HK1228925B - Crispr enzyme mutations reducing off-target effects - Google Patents

Claims (26)

1. Technisiertes CRISPR-Protein mit erhöhter Spezifität für Target-Polynukleotid-Loci im Vergleich zu Off-Target-Polynukleotid-Loci, das Protein umfassend zwei oder mehr Modifikationen in einer Furche zwischen HNH-und RuvC-Domänen in Bezug auf Cas9, wobei die Modifikationen Substituieren von wenigstens zwei positiv geladenen Resten durch neutrale oder negativ geladene Aminosäurereste umfassen.
2. CRISPR-Cas-Komplex, umfassend das technisierte Protein nach Anspruch 1.
3. In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zum Reduzieren von Off-Target-Aktivität eines CRISPR-Cas-Komplexes, das Verfahren umfassend Verwenden des technisierten Proteins nach Anspruch 1, wobei das Verfahren kein Prozess zum Modifizieren der Keimbahn genetischen Identität eines Menschen umfasst und nicht an einem menschlichen Embryo durchgeführt wird.
4. Verfahren zum Herstellen eines Proteins nach Anspruch 1, umfassend Schaffen von zwei oder mehr Modifikationen in einer Furche zwischen HNH-und RuvC-Domänen.
5. Protein, Komplex oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das technisierte Protein Cas9 ist.
6. Protein, Komplex oder Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die neutralen oder negativ geladenen Aminosäurereste Alanin umfassen.
7. Komplex oder Verfahren nach Ansprüchen 2 - 6, wobei der CRISPR-Cas-Komplex eine Führung einschließt, umfassend tracr-Partner und tracr.
8. Komplex oder Verfahren nach Anspruch 7, wobei der tracr-Partner und der tracr verbunden sind.
9. Komplex oder Verfahren nach Anspruch 8, wobei der tracr-Partner und der tracr als ein Chimär verbunden sind.
10. Protein, Komplex oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens zwei Modifikationen eine Aminosäuresubstitution an Position 780, 810, 848, 855, 976, 982, 1003, oder 1060 in Bezug auf die Aminosäurepositionsnummerierung von S. pyogenes (Sp) Cas9 umfassen.
11. Protein, Komplex oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 9, wobei die wenigstens zwei Modifikationen Aminosäuresubstitutionen umfassen, in Bezug auf die Nummerierung von SpCas9: oder R780A und K810A, oder R780A und K855A, oder R780A und R976A, oder K848A und R976A, oder K855A und R976A, oder R780A und K848A, oder K810A und K848A, oder K848A und K855A, oder K810A und K855A, oder H982A und R1060A, oder H982A und R1003A, oder K1003A und R1060A, oder R780A und H982A, oder K810A und H982A, oder K848A und H982A, oder K855A und H982A, oder R780A und K1003A, oder K810A und R1003A, oder K848A und K1003A, oder R780A und R1060A, oder K810A und R1060A, oder K848A und R1060A, oder K848A und E1108A, oder K810A und K1003A, oder R780A und R1060A, oder K810A und R1060A, oder K848A und R1060A.
12. Protein, Komplex oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 9, wobei die wenigstens zwei Modifikationen Aminosäuresubstitutionen umfassen, in Bezug auf die Nummerierung von SpCas9: H982A, K1003A, und K1129E; oder R780A, K1003A, und R1060A; oder K810A, K1003A, und R1060A; oder K848A, K1003A, und R1060A; oder K855A, K1003A, und R1060A; oder H982A, K1003A und R1060A.
13. Protein, Komplex oder Verfahren nach Anspruch 10, wobei die wenigstens zwei Modifikationen in Bezug auf die Aminosäurenummerierung von SpCas9 umfassen: K848A, K1003A, und R1060A.
14. Protein, Komplex oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein ein Cas9-Protein aus einem Organismus aus einer Gattung umfasst, umfassend Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium oder Corynebacter.
15. Protein, Komplex oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein ein oder mehrere Kernlokalisierungssignale (KLS) umfasst.
16. Protein, ein Komplex oder ein Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Protein wenigstens zwei oder mehr KLSs umfasst.
17. In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zum Modulieren von Genexpression oder zum Modifizieren einer Target-Sequenz in einer Zelle oder Zelllinie, umfassend Einbringen des Komplexes nach Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruch in die Zelle oder Zelllinie, wobei das Verfahren keinen Prozess zum Modifizieren der Keimbahn genetischen Identität eines Menschen umfasst und nicht an einem menschlichen Embryo durchgeführt wird.
18. In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zum Modifizieren einer Target-Sequenz in einer eukaryotischen Zelle, umfassend Zustellung des Komplexes nach Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruchs an die Zelle, wobei das Verfahren keinen Prozess zum Modifizieren der Keimbahn genetischen Identität eines Menschen umfasst und nicht an einem menschlichen Embryo durchgeführt wird.
19. Verfahren zum Herstellen einer Pflanze mit einem modifizierten Merkmal von Interesse, kodiert von einem Gen von Interesse, umfassend Zustellung des Komplexes nach Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruchs zu einer Pflanzenzelle, oder Unterziehen der Pflanzenzelle dem Verfahren nach einem der Ansprüche 17 - 18, wodurch das Gen von Interesse entweder modifiziert oder in die Zelle eingeführt wird und eine modifizierte Pflanzenzelle erhalten wird, und Regenerieren der Pflanze aus der modifizierten Pflanzenzelle.
20. Verfahren zum Modifizieren eines nicht-menschlichen Organismus durch Manipulation einer oder mehrerer Target-Sequenzen, umfassend Zustellen des Komplexes nach Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruchs an den Organismus, dadurch Erhalten des modifizierten nicht-menschlichen Organismus, wobei der Organismus eine Pflanze oder Alge ist.
21. Komplex nach dem System von Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruch, zur Verwendung in Therapie.
22. Komplex nach Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruch zur Verwendung in Therapie, wobei die Therapie Gen- oder Genom-Editing, oder Gentherapie umfasst.
23. Komplex zur Verwendung in Therapie nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Therapie Behandlung von einem oder mehreren der Folgenden umfasst: eine Blut- oder Gerinnungskrankheit oder -störung; eine Zelldysregulations- oder Onkologiekrankheit oder -störung; eine Entzündung oder immunbezogene Krankheit oder Störung; eine Stoffwechsel-, Leber-, Nieren- oder Proteinkrankheit oder -störung; eine Muskel-/Skelettkrankheit oder -störung; eine neurologische oder neuronale Krankheit oder Störung; oder eine Augenkrankheit oder -störung.
24. Isolierte eukaryotische Zelle, umfassend das Protein nach Anspruch 1 und ein Nukleinsäuremolekül, umfassend RNA, wobei die Zelle keine menschliche Keimzelle oder ein menschlicher Embryo ist.
25. In-vitro- oder Ex-vivo-Verwendung des Komplexes nach einem der Ansprüche 2 oder einem davon abhängigen Anspruch zum Gen- oder Genom-Editing, wobei die Verwendung keinen Prozess zum Modifizieren der Keimbahn genetischen Identität eines Menschen umfasst und nicht an einem menschlichen Embryo durchgeführt wird.
26. Protein, Komplex, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein drei oder mehr Modifikationen umfasst.