HU208635B - Process for production of stabilized medical preparatives containing fibroblast growing factor - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás fibroblaszt növekedési faktorral befolyásolható betegségek, így sebek, valamint az emésztőcsatorna fekélybetegségeinek kezelésére alkalmas stabil gyógyászati készítmény előállítására.

A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy fibroblaszt növekedési faktort és szacharóz-oktaszulfátot vagy ennek valamely savaddíciós sóját 1:5-100 tömegarányban elegyítünk és az elegyet a gyógyszergyártásban szokásos vivő-, hígítószerekkel és/vagy segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménynyé alakítjuk.

A találmány tárgya közelebbről eljárás fibroblaszt növekedési faktor (a továbbiakban rövidítve: FGF) stabilizálására hőhatással, savas környezettel és/vagy proteolitikus behatással szemben. A találmány szerint az FGF-t szacharóz-oktaszulfáttal (a továbbiakban rövidítve: SOS) és különösen annak alumíniumsójával (szukralfáttal) vagy káliumsójával kombináljuk. A találmány feladata SOS-t és FGF-t tartalmazó, FGF szempontjából stabil gyógyászati készítmények előállítása. E készítmények az FGF-ra reagáló betegségek - így sebek és a gyomor-bélcsatoma fekélyes megbetegedéseinek (állapotainak) - a kezelésére alkalmazhatók.

A gyomor-bélcsatorna fekélyes megbetegedései amelyeket általában peptikus fekélyeknek neveznek olyan betegségek, amelyek esetében az emésztőcsatorna epitéliuma hiányos. Az ilyen típusú hiány általában sósav és pepszin együttes hatása következtében lép fel. A peptikus fekélyek - definíciójuk szerint - legalább a nyálkahártya alatti szövetig hatolnak; az ennél felületibb jellegű károsodásokat (sérüléseket) eróziónak tekintik. Peptikus fekélyek a gyomor-bélcsatorna számos helyén - így a gyomorban, duodénumban (patkóbélben), nyelőcsőben, a Meckel-féle divertikulumban, sebészi úton kialakított egybenyílásokon (anasztomózisokon) és ritkábban az éhbél felső szakaszán - fordulhatnak elő.

Húsz évvel ezelőtt a peptikus fekélyeket fektetéssel, diétával, savmegkötőszerekkel és/vagy a fekélyes terület sebészi eltávolításával kezelték. Később a peptikus fekélyek kezelésére H-2 receptor-antagonistákat alkalmazták. A két legáltalánosabban alkalmazott H-2 receptor-antagonista a ranitidin és a cimetidin, amelyek terápiás hatása a gyomorsavelválasztás gátlásában áll. Részletesen vizsgálták a két antagonista nem kívánt hatásait (lásd például Thomas és munkatársai: Clinics in Gastroenterology, 13,501).

Jóllehet az ilyen antagonistákkal végzett kezelés széles körben elterjedt és viszonylag sikeresnek bizonyult, számos peptikus fekély nem reagál a H-2 receptor-antagonista terápiára. így például - bár ennek okai még nem világosak - a duodénumfekélyeknek mintegy 20-30%-a cimetidinnel vagy ranitidinnel végzett 4-6 hetes terápia során nem gyógyult; sőt a H-2 receptorantagonisták alkalmazása során a fekélyes állapot kiújulása is előfordult.

A szukralfátot szintén felhasználták fekélyek gyógyítására; mellékhatásai minimálisak. Úgy vélik, hogy a szukralfát a gyomor-bélcsatorna többszörös védőmechanizmusát befolyásolja, és javítja vagy teljessé teszi

i) a pepszin és az epesavak adszorpcióját, ii) serkenti a gyomornyálkahártya-elválasztás citoprotektív hatását és a gyomornyálkahártya hidrogén-karbonát-elválasztását, iii) védőhatást nyújt a prolifaktív terület károsodásával szemben, továbbá iv) védi az érhálózat épségét. Jóllehet jelentős előrehaladást értek el a szukralfát eróziókkal és fekélyekkel szemben kifejtett megelőző hatásának, valamint fekélyeket gyógyító hatásának a megértésében, mindeddig nem derítették fel teljesen a hatóanyag krónikus terápiás hatásait.

Kimutatták, hogy az FGF hatásos érképző (angiogén) faktor, amely - többek között - a sebgyógyulás friss érképződéséért is felelős. Az FGF-nek két típusa van; az egyik a savas fibroblaszt növekedési faktor (az alábbiakban rövidítve: aFGF), a másik a bázisos fibroblaszt növekedési faktor (bFGF). Az aFGF és bFGF azonban savval és/vagy hőhatással szemben labilis, tehát az FGF-nak savas és/vagy hőhatást előidéző környezetben - így peptikus fekélyek kezelésére - végzett alkalmazása megkívánja, hogy az ilyen környezettel szemben stabilizálják a terápiás νο/μΐ értékének maximálissá tétele céljából.

Újabban azonban a WO90/01941 számú közzétételi iratban olyan, savval szemben ellenálló FGF készítményeket közöltek, amelyek például rekombináns úton előállított FGF-t tartalmaznak kombinálva i) stabilizálószerekkel, például glikozaminoglikánnal, glükánszulfátokkal, valamint szulfátéit ciklodextrinekkel; ii) elválasztást gátló szerekkel, például H-2 receptor-antagonistákkal; iii) citoprotektív szerekkel és iv) savmegkötőszerekkel. Kinyilvánították, hogy ezek az új készítmények rendkívül hatásosak olyan bántalmak kezelésében, ahol az FGF hatásos gyógyszer lehetne, ha nem kerülne savas és/vagy hőhatással járó környezetbe.

A fentiek alapján továbbra is fennáll az igény olyan új eljárásokra, amelyek útján az FGF stabilizálható, s így mind diagnosztikai lehetőségei, mind gyomor-érrendszeri megbetegedések, sebek és hasonló kóros állapotok kezelésében terápiás potenciálja kiaknázható.

A jelen találmány eljárást biztosít FGF stabilizálására. Ez az eljárás abban áll, hogy az FGF-t a szacharóz-oktaszulfát (SOS) valamelyik sójával, különösen az alumíniumsójával (szukralfáttal) vagy káliumsójával kombináljuk. Az alábbiakban az „SOS” rövidítést használjuk a szacharóz-oktaszulfát sóinak a rövidítésére, így alumínium- és káliumsóinak a rövidítésére is. A jelen találmány szerinti stabil FGF készítmény felhasználható olyan emlősök, ezen belül humán betegek kezelésére, amelyek valamilyen FGF-ra reagáló betegségben, különösen olyan betegségekben szenvednek, amelyek savas vagy hőhatással járó környezetben lépnek fel, vagy amelyek környezetében proteolitikus hatású anyagok vannak jelen. A jelen találmány szerinti készítmények konkrétan a gyomor-bélcsatorna fekélyes megbetegedéseinek kezelésére alkalmazhatók úgy, hogy a beteg számára az FGF hatásos mennyiségét SOS-tal kombinálva, gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal, segédanyagokkal vagy hígítószerrel együttesen adagoljuk. A találmány szerinti készítmény olyan sebek kezelésére is alkalmazható, ame2

HU 208 635 Β lyek esetében proteolitikus anyagok az FGF terápiás értékét lerontanák.

Egy másik vonatkozásában azt találtuk, hogy az SOS nagy affinitást mutat az FGF iránt, s így felhasználható FGF tisztítására, továbbá diagnosztikailag is alkalmazható olyan esetekben, ahol az FGF jelenléte és/vagy mennyisége lényeges.

A jelen találmány alapján lehetővé válik új, stabil FGF készítmények előállítása emlősök, ezen belül humán páciensek olyan megbetegedéseinek kezelésére és/vagy megelőzésére, amelyek FGF-terápiára reagálnak (válaszolnak).

Az FGF-ra reagáló kóros állapotok kezelési módszere legegyszerűbb formájában abban áll, hogy humán betegnek vagy emlős állatnak valamilyen stabil FGF készítménynek vagy gyógyászati szempontból elfogadható sójának hatásos mennyiségét adagoljuk, ahol a stabil készítmény SOS és FGF kombinációját tartalmazza.

Különböző emésztőrendszeri fekélyes megbetegedések például úgy kezelhetők, hogy a humán betegnek vagy az emlős állatnak egy stabil FGF készítmény hatásos mennyiségét adagoljuk. Ilyen fekélyes megbetegedések például: a regionális csípőbélgyulladás (ileitis), a fekélyes vastagbélgyulladás és a peptikus fekély (mind a gyomor-, mind a duadénumfekély).

A találmány szerinti stabil FGF készítmény alkalmazható továbbá humán betegek és emlős állatok más kóros állapotainak a kezelésére is, amelyek reagálnának az FGF terápiára, azonban savas, hőhatással járó és/vagy proteolitikus hatású környezet az FGF gyógyító hatását lerontja. így például a hólyagrák sugár- vagy kemoterápiás kezelése során gyakran fellép a hólyagszövet fekélyesedése, amely kezelhető volna FGF-ral, ha az FGF stabil maradna a hólyagban fennálló savas környezettel szemben. Sebek is létrehozhatnak olyan savas és/vagy proteolitikus környezetet, amely a jelen találmány szerinti, stabil FGF-készítményre kedvezően reagálhat. A területen jártas szakember számára nyilvánvalók olyan körülmények, amelyek savas, hőhatással járó vagy proteolitikus környezetet teremtenek, és amelyek egyébként FGF terápiával szemben válaszképesek (FGF terápiára reagálnak), ilyenek például:

i) szöveti károsodások, égési sebek, sebek, műtét utáni szövetkárosodások, trombózis, arterioszklerózis;

ii) az izomzat és a csontváz kóros állapotai, például csonttörések, szalagok (ligamentumok) és inak sérülései, íngyulladás, nyálkatömlőgyulladás, a bőr kóros állapotai, így kisebb égések, vágott sebek, felfekvés által okozott sebek, lassan gyógyuló és krónikus fekélyek, például cukorbetegeken előforduló fekélyek, valamint iszkémiai (vérellátási zavarok) és szívizom-infarktus során fellépő szövetkárosodások;

iii) a szem recehártyájának kóros állapota, például cukorbetegek retinopátiája és neovaszkuláris glaukómája; bőrbetegségek, például pszoriázis és lencse mögötti fibroplázia, krónikus gyulladás, reumás ízületi gyulladás, továbbá olyan neoplazmák, amelyek erősen érképző (angiogén) jellegűek, így egyes jóindulatú vagy rosszindulatú daganatok növekvése, amilyenek a hemangiómák, angiofibrómák és a szilárd daganatok.

A jelen találmány szerinti stabil FGF készítmény lehet SOS-t és akár aFGF-t, akár bFGF-t tartalmazó készítmény. A találmány megvalósítására számos forrásból - így emlősökből, például embertől, szarvasmarhától, majomtól, sertéstől vagy lótól - származó aFGF és bFGF alkalmazható.

Előnyös az olyan stabil FGF készítmény, amely módosított FGF-t, például tisztított, rekombináns emberi bázisos FGF (rövidítve: rhbFGF) fehérjét tartalmaz, amelyben mutációt indukálunk („mutein”) úgy, hogy az érett fehérjében lévő 25., 69., 87. és 92. helyzetű négy ciszteinmaradék közül egyet vagy többet szerinre cserélünk. Az emberi bFGF-t felépítő aminsavak számozásában az N-terminális Pro jelenti az első aminosavat. A legelőnyösebb FGF az rhbFGF CS23 jelű muteinje (muntánsa), amelynek szerkezetét Senoo és munkatársai részletesebben leírták [Biochem. Biophys. Rés. Com. 151, 701 (1988); valamint az 1988. február 18-án benyújtott 161123 alapszámú egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, amely megfelel a 0281822 számú közzétett európai szabadalmi bejelentésnek, s amelyre e leírásunkban hivatkozunk]. Más muteinek - amelyek a jelen találmány gyakorlati megvalósítása során felhasználhatók, s amelyeket szintén a fenti irodalmi idézetekben leírtak - például az olyan muteinek, amelyekhez további aminosavat (aminósavakat) kapcsoltak, vagy amelyekben egy vagy több aminosavat helyettesítettek vagy elhagytak.

A jelen találmány szerinti stabil FGF készítményeket igen stabilnak találtuk savas, hőhatással vagy proteolitikus hatással járó környezettel szemben. Az olyan aktív, emlőstől származó FGF-ok és FGF-változatok, amelyeket rekombináns úton a fentiek szerint a savval szemben mutatott ellenállás céljából módosítunk, igen kevéssé toxikusak.

Az FGF stabilizálására alkalmazható két előnyös szacharóz-oktaszulfátsó az SOS káliumsója és alumíniumsója (szukralfát). Számos tényező, például az adagolás módja, a szolubilizálás igénye dönti el, hogy az előnyös, stabil FGF készítmény előállításához a szacharóz-oktaszulfát melyik sóját választjuk. A gyomorbélrendszeri megbetegedések kezelésére előnyösen alkalmazhatjuk az SOS alumíniumsóját (szukralfátot), mivel a vérpályákba nem szívódik fel.

A találmány szerinti stabil FGF készítmény előnyös adagolási módja több tényezőtől, így például a kezelésre szoruló kóros állapottól és a betegségtől függ. így például, ha a találmány szerinti készítményt húgyhólyag fekélyes sebeinek - amelyek például sugárkezelés vagy kemoterápia következtében lépnek fel - a kezelésére alkalmazzuk, akkor a stabil FGF készítményt a húgyvezetékbe helyezett katéteren át adagolhatjuk. Ha a gyomor-bélcsatoma fekélyét kezeljük, akkor az adagolást előnyösen orális úton, például tabletta, kapszula, tasak vagy rágógumi alkalmazásával végezzük. Az emésztőrendszeri fekélyek kezelését például végbélen át vagy parenterálisan is elláthatjuk.

A stabil FGF készítményeket az adagolás céljára a szokásos módon állíthatjuk elő. Tablettákat és kapszulákat segédanyagok, így gyógyászati szempontból elfo3

HU 208 635 Β gadható vivőanyagok (például laktóz, kukoricakeményítő, gördülékeny szilícium-dioxid, mikrokristályos cellulóz, szacharóz), kötőanyagok [például alfa-keményítő, metil-cellulóz, (karboxi-metil)-cellulóz, (hidroxi-propil)-cellulóz, (hidroxi-propil)-metil-cellulóz, polivinil-pirrolidon], szétesést előidéző szerek [például (karboxi-metil)-cellulóz-kalciumsó, keményítő, kismértékben szubsztituált (hidroxi-propil)-cellulóz], felületaktív szerek [például Tween 80, Pluronic F68 (Asahi Denka, Japán], poli(oxi-etilén)-poli(oxi-propilén)-kopolimer, antioxidánsok (például L-cisztein, nátrium-szulfit, aszkorbinsav-nátriumsó) és kenőanyagok (például magnézium-sztearát, talkum) alkalmazásával állíthatunk elő.

Végbélben (rektálisan) alkalmazható készítményeket szintén a szokásos eljárásokkal állítunk elő, aminek során kenőcsös állományú alapanyagot, például hoszszabb szénláncú zsírsav-gliceridet (így természetes eredetű kakaóvajat, félszintetikus Witepsolokat (Dynamite Nobel, NSZK), közepes lánchosszúságú zsírsav-gliceridet [például Miglyolokat (Dynamite Nobel)] vagy növényi olajat (például szézámolajat, szójababolajat, gabonaolajat, gyapotmagolajat, olívaolajat) alkalmazunk.

Ha a készítményt befecskendezhető vizes oldat formájában alakítjuk ki, akkor ezt az oldatot a szokásos módon állítjuk elő; ehhez oldószerként például vizes oldószert (így desztillált vizet, fiziológiás konyhasóoldatot, Ringer-oldatot) vagy olajos oldószert (így szezámolajat vagy olívaolajat) alkalmazunk. Kívánt esetben egy vagy több segédanyagot is használhatunk. Ilyen segédanyagok például az oldódást elősegítő anyagok (így a nátrium-szalicilát, nátrium-acetát), pufferanyagok (például nátrium-citrát, glicerin), izotonizálószerek (például glükóz, invertcukor), stabilizálószerek (például a humán szérumalbumin, polietilénglikol), tartósítószerek (például a benzil-alkohol, fenol), valamint fájdalomcsillapítók (így a benzalkónium-klorid, prokain hidroklorid). Előnyös az SOS káliumsójának az alkalmazása, ha intravénásán adagolunk, mivel a sók jól oldódnak.

Amennyiben a készítményt szilárd alakban állítjuk elő, akkor rutinszerűen járhatunk el, és alkalmazhatunk: valamilyen oldószert (így desztillált vizet, fiziológiás konyhasóoldatot, glükózoldatot), vivőanyagot [például karboxi-metil-cellulózt, nátrium-alginátot], tartósítószert (például benzil-alkoholt, benzalkóniumkloridot, fenolt) vagy fájdalomcsillapítókat (például glükózt, kalcium-glükonátot, prokain hidrokloridot). Az SOS-t előnyösen szukralfát alakjában alkalmazzuk.

A készítmény FGF komponensének mennyisége egyéb gyógyászati hatású szerekkel, például a H-2 antagonistákkal összehasonlítva figyelemreméltóan csekély, és számos tényezőtől, így a kezelésre szoruló kóros állapottól, a beteg élelemfogyasztásától, valamint attól függ, hogy az FGF komponenst önmagában vagy más, az elválasztást gátló szerekkel, citoprotektív és savmegkötő hatóanyagokkal együttesen alkalmazzuk.

Ha például felnőtt betegek gyomor-bélrendszeri fekélyes betegségeit kezeljük, akkor a találmány szerinti gyógyászati készítmény FGF fehérjekomponensét orálisan általában naponta körülbelül 0,1 pg és 30 mg közötti mennyiségben, előnyösen körülbelül 0,1 pg és 10 mg közötti mennyiségben, még előnyösebben naponta 1,0 pg és 3 mg, legelőnyösebben körülbelül 10 pg és 300 pg közötti mennyiségben adagoljuk. Orális adagolás céljára 10 pg-150 pg rhbFGF CS23 muteint vagy annak sóját szukralfáttal (általában körülbelül 10-1000 mg szukralfáttal) készítménnyé, például tablettává vagy kapszulává alakíthatjuk gyógyászati szempontból elfogadható vivő-, hígítószenei vagy más alkalmas vehikulummal keverve. Az ilyen készítményt előnyösen naponta 1-4 alkalommal adagoljuk a megfelelő dózistartomány elérése céljából.

Az alsó emésztőcsatorna egyes kóros állapotai, például peptikus fekélyei és fekélyes vastagbélgyulladás esetében előnyös a stabil FGF készítmény bevonása valamilyen bélben oldható kopolimerrel, amilyen például a (hidroxil-propil)-metil-cellulóz-ftalát, cellulózacetát-ftalát vagy a metakrilsav; ez a bevonat további védelmet biztosít a stabil készítmény számára savval és emésztőenzimekkel, például pepszinnel szemben. Az így bevont készítmény a gyomor-bélcsatomán át az emésztőcsatornának olyan szakaszába jut, ahol terápiás értéke optimális.

A stabil FGF készítmény FGF komponensének stabilizálására alkalmazott SOS mennyisége több tényezőtől, például az oldhatóságtól függ. Szukralfátból a jelen találmány szerint általában az emberek kezelésére alkalmazott mennyiséget adagoljuk, orális adagolás céljára például körülbelül napi 0,6-6 g-ot alkalmazhatunk (előnyösen több részre elosztva) a stabil készítmény FGF komponensével kombinálva.

A találmány szerinti SOS komponens más sók alakjában is alkalmazható; e célra gyógyászati szempontból elfogadható kationokként például a nátrium-, ammónium-, trimetil-ammónium-kationok alkalmazhatók.

Az FGF fehérjekomponens szulfatált diszacharidhoz viszonyított tömegaránya a vizes közegben körülbelül 1:1-től körülbelül 1:10000-ig terjed.

Az SOS koncentrációja a vizes közegben előnyösen körülbelül 0,4 mg/ml-től 400 mg/ml-ig, előnyösebben körülbelül 0,4 mg/ml-től 100 mg/ml-ig, még előnyösebben 4 mg/ml-től 40 mg/ml-ig terjedő tartományban van. Az FGF koncentrációja a vizes közegben előnyösen körülbelül 1 mg/ml és 5000 mg/ml, még előnyösebben körülbelül 10 mg/ml és 500 mg/ml között van.

Az FGF fehérjekomponens az SOS-tal vizes közegben puszta keveréssel érintkezésbe hozható. Vizes közegként előnyösen desztillált vizet, fiziológiás konyhasó-, glükóz- vagy pufferoldatot - így foszfát- vagy tri(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid puffer oldatot használunk. A stabil FGF készítmény ebben az alakjában elkülönítés vagy kinyerés nélkül felhasználható.

A fentebb leírt eljárások útján igen kedvezően stabil FGF készítményt kapunk, amely biztonságosan alkalmazható emlős állatok, például emberek, patkányok, tengerimalacok, kutyák, egerek kezelésére.

HU 208 635 Β

Jóllehet, elméleti szemponthoz nem ragaszkodunk, véleményünk szerint a szukralfát (az SOS alumíniumsója) gyomor- és duodénumfekélyekre kifejtett terápiás hatása abban állhat, hogy az endogén bFGF tartós felszabadulást biztosító vivőanyagaként és stabilizátoraként hat. A jelen találmány értelmében úgy gondoljuk, hogy a szukralfát a bFGF-t a normális nyálkahártyából és a sejten kívüli (extracelluláris) mátrixból kivonja, és biológiailag aktív formában a gyomor-bélcsatoma fekélyes vagy másként sérült területeire szállítja. Előzőleg kimutatták, hogy az extracelluláris mátrixban nagy mennyiségű bFGF raktározódik [lásd: Vlodavsky és munkatársai: P. N. A. S. (USA) 64, 2292 (1987); valamint Folkman és munkatársai: Amer. J. Pathol, 130, 393 (1988). Ez összhangban van azzal a korábbi közléssel, hogy exogén, savval szemben stabilis bFGF megkönnyíti indukált, krónikus duodénumfekélyek gyógyulását [Szabó és munkatársai: Dig. Dis. Sci. 34, 1323 (1989)], valamint a fentebb idézett US 03467 alapszámú nemzetközi PCT szabadalmi bejelentés]. Ennek alapján - a jelen találmány értelmében - úgy gondoljuk, hogy a SOS-tal stabil FGF megnyújtja az FGF biológiai hatását például sebek, égések és fekélyek gyógyításában.

Az SOS felhasználható továbbá a különböző szövettenyészetekben található FGF stabilizálására. Azt találtuk, hogy az SOS sejtekkel szemben in vitro 400 gg/ml koncentrációig nem toxikus. Az SOS tehát szövettenyészetekben komponensként alkalmazható az adott szövettenyészet sejtjeiben lévő endogén FGF stabilizálására.

Az alábbi I. és II. példákban használt rekombináns emberi bázisos FGF-t (rhbFGF) a 237 966 számú európai szabadalmi leírás 1., 3., 6. vagy 8. példája szerint állítottuk elő Escherichia coli K12 MM294/pTB669 (IFP 14532, FERM BP-1281) transzformáns alkalmazásával.

Az I. példában használt rhbFGF CS23 muteint a fentebb idézett Biochem. and Biophys. Research Com. 151, 701 (1988), valamint a 161123 alapszámú egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (amely ekvivalens a 281822 számú közzétett európai szabadalmi bejelentéssel) 1. és 2. összehasonlító példái, valamint 1., 6., 7. és 24. példái szerint Escherichia coli MM 294/pTB762 (IFO 14613, FERM BP-1645) transzformáns alkalmazásával állítottuk elő.

A találmányt az alábbiakban nem korlátozó jellegű kiviteli példákban részletesen ismertetjük.

I. példa

FGF stabilizálása szukralfáttal

A. Stabilizálás hőhatással szemben

FGF-t tartalmazó oldatot állítunk elő úgy, hogy 0,25 gg humán bFGF-t 50 gl, 20 gg BSA-t (borjúszérum albumint) tartalmazó Trisz-pufferoldattal összekeverünk. Ezt az oldatot 60 ’C hőmérsékleten 2 mg SOSkáliumsó jelenlétében - vagy anélkül - 10 percig inkubáljuk. Az inkubálási időszak letelte után a bFGF mintákat 20-szoros térfogatra hígítjuk 1 mg/ml koncentrációban BSA-t tartalmazó Trisz-pufferoldattal, és a növekedési faktor aktivitását [³H]-timidinnek Balb/c egerek 3T3 sejtjei DNS-ébe épülésével mérjük [Klagsbrun és munkatársai közlése szerint: P. N. A. S. (USA) 82, 805 (1985)].

Az 1. ábra mutatja magasabb hőmérsékletek hatását bFGF-ra SOS jelenlétében és hiányában. Az ábrán a 4 °C kontroll hőmérsékleten észlelt aktivitásokat üres oszlopok mutatják. A sötét oszlopok a magas hőmérsékleten tartott minták aktivitását jelzik. Az a) minták csak konyhasót, a b) minták bFGF-et, a c) minták bFGF-et és SOS-K-sót, a d) minták csak SOS-K-sót tartalmaznak. Az ordinátán a DNS-szintézis eredménye szerepel 10~³ CPM-ben kifejezve. Az FGF növekedési faktor hatását a CPM értékkel (percenkénti számlálás) fejezhetjük ki; a CPM a [H³] timidinnek a DNS-be való beépülését jelzi, a vizsgálatokat a fentiek szerint Balb/c egerek 3T3 sejtjein végeztük; minél több DNS képződik, annál hatásosabb az FGF. Az FGF hatása hőkezeléssel és pepszin hozzáadásával lecsökkenthető; a hő és a pepszin destruktív hatása SOS-sel kivédhető.

Az 1. ábrából látható, hogy a SOS-káliumsó az FGF-t magas hőmérséklettel szemben stabilizálja, minthogy csak az SOS tartalmú c) mintánál nem lép fel FGF hatáscsökkenés.

B. Stabilizálás savval szemben

FGF-t tartalmazó savas oldatot készítünk úgy, hogy 0,5 gg FGF-t 60 ml, 20 gg BSA-t tartalmazó 1,5 mólos ecetsavoldattal keverünk. Ezt a 2,2 pH-értékű oldatot 37 ’C-on 2 mg SOS-káliumsó jelenlétében - vagy anélkül - 30 percig inkubáljuk, utána a bFGF mintákat 1 mg/ml koncentáricóban BSA-t tartalmazó Trisz-pufferoldattal hígítjuk és közömbösítjük, majd a növekedési faktor aktivitását a fentiek szerint meghatározzuk. A bFGF minták azonban a sav hatására oldhatatlanná válnak, s így centrifugálással kell derítenünk. Mind a felülúszó, mind a Trisz-pufferoldattal szolubilizált csapadék (amely ez esetben is 1 mg/ml koncentrációban BSA-t tartalmaz) növekedési faktor-aktivitását megmérjük.

A 2. ábra mutatja sav hatását bFGF-ra SOS jelenlétében vagy hiányában. Az üres oszlopok jelzik a 7 pH-jú mintákat. A sötét oszlopok a 2,2 pH-jú oldatok aktivitását szemléltetik, a), b) c) és d) jelentése a fentivel azonos.

Amint a 2. ábrából látható, az SOS-káliumsó stabilizálja az FGF-et savval szemben, például a gyomorbéltraktusban előforduló savas környezettel szemben. A 7-es kontroll-pH értéken kapott aktivitásokat üres oszlopok mutatják. Csak az SOS tartalmú c) minta tartja meg FGF aktivitását savas közegben.

C. Stabilizálás proteolitikus anyagokkal szemben

200 gg/ml koncentrációban rekombináns rhbFGF CS23 mutánst tartalmazó oldatot 2,3 pH-n 37 ’C hőmérsékleten 4 gg/ml koncentrációjú pepszin jelenlétében 20 órán át szukralfáttal inkubálunk. A szukralfátot 1:10 mólarányban adjuk az elegyhez. A megmaradó mitogén hatást szarvasmarha-magzatszív endoteliális sejtjein (ATCC CRL 1935) határozzuk meg.

A 3. ábra mutatja pepszin hatását rekombináns emberi bázikus FGF (rhbFGF) mutein CS23 hatását szukralfát jelenlétében és hiányában.

HU 208 635 Β

Az abszcisszán az inkubálási idő szerepel, az ordinátán a hatás van feltüntetve %-ban. Az a) mintában csak CS23 önmagában van; a b) minta CS23 mellett szukralfátot is tartalmaz 1:10 arányban. Az a) mintánál mért értékeket a U-val jelzett görbe, a b) mintánál mért értékeket a A-val jelzett görbe szemlélteti.

Amint a 3. ábrából látható, a szukralfát megvédi az rhbFGF CS23 muteint a pepszin proteolitikus hatásától.

II. példa

Az FGF és szukralfát közötti affinitás

A. Heparin-affinitásos kromatográfia

A Pharmacia cégtől származó gyors folyadékkromatografáló (FPLC) rendszert alkalmaztuk FGF szukralfáttal szemben mutatott affinitásának a kimutatására az alábbiak szerint.

0,1 mg BSA-t tartalmazó 0,1 ml konyhasóoldatban

2,5 pg bFGF-t TSK-GEL Heparin 5PW oszlopra viszünk (az oszlop hossza 3,5 cm, belső átmérője 8 mm, beszerzési helye Tosohaas, Phil., PA). Az oszlopot előzőleg 0,6 mólos koncentrációban konyhasót tartalmazó 10 mmól Trisz-HCl oldattal (pH 7) kiegyensúlyozzuk. Feltöltés után az oszlopot 10 ml Trisz-pufferoldattal, 0,6 mól konyhasóoldattal öblítjük. A megkötött aktivitást 4 ml olyan Trisz-pufferoldattal eluáljuk, amely vagy 2 mól nátrium-kloridot vagy 70 mmól SOS-káliumsót tartalmaz, 0,5 ml/perc áramlási sebességet alkalmazunk. 1 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk, és az I. példában leírt módon meghatározzuk a növekedési faktor koncentrációját.

A 4. ábra mutatja SOS affinitását bFGF-ral szemben olyan értelemben, hogy az SOS képes a bFGF-t a heparinról leválasztani. (2 mól koncentrációjú konyhasóoldattal összehasonlítva mutatjuk be.) Az abszciszszán a frakciószámot tüntetjük fel, az ordinátán a hatás szerepel CPM 10^_3-ban kifejezve; az a) helyen a bFGF jelenik meg (a bFGF hatása kicsi, mert a heparinhez kötve marad), a b) helyen a NaCl, a c) helyen az SOS-K-só jelentkezik. A d) pontban az FGF és a NaCl, az e) pontban az FGF és SOS együttes hatását mérjük.

Amint a 4. ábra e) pontja illusztrálja, a SOS-káliumsó 78 mmól koncentrációban leválasztja a bFGF-t a heparin-Sepharose oszlopról. Az ábrából az is látható, hogy az SOS alkalmazásával kapott mitogén aktivitás legalábbis hasonló a 2 mól nátrium-kloriddal kapott aktivitáshoz (4. ábra, felső rész). Mivel előző vizsgálatok megmutatták, hogy a bFGF szorosan kötődik az immobilizált heparinhoz [Shing és munkatársai: Science 223, 1296 (1984), valamint Klagsbum és munkatársai fenti idézett közleménye], és nagy koncentrációban jelen lévő (azaz 1,5 mólos koncentrációjú) konyhasóval kimosható, úgy látszik, hogy a bFGF affinitása szukralfáttal szemben azonos vagy nagyobb, mint a hepariné.

B. Szukralfát-Sepharose kromatográfia

Szukralfát-Sepharose oszlopot állítunk elő úgy, hogy 0,1 g szukralfátot 0,8 ml (beágyazott térfogat) és Sepharose CL-68 (Pharmacia) anyagot Trisz-pufferoldatban 0,6 n konyhasóoldattal keverünk. A szukralfátoszlopra 0,1 mg BSA-t tartalmazó 0,2 ml konyhasóoldatban 2 pg bFGF-t viszünk. Az oszlopot 10 ml Triszpufferoldattal, 0,6 mólos konyhasóoldattal öblítjük, majd 15 ml/óra áramlási sebességgel az alábbi módon eluáljuk: (i) gradiens módon 80 ml 0,6-3 mólos koncentrációjú konyhasóoldattal; (ii) 20 ml 3 mólos konyhasóoldattal; és (iii) 30 ml 1,5 mólos ecetsavoldattal (pH 2,2), 2 ml térfogatú frakciókat veszünk. Valamennyi frakcióból kivett alikvot részt hígítjuk, Trisz-pufferral közömbösítjük, és a növekedési faktor aktivitását az I. példában leírt módon meghatározzuk.

Az 5. ábra illusztrálja egy folyékony mintából származó bFGF tisztítását szukralfát-Sepharose oszlop segítségével. Az abszcisszán a ffakciószámot tüntetjük fel, az ordinátán a hatás szerepel 10^-3 CPM-ben kifejezve; az 1) görbén az a) helyen a bFGF jelenik meg, a

d) helyen a HAc. A jobb oldali ordinátán a NaCl tartalmat tüntetjük fel mólban. A NaCl koncentrációt a

2) görbe szemlélteti.

Az 5. ábrából látható, hogy ha a szukralfátot Sepharose-gyöngyökkel keverve oszlopot alakítunk ki, akkor 3 mólig terjedő koncentrációjú konyhasóoldattal gradiens eluálva az oszlopra előzőleg felvitt bFGF nem eluálható. A biológiailag aktív bFGF az oszlopról

1,5 mól koncentrációjú ecetsavoldattal (pH 2,2) kinyerhető, és aktivitása az I. példában leírt módon a növekedési faktor aktivitásával meghatározható. Ez ismét mutatja az FGF erős affinitását szukralfáttal szemben, továbbá a szukralfát alkalmazási lehetőségét folyadékmintából származó FGF tisztítására.

Tabletta előállítása:

FGF mutein CS23 10 pg

SOS 10 mg

Laktóz (hordozóanyagként) 70 mg

Keményítő (szétesést elősegítő anyagként) 30 mg

Metil-cellulóz (kötőanyagként) 3 mg

Magnézium-sztearát (lubrikánsként) 0,2 mg

Fenti komponensek alkalmazásával ismert módon tablettákat készítünk.

Injekciós célra szánt vizes oldat:

FGF mutein CS23 10 pg

SOS 10 mg

Nátrium-klorid 90 mg desztillált víz ad 10 ml

Fenti komponensek alkalmazásával vizes injekciós oldatot állítunk elő, majd a kapott oldatot ampullákba letöltjük.

Kapszula készítés:

FGF mutein CS23 10 pg

SOS 10 mg

Laktóz (mint vivőanyag) 150 mg

Magnézium-sztearát (mint lubrikáns) 1,5 mg

Fenti komponensek alkalmazásával szilárd zselatinkapszulákat állítunk elő.

Kúpkészítés:

FGF mutein CS23 10 pg

SOS 10 mg kakaóvaj ad 1 g

Fenti komponensek alkalmazásával ismert módon kúpokat állítunk elő.

Claims (3)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás fíbroblaszt növekedési faktorral befolyásolható betegségek, így sebek, valamint az emésztőcsatorna fekélybetegségeinek kezelésére alkalmas stabil gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy fíbroblaszt növekedési faktort és szacharóz-oktaszulfátot vagy ennek valamely savaddíciós sóját 1:5100 tömegarányban elegyítünk és az elegyet a gyógyszergyártásban szokásos vivő-, hígítószerekkel és/vagy segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy természetes eredetű vagy rekombináns fibrob5 laszt növekedési faktort alkalmazunk.

. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns humán bázisos fíbroblaszt növekedési faktorként rekombináns humán bázisos FGF CS23 mutánst alkalmazunk.