HindlII restrikciós hasítóhelyek közé 4 oligonukleotid (1)-(4) lett beépítve. A polipeptid előállítását és tisztított „Igase”-zal történő hasítását közelebbről az 5. példa szemlélteti.

A 2. ábra egy proteinfüziót mutat be, amely hordozófehérjéből (az MS2-polimeráz 99 aminosavából és 6 plazmidkódolta aminosavból áll) és a humán T-limfociták CD8-proteinjének 206 aminosavából áll. A CD8protein aminosavsorrendjében megtalálható a természetes hasítószekvencia, amely az „Igase” által hasítható (lásd 6. példa).

A 3. ábra a B63* fehéijefúziót mutatja be, amelyet E. coli sejtek expressziós-szekréciós rendszerének segítségével állítottunk elő. Ez a fúzió az aminovégen a koleratoxin B alegységből (103 aminosav) áll, ezt követi egy kötőrégió (11 aminosav) az „Igase” hasítóhellyel, majd következik a karboxivégen az IgA-proteáz előfehéije β-doménjének egy része (aminosavpozíció 1097-1160). A hasítóhelyet mindkét oligonukleotid (TK 006 és TK 007) segítségével mindkét proteindoménbe beépítettük.

HU 217 103 Β

A 4. ábra a B49 és B59 fehéqefüziókat mutatja sematikusan. Azok a koleratoxin B alegységből és az IgAproteáz előfehéije β-doménjéből állnak. A két fehéije között két különböző átmeneti régiót tartalmaznak, két különböző „Igase” hasítószekvenciával (-Pro-Pro-Ala-Pro- és -Pro-Pro-Thr-Pro-). A hasítószekvenciát szintetikus oligonukleotidokkal konstruáltuk (lásd 3. ábra).

1. példa

Plazmid szerkesztése metioninmentes G-CSF kifejezésére

A szerkesztéshez a pPZ07-mgllac jelű expressziós vektort (WO 88/09373) használtuk fel. Ehhez a pPZ07mgllac jelű expressziós vektort Ncol enzimmel hasítottuk, és a kiálló végeket Mung-bean nukleázzal eltávolítottuk. Ezt követően a vektort BamHI-gyel hasítottuk. Az IgA felismerőszekvenciához DNS-szinten a következő oligonukleotidokat készítettük el.

Oligonukleotid A:

5’ AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA

CCA CTG CGA CCT CCT ACA CCA CTG GGC

CCTG3’.

Oligonukleotid B:

5’ GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG

AGG TCG CAG TGG CAT TAA TTT TTC CTC

CGA ATT 3’.

Mindkét oligonukleotidot ekvimoláris mennyiségben összekeveijük, és körülbelül 100-szoros feleslegben a fent leírt módon hasított pPZ07-mgllac jelű vektorba bevezetjük. Ligálás után a szokásos módon kompetenssé tett E. coli K12 sejteket transzformáltuk. A sejtekből a DNS-t ismert módszerek szerint izoláltuk és Apai-gyei és BamHI-gyel hasítottuk. Egy körülbelül 520 bp hosszúságú G-CSF-fragmenst a G-CSF-szekvenciából (Science, 232, 61-65, 1986) az Apai és BamHI restrikciós endonukleázok felhasználásával izoláltunk. Ezt a fragmenst a hasonlóképpen Apai és BamHI-gyel hasított vektorba ligáltuk.

2. példa

A fúziós fehéije az IgA 1-felismerőszekvencián túlmenően még peptideket is tartalmazhat, amelyek a tisztítást segítik. Ezek a sztreptavidint kódoló DNS-ből állhatnak. Ebben a sztreptavidin gént (WO 89/03422) a helyes leolvasási keretbe az IgA-proteáz-felismerő hely elé klónoztuk.

3. példa

Az 1. példában leírt plazmiddal E. coli KI 2 sejteket (ED 8654, DSM 2102) transzformáltunk, antibiotikum markerre (ampicillin) szelektáltuk azokat, és a plazmidot restrikciós analízis útján jellemeztük. Egy ilyen kiónt használtunk fel a tenyésztésre és a G-CSF expresszálására. A sejteket teljes tápközegben tenyésztjük. Ez a tápközeg literenként 16 g bactotryptont (Difco), 10 g élesztőextraktumot (Difco) és 5 g nátrium-kloridot tartalmazott. A sejteket növekedni hagytuk, míg az OD-érték 2-ről 546-ra nőtt, és ekkor 10^-3 mol/1 IPTGvel (izopropil^-D-tiogalaktopiranozid) indukáltuk. További 4 óra elteltével a sejteket centrifugálással elválasztottuk, lizozim/EDTA segítségével feltártuk, és a

G-CSF-t mint zárványtesteket (inclusion bodies) izoláltuk (IB’s, lásd 0219 874 európai közrebocsátási irat).

Az izolált, oldhatatlan G-CSF fúziós részecskék denaturálását, illetve renaturálását a 0219 874 számú európai közrebocsátási iratban leírtak szerint hajtottuk végre. A denaturálást dialízissel végeztük 6 mol/1 guanidin-hidrokloriddal szemben. Ezután egy alikvotot vettünk ki, és 5 mmol/1 kálium-foszfát-pufferrel szembeni dialízis után pH 7-en IgA-proteázzal hasítottuk (lásd 4. példa).

Alternatív megoldás, ha a denaturálás után, melyet guanidin-hidrokloridban hajtottunk végre, egy dialízist végzünk 5 mmol/1 kálium-foszfát pufferrel szemben pH 7 értéken, amely 1 mmol/1 GSH-t (glutation, redukált) és 3 mmol/1 GSSG-t (glutation, oxidált) tartalmazott. Denaturálás után hasonlóképpen egy dialízis következik 5 mmol/1 kálium-foszfát pufferrel szemben, pH 7 értéken.

4. példa

Fúziós fehérje IgA 1-proteázzal történő hasítása natív, a-l pozícióban metionint nem tartalmazó G-CSF előállítására

Az IgAl-proteázt az EMBO Jour., 3, 1595-1601 (1984) cikkben leírtak szerint izoláltuk. 10 pg, a 3. példa szerint előállított renaturált, illetve denaturált G-CSF-hoz 2-5 pg IgA-proteázt adtunk és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Különböző ioncserélő oszlopokon, mint a Mono-Q vagy Mono-S a metioninmentes G-CSF-t izoláltuk. Az aminoterminális vég fehérjeszekvenálása igazolta, hogy a tisztított G-CSF a korrekt aminosavsorrenddel Thr(+l)-Pro(+2) kezdődik.

5. példa

Fehérjefúzió előállítása és a zárványtestekből származó oldhatatlan fehérjeaggregátum hasítása egy „Igase-specifikus hasítóhelyen

A pEX31C jelű prokarióta expressziós vektort (K. Strebel: Journal of Virology, 57, 983-991, 1986) oly módon módosítottuk, hogy egy, ezzel a rendszerrel E. coli sejtekben termelődött fehéijefuzió a hordozófehérje és a kívánt fehéije között „Igase” által hasítható legyen. E célból szintetikusan előállított oligonukleotidokból egy duplaszálú DNS-fragmenst állítottunk elő, amely a Thr-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro·! Thr-Pro aminosavszekvenciát kódolja. Ezt a DNS-fragmenst a pEX31C jelű expressziós vektor EcoRI hasítóhelyére géntechnológiai módszerekkel behelyeztük. Ez után közvetlenül a HindllI hasítóhely mellé két további szintetikus DNS-fragmenst vezettünk be, amelyek egy sor alkalmas hasítóhelyet tartalmaztak a restrikciós endonukleázok számára, és terminációs szignálokat a génexpresszióban részt vevő bakteriális enzimek számára. Az így keletkezett pEV37 jelű expressziós plazmidba az Smal és HindllI hasítóhelyek használata révén egy DNS-fragmenst építettünk be, amely a Neisseria gonorrhoeae MSI 1-ből származó IgA-proteáz

HU 217 103 Β előpeptid béta-doménjét kódolta. Ezáltal egy hibrid gén keletkezett, amelynek E. coliban történő kifejeződése során egy fúziós fehérje képződött. Ez a fúziós fehérje az aminovégen hordozófehérjeként az MS2-polimeráz 99 aminosavát tartalmazta, ezután következett egy 12 aminosavból álló centrális átmeneti régió az „Igase” hasítószekvenciával és a kívánt béta-domén a karboxilvégen (lásd 1. ábra). A béta-domén a fehéijefűzió karboxilvégéről a Pro ·! · Thr hasítóhelyen az átmeneti régión belül lehasítható.

A hibrid gént tartalmazó plazmidot transzformációval vittük be az E. coli sejtekbe, amelyek a lambda bakteriofágból származó Cl⁸⁵⁷ regulációs faktort tartalmazták, mellyel a fehéijefuzió túltermelése szabályozható (E. Remant, Gene, 22, 103-113, 1983). A CI⁸³⁷represszort a hőmérséklet 28 °C-ról 42 °C-ra történő emelésével inaktiváltuk, és ennek következtében a fehérjetermék a rekombináns E. coli sejtekben aktiválódott. Ehhez 50 ml, 12 órán át 28 °C-ra növesztett E. coli tenyészetet adtunk 200 ml, előzőleg 45 °C-ra előmelegített tápközeghez, és 2 órán át 42 °C-on tovább tenyésztettük. Ebben a lépésben a fehéijefuzió nagyrészt a baktériumok citoplazmájában, zárványtestek formájában felszaporodik. A baktériumokat ez után centrifugálással elválasztottuk, 20 ml lizálópufferben (10% szacharóz, 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) szuszpendáltuk és 400 μΐ lizozimoldat hozzáadása után (5 mg/ml) 30 percig 22 °C-on inkubáltuk. Majd 0,1% végkoncentráció eléréséig Triton X-100 detergenst adtunk az oldathoz és ismét 30 percig inkubáltuk. A sejtek lizálásával szabaddá tett DNS-t ultrahangos kezeléssel széttördeltük, az oldhatatlan alkotórészeket, azaz a precipitációs részecskékben jelen lévő fúziós fehéijét lecentrifugáltuk, és végül 5 ml HINTE-pufferrel (1 M karbamid, 50 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) mostuk. Újabb centrifügálás után a maradékot ultrahangos kezeléssel 5 ml PBS-pufferben (20 mM kálium-foszfát, pH 7,5, 130 mM NaCl) szuszpendáltuk és mostuk. Ezt a műveletet többször megismételtük, hogy a karbamidnyomokat teljesen eltávolítsuk. Végül az oldhatatlan frakciót, amely a fúziós fehéijét tartalmazta, ultrahangos kezeléssel 5 ml PBSpufferben szuszpendáltuk.

A szuszpendált fúziós fehéije mennyiségét és minőségét SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (12,5%) és azt követően Coomassie-kék színezéssel határoztuk meg. A fehéijeszuszpenziót a hasításban 1/100 (W/W) enzim/szubsztrát arányban 3 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. A nem tisztított és oldhatatlan fehéqefűzió bekövetkezett hasítását SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáltuk, ahol az adódott, hogy egy polipeptid a béta-fehérjére várt mennyiségben keletkezett. Ezt a fehéijét átvittük egy nitro-cellulóz membránra és automatizált szekvenciaanalízisnek vetettük alá. A terminális aminosavak sorrendje igazolta, hogy a fehérje valóban a fehérjefúzióból keletkezett, a jelen lévő „Igase” hasítóhelyen történő pontos hasítás által.

A hasításkor azonban csak a bevitt szubsztrát összmennyiségének körülbelül 50%-a alakult át. Nagyobb mennyiségű „Igase” hozzáadásával és hosszabb reakcióidővel nem lehetett növekedést elérni. Ez azt jelentette, hogy a fúziós fehérje nem hasadó részében nem hozzáférhető a hasítóhely az „Igase” részére. A hibrid fehérje és a hasítási termékek az enzimes inkubálás után továbbra is oldhatatlan aggregátum formájában fordultak elő, és ennek következtében centrifugálással a szuszpenzióból le lehetett választani őket. A hasítás hozama elérte a 90%-ot, ha egy nem tisztított zárványtestfrakció helyett egy olyan fúziós fehérjét alkalmaztunk, amelyet előzőleg egy kiegészítő tisztítási lépésnek vetettünk alá. E célból az oldhatatlan szedimentációs maradékot HlNTE-pufferben történő mosás után (lásd fent) 5 ml H7NTE-pufferben (7 M karbamid, 50 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) felvettük. Az oldhatatlan részeket centrifugálással leválasztottuk, és az oldható frakciót 5 1 PBS-pufferrel szemben 4 °C-on dializáltuk. A karbamid eltávolításával a dialízis során a fúziós fehérje kicsapódott az oldatból oldhatatlan aggregátum formájában. A kiváló aggregátumot átalakítottuk ultrahangos kezeléssel finom szuszpenzióvá, és a fent leírt módon „Igase”-zal kezeltük, és analizáltuk.

6. példa

Egy renaturált, oldható fehérjefúzió „Igase”-zal történő specifikus hasítása

A pEX expressziós rendszer felhasználásával egy hibrid fehérjét állítottunk elő (lásd 1. példa), amely az MS2-polimeráz és a humán citotoxikus T-limfociták CD8-proteinjének egy részéből áll (lásd 2. ábra). A fehérjét előtisztítás után a zárványtestekből oldottuk H7NTE-pufferben, és további tisztítási lépésként beiktattunk egy preparativ 12,5% SDS-poliakrilamid gélelektroforézist. A fehéijefúziót mint egyetlen kötést, a Coomassie-kékkel való színezés után a gélből kivágtuk, és ezt követően Hunkapiller módszere szerint (Methods in Ensymology, 91, 227-235, 1983) a gél anyagától elválasztottuk. Ennek során elektroelúció ment végbe TAE-pufferben (40 mM Tris/acetát, pH 7,9), amelyet 0,1% SDS-hez (nátrium-lauril-szulfát) adtuk hozzá. Később az SDS-t dialízissel, szemben 5 1 TAE-pufferrel, 22 °C-on eltávolítottuk. Egy további dialízisben a fehérjét átvittük a megőrző pufferbe (20 mM káliumfoszfát, pH 7,5, 140 mM NaCl, 50% glicerin). Az így kapott oldható fúziós fehérjét tisztított „Igase”-zal inkubáltuk (lásd 5. példa), és ezáltal a CD8-molekulában lévő hasítóhelyen (-Pro-Pro·!-Thr-Pro-Alá-, lásd 2. ábra) a két polipeptidffagmens között teljesen hasítottuk. A hasítás specifikusságát a kis hasítási termékek aminovégén az aminosavsorrend analízisével vizsgáltuk. Ennél a várt szekvenciát, Thr-Pro-Ala-Pro-Thr-Ile, kaptuk.

7. példa

Egy oldható, a tenyészet felülúszójából nyert fehérjefúzió „Igase”-zal történő specifikus hasítása A koleratoxin B alegység és az N. gonorrhoeae

MSI 1-ből származó IgA-proteáz előfehéqe béta-doménjének egy részéből (Pos. 1097-1160; J. Pohlner, Natúré, 325, 458-462, 1987) álló fehéijefúziót oldható formában

HU 217 103 Β rekombináns E. coli sejtek tenyészetének felülúszójából nyertük. Hogy a két fehéqerészt egymástól elválaszthassuk, behelyeztünk géntechnológiai módszerekkel egy, az „Igase” számára alkalmas mesterséges hasítószekvenciát (Pro-Pro ! Thr-Pro-) a koleratoxin B alegység és a 5 béta-domén közötti átmeneti régióba. Erre a célra a Tk 006 és Tk 007 oligonukleotidokat beépítettük az EcoRI és SacII restrikciós hasítóhelyek közé az átmeneti régióba (lásd 3. ábra). A fúziós fehéijét egy 2 órán át, °C-on növesztett baktériumtenyészet 2 1-nyi felül- 10 úszójából ammónium-szulfátos kicsapással feldúsítottuk, és ezt követően 5 1 PBS-pufferrel szemben dializáltuk.

A hasítást tisztított „Igase”-zal, 50 gg/ml koncentrációban, PBS-pufferben, 1/50 (W/W) enzim/szulfát arány mellett, 2 órán át, 37 °C-on inkubálással végeztük. Az 15 immun-blot analízis megmutatta, hogy a teljes hasításkor keletkező nagyobb hasítási fragmens molekulasúlyában és az antiszérummal lejátszódó reakcióban megfelel a természetes koleratoxin B alegységnek.

8. példa

Fehérjefúziók „Igase”-zal történő specifikus hasítása gramnegatív baktériumok felszínén Egy megfelelő expressziós-szekréciós rendszert használunk, hogy a TKB 49 és TKB 59 fehérjefuziókat, amelyek a koleratoxin B alegységből és az IgA-proteáz β-doménjéből állnak, rekombináns Salmonella baktériumok felszínére kijuttassuk. A TKB 49 fúziós fehérjét kódoló hibrid gén a toxin és a β-domén között az átmeneti régióban az „Igase” számára az eredeti hasítószekvenciát [c) -Pro-Pro·! -Ala-Pro-] tartalmazza. Ezzel szemben a TKB 59-et kódoló génbe az EcoRI és SacII restrikciós hasítóhelyek közé beiktattunk egy mesterséges DNS-fragmenst, amely a Tk 006 és Tk 007 oligonukleotidokból áll és a hasítószekvenciát 35 (-Pro-Pro·! Thr-Pro-) kódolja (lásd 3. ábra). Ha az ilyen, a felszínükön rögzített fehérjefüziót hordozó, intakt baktériumokat tisztított „Igase”-zal inkubáltuk, akkor az Igase-hasító helyen specifikus hasítást lehetett megfigyelni. Az immun-blot analízissel ugyanis kimu- 40 tattuk, hogy a hasításkor keletkező kis hasított fragmensek nagyságukat és antiszérummal való reakciójukat tekintve megfelelnek a természetes koleratoxin B alegységnek.

9. példa

Rekombináns E. coli sejttenyészet felülúszójából származó aktív „Igase” tisztítása Rekombináns E. coli C600 sejtek, amelyek egy módosított IgA-proteáz gént hordozó pEX1070 jelű plazmidot (DE 36 22 221.6) tartalmaznak, a tenyészközegbe aktív Igase-enzimet választanak ki. Az enzimet a sejttenyészet felülúszójában membránszűréssel feldúsítottuk, és ezt követően ammónium-szulfáttal (0,42 g/ml) az oldatból kicsaptuk. Centrifügálás után a maradékot Biorex-pufferben (50 mM kálium-foszfát, pH 7,0, 8,6% glicerin) feloldottuk (1 ml puffer, 1 1 felülúszó), dialízis során 2 1 pufferrel szemben kiegyensúlyoztuk, majd kationcserélő kromatográfiának (Biorex 70) vetettük alá. A megkötött IgA-proteázt egy lépésben az elúciós pufferrel (500 mM kálium-foszfát, pH 7,0, 8,6% glicerin) az oszlopról eluáltuk és frakcionáltuk. Az IgA-proteáztartalmú frakciókat ezt követően SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (12,5%) analizáltuk. A tisztítás ezen pontján átlagos tisztítási foknak >90% adódott. Az „Igase” tiszta formában történő előállítására egy 25 gélszűrést, melyet Sephacryl HR300-zal Biorex-pufferben kiviteleztünk, majd egy további kationcserélő kromatográfiát (lásd fent) hajtottunk végre. Az „Igase” aktivitását IgA-antitestekkel történő inkubálással és a keletkezett hasítási termékek SDS-poliakrilamid gélben 30 történő szétválasztásával teszteltük.

10. példa

Plazmid szerkesztése metioninmentes interleukin-3 kifejezéséhez

A plazmid szerkesztését a pPZ07-mgllac jelű (WO 88/09373) expressziós vektor felhasználásával végeztük. Ekkor a pPZ07-mgllac expressziós vektort Ncolgyel hasítottuk, és a kiálló végeket Mung-bean nukleázzal eltávolítottuk. Ezt követően a vektort BamHI-gyel ismét hasítottuk. A fúziós fehéije optimális aminoterminális régiója számára DNS-szinten a következő oligonukleotidokat készítettük el:

Primer IA:

5’ AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAACATGTCGACCATG GAG 3’

Primer 1B:

5’ GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATTAATTTTTCC TCCGAATT 3’

Mindkét oligonukleotidot ekvimoláris mennyiségben összekevertük, és körülbelül 100-szoros feleslegben a pPZ07-mgllac vektorba, amelyet a fent leírt módon hasítottunk, bevezettük. Ligálás után a szokásos módon kompetenssé tett E. coli KI 2 sejteket transzformáltuk. A sejtekből a DNS-t ismert módon izoláltuk, Sall/BamHI-gyel hasítottuk, és DNS-fragmenssel, amely az interleukin kódoló régióját a szignálszekvencia nélkül tartalmazta (alábbiakban leírva), ligáltuk.

Az interleukin 3 kódoló régiójának elkészítése az IgA-proteázt felismerő régióval, DNS-szinten a PCR is55 mert technika szerint történt, melyben egy PCR-reakciót hajtottunk végre interleukin 3 cDNS-sel mint templáttal, és az alábbiakban leírt primerekkel:

Primer 2A:

5’ AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC 3’

HU 217 103 Β

Primer 2B:

5’ TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT 3’

A reakció eredményeként kapott PCR-fragmenst Sáli és BamHI enzimekkel utólag hasítottuk, és így közvetlenül a fent leírt vektor DNS-be bevezettük és ligáz segítségével kovalensen kötöttük.

A DNS-t egy alkalmas gazdasejtbe, például E. coli KI2 C600, transzformáltuk, az E. coli sejtekben az 11-3 Rb’s formájában szintetizáltuk, és ezt követően izoláltuk. Amint azt a G-CSF-nál leírtuk, a fehérjét deés renaturáltuk, és a renaturált fehérjét IgA-proteázzal hasítottuk. Az így előállított Met-mentes II 3-at további tisztítási lépések után a terápiában alkalmaztuk.

11. példa

Plazmid szerkesztése metioninmentes interleukin—2 kifejezésére

A szerkesztést a pPZ07-mgllac (WO 88/09373) jelű expressziós vektor felhasználásával végeztük, amelyet a primer 1A és IB inszerciója után, mint azt a 10.

példában leírtuk, Sall/BamHI-gyel hasítottunk. Az interleukin 2 kódoló régiójának az elkészítése az IgAproteáz-felismerő régióval a PCR-módszer szerint történt, amelyben egy PCR-reakciót hajtottunk végre az interleukin 2 cDNS-sel mint templáttal és a 3A és 3B primerekkel, amelyek ebben az esetben az IgA-proteázfelismerő régiót kódolták:

Primer 3 A:

5’ AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG 3’ Primer 3B:

5’ TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTT 3’

Az így kapott PCR-fragmenst Sáli és BamHI enzimekkel utólag hasítottuk, és így közvetlenül be tudtuk vezetni a fent leírt vektor DNS-be. A továbbiakban az eljárást az II 3-nál leírtak szerint végeztük.

Az előző példákban leírtuk, hogyan lehet az IgAproteázt felismerő hasítóhelyek alkalmas felhasználásával és további eljárásokkal metioninmentes terápiás hatású fehéijéket előállítani, amelyek az Ala-Pro aminosavszekvenciával kezdődnek. További fehérjék, amelyek az eddig leírt példákkal analóg módon metioninmentesek, is előállíthatók, és - bár oligonukleotidok felhasználása által - egyrészt az IgA-proteáz számára a felismerő régiót, valamint egy régiót tartalmaznak, amely megfelel, illetve analóg a publikált szekvencia 5’-, illetve 3’-végével és ezáltal PCR-amplifikálással előállíthatók. A következőkben további, terápiásán alkalmazható releváns proteineket sorolunk fel, amelyek érett, természetes módon előforduló formában Ala-Pro-val kezdődnek, és ezért a találmány szerinti eljárással analóg módon előállíthatók:

Katepszin L (EC. 3.4.22.15), Mason, R. W. és munkatársai: Biochem. J., 240, 373-377, 1986.

Eritropoietin, Lai, P. H. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 261, 3116-3121, 1986.

Interleukin-1 béta, Zsebo, K. M. és munkatársai: Blood, 71, 962-968, 1988.

Oszteonektin, Fisher, L. W. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 262, 9702-9708, 1987.

IV típusú kollagenáz, Collier I. E. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 263,6579-6587, 1988.

Továbbá ezen a módon előállíthatók olyan fehéijék, amelyek érett formában Ser-Pro aminosavszekvenciával kezdődnek. Mint például az alábbiakban megnevezettek:

Alfa-1 antitripszin, Hill, R. E. és munkatársai: Natúré, 311, 175-177, 1984.

Atrialis nátriuretikus faktor, Kambayashi, Y. és munkatársai: FEBS Lett., 259, 341-345, 1990.

További példák fehérjékre, amelyek érett formájukban Thr-Pro szekvenciával kezdődnek és terápiásán relevánsak lehetnek, például:

Komplement faktor B, Campell, R. D. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., 80,4464-4468, 1983. Apolipoprotein A, Eaton, D. L. és munkatársai:

Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3224-3228, 1987.

Claims (38)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás fehérjék fúziós fehéijék enzimatikus hatá35 sával történő előállítására, azzal jellemezve, hogy

   i) géntechnológiai eszközökkel a fúziós fehéije két részét egymással összekötő átmeneti régiót úgy módosítjuk, hogy ebben az átmeneti régióban legalább egy, Υ-Pro ! Χ-Pro aminosavszekvenciájú IgA40 proteáz-felismerő helyet alakítunk ki, ahol X egy tetszőleges aminosav és Y egy vagy több tetszőleges aminosav lehet, ii) az i) lépésben kapott fúziós fehérjét a felismerőhely ! jellel jelölt pozíciójában IgA-proteázzal hasít45 juk, és iii) hasítás után a kívánt fehérjét kinyerjük. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehérje átmeneti régiójának módosítását

   50 egy, az IgA-proteáz-felismerő helyet vagy annak egy részét kódoló nukleotidszekvencia beépítésével végezzük, ahol a nukleotidszekvencia elé és/vagy után a kívánt fehérjét kódoló egy vagy több DNS-szakaszt építünk be. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)

   55
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy eredetileg semmilyen természetes IgA-felismerő hellyel nem rendelkező fúziós fehérjét módosítunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás,

   60 azzal jellemezve, hogy egy, a kívánt rész mellett még egy

   HU 217 103 Β vagy több hordozórészt tartalmazó fúziós fehéije átmeneti régióját módosítjuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozórészként a béta-galaktozidáz egy részét tartalmazó fúziós fehéijét módosítunk. (Elsőbbsége: 1990. 02. 03.)
6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozórészként több töltéssel rendelkező aminosavat és/vagy egy specifikus anyagra nagy affinitással kötődő proteint vagy polipeptidet tartalmazó fúziós fehéijét módosítunk. (Elsőbbsége: 1990. 02. 03.)
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy X-et Ser, Thr vagy Alá aminosavra módosítjuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy X-et Ser vagy Thr aminosavra módosítjuk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Y végződéseként a Pro, Pro-Alá, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro vagy Pro-Ala-Pro-Arg-Pro szekvenciát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi

    a) Pro-Ala-Pro ! · Ser-Pro,

    b) Pro-Pro!-Ser-Pro,

    c) Pro-Arg-Pro-Pro ! Ala-Pro,

    d) Pro-Pro ! ·Thr-Pro

    e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro ·! · Thr-Pro vagy

    f) P ro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro! -Thr-Pro aminosavszekvenciával rendelkező IgA-proteáz-felismerő helyet alakítunk ki. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

    i) valamely sejtet egy rekombináns DNS-sel és/vagy egy rekombináns vektorral transzformálunk, ahol a DNS vagy vektor a fúziós fehéijét kódoló gén legalább egy kópiáját tartalmazza, amely az átmeneti régióban legalább egy IgA-proteáz-felismerő helyet hordoz, ii) a transzformált sejtet alkalmas tápközegben tenyésztjük, iii) a fúziós fehérjét kódoló gént a transzformált sejtben kifejezésre juttatjuk, iv) a fúziós fehérjét IgA-proteázzal hasítjuk, és

    v) a fúziós fehéije egy vagy több kívánt részét izoláljuk. (Elsőbbsége: 1990.05.17.)
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehéijét az IgA-proteázzal a tápközegben a sejtfeltárás és/vagy a celluláris fehéijék leválasztása után hasítjuk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fúziós fehérje hasításához a Neisseria nemzetség patogén baktériumfajaiból, különösen Neisseria gonorrhoeae és Neisseria meningititisből vagy a Haemophilus nemzetségből, különösen Haemophilus influenzáé és Haemophilus egypticusból vagy egy hasonló jellegű IgA-proteáz módosításával levezetett fehérjéből származó IgA-proteázt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehérje hasításához egy túltermelő, nem patogén baktériumtörzsből nyert IgA-proteázt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
15. 15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehérje hasításához az IgAproteázt immobilizált formában alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1990.02.03.)
16. 16. A 11-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy oldható, oldhatatlan, membránasszociált vagy sejthez kötött formában lévő fúziós fehéijét hasítunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy oldhatatlan csapadékrészecskék formájában jelen lévő fúziós fehéijét hasítunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
18. 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokarióta sejtekből származó, az N-terminálison metioninrészt nem tartalmazó rekombináns fehérjék előállítására egy Met-Y-Pro! X-Pro-A szekvenciájú fúziós fehéijét, ahol X egy tetszőleges aminosavat és Y egy vagy több tetszőleges aminosavat jelent, IgA-proteázzal hasítunk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt fehérje X-Pro aminosavszekvenciával kezdődik. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
20. 20. Az 1 -19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kívánt fehéreként a humán granulocita kolónia stimuláló faktort (G-CSF) vagy annak egy származékát állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1990. 02. 03.)
21. 21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós fehéije előállítandó részét IgA-proteázzal történő hasítás után egy további lépésben egy dipeptidil-amino-peptidázzal kezeljük, és ily módon az N-terminális X-Pro szekvenciát lehasítjuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az N-terminális X-Pro szekvencia lehasítására egy X-Pro-dipeptidil-amino-peptidázt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
23. 23. Fúziós fehérje, amely több polipeptidrészt tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a fehérje legalább egy átmeneti régióban a mindenkori polipeptidrészek között egy vagy több Y-Pro·! -X-Pro aminosavszekvenciájú IgA-proteáz-felismerő hellyel rendelkezik, ahol X egy tetszőleges aminosavat, előnyösen Ser-t, Thr-t vagy Ala-t jelent és Y egy vagy több tetszőleges aminosav lehet. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
24. 24. A 23. igénypont szerinti fúziós fehéije, azzal jellemezve, hogy a Met-Y-Pro·!-X-Pro-A aminosavszekvenciával rendelkezik, ahol X és Y jelentése a fentiekben megadott és A egy tetszőleges aminosavszekvenciát jelent. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
25. 25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti fúziós fehéije, azzal jellemezve, hogy Y Pro, Pro-Ala, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro vagy Pro-Ala-Pro-Arg-Pro szekvenciával fejeződik be. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)

    HU 217 103 Β
26. 26. A 23-25. igénypontok bármelyike szerinti fúziós fehérje, azzal jellemezve, hogy az X—Pro-A aminosavszekvencia egy granulocita kolónia stimuláló faktor (G-CSF) vagy annak egy származéka. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
27. 27. A 26. igénypont szerinti rekombináns G-CSF, azzal jellemezve, hogy lényegében kvantitatíve mentes az N-terminálison metioninmaradékot tartalmazó G-CSF-tól. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
28. 28. A 26. vagy 27. igénypont szerinti rekombináns G-CSF, azzal jellemezve, hogy kevesebb, mint 0,1% egyéb fehéijével szennyezett. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
29. 29. A 26. vagy 27. igénypont szerinti rekombináns G-CSF, azzal jellemezve, hogy kevesebb, mint 0,001% egyéb fehérjével szennyezett és kvantitatíve mentes az olyan G-CSF-tól, amely az N-terminálison metioninmaradékot hordoz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
30. 30. Gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként a 26-29. igénypont bármelyike szerinti G-CSF-t vagy egy G-CSF-származékot és adott esetben a szokásos gyógyszerészeti adalék-, segéd- és/vagy hordozóanyagokat tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
31. 31. Eljárás a 26-29. igénypontok bármelyike szerinti G-CSF-származékot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot adott esetben a szokásos gyógyszerészeti adalék-, segéd-, töltő- és/vagy hordozóanyagokkal összekeverjük, és a keveréket formázzuk. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
32. 32. Rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az a 23-29. igénypontok egyike szerinti fúziós fehéqét kódolja. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
33. 33. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a 32. igénypont szerinti rekombináns DNS egy vagy több kópiáját tartalmazza. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
34. 34. A 33. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS egy indukálható expressziós szignál kontrollja alatt áll. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
35. 35. A 33. vagy 34. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy egy prokariotikus vektor. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
36. 36. A 32-34. igénypontok egyike szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy egy plazmid. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
37. 37. Sejt, azzal jellemezve, hogy egy 32. igénypont szerinti vektorral van transzformálva. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
38. 38. A 37. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy egy prokarióta sejt. (Módosítási elsőbbsége: