HU200793B

HU200793B - Genetic engineering technique for producing new, human interleukin-2 protein

Info

Publication number: HU200793B
Application number: HU844383A
Authority: HU
Inventors: Koichi Kato; Haruo Onda; Takao Yamada
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1983-11-28
Filing date: 1984-11-27
Publication date: 1990-08-28
Also published as: KR850003734A; NO844710L; JPS60115528A; FI81118B; PT79555A; DK164174C; NO169021B; FI844678L; PT79555B; FI844678A0; JPH0542413B2; EP0442538A1; EP0145390A2; NO169021C; NZ210352A; EP0145390A3; SG46452A1; KR920006879B1; HUT36186A; DK560784A

Description

A bejelentés tárgya eljárás humán interleukin-2 - fehér je előállítására genetikai manipulációs technika segítségével.

Az interleukin-2 (amelyet T sejt növekedési faktornak is neveznek (TCGF); ezután ezt IL-^-ként fogjuk rövidíteni] egy olyan limfokin, amelyet a T aejtek produkálnak lektinnel vagy alloantigénnel történt stimulálásra [lásd pl. Science, 193, 1007 (1976); Immunological Reviewe, 51, 257 (1980)]. Az IL-2 lehetővé teszi a T sejtek hosszú időn át tenyésztését, in vitro növesztésüket engedve meg, miközben funkcióik megmaradnak. Ezentúl az IL-2 állítólag elősegíti a timusz (csecsemőmirigy) sejtek mitogén reakcióját (kostimulétor), helyreállítja a lépsejtek T-sejt-függő antigénjei elleni antitest-termelést meztelen egérben (T-sejt helyettesítő faktor), vagy elősegíti a killer (gyilkos) sejtek differenciálódását és sejtburjánzását (killer segítő faktor) (The Journal of Immunology, 123, 2928 (1979); Immunological Reviews, 51, 257 (1980)].

A killer T sejt kiónokat, a kisegítő T sejt kiónokat, továbbá a természetes killeV sejt kiónokat eddig is nagy számban nyerték az IL-2 hasznosítása útján [pl. Natúré, 268, 154 (1977); The Journal of Immunology, 130, 981 (1983)]. A T sejtekben vagy a természetes killer sejt klónozásban való ilyen közvetlen alkalmazáson túl az IL-2-t lehet használni a speciális antigénekre fajlagos killer T sejtek szelektív növesztéséhez, pl. olyan kil— ler T sejtekhez, amelyek felismerik a tumor antigént és elroncsolják a tumort in vitro. Az ilyen módon növesztett fajlagos killer T sejtek injektálásával egy állatba, lehetséges gátolni és megelőzni a tumor növekedését [The Journal of Immunology, 125, 1904 (1980)]. Az is ismeretes, hogy az IL-2 indukálja az IFN-γ termelését (The Journal of Immunology, 130, 1784 (1983), és hogy az IL-2 aktiválja a természetes killer sejteket (The Journal of Immunology, 130, 1970 (1983)].

A fenti kísérleti tények azt sugallják, hogy az IL-2 valószínűleg hasznos lehet tumorellenes szerként. Az IL-2-ről ismeretes, hogy helyreállítja a segítő T sejt funkcióit meztelen egérben, amelyben hiányzik a csecsemőmirigy-funkció. [European Journal of Immunology, 10, 719 (1980)] vagy helyreállítja a homológ sejtek elleni killer T sejtek in·dukcióját [Natúré, 284, 278 (1980)] és ennél fogva az IL-2-röl elvárható, hogy hasznos lesz az immun-rendszert elnyomó betegségek kezelésében.

Az IL-2 nagy mennyiségű termelése azonban mindeddig nehéz volt, úgy hogy ennek klinikai alkalmazása a jelen ideig nem lehetséges. Következésképpen egy olyan technikára, amely lehetőséget nyújt nagy mértékben tisztított IL-2 előállítására nagy mennyiségben, könnyű és egyszerű módon és kis költséggel, nagyon vérnak.

Taniguchi és munkatársai a Jurkat humán T sejt leukémia vonalból, mint kiindulási anyagból izolált IL-2 mRNS-t használva klónozták a humán IL-2 gént, közölték a hunién

IL-2 fehérje aminosav-szekvenciáját, amint ebből kikövetkeztették, és a géneket COS-7 sejtekben kifejezték [Natúré, 302, 305 (1983)]. Később Devos és munkatársai közölték, hogy a humán lépsejteredetű IL^X2 gént klónozták és Escherichia colí-ban kifejezték [Nucleic Acids Research, 11, 4307 (1983)].

Mindamellett egy IL-2 szerű, vegyület jelenlétét csak feltételezték azon az alapon, hogy TCGF aktivitást mutattak ki. Nincsen olyan közlemény, amely arról számolna be, hogy egy humán IL-2 kódoló DNS-t hordozó transzformáns által termelt humán IL-2 fehérjét valóban izolálták volna tisztított formában. A 91.539 sz. európai közrebocsátási irat humán IL-2 géntechnológiai előállításét ismerteti, a kapott fehérje tisztasága azonban nem kielégítő.

A jelen feltalálók intenzív kutatásokat végeztek, hogy. megkíséreljenek olyan tech25 nikát kifejleszteni, amellyel a kivánt IL-2 fehérjét lehet nyerni a humán IL-2 gén klónozása útján, a gén-manipulációs .technikát alkalmazva, a nyert rekombináns DNS molekulát egy gazdaszervezetbe bevezetve, a humán

IL-2 gént az említett, gazdaszervezetben kifejezve; ennek eredményeképpen alapjában véve tiszta, nem .glükozilált humán IL-2 fehérje előállítására szolgáló módszert hozhattak létre, és teljessé tehették a jelen talál35 mány szerinti eljárást.

igy a jelen találmány alapjában véve tiszta, nem glükozilált humán IL-2 fehérjét szolgáltat, valamint egy módszert az említett humán IL-2 fehérje előállítására, amely mód40 szer abban áll, hogy egy humán IL-2-t kódoló bázis-szekvenciával rendelkező DNS-t hordozó transzformánst tenyésztünk és az említett fehérjét a tápközegböl elkülönítjük és tisztítjuk.

a jelen találmány gyakorlatában alkalmazandó, humán IL-2-t kódoló DNS pl. egy DNS (I), amely a 2. ábrában levő 1-133 kódonok által definiált bázis szekvenciával rendelkezik. Ez a DNS (I) adott esetben viselhet

5’ végen vagy ATG-t, vagy egy olyan szig.nál-szekvenciát, amelyet a 2. ábrában az Sl-S2Q kódonok reprezentálnak; és 3’ végen előnyösen TAA-t, TGA-t, vagy TAG-t, legelőnyösebben TGA-t visel.

A DNS (I), előnyösen a promotertól lefelé kapcsolódik, a promoterre példák lehetnek a triptofán(trp)promoter, a rec A promoter, vagy Λ PL promoter, alkalmas módon a trp vagy a Λ PL promoter.

θθ A jelen találmánnyal összhangban a humán IL-2-t kódoló mRNS-t egy pl. konkanavalin A-val stimulált humán perifériás leukocita tenyészetből izoláljuk, majd reverz transzkriptázt alkalmazva egy egyszálú θδ cDNS-t szintetizálunk, és a továbbiakban egy

HU 200793 Β kettős szálú DNS-t szintetizálunk. A DNS-t egy plazmidba iktatjuk, a rekombináns plazmidot pl. egy Escherichia coli vagy Bacillus subtilis törzs transzformálásához használjuk fel, és a cDNS-tartalmü plazmidot klónozzuk, ilyen módon állíthatunk elő egy humán IL-2-t kódoló kettős szálú DNS-t.

Még részletesebben a humán IL-2-t kódoló mRNS-t, amelyet a találmány gyakorlati kivitelében akarunk alkalmazni, Hinuma és munkatársai módszere szerint állíthatjuk eló [Biochemical and Biophysical Research Communications, 109, 363 (1982)]. Az igy nyert humán IL-2 mRNS-el, mint templáttal cDNS-t szintetizálunk ismert módon reverz transzkriptáz alkalmazásával, és .a cDNS-t átalakítjuk kettős szálú DNS-é [Maniatis, T. és munkatársai: Cell, 8, 163 (1976); Land, H. és munkatársai: Nucleic Acids Research, 9, 2251 (1981)]. Ezt a DNS-t pl. a pBR322 plazmidba iktatjuk be a PsQ. restrikciós endonukleáz hasitási helynél pl. a dG-dC homopolimer ligációs módszerrel (Nelson, T.S.: Methods in Enzimology, 68, 41 (1979)]. Ezután egy, a humán IL-2 egy részlete aminosav-szekvenciájának megfelelő bázis-szekvenciával rendelkező oligonukleotidot szintetizálunk pl. kémiai úton; majd ^P-vel jelezzük. Ezt, mint mintát használva a kivánt kiónt a tetraciklin- vagy ampicillin-rezisztens transzfor.mánsok közül az ismert telephibridizációs módszerrel'kiszelektáljuk [Grunstein, M. és Hogness, D.S.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,¹ 72, 3961 (1975); Alwine, J.C. és munkatársai: Methods in Enzimology, 68, 220 (1979). A humán IL-2 gén jelenlétét a Maxam-Gilbert módszerrel [Maxam, A.M. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)], vagy az M 13 fágot alkalmazó dinukleotid szintetikus lánc végpont módszerrel [Messing, J. és munkatársai: Nucleic Acid Research, 9, 309 (1981)] a fenti hibridizációs módszerben pozitívan reagáló klónokból származó DNS bázisszekvenciájának meghatározásával igazoljuk. Majd a humán IL-2 gén egészét vagy egy részét a nyert klónból kimetsszük és egy plazmidba iktatjuk be az alkalmas promoterrel és az SD (Shine és Dalgarno) bázis-szekvenciától lefelé a megfelelő gazdaszervezetbe ez után történő bevezetés érdekében.

Többek között a trp promoter alkalmazása előnyös promoterként. Gazdaszervezetként többek között egy Escherichia coli törzs (pl. 294. törzs, DH1 törzs, N4830 törzs) alkalmazható előnyösen.

Az Escherichia coli 294 törzs [Beckman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (1976)], E. coli DH1 törzs [Selson,

M.E. és munkatársai, Natúré, 217, 1110 (1968) és E. coli N 4830 törzs (Cell, 25, 713 (1981)] ismert törzsek.

Az ilyen gazdatörzsek transzformálását a DNS-el ismert módszerrel lehet végrehajtani [Cohen, S.N. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]. Az így nyert gazdaszervezetet ismert közegekben tenyésztjük, mint pl. a glükózt és kazamino-savat tartalmazó M9 tápközeg (Miller, J.: Experiments is Molecular Genetics (Kísérletek a molekuláris genetikában) 431-433 oldal [Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. Azokban az esetekben, ahol trp promotert használunk, valamilyen ágenst, pl. 3-8-indolil-akrilsavat adhatunk az említett promoter hatásosságának növelésére. A tenyésztést általában 15-43 °C között hajtjuk végre 3-24 óra alatt, levegőztetve ée kevertetve olyan mértékben, amennyire szükséges.

Abban az esetben, ha Λ PL promotert használunk, a tenyésztést előnyös viszonylag alacsony hőmérsékleten végrehajtani, 30 és 36 °C között növesztve a transzformánst, majd 37 és 42 °C között folytatni a transzformánsban levő represszor inaktiválása érdekében és igy hatásosan kifejezni a humán IL-2-t kódoló DNS-t.

Az igy keletkezett humán IL-2-t meg kell határozni IL-2-függŐ sejtvonalat alkamazva. Mivel a humán IL-2-röl ismeretes, hogy elósegiti a patkány-, egér- humán vagy más. IL-2-függő sejtek növekedését, [Immunological Reviews, 51, -257 (1980)]; nem csupán a humán lL-2-függő sejtvonalak, hanem a patkány- vagy egér IL-2-függő sejtvonalak is alkalmazhatók [Journal of Immunology, 130, 981 és 988 (1983)].

Főleg az egér IL-2-függő .sejtvonalakat lehet stabilan fenntartani hosszú időtartamon át 'altenyészetekben úgy, hogy alkalmazása nagyon jól reprodukálható vizsgálati eredményeket adhat.

A humán IL-2 találmány szerinti kinyerésében a tenyésztett sejtekből a sejteket tenyésztés után ismert módon kinyerjük, Jehérje-denaturáló szer, pl. guanidin ásványi savas sói (pl. hidroklorid, nitrát, szulfát) oldatában szuszpendáljuk és a szuszpenziót hidegben keverjük, majd centrifugáljuk, miáltal IL-2 tartalmú felülúszót nyerünk, vagy egy másik módszer szerint a kinyert sejteket pufferben szuszpendáljuk, ultrahang kezeléssel feltárjuk, lizozimmel kezeljük és/vagy fagyasztjuk és felengédtetjük, végül centrifugáljuk, igy nyerjük az IL-2 tartalmú felülúszót. Bármiféle más alkalmas módszer is használható.

Az IL-2 izolálását a fenti felülúszöból és az IL-2 ezt követő tisztítását végre lehet hajtani az ismert elkülönítési és tisztitási módszerek alkalmas kombinációjával. Az ilyen ismert elkülönítési és tisztitási módszerek lehetnek többek között olyan módszerek, amelyek az oldhatósági különbségeket használják ki, mint pl. a kisózási módázer és az oldószeres kicsapási módszer; olyanok, amelyek nagyrészt a molekulatömeg különbségeket használják ki, mint pl. a dialízis, ultraszűrés, gélszűrés és SDS(nátrium-D0DECIL-6Zulfát)-poliakrilamid-gél elektroforézis; olyanok, amelyek a töltésekben levő különbségeket

-3HU 200793 B használják ki, mint pl. az ioncserélő kromatográfia; olyanok, amelyek a fajlagos affinitásokat használják ki, mint pl. az affinitás-kromatográfia; olyanok, amelyek a hidrofóbitási különbségeket használják ki, mint pl. a fordított fázisú nagy teljesítményű folyadék kromatográfia; vagy olyanok, amelyek az izoelektromos pontok közötti különbségeket használják ki, mint pl. az izoelektromos fókuszálás. Mivel a humán IL-2 fehérje nagyon hidrofób, a hidrofób oszlopkromatográfia, főleg a nagy teljesítményű folyadékkroraatográfia fordított fázisú oszlopot használva, nagyon hatásos a fenti fehérje tisztításában.

igy pl. a humán IL-2-t kódoló gént hordozó Escherichia coli törzs tenyésztésével nyert sejteket egy oldatban szuszpendáljuk, amely előnyösen egy fehérje-denaturéló szer, mint pl. guanidin hidroklorid pufferja (2 mól/liter és 8 mól/liter, előnyösen 6 mól/liter és 8 mól/liter közti koncentrációban), majd a szuszpenziót kevertetjük előnyösen 0 és 5 “C közötti hőmérsékleten 0,5-3 órán át, majd centrifugáljuk. Az így összegyűjtött felülúszót, akár ebben a formában, akár ultraszűrő berendezést vagy hasonlót használó koncentrálás után, dialízisnek vetjük alá. Az igy nyert csapadékot centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszót pl. dietil-amino-etil-cellulózt [pl. DE cellulóz (Whatman, Nagy-Britannia) oszlopot] alkalmazó anioncseréló kromatográfiának vetjük alá, majd az aktív frakciót összegyűjtjük.

Majd, miután ultraszűrő berendezést használva koncentráltuk, az aktív frakciót Ν,Ν’-metilén-biszakrilamid-keresztkötésű allil-dextránt, pl. Sephacryl S-200 (Pharmacia, Svédország) oszlopot, vagy hasonlót használó gélszűrésnek vetjük alá. Az összegyűjtött aktív frakciókat ez után a korábban említett nagy teljesítményű folyadékkromatográfiának vetjük alá. Ezen a módon nyerhetjük a találmány szerinti nem glükozilezett humán IL-2-t.

A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában használandó fordított fázisú rendszerként többek között az alkilezett (Ci-ie) szilánokkal borított gyanták hatásosan alkalmazhatók. Eluáló szerként valamely Ci-e szénatomszámú alkanol (pl. etanol, propanol) vagy acetonitril alkalmazható előnyösen és az eluálószer pH-ja 1,5-8, előnyösen 1,5-4 között lehet. Az eluálás sebessége előnyösen 0,1y-100 ml/perc között van.

Az igy nyert humán IL-2 fehérjét por formájúvá lehet alakítani Íiofilezéssel, ha szükséges. A liofilezés alkalmával stabilizálószert, pl. szorbltot, mannitot, dextrőzt, maltózt, glicerint vagy humán szérum-albumint (HSA) lehet adni.

Amikor az IL-2 aktivitást mérjük, indexként az IL-2-függó egér-sejtek radioaktív timidin felvételt alkalmazva, a jelen találmány szerint nyert IL-2 fehérje nem kevesebb, mint 1 x 10⁴ egység/mg fajlagos aktivitást mutat. A találmánnyal összhangban lehet nyerni nagyon tiszta, nem glükozilezett humán IL-2 fehérjét is, amely nem kevesebb, mint 2 x 10⁴ egység/mg fajlagos aktivitással rendelkezik, de felmehet 4 x 10⁴ egység/mg-ra is.

Az előbb említett IL-2 aktivitási egységet a következő módon számíthatjuk ki.

IL-2 tartalmú mintát adúnk egy olyan tápközeghez, amely az IL-2 koncentrációtól függóen növekvó egér-sejtvonal sejtjeit tartalmazza, és az egész keveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át 5% COz jelenlétében, és az említett sejtvonal növekedését triciummal jelzett timidint alkalmazva meghatározzuk. Az egységekben való aktivitás kiszámításához a szóban forgó mintában, standard IL-2-t (1 egység/ml) mindig alkalmazunk összehasonlításként, és az egységben megadott aktivitást a minta és a standard közti aktivitás hányadosából számítjuk ki.

Részletesebben kifejtve, egy IL-2-függó egér-sejtvonal (NKC3) [Hinuma és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun., 109, 363 (1982)], amelyet IL-2 tartalmú kondicionált tápközeggel kiegészített 20% hozzáadott FCS (borjúembrió szérum) tartalmú tápközegben 37 °C hőmérsékleten 5% CO2 jelenlétében tenyésztéssel tartottunk fenn, sejtjeit kétszer mossuk szérummentes RPMI 1640 tápközeggel és újból szuszpendáljuk 20% hozzáadott FCS tartalmú tápközegben 6 x 10⁵ sejt/ml sejtsűrűségre.

Az IL-2-tartalmú mintákat 50 jul-es adagokban egy 96 üreges laposfenekű mikrotitráló lemez (Nunc, Dánia) első sorában levó üregekre osztjuk el. A 20% hozzáadott FCS tartalmú RPMI 1640 tápközegból 50 μΐ-es adagokat használva, kétszeres higitási sort készítünk a 12. sorig. Ez után a fenti NKC 3 sejtszuszpenziót osztjuk szét 50 μΐ-es adagokban minden egyes üregbe, ezt követi egy 24 órás inkubálás 5% COz jelenlétében 37 °G hőmérsékleten. Az inkubálás 20. órája után 1 uCi triciummal jelzett timidint (Amersham, Nagy-Britannia) adunk minden egyes üregbe. Az inkubálás további négy órája után a sejteket egy üvegszűróbe kinyerjük egy sejt-arató berendezést (Flow, Amerikai Egyesült Államok) használva, és'megmérjük a triciummal jelzett timidin felvételét, folyadék szcintillációs számlálót alkalmazva. A fenti meghatározás kivitelezésében standard IL-2 mintát is kiteszünk azonos eljárásnak a mérendő mintákkal együtt, és a triciummal jelzett timidin felvételét meghatározzuk.

Az aktivitás kiszámítását egységekben a probit módszerrel hajtjuk végre, a Journal of Immunologyban megjelent közlemény szerint [120, 2027 (1978)]. így a standard IL-2 minta higitási sorozatban nyert maximális timidin-felvételt tekintjük 100%-nak, és a timidin-fe)vétel százalékát % minden egyes higitási stádiumnál kiszámítjuk. Az így nyert ér5

HU 200793 Β . 8

A ség/ml) ki: ·

A minta tékeket egy normál valószínűségi felvételi lapon (probability paper) függvényben ábrázoljuk, és azt a hígitási tényezőt, amelynél a timidinfelvétel 50%, grafikusan meghatározzuk. Minden egyes IL-2 tartalmú mintánál g ugyancsak meghatározzuk azt a hígítási faktort, amelynél a timidinfelvétel 50%, azonos módon. Azt az IL-2 aktivitás-mennyiséget, amelyet humán perifériás ’ vér limfociták (5 χ 10⁶ sejt/ml) 40 ug/ml konkanavalin A-val és 15 ng/ml · 12-O-tetradekanoil-forbol- 13-acetáttal kiegészített, 10% hozzáadott FCS tartalmú RPMI 1640 tápközegben képzett szuszpenziója tenyészetének felülúszója tar- talmaz 48 órás inkubálás után 37 °C hőmér- jg sékleten 5% CO2 jelenlétében, határozzuk meg 1 egység/ml-ként. ' minta IL-2 koncentrációját (egya következő képlettel számíthatjuk hígítási faktora, amelynél az 50% timidin-felvétel megvalósul

A standard IL-2 minta higitási ' faktora, amelynél az 50% timidih-felvétel megvalósul.

A humán perifériás vérből nyert terme- 25 szetes IL-2. fajlagos aktivitása 20000-70000 egység/mg között van a fenti vizsgálati módszerrel meghatározva. Ez az aktivitás csaknem azonos a jelen tanulmány szerinti nem-glikozilezett humán IL-2 aktivitásával. 3Q

A találmány szerinti nem-glikozilezett humán IL-2 fehérje előnyösen a (II) polipeptidet tartalmazza, amelynek aminosav-szekvenciája a 3. ábrában látható, ahol X jelentése Met vagy hidrogénatom. 35

A jelen találmány szerint előállított IL-2 fehérje a következő jellemzőkkel bir:

1. ) SDS-poliakrilamid gél elektroforézisbeh homogén és molekulatömege 15000 ± 1000 dalton, az említett elektroforézissel meghatá- 4Q rozva;

2. ) Alanint vagy . metionint tartalmaz amino-terminális aminosavként.

3. ) Treonint tartalmaz karboxil-terminális aminosavként; 45

4. ) Aktivitással bir a T sejtek vagy a természetes .killer sejtek növesztésében, miközben azok megtartják funkcióikat. ,

A jelen találmánnyal összhangban előállított humán IL-2 fehérje negatívan reagál a 50 limulusz lizátum vizsgálatra [Haemostasis, 7,

183, (1978)] és szennyező fehérje, valamint pirogén tartalma nagyon kicsiny, úgy, hogy ezt biztonságosan lehet alkalmazni, mint alapanyagot injekciók, stb. gyártásához. 55

A találmánnyal összhangban nyert nem-glikozilezett humán IL-2 fehérje rendelkezik olyan aktivitással, hogy elősegíti a normál T sejtek vagy természetes .killer' sejtek növekedését, miközben azok megtartják funkci- 60 óikat. Ennélfogva a találnfány szerinti IL-2 fehérjét lehet alkalmazni T sejtek vagy természetes .killer sejtek növesztésében és tenyésztésében in vitro hosszú időtartamon át, vagy ezek klónozásában. Sőt, ezt a tulajdon- 65

Ságot fel lehet használni a humán IL-2 aktivitás mérésében.

Ezen kivü) a találmány szerint előállított IL-2 fehérje lehetővé teszi az antigén-fajlagos' .killer T sejtek, amelyek felismerik és elroncsolják a tumor antigéneket, szelektív növesztését, vagy a természetes .killer* sejtek, amelyek képesek a tumor sejtek dőlésére, tekintet nélkül az antigén érzékenyités tapasztalatának jelenlétére vagy távollétére, szelektív növesztését in vitro. Amikor beoltjuk az élő organizmusba szimultán az említett .killer sejtek bevezetésével az élő organizmust, a jelen találmány szerinti humán IL-2 növeli a .killer* T sejtek antitumor hatását. Ennélfogva ezeket lehet alkalmázni tumorok megelőzéséhez vagy kezeléséhez vagy immunhiányos betegségek kezelésében melegvérű állatokban (pl. egér, patkány, nyúl, kutya, macska, sertés, ló, birka, szarvasmarha, ember).

A találmány szerint előállított IL-2 fehérje nagy mértékben tisztított termék, és antigénképessége embernél kicsiny, valamint toxicitása is.

Mint a tumorok megelőzéséhez és kezeléséhez szolgáló szer, a találmány szerinti humán IL-2 fehérjét vagy parenterálisan, vagy szájon keresztül lehet beadni, pl. egy ismert hordozóval megfelelő módon összekeveréssel vagy hígítással készített injekció vagy kapszula formájában. Ezt lehet használni vagy egyedül, vagy korábban említett módon in vitro növesztett .killer’ T sejtekkel vagy természetes killer sejtekkel kombinálva.

A találmány· szerint előállított humán IL-2 fehérje lényegében azonos aktivitással bir, mint a természetes humán IL-2 és következésképpen hasonló módon lehet alkalmazni, mint az említett természetes IL-2 fehérjét. Ennek disszociációs konstansa a megfelelő sejtek IL-2 receptor helyéhez vonatkozóan igen^- kicsiny, úgy, hogy nagyon kis mennyiség is elegendő a legtöbb esetben.

A T sejt in vitro növesztése céljából a találmány szerinti humán IL-2-t a tápközeghez adjuk mintegy 0,01-1 egység/ml, előnyösen 0,1-0,5 egység/ml koncentrációban.

A felhasználás egy példájaként T sejtek in vitro növesztése céljából, a találmány szerinti IL-2 fehérjét 0,1-0,5 egység/ml koncentrációban egy olyan sejtszuszpenzióhoz adjuk, amely pl. humán perifériás vér-eredetű T sejtek 3 napos kevert limfocita-tenyészettel (1 χ 10⁶ sejt/ml), röntgen-besugárzásból (1500 rád) származó β-sejt transzfprmánsok (1 χ 10® sejt/ml) hozzáadásával 20% borjúembrió szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközegben nyert alloantigén-érzékenyitett T sejteket tartalmaz. A tenyésztést, mintegy 1 hónapig folytatjuk, mialatt ismételt táptalaj-cserét végzünk kb. 1 hetes intervallumokban.

A következő példákban érintett transzformánst, nevezetesen .az Escherichia coli

HU 200793 Β

DHl/pTF4, az Institute fór Fermentation-nál (Fermentációs Intézet), Osaka (IFOJ-14299 letéti számon helyeztük el, és szintén elhelyeztük a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry-nál, Japan (FRI) (Nemzetközi Kereskedelmi és Ipari Minisztérium, Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség, Fermentációs Kutató Intézet) FERM BP-628 letéti szómon a Budapesti Szerződés szerint.

A jelen leírásban és ábrákban a bázisok és az aminosavak, amikor rövidített formában jelezzük, a rövidítéseket az IUPACIUB Biokémiai Nomenklatúra Bizottságának szabályai szerint vagy az érintett szakterület gyakorlata szerint végeztük el. A példák erre az 1. táblázatban találhatók. Optikai izoméria esetén az említett aminosavak L-formóban vannak, hacsak különlegesen másképpen nem jelezzük.

1. TÁBLÁZAT

DNS = dezoxiribonukleinsav cDNS = komplementer dezoxiribonukleinsav

A = adenin

T = timin

G = guanin

C =. citozin

RNS = ribonukleinsav mRNS - messenger (hírvivő) ribonukléinsav dATP = dezoxiadenozin-trifoszfát dTTP = dezoxitimidin-trifoszfát dGTP = dezoxiguanozin-trifoszfát dCTP = dezoxicitidin-trifoszfót

ATP = adenozin trifoszfót

EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav

SDS = nátrium-lauril-szulfát

Gly = glicin

Ala = alanin .

Val = valin

Leu = leucin

Ile = izoleucin

Ser ' = szerin

Thr = treonin

Cys = cisztein

1/2 Cys = fél cisztein

Met = metionin

Glu = glutaminsav

Asp = aszparaginsav

Lys = lizin

Arg = arginin

His = hisztidin

Phe = fenil-alanin

Tyr = tirozin

Trp = triptofán

Pro = prolin

Asn = aszparagin

Gin = glutamin

Az ábrák rövid leírása

Az 1. és 2. ábrák az 1. referencia példában, a VII. részben nyert pILOT135-8 plazmid restrikciós térképet (a balról-jobbra felülről-lefelé irányuló csíkozással ellátott terület jelzi a szignál peptidet kódoló részt, míg a balról jobbra alulról-felfelé irányuló csíkozással ellátott terület jelzi az IL-2-t kódoló részt), illetve az említett plazmid primer szerkezetét (bázis-szekvenciáját) mutatják be. A 3. ábra mutatja a találmány szerinti nem glikozilezett humán IL-2 fehérje aminosav-szekvenciáját, ahol X jelentése Met vagy hidrogénatom. A 4. ábra mutatja be a 2. példában megadott pTF< kifejeződést közvetítő plazmid megalkotásának vázlatát. Az 5. ábra mutatja be az SDS-poliakrilamid lap gélelektroforézis eredményeit az 1. példa V. rész (1, és (2) módszerei szerint végrehajtva. A

6. ábra az 1. példa V. rész (6) módszerében említett tripszin-emésztéses peptid térkép, mig a 7. és 8. ábrák a találmány szerinti humán IL-2 fehérje hatását mutatják be a triciummal jelzett timidin beépülésre az NKC3 sejtvonalba illetve a' humán sejtvonalba, amint ez az 1. példa V. részének (7) módszerében megtalálható. A 9. ábra az NKC3 sejtvonal hosszú időtartamú tenyésztésének eredményeit mutatja az 1. példa V. részének (7) módszere szerint végrehajtva.

1. referencia-példa

I. A humán IL-2-t kódoló mRNS izolálása

Humán perifériás vérből készített limfocitákat inkubálunk 10% borjúembrió szérummal, 15 ng/ml 12-0-tetradekanoil-forbol-13 acetáttal (TPAj és 40 ug/ml konkanavalin A-val kiegészített RPMI 1640 tápközegben 37 °C hőmérsékleten, ezen a inódon indukálva IL-2-t. Az inkubálás 24. órája után 1 χ 10¹⁰így indukált humán limfocitát feltárunk és denaturálunk 5 mól/liter guanidin-Úocianátot, 5% merkaptoetanolt, 5p mmól/ liter Trisz-HCl puffért és 10 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldatban, Teflon homogenizálót alkalmazva, majd nátrium N-lauroil-szarkozinátot adunk hozzá 4% koncentrációig, és a keveréket homogenizálás után 6 ml 5,7 mól/literes cézium-klorid oldatra (5,7 mól/liter cézium-klorid, 1 mól/liter EDTA) rétegezzük és centrifugáljuk Beckman SW28 rotort használva 24000 fordulat/perccel és 15 °C hőmérsékleten 48 órán át, így nyerünk egy RNS csapadékot. Ezt az RNS csapadékot 0,25X-os nátrium-N-lauroil-szarkozinétban oldjuk és etanollal kicsapjuk, 10 mg RNS-t nyerve. Nagy koncentrációjú sóoldatban , [0,5 mól/liter NaCl, 10 mmól/liter Trisz-HCl (pH 7,6), 1 mmól/liter EDTA, 0,3% SDS] ezt az RNS-t adszorbeáljuk egy oligo *(dT) cellulóz oszlopra. Az eluáláa kis koncentrációjú sóoldattal [10 mmól/liter Trisz.HCl (pH 7,6), 1 mmól/liter EDTA, 0,3%

-611

HU 200793 Β

SOS) 300 pg poli (A)-t tartalmazó mRNS-t ad.

Ezt az inRNS-t a továbbiakban etanolos kicsapásnak vetjük alá, majd feloldjuk 0,2 ml oldatban [10 mmól/liter Trisz.HCl (pH 7,6), mmól/liter EDTA, 0,3% SDS), 65 °C hőmérsékleten 2 percig kezeljük, majd 10-35% közötti szacharóz sűrűség gradiens centrifugálással (20 °C hómérsékleten, 25000 fordulat/perccel 21 órán át, Beckman SW 28 rotort használva) 22 frakcióra frakcionáljuk. Minden egyes frakcióból egy alikvotot (részarányos adag) injektálunk Xenopus laevis oocitáiba éretlen petesejt) és az igy szintetizált fehérjékben az IL-2 aktivitást megmérjük. A 11-15 frakciókról (8S-15S ülepedési-koefficiens) úgy találjuk, hogy van IL-2 aktivitásuk. Kb.

pg IL-2 mRNS-t tartalmaztak ezek a frakciók.

II. Egyszálú DNS szintézise.

A fentebb nyert mRNS-t és reverz transzkriptázt alkalmazva inkubálást hajtunk végre 100 μΐ reakcióoldatban [5 pg mRNS,

Mg oligo (dT), 100 egység reverz transzkriptáz, 1 mmól/liter dATP, 1 mmól/liter dCTP, 1 mmól/liter dGTP,' 1 mmól/liter dTTP, mmól/liter MgCh, 50 mmól/liter KC1, mmól/liter ditiotreitol, 50 mmól/liter Trisz.HCl (pH 8,3)] 42 °C hómérsékleten 1 órán át, ezt követi a fehérjementesltés fenollal és kezelés 0,1 n NaOH-val 70 °C hőmérsékleten 20 percen ót az RNS eltávolítása érdekében elbontással.

III. Kettős szálú- DNS szintézise.

Egy kettős szálú DNS-t szintetizálunk olyan módon, hogy az igy szintetizált egyszálú komplementer DNS-t 50 pl reakcióoldatban kezeljük [a reakcióoldat a fentebb említett reakcióoldattal azonos, kivéve, hogy mRNS és oligo(dT) nincs jelen] 42 °C hőmérsékleten 2 órán át.

IV. dC farok hozzáadása

Ezt a kettős szálú DNS-t SÍ nukleázzal kezeljük 30 pl reakcióoldatban [kettős szálú DNS, 0,1 mól/liter . nátrium-acetát (pH 4,5), 0,25 mól/liter NaCl, 1,5 mmól/liter ZnSCta, 60 egység SÍ nukleáz] szobahőmérsékleten 30 percen ót, ezt követi a fehérjementesltés fenollal és a DNS kicsapása etanollal. A DNS-t terminális transzferázzal kezeljük 50 pl reakciökeverékkel [kettős szálú DNS, 0,14 mól/liter kálium-kakodilát, 0,3 mól/liter Trisz/bázis) (pH 7,6), 2 mmól/liter ditiotreitol, mmól/liter COCh, 0,15 mmól/liter dCTP, 30 egység terminális transzferáz] 37 °C hőmérsékleten 3 percen át, ezáltal a kettős szálú DNS kiterjesztését idézve elő mintegy 15 dezoxicitidin egységgel mindkét 3’ végnél.

Ez a reakciósor mintegy 30 ng dezoxicitidin 60 lánc tartalmú kettős szálú DNS-t ad.

V. Az Escherichia coli plazmid hasítása és dG farok hozzáadása

Elkülönítve 10 Mg Escherichia coli pBR322 plazmid DNS-t kezelünk PsO. restrikciós enzimmel 50 m1 reakcióoldatban [10 Mg DNS, 50 mmól/liter NaCl, 6 mmól/liter

Trisz.HCl (pH 7,4),* 6 mmól/liter MgCh, mmól/liter 2-merkaptoetanol, 100 Mg/ml borjú szérum albumin, 20 egység PstI] 37 °C hőmérsékleten 3 órán át, ezáltal elhasitva a pBR322 DNS-ben előforduló egyetlen Psü fel0 ismerő helyet, ezt követi a fehérjementesltés fenollal. A hasított pBR322 plazmid DNS-t kibővitjük kb. 17 dezoxi-guanin-egységgel mindkét 3' végén, terminális transzferázzal kezelve 50 pl reakcióoldatban [10 pg DNS,

0,14 mól/liter kálium kakodilát, 0,3 mól/liter Trisz bázis (pH 7,6), 2 mmól/liter ditiotreitol, 1 mmól/liter C0CI2, 0,15 mmól/liter GTP, 30 egység terminális transzferáz] 37 °C hőmérsékleten 3 percen át.

__

VI. A cDNS összeforrasztása és az Escherichia coli transzformálása.

Az igy nyert szintetikus kettős szálú DNS-t (0,1 Mg) és 0,5 pg fentebb említett 5 pBR322 pla^midot összeforrasztunk egy 0,1 mól/liter NaCl-t, 50 mmól/liter Trisz.HCl-1 (pH 7,6) és 1 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldatban melegítve 65 °C hőmérsékleten 2 percen át, majd 45 °C hőmérsékleten 2 órán 3 át, ezt követi a fokozatos hűtés. Ezt a terméket használjuk az Escherichia coli MM294 transzformálására Enea és munkatársainak módszerével összhangban [J. Mól. Bioi. 96,

495 (1975)].

VII. A cDNS-tartalmú plazmid izolálása

Ezen az úton mintegy 20000 tetraciklinre rezisztens transzformánst izolálunk. Mindegyikük DNS-ét nitrocellulóz szűrőn rögzít) jük. Az IL-2 Taniguchi és munkatársai által közölt [Natúré, 302, 305 (1983)] aminosav-szekvenciája alapján a 74-78. aminosavaknak (Lys-His-Leu-Gln-Cys), illetve 122-126. am’inosavaknak (Thr-Phe-Met-Cys-Glu) megfelelő > bázisszekvenciák komplementer oligonukleotidjait (⁵'AAA CAT . CTT CAG TGT³' és ^s’ ACA TTC ATG TGT GAA³’) kémiai úton szintetizáljuk a foszfortriéezter módszerrel [Crea, R. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,. 75, 5765 (1978)1. '

Ezeket az oligonukleotfdokat ³²P-vel jelöljük az 5’ végükön»T4 polinukleotid kinázzal kezelve 50 pl reakcióoldatban [0,20 pg oligonukleotid, 50 mmól/liter Trisz.HCl (pH 8,0), 10 mmól/liter Mg.Ch, 10 mmól/liter 2-merkaptoetanol, 50 pCi 7-³² Ρ ATP, 3 egység T4 polinukleotid kinéz] 37 °C hőmérsékleten 1 órán át. Ezeket a jelzett oligonukleotidokat, mint vizsgáló mintákat a fentebb említett, nitrocellulóz szűrőn rögzített DNS-ekkel összeforrasztjuk Lawn és munkatársai módszere szerint (Nucleic Acids Rés. 9, 6103 (1981)]. Négy transzformánst, amely reaktív a fenti két oligonukleotid vizsgáló mintára, észlelünk autoradiográfiával. A plazmid DNS-t

-713

HU 200793 Β ezeknek a transzformánsok nak mindegyik sejtjéből izoláljuk a Birnboim-Doly alkáli módszerrel [Bimbóim, H.C. és Doly, J.: Nucleic Acids Rés. 7, 1513 (1979,]. Majd a plazmid DNS-ben a beiktatott részt kihasítjuk, a Pstl 5 restrikciós enzimet használva. Az izolált plazmidok közül az egyetlent, amely a leghosszabb beiktatott fragmenst tartalmazza, szelektáljuk és pILOT 135-8-nak nevezzük el. Ennek a plazmidnak a restrikciós enzimes 10 térképét mutatja az 1. ábra.

Az ebbe a pILOT 135-8-ba beiktatott cDNS primer szerkezetét (bázis-szekvenciáját, a didezoxi-nukleotid módszerrel és a Maxam-Gilbert módszerrel határozzuk meg. Az 15 igy meghatározott primer szerkezetet mutatja be a 2. ábra. Az ezzel a bázis-szekvenciával meghatározott peptid 153 aminosavból áll, kezdve a szintézist start szignáljával (64-66 ATG,. Ezekből az N-terminálisból eredő 20 20 aminosavat tekintjük annak, amely szignál peptidet alkothatja. A fenti primer szerkezet megmutatja, hogy ez a plazmid rendelkezik a humán IL-2 fehérjét kódoló teljes bázis szekvenciával. Ez a tény azt jelzi, hogy az 25 említett plazmidba beiktatott gén beiktatása egy megfelelő kifejeződést elősegítő plazmidba az IL-2 fehérje tetszés szerinti polipeptid részének termeléséhez vezethet.

2. referencia példa

Az 1. referencia-példában nyert pILOT 135-8 plazmidot Hgi Al restrikciós enzimmel elhasitjuk. Az igy nyert 1294 bp hosszúságú 35 DNS fragmenst, amely az IL-2 gént· tartalmazza, T4 DNS polimerázzal kezeljük, CGATA ATG GCA dal kapcsolóval egyesítjük, amely tartalmazza az alaninhoz szolgáló GCA kodont és a metioninhoz szolgáló ATG kodont, és a 40 terméket Clal-el és PsŰ-el kezeljük, 'ezt követi a beiktatás a ptrp 771-be (Nudeic Acids Research II, 3581-3591, 1983) a Clal-Psü helynél. Az így nyert kifejeződést elősegítő plazmidot pTF4-nek nevezzük (4. ábra,. 45

3. referencia példa

Escherichia coli DHl-et transzformálunk 50 a 2. referencia-példában nyert pTF4 plazmiddal. Cohen és munkatársainak módszerével összhangban [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], hogy olyan transzformánst nyerjünk (Escherichia coli DH1 (pTF4), amely 55 az említett plazmidot hordozza.

1. példa

I. E. coli DH1 (pTF4-et, amelyet a 3. referencia-példában nyertünk) inokulálunk 50 ml folyékony tápközegben (pH 7,0), amely 1% Bacto triptont (Difco Laboratories, Amerikai Egyesült Államok), 0,5% Bacto élesztőki- 65 vonatot (Difco Laboratories, Amerikai Egyesült Államok), 0,5% nátrium-kloridot és 7 pg/ml tetraciklint tartalmaz, 250 ml-es Erlenmayer lombikba helyezve. 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át lengő rotoron történt inkubálás után a tenyésztő közeget 5 literes széles szájú fermentorba visszük át, amely 2,5 liter M 9-es tápközeget tartalmaz, ennek a tápközegnek az összetétele: 0,5% kazanpno-sav, 0,5% glükóz és 7 Mg/ml tetraciklin. Az inkubálást ezután levegőztetés és kevertetés mellett 37 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 4 órán át, majd. 25 Mg/ml 3-B-indolil-akrilsa.v hozzáadása után további 4 órán át. Az igy nyert 2,5 liternyi tenyészléböl a sejteket centrifugálással kinyerjük, és -80 °C hőmérsékletre lefagyasztjuk és tároljuk.

II. Az 1. példa (I, részében nyert far gyasztva tárolt sejteket (12,1 g) 100 ml extrahálószerben szuszpendáljuk (pH 7,0), amely 7 mól/liter guanidin hidrokloridot éa 0,1 mól/liter Trisz. HCl-t tartalmaz, a szuszpenziót 4 °C hőmérsékleten 1 órán át szuszpendáljuk és a lizátumot 28 000 Xg-nél 20 percen ét centrifugáljuk, igy 93 ml felülúszót nyerünk.

III. Elkülönítve különböző eljárásokat hajtunk végre, hogy kivonjuk az 1. példa (I) része szerinti módszerrel nyert E. coli DHl/pTF4 transzformáns sejtekből az IL-2-t a megfelelő extrakciős hatásosságok összehasonlítása érdekében.

A lizozim-EDTA módszerben 2 g, az 1. példa I. része szerint nyert E. coli DHl/pTF4 sejtet 16 ml pH 7,0 értékű, 0,1 mól/liter Trisz.HCl-t, .10 mmől/liter EDTA-t és 250 mg/1 lizozimot tartalmazó oldattal keverünk össze, a keveréket 4 °C hőmérsékleten 1 órán ét, majd 37 °C hőmérsékleten 5 percen át kevertetjük, és a lizátumot 28 000 Xg-nél 20 percen át centrifugáljuk.

Az ultrahangos 'feltárási (szonikációs) módszerben 2 g fentebb említett sejtet 16 ml pH 7,0 értékű, 0,1 mól/liter Trisz.HCl-t tartalmazó oldatban szuszpendálunk, a szuszpenziót ultrahanggal kezeljük 0 °C hőmérsékleten 5. percen át, és a lizátumot 28 000 Xg-nél 20 percen ét centrifugáljuk.

A guandini.HCl módszerben 2 g fentebb említett sejtet 16 ml pH 7,0 értékű, 0,1 mól/liter Trisz.HCl-t és 2 mól/liter vagy 4 mól/liter vagy 7 .mól/liter guanidin.HCl-t tartalmazó oldattal összekeverünk, a keverékét 4 °C hőmérsékleten 1 órán ét kevertetjük és a lizátumot 28 000 Xg-nél 20 percen át centrifugáljuk. Az igy nyert felülűszó folyadékokat alkalmazzuk a fehérje-koncentré-: ció és az IL-2 aktivitás méréséhez.

Az eredményeket a 2. táblázat szemlélteti.

-815

HU 200793 Β

2. TÁBLÁZAT. Az IL-2 extrahálása

Extrakciós eljárás	Fehérje-koncentráció (mg/ml)	IL-2 aktivitás az extraktumban (egység/ml)	Relatív hányados (X)
Lizozim-EDTA	5,40	3,3	0,02
Ultrahangos kezelés	6,54	2,2	0,01
2 mól/liter Gu.HCl	2,60	46	0,2
4 mól/liter Gu.HCl	4,12	144	0,8
7 mól/liter Gu.HCl	7,22	19100 .	100
Gu.HCl = guanidin hidroklorid

IV. Az 1. példa II. része szerint nyert felülúszó folyadékot dializáljuk 0,01 mól/liter Trisz.HCl pufferral (pH 8,5) szemben, majd centrifugáljuk 19 000 Xg-nél 10 percen át, így 94 ml dializált felülúszó .folyadékot nyerünk. Ezt alkalmazzuk egy DE 52 (DEAE-cellulóz, Whatman, Nagy-Britannia) oszlophoz (50 ml térfogatú), amelyet 0,01 mól/literes Trisz.HCl pufferrel egyensúlyoztunk ki, a fehérjék adszorpciója érdekében. A fehérjéket lineáris “NaCl koncentráció-gradienssel (0-0,15 mól/liter NaCl, 1 liter) eluáljuk. Az aktív frakciókat (53 ml) 4,8 ml-re koncentráljuk YM-5 membránt- (Amican, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazva, majd 0,1 mól/liter Trisz.HCl (pH 8,0f - 1 mól/liter NaCl pufferral kiegyensúlyozott 500 ml térfogatú Sephacryl S-200 (Pharmacia, Svédország) oszlopot alkalmazva gélszűrésnek vetjük alá. Az igy nyert aktív frakciókat (28 ml) 2,5 ml-re koncentráljuk YM-5 membrán alkalmazásával. Ezt a koncentrátumot alkalmazzuk Ultrapore RPSC (Altex, Amerikai Egyesült Államok) oszlopra az adszorpcióhoz, és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát hajtunk végre, mozgó fázisként trifluor-ecetsav-acetonitril rendszert alkalmazva.

Az alkalmazott körülmények a következők: oszlop: Ultrapore RPSC (4,6 x 75 mm); oszlop hőmérséklet: 30 °C; A oldat: 0,1% trifluor-ecetsav-99,9% víz; B oldat: 0,1% trifluor-ecetsav-99,9% acetonitril; elúciós program: 0. perc (68% A + 32% B) - 25. perc (55% A + + 45% B) - 35. perc (45% A + 55% B) - 45. perc (30% A + 70% B) - 48. perc (100% B); elúciós sebesség: 0,8 ml/perc; kimutatási hullámhossz: 230 nm. Aktív frakciót gyűjtünk össze mintegy 39 perc retenciós időnél. így 10 ml oldatot nyerünk, amely 0,53 mg nem glikozilezett humán IL-2 fehérjét tartalmaz [fajlagos aktivitás: 30000 egység/mg; aktivitás-visszanyerés a kiindulási anyagból: 30,6%; a fehérje tisztasága: 99% (SDS-poliakrilamid gél elektroferogramon végrehajtott denzitometriás méréssel meghatározva)].

A fenti oldat liofilezése fehér port ad. A por fajlagos aktivitása 26 000 egység/mg.

V. Az 1. példa IV. része szerint nyert humán IL-2 fehérjét a következő tulajdonságokra vizsgáljuk:

(1) Homogenitás:

A festés Coomassie Brilliant Blue festékkel az SDS-poliakrilamid gél elektroforézis után Laemmli és munkatársai [Natúré, 227, 680 (1970)] szerint csak az említett humán IL-2 fehérje egyetlen csíkját mutatja' ki '(lásd 5. ábra). A kötés elhelyezkedése változatlanul marad redukáló körülmények között éppen úgy, mint nem redukáló körülmények' között.

(2) Molekulatömeg

Az említett humán IL-2 fehérje molekulatömegét kb. 15 000 daltonnak számoljuk ki az SDS-poliakrilamid gél elelktroforézis eredményei alapján (lásd 5. ábra) (3) Aminosav-összetétel

Az említett humán IL-2 fehérje 20 pg-os adagját egy üveg kémcsőbe helyezzük hidrolízis céljából, 4% tioglikolsavat tartalmazó, állandóan forrásban levő sósavat adunk hozzá, majd a csövet vákuumban leforrasztjuk és hidrolízist végzünk 110 °C hőmérsékleten 24, 48 és 72 órán át. Hidrolízis után a csövet felnyitjuk, a sósavat csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és a maradékot 0,02 n.sósavban feloldjuk, majd Hitachi 835 modell aminosav-analizátort alkalmazva' aminosav analizisnek vetjük alá. A cisztin és cisztein meghatározásához az említett humán IL-2 fehérjét perhangyasavval oxidáljuk Hirs módszere szerint [Methods in Enzymol., 11, 59 (1967)], fezt követi a hidrolízis állandóan forrásban levő sósavban csökkentett nyomáson 24 órán át. A hidrolizátumot ciszteinsav meghatározásnak vetjük ^lá, aminosav analizátort alkalmazva. A fenti aminosav-analizisekkel nyert eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be. Az eredmények három érték átlagát jelentik .minden esetben, a három értéket a 24, 48 és 72 órás hidrolízis után nyerjük; a szerin és a treonin kivételt képez, ezeket a hidrolízis zéró időpontjára való extrapolálással határozzuk meg.

-9HU 200793 B

3. TÁBLÁZAT

Lépés

Kimutatott PTH-aminosav

Aminosav	Mól %
Asp/Asn	8,8
Thr	9,3
Ser	5,7'
Glu/Gln	13,7
Pro	3,4
Gly	.1,7
Ala	3,8
1/2 Cys	2,3
Val	3,1
Met	3,7
Ile	6,3
Leu	16,3
Tyr	2,3'
Phe	4,5
Lys	8,3 ’
His	2,5
Arg	3,1
Trp	1,1

(4) N-terminális aminosav-szekvencia • Az említett humán IL-2 fehérje 34 pg-os adagját elemezzük az N-terminális aminosav-szekvenciára, erre a célra az automatikus Edman-lebontási módszert alkalmazva, egy gázfázisú fehérje szekvencia-me gállapító (sequenator) (470 A modell, Applied Biosystems, Amerikai Egyesült Államok) segítségével. Fenil- tiohidantoin-aminosavakat (PTH-aminosa•vak) azonosítunk nagy teljesítményű folyadék-kromatográfiával Micropak-SP oszlopot (Varion, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazva. Az egyes lépésekben kimutatott aminosavat vagy aminosavakat a 4. táblázat mutatja be.

Y*

Leu

Asp * még nincs azonosítva (5, C-terminális aminos&v

Az említett IL-2 fehérje 33 pg-os adagját üveg kémcsőbe helyezzük hidrazinos le15 bontáshoz, 0,05 ml vízmentes hidrazint adunk hozzá és a csövet vákuumban leforrasztjuk, majd 100 °C hőmérsékleten 6 órán át melegítjük. Az igy nyert hidrazinos bontási terméket liofilezzük és desztillált vízben oldjuk.

Benzaldehidet adunk az oldathoz, a keveréket szobahőmérsékleten 1 órán át kevertetjük, majd centrifugáljuk. Az igy nyert vizee réteget liofilezzük és aminosav-analizisnek vetjük alá, Hitachi 835 aminosav-analizátort alkalmazva. Kizárólag treonint mutatunk ki.' (6) Tripszines peptid-térképezés

Az emlitett IL-2 minta 15 pg-os adagját 0,4 pg tripszinnel (Washington, Amerikai Egyesült Államok) emésztjük 120 pl 0,02 mól/ /literes nátrium-hidrogén-karbonátban 37 °C hőmérsékleten 18, órán át. Ezután 5 juíl 2-merkapto-etanolt adunk hozzá és a reakciót további 2 órán át folytatjuk 37 °C hőmérsékleten. Ezután a reakciót befejezzük 75 pl 1%35 -os trifluor-ecetsav hozzáadásával· A reakcikeverék nagy teljesítményű folyadékkromatográfiája, amelyet az alább megadott körülmenyek közölt végzünk, a 6. ábrában bemutatott térképet adja.

Oszlop: Ultrasphere-Octyl (5 pm; 4,6 x x'250 mm; Altex, Amerikai Egyesült Államok) ’ Oszlop-hőmérséklet: 30 °C Mozgó fázis:

4. TÁBLÁZAT

Lépés	Kimutatott PTH-aminosav	45	A oldószer: , 0,02% trifluor-ecetsav 99,98% víz; B oldósifer: 0,02% trifluor-recetsav 99,98% acetonitril;
1	Ala
2	Met Pro	50	0. perc (95% A oldószer + 5% B, oldószer) - 40. perc
	Ala	(30% A oldószer + 70% B oldószer);
3	Thr		Áramlási sebesség: 1 ml/perc;
4	Pro Ser		Kimutatás: Fluoreszcenciás módszer [Analytical Biochem., 67, 438 (1975)], fluoreezcamint
5	Thr Ser	55	(Roche, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazva
6	Ser		(7) Aktivitás az IL-2-függő sejtvónalakkal
7	Thr		szemben
8	Lys		A találmány szerinti nein-glikozilezett
9	Lys	60	humán IL-2 fehérje meghatározása a Biochem.
10	Thr	Biophys. Rés. Commun., 109, 363 (1982) sze-
11	Gin		rinti módszerrel összhangban azt mutatja,
12	Leu		hogy az 'említett IL-2 fehérje rendelkezik
13	Gin		olyan aktivitással, hogy elősegítse a tricium-
14	Leu	65	mai jelzett timidin beépülését egy IL-2-függő
15	Gin

-1019 egér sejtvonalba (NKC3, lásd 7. ábra), valamint egy IL-2-függő emberi sejtvonalba (lásd

8. ábra).

Ezen kivül az IL-2 fehérjét 20% FCS-el kiegészített RPMI 1640 tápközegben oldunk 5 0,5 egység/ml koncentrációra, és 2 x x 10^s sejt/ml NKC3 sejtvonalat szuszpendálunk el a tápközegben. Tenyésztést folytatunk Limbro Multi lemezen (Flow, Amerikai Egyesült Államok) 37 °C hőmérsékleten 5% 10 CO2 jelenlétében, miközben az élősejt számlálást és a tenyészet újra szuszpendálását friss tápközegben megismételjük 2-3 naponként. Ennek eredményeképpen azt találjuk, hogy az említett IL-2 fehérjének van aktivi- 15 tása az NKC3 sejtvonal növekedésének fenntartására hosszú időn át, amint ez a 9. ábrán látható.

2. példa. (Injekció készítése)

Az 1. példa IV. része szerint nyert nem glikozilezett humán IL-2 fehérjét tartalmazó oldatot alkalmazzuk 0,025 möl/liter ammónium- 25 -acetát pufferral (pH 5,0) kiegyensúlyozott CM Toyopearl (Toyo Sóda, Japán) oszlophoz, az adszorpciót aszeptikus körülmények között végezve, majd ezt követi az elúció a fenti pufferral, amely még 0,15 mól/liter 30 NaCl-t is tartalmaz. Az eluátumot megfelelő mennyiségű 0,15 mól/literes NaCl-el hígítjuk, majd HSÁ-t adunk hozzá 0,5% koncentrációig, és a keveréket membránszűrőn (0,22 um pórus-átmérő) átszűrjük. A szűrletet aszepti- 35 kusan 1 ml-es adagokban ampullákba osztjuk szét, ezt követi a liofilezés. A humán IL-2 injekciós készítményt ampullánként 1 ml desztillált vízben oldjuk fel injekcióhoz használat előtt.

Az IL-2 készítmények endotoxin tartalmának és pirogenecitásának meghatározásához két tétel tisztított IL-2-t állítunk elő E. coli sejtekből a találmány szerinti eljárással, és két tétel nyers extraktumot, vagyis sejt- 45 mentes extraktumot állítunk élő E. coli sejtekből a 91 539. számú európai közrebocsátási irat szerint. A minták előállítását az I. kísérletben ismertetjük.

Az így kapott két tétel nyers extraktu- 50 mot és két tétel tisztított készítményt használjuk a II. kísérletben ismertetett endotoxin meghatározáshoz és pirogén teszthez.

(1) Endotoxin tartalom

Mint a II. kísérlet 7. táblázatából látható, a tisztított készítmény endotoxin tartalma különösen alacsony, közelebbről 0,017 és 0,014 ng/mg fehérje. Ezzel ellentétben a nyers extraktum endotoxin tartalma mintegy

1,6 x 10^{1 * * * 5}-szerese a tisztított készítményének, vagyis konkrétan 2,0 x 10³ és 2,9 x 10³ ng/ mg fehérje. 55

Mivel a nyers extraktum endotoxin 'tartalma túl nagy, az extraktum klinikai célokra nem használható, míg a különösen kevés endotoxint tartalmazó tisztított készítmény klinikai felhasználásra önmagában alkalmas.

(2) Pirogén teszt

Az egyedenként 1 x 10³ egység értékű klinikai dózisból kiindulva (ami 50 kg átlagos testtömeg figyelembevételével megfelel 20 egység/kg dózisnak), pirogén tesztet hajtunk végre mindkét készítmény tízszeres, vagyis 200 egység/kg dó2isú adagolásával. A dózis meghatározó kísérletben azonban a nyers extraktummal kezelt nyulak a testhőmérséklet emelkedése miatt elpusztultak. Ezért a nyers extraktum dózisát 20 egység/ 20 kg értékre csökkentjük.

Mint a II. kísérlet 8. táblázatából látható, a tisztított készítmény adagolása esetén pirogenecitás nem mutatható ki, mig a nyers extraktum esetén a jóval kisebb dózisban alkalmazott rIL-2-nél is piYogenecitás észlelhető.

. A nyers extraktum tehát pirogenecitása miatt klinikai felhasználásra nem alkalma^, mig a tisztított készítmény klinikai célokra felhasználható.

I. kísérlet (1) E. coli N4830/pTB 285 előállítása

Az 1. referencia példa szerint előállított pilot 135-8 plazmidot HgiAI restrikciós enzimmel hasítjuk, igy így kapott 1294 bp DNS fragmenst T4 DNS fragmens polimerázzal tompa végűvé alakítjuk .és T4 DNS ligáz felhasználásával dRGCCATGAATTCATGGCA EcoRI linkerrel kapcsoljuk. Az igy kapott DNS-t EcoRI segítségével hasítva olyan DNS fragmenst kapunk, amely többek között ATG start kodont és humán IL-2 gént tartalmaz.

Ezt a DNS fragmenst T4 DNS ligáz segítségével EcoRI-PstI helyen hasított ptrp 781-be (Nucleic Acid Research 11, 3077, 1983) építjük be. Az így. kapott pTF 1 kifejező plazmid egy transzlációs statt kodont és a trp promotertől lefelé egy humán IL-2 gépt tartalmaz.

Á pTF 1 plazmidot Stul restrikciós en55 zimmel hasítjuk és BamHI linkerrel kapcsoljuk. Ezt a plazipid DNS-t BamHJ és EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük és az EcoRI-BamHI helyen XPL promotert tartalmazó pTB 281-be építjük be. Az igy kapott kifejező 60 plazmid a pTB 285 jelet kapja.

(2) Escherichia coli N4830 törzset Cohen és munkatársai szerint (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110, 1972) a fenti pTB 285 plazmiddal transzformáivá az adott plazmidot hordozó transzformánst kapunk (Escherichia coli N4830/pTB285).

-1121 HU ;

(3) A kapott E. coli N4830/pTB285 transzformánst 50 ml folyékony közegbe (pH = 7,0) inokuláljuk, amely 1 tömegX Bacto triptont (Difco Laboratories, USA), 0,5 tömegX Bacto élesztő extraktumot (Difco Laboratories, USA), 0,5 tömegX nátrium-kloridot és 7 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmaz és 250 ml-es Erienmeyer lombikba töltjük. Rázógépen egy éjszakán keresztül 35 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a tenyészközeget 5 l-es fermentorba visszük, amelyben 2,5 liter M9 közeg található, amely 0,5 tömegX kazaminosavat, 0,5 tömeg glükózt és 7 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmaz. A tenyészetet levegőztetés és kevertetés közben 4 órán keresztül 35 °C hőmérsékleten és további 3 órán keresztül 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az igy kapott 2,5 liter térfogatú tenyészközegból centrifugálással összegyűjtjük a sejteket,'majd -80 °C hőmérsékletre hűtjük és tároljuk.

A sejteket az 1. példában leírt módon extrahálva és tisztítva nagy tisztaságú humán IL-2 fehérjét kapunk, amelynek tulajdonságai megegyeznek az 1. példa V. pontjában leirt tulajdonságokkal.

(4) E. coli N4830/pTB285 transzformánst az 1. példa I. pontjában leirt módon tenyész5.

rIL-2 készítmény

I B 22 tünk. A kapott E. coli sejteket a 91 539. számú európai kőzrebocsátási irat 5. példájában leírt módon extraháljuk. Közelebbről, 8 g E. coli sejtet 40 ml Tris-HCl (pH = 7,5) pufferben szuszpendált 30 mmól/1 nátrium-klorid és 20 mmól/1 Tris-HCl eleggyel mosunk, majd 0 °C hőmérsékleten 2 percen keresztül ultrahanggal kezeljük. A lizáturoot Ό °C hőmérsékleten 20 percen keresztül 1 mikrogramm/ ml lizozimmal kezeljük, háromszor megfagyasztjuk és felolvasztjuk és a kapott 'elegyet 30 percen keresztül 28 000 g értéken centrifugáljuk. így két tétel nyers extraktumot állítunk elő, amely a táblázatban 01 tétel és 02 tétel számon szerepel.

(5) E. coli N4830/pTB285 transzformánst tenyésztünk az 1. példa I. pontjában leirt módon. A kapott E. coli sejteket az 1. példa IL, III. és IV. pontjában léirt módon extra20 háljuk és tisztítjuk. így két tétel rekombináns IL-2 (rIL-2) készítményt állítunk elő, mely a táblázatban 51 tétel és 52 tétel számon szerepel.

(6) A 844678. számú finn kőzrebocsátási iratban megadott módon meghatározzuk a nyers extraktum és a' tisztított készítmény fehérjetartalmát és IL-2 aktivitását. A mérési eredményeket az 5. táblázatban adjuk meg.

TÁBLÁZAT

Fehérjetartalom IL-2 aktivitás (mg/ml) (egység/ml)

Nyers extraktum: 01 tétel tétel

Tisztított készítmény tétel tétel (7) A kapott rIL-2 készítményeket használjuk a kővetkező II. kísérletben.

II. kísérlet

Π-l. kísérlet: az rIL-2 készítmények endotoxin tartalma ' (1) Felhasznált anyagok:

Az rIL-2 készítményeket (01 és 02 tétel nyers' extraktum, valamint 51 és 52 tétel tisztított készítmény) a I. kísérlet szerint állítjuk elő.

(2) Vizsgálati módszerek és eredmények:

A készítmények endotoxin tartalmát T.

Sakata és munkatársai (J. Párén. Sci. Teck.

39, 194, 1985) módszerével határozzuk meg. Először Escherichia coli 055: B5 Control 704089 cn törzsből (Difco Laboratories, USA) származó standard endotoxint oldunk vízben, és igy

3,1 x 10³ ng/ml, 6,3 x 10^-3 ng/ml, 1,25 x x 10^-2 ng/ml, 2,5 x 10*² ng/ml és 5,0 x x 10^_z ng/ml koncentrációjú endotoxin oldat sorozatot állítunk elő. A toxinométer ET-201

15,4 90,0

14,0 86,5

1,08 28500

0,98 27000 készüléken elvégzett vizsgálathoz egy 10 mm átmérőjű üvegcsőbe 100 mikroliter vizsgálandó oldatot és 100 mikroliter LAL oldatot (Limulus ambocyte lizátum egy Limülus polyphemus vérsejt extraktum, Associates of Cape Cod, Inc.) adunk. A reakcióelegyet- Voltex keverőn néhány másodpercen keresztül kevertetjük, majd a kémcsövet a készülék optikai egységébe helyezzük és a később részletezett módon mérjük a zavarosságot. A reakcióidőt minden mintánál külön számoljuk a gélesedés megkezdéséig. A mérési eredményeket a 6. táblázat tartalmazza.

6. TÁBLÁZAT

Standard endotoxin Gélesedési idő koncentráció (ng/ml) (perc)

5,0 x 10-²	16,50
2,5 x 10-²	19,40
1,25 x 10-²	24,60
8,3 x 10-³	32,20
3,1 x 10-³	39,40

-1223

HU 200793 Β

A mérési eredmények alapján felvesszük az endotoxin koncentráció görbéjét: lóg C = -3,07 x lóg Tg + 2,389 r = -0,997

A toxinométeri ET-201 készülék 660 nm hullámhosszon a LAL/endotoxin oldat gélese- 5 dés közben fellépő zavarosság változást méri és automatikusan a minta gélesedési idejét jelzi ki. A készülék egyidejűleg 64 mintánál és egymástól függetlenül 12 másodperces időintervallumokban a kezdeti elnyeléshez vi- 10 szonyitott pillanatnyi érték R(t) arányát jelzi ki. A gélesedés pontos kimutatásához a mintákat 37 ± 0,5 °C hőmérsékleten · inkubáljuk és igy kizárjuk a minta rázódásából származó hibákat. A készülék a T(G) gélesedési időt 15 adja meg, amely az R(t, 5%-os növekedéséhez szükséges reakcióidőnek felel meg és felhasználható az endotoxin koncentráció kiszámításához.

Ezután az rIL-2 készítményeket ,vizben oldjuk, majd a fent ismertetett eljárás végrehajtása után meghatározzuk a gélesedési időt. A mérési eredményekből a standard endotoxinnal felvett görbe alapján meghatározzuk az oldatok endotoxin koncentrációját és ez alapján az rIL-2 fehérje 1 mg-jára vonatkoztatott endotoxin tartalmat. A mérési eredményeket a 7. táblázat tartalmazza.

rIL-2 készítmény Endotoxin koncentráció (ng/ml)

7. TÁBLÁZAT

Fehérje koncentráció (mg/ml)

En dotoxin/f ehérje (ng/ml)

Nyers extraktum tétel 3,1 x 10⁴ 15,4 tétel 4,1 x 10⁴ 14,0

Tisztított készítmény tétel 1,8 x 10'² 1,08 tétel 1,4 x 10’² 0,98

2,0 x 10³2,9 x 10³

1,7 x 10-²1,4 x ΙΟ'²

II-2. kísérlet: Az rIL-2 készítmények pirogenecitásának meghatározása (1) Felhasznált anyagok:

Az rIL-2 készítményeket (nyers extrák- ^5 tűm 01 és 02 tétel, valamint tisztított készítmény 51 és 52 tétel) a I. kísérlet szerint állítjuk elő. A kísérleti állatként alkalmazott nyulakat az Ichikawaya tenyészetből (Tokió, Japán) szerezzük be.

(2) Kísérleti módszerek és eredmények:

A pirogén tesztet a · .Minimum Requirements of Bíological Products, Association of Biologicas Manufacturers of Japan, 1986' 324-326. oldalán megadott módon végezzük. A‘ mérési eredményeket a 8. táblázatban adjuk meg.

rIL-2 készítmény

8. TÁBLÁZAT

Dózis Hőmérsékletemelkedés Pirogenecitás (rIL-2 egység/kg) (°C)

Nyulak sorszáma:

3 Össz.

Nyers extraktum

01 tétel	20	0,8	1,6	1,8	4,2	+
02 tétel	20	0,7	1,1	1,2	3,0	+
Tisztított
készítmény
51 tétel	200	0,2	0,2	0,3	0,7	-
52 tétel	200	0,2	0,2	0,3	0,7	-

-1325

HU 200793 Β

Az alkalmazott pufferek pirogén mentesek.

(3) Kiértékelés:

A mérési eredményekből látható, hogy 'a tisztított készítmények pirogén mentesek, mig 5 a nyers extraktumok' a humán gyógyászatban alkalmazható klinikai dózisban az alkalmazott vizsgálati módszer pirogenecitást mutatnak.

Claims

1. ) Eljárás lényegében tiszta nem glikozilezett humán interleukin-2 fehérje előállítására, amelynek fajlagos aktivitása nem keve- 15 sebb, mint 10⁴ egység/mg, azzal jellemezve, hogy a) egy humán interleukin-2-t kódoló bázisszekvenciával rendelkező DNS-t hordozó

E. coli transzformáns törzset megfelelő tenyésztő közegben tenyésztünk és b) az Így 20 nyert humán interleukin 2-t hidrofób oszlopkromatográfiásan tisztítjuk.

2. ) az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a hidrofób oszlop|cromatográfiaként fordított fázisú oszlopot 'használó 25 nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát alkalmazunk.

3. ) A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kromatográfiát 1,5-8 közötti pH értékű eluálószert alkalmazva hajt- 30 juk végre.

4. ) A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kromatográfiát 0,1-100 ml/perc áramlási sebesség mellett hajtjuk végre. 35

5. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a humán interleukih-2-t növekvő transzformáns sejtekben állitjuk elő és halmozzuk fel ás a humán interleukin 2-t a sejtekből kivonjuk, igy [íumán interleukin- 40 -2-tartalmú folyadékot nyerünk.

6. ) Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a humán interleukin 2-t egy fehérje-denaturáló szer oldatával vonjuk ki. 45

7. ) A 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a humán interleukin 2-t egy guanidin só 2 mól/liter és 8 mól/liter közti koncentrációjú oldatával vonjuk ki.

8. ) Eljárás gyógyászati kompozíció elóál- 50 litására, azzal jellemezve, hogy lényegében tiszta, nem glikozilezett humán interleukin-2 fehérjét, amelynek fajlagos aktivitása nem kevesebb, mint 10* egység/mg, farmakológiailag elfogadható hordozóval, vivőanyaggal 55 vagy hígítóval keverünk össze.