HU206373B

HU206373B - Process for producing new pentapeptides and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient

Info

Publication number: HU206373B
Application number: HU9057Q
Authority: HU
Inventors: Jan Erik Paulsen; Karl-Ludwig Reichelt
Original assignee: Hafslund Nycomed Bioreg
Priority date: 1988-09-13
Filing date: 1989-09-12
Publication date: 1992-10-28
Also published as: MD503C2; CN1041158A; AU4224089A; JPH04501710A; FI911219A0; NO910933D0; NO884054D0; RU2010799C1; KR900701830A; HUT58766A; AU623687B2; LV10289A; DK43891A; EP0360481A1; MY104912A; FI911219A7; MD503B1; ZA896944B; ES2062024T3; WO1990002754A1

Description

A találmány tárgya eljárás a DNS szintézisre, a regenerálódó máj mitózis-sebességére, valamint a malignáns hepatóma sejtvonalak in vitro és in vivő DNS szintézisére és szaporodására gátló hatással bíró új pentapeptidek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

Ezek a pentapeptidek emlősök, különösen ember olyan májbetegségeinek kezelésére használhatók, amelyek nemkívánt sejtszaporodással járnak, mint például a májrák esetén. A peptid a normális májsejtekre is hat, és ezért alkalmazható olyan helyzetekben is, amikor a májsejíek szaporodásának szabályozása kívánatos.

Korábban is ismertek voltak sejtszaporodást gátló aktivitással bíró pentapeptidek, ilyeneket ismertetnek például a WO 87/00180 közzétételi számú PCT bejelentésben (PCT/NO 86/00041). Az ismertetett pentapeptidek gátolják a sejtszaporodást a pikkelyes epitheliumban, ezért alkalmasak az epidermisben bekövetkező nemkívánt sejtszaporodás kezelésére. Ez az aktivitás azonban szelektív, így az eddig ismert pentapeptidek nem azonosan aktívak a sejtek szaporodásának különböző szervekben való gátlása terén.

Jan Erik Paulsen, Karl-L. Reichelt és Anne K. Petersen közleményükben [Virchows Arch B (1987) 54: 152-154, „Purification and characterization of a growth inhibitory hepatic peptide, A preliminary note” egér májból izolált pentapeptidről írják le, hogy az feltehetőleg gátolja a DNS szintézist, és a regenerálódó egér máj mitózis-sebességét. Azt találták, hogy részleges hepatektómiát követően a DNS szintézis és a mitózis-sebesség az egér májból izolált peptiddel kezelt egerek esetén jelentősen csökkent a kontroll állatokhoz viszonyítva.

Eltekintve attól a ténytől, hogy feltehetőleg a kérdéses pentapeptid N-terminálisa egy piroglutamát, a peptid aminosavszekvenciája tekintetében semmit nem közölnek.

Kiterjedt vizsgálatokat követően néhány új pentapeptidet találtunk, amelyek szerkezetét teljesen azonosítottuk. A találmány tárgyát ezen új (I) általános képletű pentapeptidek előállítása képezi. Az (I) általános képletben

Z jelentése -CH₂- vagy =CO,

Y jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, és Χ’,Χ², X³ jelentése egymástól függetlenül hidroxilcsoport vagy aminocsoport, azzal a megkötéssel, hogy X² és X³ nem lehet egyidejűleg aminocsoport.

A találmány szerint előállított vegyületek bármely, a peptidek előállítására szokásosan alkalmazott eljárással előállíthatók. Előállításának utolsó lépései során a peptid általában védett származék formájában van jelen, az utolsó lépésben vagy az utolsó lépésekben a védőcsoportokat távolítjuk el (az amino-, amido-, hidroxil- és/vagy karboxilcsoportról). Különösen alkalmas eljárás az úgynevezett szilárd fázisú eljárás, amelyet oligopeptidek és analógjaik gyors és jó hozamú előállításának megfelelő módjaként tekintenek. Ennek az eljárásnak a során a növekvő peptidláncot egy szilárd polimer hordozóhoz kötve reagáltatjuk, a szintézis a

C-terminális aminosavnak a polimerhez való kapcsolásával kezdődik. A legszokásosabb aminosavak már kereskedelmi forgalomban kaphatók polimer hordozóhoz kapcsoltan. A következő aminosavat ezután ehhez a polimerhez kötött aminosavhoz kapcsoljuk, a védőcsoport eltávolítás, mosás és kapcsolás ciklusának megismétlésével. így az egész peptid felépíthető polimerhez kötött formában, és mikor a peptid teljes felépítése befejeződött, a végterméket a polimerről megfelelő reagenssel lehasítjuk. Ezzel egyidejűleg vagy ezt követően eltávolítjuk a visszamaradt védőcsoportokat.

Folyékony fázisú peptidszintézis esetén a peptidlánc a C-terminális aminosavval kezdődik. Minden oldalláncot, kivéve az α-aminocsoportot, szokásosan védjük, olyan megfelelő védőcsoportokat alkalmazunk, amelyek a teljes szintézis során uralkodó állapotok mellett stabilak. Az α-aminocsoport vagy szabadon marad, hogy reagáljon, vagy félig védett, amit egy könnyen lehasítható szerves vagy szervetlen só alkalmazásával valósítunk meg.

Ennek a C-terminális aminosavnak (vagy pepiidnek) az oldatába a következő, a növekvő peptidlánchoz hozzákapcsolandó aminosavat keverés mellett adjuk hozzá. A következő aminosav minden reakcióképes oldallánca megfelelő, a teljes szintézis során uralkodó körülmények között stabil védőcsoportokkal védett, kivéve az α-karboxilcsoportot. Az α-karboxilcsoport valamilyen megfelelő módon előre aktivált, vagy alkalmas arra, hogy bármely megfelelő eljárással in situ aktiváljuk, hogy a C-terminális aminosav (vagy peptid) szabad aminocsoportjával kapcsolódjon. Ha a C-terminális aminosav (vagy peptid) egy szerves vagy szervetlen sóval félig védett, 1 ekvivalens megfelelő bázist adunk hozzá, hogy az α-amino funkciót szabaddá tegyük.

In situ aktiválásra bármely aktiválási módszer használható, például DCC, EEDQ, vegyes anhidrid, BOP, azid.

Az előre aktivált reagensek lehetnek például szimmetrikus anhidridek vagy aktivált észterek.

Mind az előzetes aktiválás, mind a karboxilcsoport in situ aktiválásával végzett kapcsolás elősegíthető bizonyos olyan kémiai vegyületek adagolásával, amelyek a reakciót gyorsítják, vagy visszafojtják/megelőzik a racemizálódást. Ilyen adalékok lehetnek például a hidroxi-benzotriazol vagy az N-hidroxi-szukcinimid.

A kapott peptidet a reakcióelegyből bánnely szokásos eljárással elkülöníthetjük, például használhatunk folyadék-folyadék extrakciós vagy kicsapásos eljárást. A nyersterméket általában további tisztítás nélkül alkalmazzuk, a tisztítás/azonosítási vizsgálatokat általában vékonyrétegkromatográfiás eljárással végezzük. A peptid N-terminális a-aminocsoportjáról a védőcsoportot olyan reagenssel távolítjuk el, amely az időleges N-védőcsoportok szelektív és mennyiségi eltávolítására képes, miközben a többi (az oldalláncokon lévő) védőcsoportokat érintetlenül hagyja.

Ez a védőcsoportokkal ellátott, de szabad a-aminocsoportokkal bíró peptid képezi a növekvő peptidlánc C-terminális részét, és az egész eljárást megismételjük

HU 206 373 Β a növekvő peptidlánc N-terminálisához kapcsolandó következő aminosav adagolásával.

Ezt az eljárást ismételjük, amíg a teljes peptid védett származékát ki nem alakítjuk.

Ezután a szabad pepiidet a védett peptidszármazék olyan reagensekkel való kezelésével nyerjük, amelyek minden állandó védőcsoportot lehasítanak. Ilyen reakciók/reagensek: trifluor-ecetsav (TFA) a közepesen savas stabil védőcsoportok esetén, szénhordozós palládium katalizátor jelenlétében végzett hidrogénezés benzil-védőcsoportok esetén, folyékony HF alkalmazása igen savas stabil védőcsoportok esetén.

Azok az aminosav egységek, amelyek a pentapeptidet képezhetik, a C-terminálistól kezdve a felsorolást, a következők:

1. Aszparaginsav	(Asp)	X² = X³ = OH
β-aszparagin	(β-Asn)	X²-NH₂,X³-OH
a-aszparagin	(a-Asn)	x²-oh,x³=nh₂
2. alanin	(Alá)	Y = H
szerin	(Ser)	Y = OH
3. glicin	(Gly)	X’-OH
4. glutaminsav	(Glu)
glutamin	(Gin)	χ’-νη₂
5. piroglutaminsav	(pGlu)	z-co
prolin	(Pro)	z-ch₂

Az aminosavakat általában L-formájukban alkalmazzuk, kivéve az alanint, amely alkalmazható D-formájában is.

Az (I) általános képletű vegyületek körébe tartozóak közül két vegyületet in vitro és in vivő további vizsgálatoknak vetettünk alá. Ezek a vegyületek a következők:

A: pGlu-Gln-Gly-Ser-P-Asn (Z - CO, Y - OH, X¹ - NH2, X² - NH2, X³ - OH) B: pGlu-Glu-Gly-Ser-P-Asn (Z - CO, Y - OH, X¹ - OH, X² - NH₂, X³ - OH) (minden aminosav L-konfigurációjú)

A következő táblázatban azt mutatjuk be, hogyan gátolja az A vegyület a máj tömegének regeneratív növekedését olyan egérben, amelyen 70%-os hepatektómiát hajtottunk végre. Az A vegyületet naponta injektáltuk be sóoldatban intraperitoneálisan, déli 12 órakor. A kontroll állatoknak csak sóoldatot adtunk.

Nap, a 70%-os hepatektómia után	pmól peptid állatonként	Máj nedves tömeg, a kontroll %-ában	P
4.	0	100
4.	1	101 ±7
4.	10	79±6	0,005
4.	100	77 ±5	0,0025

N-8 +SD

A B vegyületet 70%-os hepatektómiának kitett egereknek adtuk, és a mitózis-sebességet mértük 5 órával az adagolást követően. Azt találtuk, hogy a mitózis-sebesség mintegy 40%-a a kontroll állatok mitózis-sebességének, az eredmények az alábbi táblázatban láthatók:

pmól peptid állatonként	Mitózis-sebesség a kontroll %-ában	P
0 (kontroll)	100
1	52 + 9	<0,0025
10	39+11	<0,0005
100	37 ±9	<0,0005

N -6 ±SD

A fentivel azonos B pepiiddel való kezelés után 4 órával azt is észleltük, hogy a mitózis-sebesség mintegy 50%-ra csökkent a kontroll állatok mitózis-sebességéhez képest szén-tetraklorid mérgezésen 48 órával korábban átesett állatoknál. Ezt az alábbi táblázatban mutatjuk be:

pmól peptid állatonként	Mitózis-sebesség a kontroll %-ában	P
0 (kontroll)	100
1	90+13
10	49 ±10	<0,025
100	74 ±12

N-3 ±SD

A B peptid a patkány hepatóma sejtek számát in vitro, a peptid adagolását követő 72 óra múlva mintegy 70%-ára csökkenti a kontroll állatokénak. Az eredmények a táblázatból láthatók:

Peptid koncentráció lóg M	A sejtek teljes száma a kontroll %-ában	P
0 (kontroll)	100
-14	79 ±6	<0,005
-11	71 ±5	<0,0025
-8	80±7	<0,025

N-6 ±SD

A B vegyület in vivő aktivitásának malignáns hepatóma sejtvonalra négy, egyenként 8 állatból álló csoportot alkalmaztunk, amely állatoknak intravénásán előre meghatározott számú malignáns sejtet injektáltunk be, és az állatokat a B vegyület három különböző koncentrációjával kezeltük.

Ebben a vizsgálatban a tüdőre való áttétel terjedését vizsgáltuk, a kezelt csoportnál ennek nagymértékű csökkenését észleltük.

Azt találtuk továbbá, hogy ez a peptid gátolja

MHtCj - egy Morris transzplantálható hepatómából in vitro klónozott törzs - DNS szintézisét és szaporodását.

HU 206 373 Β

A kísérletet a következő módon végeztük:

napos nőstény Buffalo patkányok farki vénájába 10⁴ patkány hepatóma sejtet injektáltunk be. Ezt követően azonnal beinjektáltuk a peptid B-t. A patkányoknak a vizsgálat során hetente háromszor intraperitoneálisan adtuk be a pepiidet (összesen 12 injekciót). A vizsgálat megkezdése után 4 héttel a beinjektált hepatóma sejtekből származó áttéteket tartalmazó tüdőket megmértük (nedves tömeget mértünk).

A B peptid a tüdő (tüdő + áttétek) tömegét mintegy a kontroll tömegének 40%-ára csökkenti. A tumor tömegének csökkenése még nagyobb, ha az össz-tömegböl a normál tüdőtömeget levonjuk. A vizsgálatokat az alábbi táblázatban foglaljuk össze:

pmól peptid B állatonként	A tüdő és az áttétek tömege a kontroll %-ában	P
0 (kontroll)	100
2	55 ±37	<0,01
20	54 ±24	<0,005
200	42±8	< 0,0005

N-8 ±SD

Ha a normális tüdőszövet tömegét vesszük figyelembe, és ezt a mért tömegből levonjuk, a tumor tömegére, a kontroll %-ában kifejezve, az alábbi táblázatban található értékeket nyerjük:

pmól peptid B, állatonként	A tumor tömege a kontroll %-ában
2	45
20	43
200	29

Az előzőekben ismertetett tulajdonságok figyelembevételével az új, (I) általános képletű pentapeptidek különösen alkalmasak májrák kezelésére, és szokásos, parenterális adagolásra alkalmas készítményekké formálhatók. Az alkalmas dózis az adott esetben alkalmazott pepiidtől, a betegtől, az adagolás útjától és a készítmény formájától függ. Az előző példákban alkalmazott dózisok azonban releváns dózisokat jelölnek.

Az (I) általános képletű vegyületek előállítását a további példákban mutatjuk be.

A peptideket Merrifield szilárd fázisú eljárásával állítjuk elő. Egy reakcióedénybe ismert mennyiségű gyanta-hordozót helyezünk, és az alábbi oldószerek 150 ml-ével elegyítjük a megadott sorrendben. Minden mosást 1 percig végzünk, ha más megjelölés nem szerepel. Minden aminosavat α-konfigurációban alkalmazunk. Az alkalmazott Asn β-Asn.

1. Metilén-klorid, háromszor

2. 40%-os trifluor-ecetsav metilén-kloridban

3. 40%-os trifluor-ecetsav metilén-kloridban, 30 perc, egyszer

4. Metilén-klorid, egyszer

5. Etanol, egyszer

6. Metilén-klorid, kétszer

7. 10%-os trietil-amin metilén-kloridban, egyszer

8. 10%-os trietil-amin metilén-kloridban, 10 perc, egyszer

9. Metilén-klorid, háromszor

10. Kapcsolás az aminosavval.

Az egyes aminosavakat egymást követően kapcsoljuk, a karboxil-terminális aminosavval kezdjük a peptid felépítését. Egymással ekvivalens mennyiségű BOC-aminosavat és DCC-t adagolunk, mindkettőt az alkalmazott gyantára vonatkozatott feleslegben. Minden kapcsolási lépés után a gyantát Kaiser-teszttel megvizsgáljuk, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a reakció teljes volt-e. A védőcsoportok eltávolítását 40%-os trifluor-ecetsavval végezzük, ennek a lépésnek az eredményét is Kaiser-teszttel ellenőrizzük. A szintézist akkor tekintjük teljesnek, ha az utolsó aminosavat is sikeresen kapcsoltuk.

A pGlu-Gln-Gly-Ser-Asn szintézisénél alkalmazott kiindulási anyagok a következők:

1. para-metil-benzhidril-amin gyanta

2. Boc-Asn-a-O-benzil

3. Boc-Ser (Bzl)

4. Boc-Gly

5. Boc-Gln (Xan)

6. pGlu

A pGlu-Glu-Gly-Ser-Asn szintézisénél a Boc-Gln (Xan) helyett Boc-Glu (OcHex)-t alkalmazunk.

A pGlu-Gln-Gly-Ser-Asp szintézisénél alkalmazott kiindulási anyagok:

1. Boc-Asp (OBzl)-gyanía

2. Boc-Ser (Bzl)

3. Boc-Gly

4. Boc-Gln (Xan)

5. pGlu

A pGlu-Glu-Gly-Ser-Asp szintézisénél Boc-Gln (Xan) helyett Boc-Glu (OcHex)-t alkalmazunk.

Hidrogén-fluoridos bontás

A gyantához kötött peptidet Kel-F-tartályba helyezzük és 0 °C hőmérsékletre hfltjük. Megkötő anyagként anizolt adagolunk az elegybe, majd folyékony hidrogén-fluoridot vezetünk a rendszerbe, és a gyantát 45 percen át keverjük. Ezután a hidrogén-fluoridot a forgalmazó előírás szerint vákuumban bepároljuk. A gyantát étered extraháljuk a megkötő anyag és a lipofil melléktermékek eltávolítására. A nyersterméket ecetsavval és vízzel extraháljuk.

A fenti peptidet a következő módon tisztítjuk:

1. Nyitott üvegoszlopot C-18 gyantával töltünk meg és acetonitrillel mossuk.

2. Az oszlopot A pufferrel, amely 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmaz, előkezeljük, a pufferből 5001000 ml-t alkalmazunk.

3. A peptidet feloldjuk, és az oszlop tetejére visszük.

4. Lineáris gradiens eluálást végzünk, 40 perc alatt

HU 206 373 Β

0%-ról 100%-ra növekvő B-puffer koncentrációval, a B puffer 60% acetonitrilt tartalmazó A puffer.

5. A pepiidet vékonyrétegkromatográfiás eljárással meghatározzuk, nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon tisztítjuk, a legtisztább frakciókat gyűjtjük és liofilizáljuk.

Az alábbiakban az alkalmazott rövidítések jelentését ismertetjük:

DCC - diciklohexil-karbodiimid

Bzl - benzil

Xan - xantil

TFA - trifluor-ecetsav

OcHex = ciklohexil-oxi

Boc = terc-butoxi-karbonil

EEDQ - N-etil-oxi-karbonil-2-etil-oxi-l-dihidrokino-

lin
BOP	- benzotriazol-l-il-oxi-trisz(dimetil-amino)foszfónium-hexafluor-foszfát
DMF	- dimetil-formamid
Cbz	- karbobenzoxi-
Su	- szukcinimido-
NEM	- N-etil-morfolin

Az alábbi elemzéseket végeztük:

1. A pGlu-Gln-Gly-Ser-Asn elemzése; M - 515,44 Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat Szilícium-dioxid F_m (nBuOH: Pyr: HO Ac: H₂O

15:15:3:12), o-tolidin

Eredmény: egy fő folt, egy körülhatárolt alacsonyabban elhelyezkedő folt, és egy elhanyagolható magasabban elhelyezkedő folt.

R_f-0,28.

Szilícium-dioxid (nBuOH: EtOAc: HOAc: H₂O

1:1:1:1), o-tolidin

Eredmények· egy fő folt, elhanyagolható felső és elhanyagolható alsó folttal. R_f- 0,22.

Elektrofoiézis:

Whatman 3MM, pH 3,5 (Pyr: Aceton); 1500V, 1 h, o-tolidin

Eredmények: az anód felé vándorló fő folt, amely mellett egy elhanyagolható alacsonyabb folt van jelen.

R_f - 0,25 pikrinsav referenciaanyag mellett.

Aminosav analízis: a peptid %-a: 91,1%.

Számított Talált Asp 1 1,09

Ser 1 0,92

Glu 2 2,01

Gly 1 0,98

2. pGlu-Glu-Gly-Ser-Asn analízise: M - 516,42 Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat:

Szilikagél F_m (nBuOH: Pyr: HOAc: H₂O,

15:15:3:12), o-tolidin

Eredmények: egy fő folt elhanyagolható alacsonyabb folt kíséretében.

Rf-0,44

Szilikagél (nBuOH: EtOAc: HOAc: H₂O 1:1:1:1, o-tolidin

Eredmények: egy nagyobb folt egy elhanyagolható alacsonyabb folttal.

R_f-0,39.

Elektroforézis:

Whatman 3MM, pH 1,9 (HCOOH: aceton); 1000V, 1 h, o-tolidin

Eredmények: egyetlen, az anód felé vándorló folt.

R_f = 0,40 pikrinsav referencia anyag mellett.

Aminosav analízis:

a peptid %-a: 90,1%.

	Számított	Talált
Asp	1	0,94
Ser	1	0,95
Glu	2	2,08
Gly	1	0,98
3. A pGlu-Gln-Gly-Ser-Asp analízise, M = 516,19.

Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat:

Szilícium-dioxid F_m (nBuOH:Pyr:HOAc:H₂O, 15:15:3:12), o-tolidin,

Eredmények: egy nagyobb folt egy halvány felső folttal és egy elhanyagolható alsó folttal. R_f - 0,27.

Szilikagél (nBuOH: EtOAc: HOAc: H₂O),

1:1:1:1, o-tolidin.

Eredmények: egy nagyobb folt egy elhanyagolható felső és egy elhanyagolható alsó folttal. R_f = 0,32.

Aminosav analízis:

a peptid %-a: 87,4%.

25	Számított	Talált
Asp	1	0,98
Ser	1	0,91
Glu	2	2,06
Gly	1	0,97

4. A pGlu-Glu-Gly-Ser-Asp elemzése, M-517,18. Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat: Szilícium-dioxid F_m (nBuOH: Pyr: HOAc: H₂O,

15:15:3:12), o-tolidin

Eredmények: egy nagyobb folt egy elhanyagolható felső és egy elhanyagolható alsó folttal. R_f - 0,22.

Szilícium-dioxid (nBuOH: EtOAc: HOAc: H₂O)

1:1:1:1, o-tolidin

Eredmények: egy nagyobb folt egy elhanyagolható alsó folttal. R_f = 0,34

Aminosav analízis: a pepid %-a: 90,7%.

	Számított	Talált
Asp	1	1,00
Ser	1	0,89
Glu	2	2,04
Gly	1	0,96

pGlu-Glu-Gly-Ser-Asp

A cím szerinti pentapeptidet oldatban készítjük aktív észter eljárással a védett köztitermékek minimális tisz50 tításával.

A reagensek:

Asp (OBzl)₂Boc-Ser (Bzl)-OSu Boc-Gly-OSu

Boc-Glu(T-OBzl)-OSu Cbz-pGlu-OSu

Ezek mindegyike kereskedelmi forgalomban kapható vegyület.

Boc-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)2· (A)

Minimális mennyiségű DMF-ben oldott 1 ekviva5

HU 206 373 Β lens Asp (OBzl)₂-hoz keverés közben hozzácsepegtetjük 1,2 ekvivalens Boc-Ser(Bzl)-OSu minimális mennyiségű DMF-ben készült oldatát. A reakció lefolyását vékonyrétegkromatográfiás eljárás és ninhidrin reagens alkalmazásával követjük nyomon. A negatív ninhidrin teszt azt jelzi, hogy az aminvegyület teljesen elfogyott.

Az elegy'ről az oldószert vákuumban lepároljuk, a visszamaradó anyagot diklór-metánban oldjuk, és az alábbi oldatokkal extraháljuk:

0,05NH₂S0₄	(2x)
lmNaHCOs	(2x)
NaCl oldat	(lx)
H₂O	(lx)
Az oldatot magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük,

majd vákuumban bepároljuk, a visszamaradó anyagot minimális mennyiségű diklór-metánban oldjuk, majd éter/petroléterrel eldörzsöljük, és éjszakán át 4 °C hőmérsékleten tároljuk. A kivált csapadékot összegyűjtjük, hideg éter/petroléterrel mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A nyersterméket 95%-os hozammal nyerjük,

Ser(Bzl)-Asp(OBzl)₂-*TFA (B)

Az A nyersterméket jéghideg diklór-metánban oldjuk, és azonos térfogatú trifluor-ecetsavat adunk hozzá. A reakció lefolyását vékonyrétegkromatográfiás eljárással követjük. 30 perc elteltével az oldószert vákuumban lepároljuk, a visszamaradó anyagot diklórmetánban ismét szuszpendáljuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. A kapott nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel a következő lépésben,

Boc-Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)₂ (C) ekvivalens mennyiségű B vegyület és 1 ekvivalens mennyiségű NEM minimális mennyiségű DMF-ben készült oldatához keverés közben hozzácsepegtetjük

1,2 ekvivalens Boc-Gly-OSu minimális mennyiségű DMF-ben készült oldatát. A reakció lefolyását vékonyrétegkromatográfiás eljárás és ninhidrin reagens alkalmazásával követjük. 2 óra elteltével további 0,2 ekvivalens Boc-Gly-OSu-t adunk a reakcióelegybe, és a keverést éjszakán át folytatjuk.

Ez idő elteltével a reakcióelegy vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatban ninhidrin-negatívnak bizonyul, a kapott nyersterméket az A vegyületnél leírt eljárással dolgozzuk fel. Az éter/petroléterrel történt eldörzsölés után kapott nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel. A nyerstermék hozama 85%.

Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)₂ *TFA (D)

A kapott C nyersterméket 30 percig kezeljük diklórmetán és trifluor-ecetsav 1:1 arányú jéghideg elegyével. Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal a C vegyület teljes elfogyásáról bizonyosodunk meg. Az elegyből az oldószert vákuumban lepároljuk, a visszamaradó anyagot metanolban ismét oldjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. A kapott nyers D vegyületet további tisztítás nélkül használjuk fel.

Boc-Glu(y-OBzl)-Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)₂ (E) ekvivalens mennyiségű D vegyület és 1 ekvivalens mennyiségű NEM minimális mennyiségű DMF-ben készült oldatához keverés közben hozzáadjuk 1,3 ekvivalens Boc-Glu(y-OOBzl)-OSu minimális mennyiségű

DMF-ben készült oldatát. A reakció lefolyását vékonyrétegkromatográfiás eljárás és ninhidrin reagens alkalmazásával követjük nyomon.

Az elegyről az oldószert vákuumban lepároljuk, a nyersterméket az (A) vegyületnél leírt eljárással dolgozzuk fel. A nyerstermék hozama 90%. A kapott nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel.

Glu(y-OBzl)-Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)₂ *TFA (F)

A kapott (E) nyersterméket 30 percig diklór-metán és trifluor-ecetsav 1: 1 arányú jéghideg elegyével kezeljük. Vékonyrétegkromatográfiás eljárással meggyőződünk az (E) vegyület teljes felhasználásáról.

Az elegyről az oldószert vákuumban lepároljuk, a visszamaradó anyagot metanolban oldjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. A kapott (F) nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel.

Cbz-pGlu-Glu(y-OBzl)-Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)₂(G) ekvivalens mennyiségű (F) vegyület és 1 ekvivalens mennyiségű NEM minimális mennyiségű DMF-ben készített oldatához hozzácsepegtetjük 13 ekvivalens Cbz-pGlu-OSu minimális mennyiségű DMF-ben készült oldatát. A reakció lefolyását vékonyrétegkromatográfiás eljárás és ninhidrin reagens alkalmazásával követjük nyomon, a keverést egy éjszakán át folytatjuk.

Az elegyről az oldószert ezután vákuumban lepároljuk, a nyersterméket az (A) vegyületnél leírt módon dolgozzuk fel. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk kloroform/metanol oldószerrendszer alkalmazásával. Az (A) vegyülettől számított teljes hozam 33%.

pGlu-Glu-Gly-Ser-Asp (H)

A tisztított (G) vegyületet metanolban oldjuk és 10% fémtartalmú fémhordozós palládium katalizátort és 5 ekvivalens mennyiségű ammónium-formiátot adunk hozzá. A reakció lefolyását vékonyrétegkromatográfiás eljárással követjük nyomon, mintegy 45 perc elteltével a kiindulási anyag teljesen felhasználódik, a vékonyréteg-kromatogram UV₂₅₄ negatív. A katalizátort az elegyből szűréssel eltávolítjuk, az oldószert vákuumban ledesztilláljuk. Az ammónium-formiátot liofilizálással eltávolítjuk, a kapott nyersterméket tisztítjuk és (4) vegyületként azonosítjuk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) általános képletű pentapeptidek előállítására - a képletben

Z jelentése -CH₂- vagy =CO,

Y jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, és X¹,X²ésX³ jelentése egymástól függetlenül hidroxilcsoport vagy aminocsoport, azzal a megkötéssel, hogy X² és X³ nem lehet egyidejűleg aminocsoport azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű vegyület védett származékáról a védőcsoportokat eltávolítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pentapeptidet, adott esetben védett formában, szilárd fázisú peptid szintézis eljárással állítjuk elő, amely eljárás során a C-terminális aminosavat kapcsol1

HU 206 373 Β juk elsőként egy szilárd hordozóhoz, majd ezt követően a kívánt aminosavakat megfelelő sorrendben kapcsoljuk össze, végül a védőcsoportokat eltávolítjuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű pentapeptid előállítására, amelyben

Z jelentése -CO,

Y jelentése hidroxilcsoport,

X¹ jelentése hidroxilcsoport,

X² jelentése aminocsoport és

X³ jelentése hidroxilcsoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási anyagot alkalmazzuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű pentapeptid előállítására, amelyben

Z jelentése -CO,

Y jelentése hidroxilcsoport,

X¹ jelentése hidroxilcsoport,

X² jelentése hidroxilcsoport és

X³ jelentése hidroxilcsoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási anyagot alkalmazzuk.
5. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű pentapeptideket - ahol

Z jelentése -CH₂- vagy =CO,

Y jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, és X*,X²ésX³ jelentése egymástól függetlenül hidroxilcsoport vagy aminocsoport, azzal a megkötéssel, hogy X² és X³ nem lehet egyidejűleg aminocsoport gyógyászati célra alkalmas hordozó és/vagy egyéb segédanyaggal készítménnyé formálunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

Z jelentése =CO,

Y jelentése hidroxilcsoport,

X¹ jelentése hidroxilcsoport,

X² jelentése aminocsoport és

X³ jelentése hidroxilcsoport.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan 0) általános képletű hatóanyagot alkalmazunk, amelyben

Z jelentése =CO,

Y jelentése hidroxilcsoport,

X* jelentése hidroxilcsoport,

X² jelentése hidroxilcsoport és

X³ jelentése hidroxilcsoport.