HK1228925B

HK1228925B - Crispr enzyme mutations reducing off-target effects

Info

Publication number: HK1228925B
Application number: HK17102493.9A
Authority: HK
Inventors: Feng Zhang; Linyi GAO; Bernd ZETSCHE; Ian SLAYMAKER
Original assignee: Massachusetts Institute Of Technology; The Broad Institute Inc.
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2016-06-17
Publication date: 2022-02-11

Claims

Protéine CRISPR modifiée présentant une spécificité accrue pour des loci polynucléotidiques cibles par comparaison à des loci polynucléotidiques hors cibles, ladite protéine comprenant deux modifications ou plus dans un sillon entre les domaines HNH et RuvC en référence à la Cas9, dans laquelle les modifications comprennent la substitution d'au moins deux résidus positivement chargés avec des résidus d'acide aminé neutres ou négativement chargés.
Complexe CRISPR-Cas, comprenant la protéine modifiée selon la revendication 1.
Procédé in vitro ou ex vivo pour réduire l'activité hors cible d'un complexe CRISPR-Cas, ledit procédé comprenant l'utilisation de la protéine modifiée selon la revendication 1, dans lequel le procédé ne comprend pas de processus pour modifier l'identité génétique de lignée germinale d'un être humain et n'est pas mis en œuvre sur un embryon humain.
Procédé pour préparer une protéine selon la revendication 1, comprenant la création de deux modifications ou plus dans un sillon entre les domaines HNH et RuvC.
Protéine, complexe ou procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la protéine modifiée est la Cas9.
Protéine, complexe ou procédé selon une quelconque revendication précédente, où les résidus d'acide aminé neutres ou négativement chargés comprennent l'alanine.
Complexe ou procédé selon les revendications 2 à 6, dans lequel le complexe CRISPR-Cas comprend un guide comprenant une séquence d'appariement de tracr et tracr.
Complexe ou procédé selon la revendication 7, dans lequel la séquence d'appariement de tracr et tracr sont connectés.
Complexe ou procédé selon la revendication 8, dans lequel la séquence d'appariement de tracr et tracr sont connectés en tant que chimère.
Protéine, complexe ou procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, où au moins deux modifications comprennent une substitution d'acide aminé à la position 780, 810, 848, 855, 976, 982, 1003, ou 1060 en référence à la numérotation des positions d'acide aminé de la Cas9 de S. pyogenes (Sp).
Protéine, complexe ou procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, où les au moins deux modifications comprennent des substitutions d'acide aminé, en référence à la numérotation de la SpCas9 : R780A et K810A, ou R780A et K855A, ou R780A et R976A, ou K848A et R976A, ou K855A et R976A, ou R780A et K848A, ou K810A et K848A, ou K848A et K855A, ou K810A et K855A, ou H982A et R1060A, ou H982A et R1003A, ou K1003A et R1060A, ou R780A et H982A, ou K810A et H982A, ou K848A et H982A, ou K855A et H982A, ou R780A et K1003A, ou K810A et R1003A, ou K848A et K1003A, ou R780A et R1060A, ou K810A et R1060A, ou K848A et R1060A, ou K848A et E1108A, ou K810A et K1003A, ou R780A et R1060A, ou K810A et R1060A, ou K848A et R1060A.
Protéine, complexe ou procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, où les au moins deux modifications comprennent des substitutions d'acide aminé, en référence à la numérotation de la SpCas9 : H982A, K1003A, et K1129E; ou R780A, K1003A, et R1060A ; ou K810A, K1003A, et R1060A ; ou K848A, K1003A, et R1060A ; ou K855A, K1003A, et R1060A ; ou H982A, K1003A, et R1060A.
Protéine, complexe ou procédé selon la revendication 10, où les au moins deux modifications comprennent, en référence à la numérotation d'acide aminé de la SpCas9 : K848A, K1003A, et R1060A.
Protéine, complexe ou procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la protéine comprend une protéine Cas9 issue d'un organisme appartenant à un genre comprenant Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium ou Corynebacter.
Protéine, complexe ou procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la protéine comprend un ou plusieurs signaux de localisation nucléaire (SLN).
Protéine, complexe ou procédé selon la revendication 15, où la protéine comprend au moins deux SLN ou plus.
Procédé in vitro ou ex vivo de modulation d'une expression génique ou de modification d'une séquence cible dans une cellule ou lignée cellulaire, comprenant l'introduction du complexe selon la revendication 2 ou une quelconque revendication dépendante de celle-ci dans la cellule ou lignée cellulaire, où le procédé ne comprend pas de processus pour modifier l'identité génétique de lignée germinale d'un être humain et n'est pas mis en œuvre sur un embryon humain.
Procédé in vitro ou ex vivo de modification d'une séquence cible dans une cellule eucaryote, comprenant la délivrance à la cellule du complexe selon la revendication 2 ou une quelconque revendication dépendante de celle-ci, dans lequel le procédé ne comprend pas de processus pour modifier l'identité génétique de lignée germinale d'un être humain et n'est pas mis en œuvre sur un embryon humain.
Procédé de production d'une plante possédant une caractéristique d'intérêt modifiée codée par un gène d'intérêt, comprenant la délivrance à une cellule végétale du complexe selon la revendication 2 ou une quelconque revendication dépendante de celle-ci, ou le fait de soumettre la cellule végétale au procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 18, moyennant quoi le gène d'intérêt est modifié ou introduit dans la cellule et une cellule végétale modifiée est obtenue, et la régénération de la plante à partir de la cellule végétale modifiée.
Procédé de modification d'un organisme non humain par la manipulation d'une ou de plusieurs séquences cibles, comprenant la délivrance à l'organisme du complexe selon la revendication 2 ou une quelconque revendication dépendante de celle-ci, en obtenant ainsi l'organisme non humain modifié, dans lequel l'organisme est une plante ou une algue.
Complexe selon le système de la revendication 2 ou une quelconque revendication dépendante de celle-ci, destiné à être utilisé dans une thérapie.
Complexe selon la revendication 2 ou une quelconque revendication dépendante de celle-ci destiné à être utilisé dans une thérapie, où ladite thérapie comprend une édition génétique ou génomique, ou une thérapie génique.
Complexe destiné à être utilisé dans une thérapie selon la revendication 21 ou 22, dans lequel ladite thérapie comprend le traitement d'un ou de plusieurs des éléments suivants : une maladie ou un trouble du sang ou de la coagulation ; une maladie ou un trouble du dérèglement cellulaire ou oncologique ; une inflammation ou une maladie ou un trouble immun(e) ; une maladie ou un trouble métabolique, hépatique, rénal(e) ou protéique ; une maladie ou un trouble musculaire/squelettique ; une maladie ou un trouble neurologique ou neuronal(e) ; ou une maladie ou un trouble oculaire.
Cellule eucaryote isolée comprenant la protéine selon la revendication 1 et une molécule d'acide nucléique comprenant un ARN, dans laquelle la cellule n'est pas une cellule germinale humaine ou un embryon humain.
Utilisation in vitro ou ex vivo du complexe selon l'une quelconque de la revendication 2 ou une quelconque revendication dépendante de celle-ci, pour une édition génétique ou génomique, dans laquelle l'utilisation ne comprend pas de processus pour modifier l'identité génétique de lignée germinale d'un être humain et n'est pas mise en œuvre sur un embryon humain.
Protéine, complexe, procédé ou utilisation selon une quelconque revendication précédente, où la protéine comprend trois modifications ou plus.