HK1248149B - 去细胞软骨移植物的制备方法与用途 - Google Patents

Description

去细胞软骨移植物的制备方法与用途

本发明主张美国临时申请案第62/203,904号(申请日：2015年08月1日)的优先权，该申请案的完整内容纳入为本发明专利说明书以供参照。

技术领域

本发明属于去细胞软骨移植物的领域，特别涉及改善制备去细胞软骨移植物的方法，所述去细胞软骨移植物是适合作为细胞生长的生物性支架，因此，本发明去细胞软骨移植物可作为治疗骨软骨疾病的异种移植物。

背景技术

软骨组织损伤经常发生于活动量大的人身上和老年族群，通常是由急性或反复性的损伤或老化所导致的。现今治疗方案包含休息、利用微关节显微手术清除软骨损伤区域，以及利用其他手术治疗(例如，微裂术(microfracture)、钻孔术(drilling)和磨损法(abrasion))。这些治疗方案只能暂时性缓解症状，特别是当患者在经处置后，仍保持与损伤前相同的活动量时。举例而言，慢性膝关节软骨损伤可能使关节软骨的损坏更为严重，最终需置换整个膝关节。此外，骨软骨疾病或损伤仍面临其他困境，目前尚无有效的医疗程序和方法能够治疗。再者，除了上述老化、损伤和/或疾病所导致的软骨受损外，因整形或美容手术过程需修复或增加软骨组织，如，隆鼻手术、脸部左右不对称的矫正手术、眼睑周围的矫正手术和脸部整形手术等，使得整形或美容手术所需的软骨移植物需求量也在持续攀升中。

市面上的工程软骨是以接种水凝胶或天然或合成的聚合物所形成，以该些方式制成的工程软骨无法拥有与天然软骨相同的机械特性，此因天然软骨最主要的成分是胶原蛋白，其具有较高的机械强度。为了克服工程软骨机械强度不足的缺陷，在制备过程中往往透过添加交联剂(如，戊二醛)来改善水凝胶或聚合物支架的机械强度。然而，大部分的交联剂对人类具有毒性，故使用上有限制。

提供一种改良的软骨移植物，可用于矫正手术或治疗上述的损伤是有必要的。改良的软骨移植物不仅应拥有天然软骨的机械强度和构型，能有效的将软骨恢复至损伤前的状态，且不会引起其他并发症(如，免疫原性的问题)；另外，软骨移植物也要容易制造，且制备成本低廉。

发明内容

发明人制作的本发明内容以制造改善软骨移植物来克服前述提及的公知问题，特别是具有较佳的机械强度及具有天然软骨的天然构型的软骨移植物。

本发明内容的一方面是一种提供制备去细胞软骨移植物的方法，所述去细胞软骨移植物适用于整形手术(如，整鼻手术、脸部矫正手术等)，或治疗骨软骨疾病。所述方法包含以下步骤：

(1)切割一动物的软骨以产生一软骨基质；

(2)以一种碱来处理步骤(1)的软骨基质；

(3)将步骤(2)中经碱处理的软骨基质进行灭菌处理；以及

(4)去除步骤(3)中经灭菌的软骨基质的细胞，以制得该去细胞软骨移植物。

再者，依据本发明内容的实施方式，在步骤(1)中，所述软骨是取自于一哺乳动物，且所述软骨是鼻软骨、肋软骨、耳软骨或膝关节软骨。

依据本发明内容的实施方式，在步骤(2)中，该碱处理步骤包含在室温下以氢氧化钠溶液处理该软骨基质3至24小时。

依据本发明内容的实施方式，在步骤(3)中，以一灭菌剂处理该经碱处理的软骨基质，其中该灭菌剂选自于以下所组成的群组中：醇类、氧化剂、放射线、酚化合物和四级铵化合物。

在某些实施方式中，于步骤(3)，是以一醇类来处理该经碱处理的软骨基质，所述醇类是乙醇或异丙醇。

在又一实施方式中，于步骤(3)，是以一氧化剂来处理该经碱处理软骨基质，所述氧化剂是过氧化氢。

在又一实施方式中，于步骤(3)，是以一放射线来处理该经碱处理软骨基质，所述放射线是伽马射线。

在其他实施方式中，于步骤(3)，是以一酚化合物来处理该经碱处理软骨基质，所述酚化合物是对羟苯甲酸酯、苯甲酸或水杨酸。

在又一实施方式中，于步骤(3)，是以一四级铵化合物来处理该经碱处理软骨基质，所述四级铵化合物是氯化苄烷铵、烷基二甲基苄基氯化铵(alkyldimethylbenzylammonium chloride)、二癸基二甲基氯化铵或氯化铵。

依据本发明内容的实施方式，于步骤(4)，所述去细胞步骤包含，以一超临界流体(SCF)于压力约150-350巴和温度30-50℃下，处理该步骤(3)中经灭菌的软骨基质20分钟至5天。

所述SCF是超临界二氧化碳(scCO₂)、超临界一氧化二氮(scN₂O)、超临界水(scH₂O)、超临界烷类、超临界烯类、超临界醇类或超临界丙酮。在一实施例中，所述SCF是scCO₂。在其他实施例中，SCF是scN₂O。

依据一较佳的实施方式，所述去细胞步骤是于温度37℃、压力350巴下，处理100分钟。

制备完成的软骨移植物主要是由胶原蛋白所构成，保留了其天然结构和构型，故施用于(如，移植)个体后可作为能供细胞生长的三维支架。再者，所述软骨移植物为去细胞的软骨移植物，意即该移植物上并无任何残留的细胞物质，因此，实质上所述软骨移植物乃是无免疫原性，不会诱导宿主产生任何的免疫反应。此外，本发明软骨移植物的机械特性优于天然软骨，相较于天然软骨和/或现有的工程软骨，本发明软骨移植物为较佳的异种移植物。

再者，本发明内容第二方面是提供以本方法制备的软骨移植物。本发明内容的软骨移植物可作为整形手术或治疗由老化、损伤或疾病引起软骨缺损的异种移植物。所述整形手术的实例包含，但不限于，隆鼻、脸部左右不对称的矫正手术、眼睑周围的矫正手术或脸部整形手术等。

本发明内容的第三方面是提供一种治疗骨软骨疾病的方法。所述方法包含施用本发明去细胞软骨移植物至一个体的治疗部位(如，病灶处)。

所述骨软骨疾病可以是先天性缺陷、骨折、半月板损伤或缺损、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育不良和脊柱侧弯、骨质疏松症、牙周病、牙骨质流失、骨软化、佝偻病、纤维性骨瘤、肾性骨营养不良(renal bone dystrophy)、脊柱融合、椎间盘重建或切除、柏哲德变形性骨炎、半月板损伤、类风湿性关节炎、骨关节炎，以及创伤性或手术性软骨损伤。

在参阅下文实施方式后，本领域技术人员当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

发明内容旨在提供本发明内容的简化摘要，以使阅读者对本发明内容具备基本的理解。此发明内容并非本发明内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。

附图说明

为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：

图1是依据本发明内容一实施方式所阐示的本发明软骨移植物经H&E染色，且于放大倍率20,000x下所拍摄的照片，其中(A)是SCF处理前所拍摄的照片，以及经SCF在不同压力下分别为(B)150巴、(C)200巴，和(D)350巴处理后所拍摄的照片；

图2是依据本发明内容一实施方式所阐示的本发明软骨移植物经SCF处理前(A)和SCF处理后(B)，以H&E和DPAI染色的照片；

图3是依据本发明内容一实施方式所阐示的本发明软骨移植物经SCF处理前(A)SCF处理后(B)，以爱尔新蓝染色的照片；

图4是依据本发明内容一实施方式所阐示的本发明经SCF处理的软骨移植物在扫瞄式电子显微镜(scanning electronic microscopy,SEM)于(A)500k、(B)1000k和(C)2,000k下所拍摄的照片；以及

图5是依据本发明内容一实施方式所阐示的直条图，其绘示实施例1.1本发明经SCF处理的软骨移植物和天然软骨移植物的抗压强度，其中(A)是应力负荷(stress load)，以及(B)是杨氏模数(Young’s modulus)。

具体实施方式

为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

除非另有所指，诸如“一”(a,an)及“该”(the)等词汇所述及的单数型式词均涵盖其复数形式。

所述“去细胞(acellular)”一词是指一移植物上无任何残留的细胞物质，例如，生物活性细胞和/或其碎片。再者，所述“去细胞软骨移植物(acellular cartilage graft)”是指所述软骨移植物是取自于动物(如，哺乳动物)的软骨，且所述软骨移植物实质上不具有任何细胞物质。在一实施例中，所述软骨是取自于猪的鼻软骨。在其他实施例中，所述软骨是取自于猪的膝软骨。在又一实施例中，所述软骨是取自于猪的肋软骨。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准差之内，视本领域技术人员的考量而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而变化。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与运用一般进位法所得到的数值。

广义而言，本发明内容是有关于一去细胞软骨移植物的一种制备，其适用于美容或整形手术，或者是用来治疗骨软骨疾病，即，将本发明方法所制备的去细胞软骨移植物移植至软骨病灶处；另，所述治疗骨软骨疾病包含修复或回复受损性(damaged)、损伤性(injured)、创伤性(traumatized)或老化(aged)软骨和/或修复软骨缺损。

本发明内容的一方面是关于一种制备去细胞软骨移植物的方法，所述方法可保留胶原蛋白的机械强度，以及其天然结构和构型，因此，当本发明去细胞软骨移植物被移植至宿主身上，以进行组织重建或治疗骨软骨疾病时，能提供宿主组织细胞一可供细胞于其上生长的最佳微环境。再者，以本发明方法所制成的软骨移植物已完全移除其上的细胞物质，因此，本发明方法所制成的软骨移植物实质上是非免疫原性的移植物，在移植后不会诱导宿主产生免疫反应。

再者，本发明方法至少包含以下步骤：

(1)切割一动物的软骨以产生多个软骨基质；

(2)以一种碱来处理步骤(1)所产生的多个软骨基质；

(3)将步骤(2)中经碱处理的多个软骨基质进行灭菌处理；以及

(4)去除步骤(3)中任一该经灭菌的多个软骨基质上的细胞，以制得该去细胞软骨移植物。

为了制备合适的去细胞软骨移植物，可以从非人类动物上取下一完整的鼻软骨、肋软骨、耳软骨或膝软骨，较佳是以经济动物作为软骨的来源。举例而言，可作为供应软骨来源的经济动物包含，但不限于、猪、牛、乳牛、公牛、绵羊、山羊、驴、兔、鸭、鹅或鸡。作为软骨移植物来源的软骨，较佳是取自于现宰动物，且立即置于无菌等渗溶液或其他保存溶液中。将收集到的软骨接着切割至适当的尺寸和形状，以制备成盘状、条状、颗粒和锥状的软骨基质。在某些实施例中，每一软骨基质的形状为盘状，且直径为约8-12毫米，较佳的直径为约11毫米。在其他实施例中，每一软骨基质的形状为条状，长度为约6公分、宽度为约10毫米，且厚度为约2-5毫米。一般而言，所述软骨移植物的尺寸和形状非为本发明内容的关键，只要所述软骨移植物的尺寸和形状与治疗部位形状相符即可。

将切块的软骨基质分别施以步骤(2)和(3)的处理，即步骤(2)的碱处理和步骤(3)进行灭菌。适合本发明方法使用的碱试剂包含，但不限于，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、尿素、硫化钠和硫代乙酸钙等。在较佳的实施方式中，所述软骨基质是在室温下以氢氧化钠溶液处理3小时。灭菌处理的步骤则是以灭菌剂处理所述软骨基质使其无菌，其中灭菌剂可以是氧化剂、酚化合物、四级铵化合物、抗生素和放射线。举例而言，适用于本发明方法灭菌剂包含，但不限于，醇类、异丙醇、重碳酸钠、过氧化氢、醋酸、磺胺类药物、对羟苯甲酸酯、苯甲酸、水杨酸、氯化苄烷铵、烷基二甲基苄基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、氯化胺、X-光、伽玛放射线和紫外光。在某些实施方式中，是以过氧化氢溶液处理所述软骨基质。再者，于执行每一步骤后皆以大量的水冲洗软骨基质移除其中水溶性物质后，再进行下一步骤。

接着，除去步骤(3)中该经碱处理及经灭菌的软骨基质上的细胞。去细胞的目的在于，移除软骨组织上的细胞物质，且可保留胶原蛋白的物理及生物化学特性，使其可作为组织支架(如，一异种移植物)。此外，在步骤(4)中，将步骤(3)中该经灭菌的软骨基质，于压力约150-500巴下以一超临界流体(SCF)进行处理，所述压力例如100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490和500巴；较佳为约150–350巴，例如，150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340和350巴。再者，步骤(4)是在温度为30-50℃之间进行的，例如，30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃；较佳的温度是35-45℃之间，例如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45；处理时间为约20分钟至5天，例如约20、30、40、50和60分钟；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24小时；2、3、4、和5天。在某些实施例中，步骤(3)经灭菌的软骨基质以SCF处理约1至24小时。在其他实施例中，所述步骤(3)中经灭菌的软骨基质以SCF处理约2至5天。

SCF可以是任一种超临界二氧化碳(scCO₂)、超临界一氧化二氮(scN₂O)、超临界水(scH₂O)、超临界烷类、超临界烯类、超临界醇类或超临界丙酮。在一实施例中，所述SCF是scCO₂，scCO₂的超临界条件是温度37℃、压力为约350巴，因此，去除生物物质时是在或接近个体体温(即，37℃)的温度下执行的。在另一较佳的实施方式，所述SCF是scN₂O。

在一非必要的实施方式中，所述SCF连同一共溶剂一并施用至步骤(3)中该经灭菌的软骨基质上。所述共溶剂可以是C_1-4醇，其包含，但不限于，乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇和环丁醇。在某些较佳的实施方式中，所述共溶剂是乙醇，且和SCF一并施用，其中共溶剂和SCF的体积比为1:20至1:4，例如，1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5和1:4。在一较佳的实施方式中，所述乙醇和SCF是以体积比1:19施用。在其他实施方式，所述乙醇和SCF是以体积比1:10施用。在又一实施方式中，所述乙醇和SCF是以体积比1:4施用。在一最佳的实施方式中，所述乙醇和SCF是同时施用，且乙醇和SCF是以体积比约1:10。

依据本发明内容的实施方式，所述步骤(4)该经SCF处理的软骨移植物实质上已完全去除其上的细胞物质，不需额外以酶消化处理(如，以蛋白酶和/或糖苷酶消化)来去除可能作为异种移植物免疫排斥来源的抗原表面碳水化合物部分。依据本发明内容的实施方式，以本方法所制备的软骨移植物已完全去除核酸和非胶原的蛋白。

再者，步骤(4)中该经SCF处理的软骨移植物是由胶原蛋白纤维所构成，且保留机械强度和胶原蛋白纤维的完整性，因此，本发明所制备出的软骨移植物适合作为生物性支架，供宿主细胞在其上生长。依据本发明内容的实施方式，本发明软骨移植物保留胶原蛋白天然结构和构型，且能够支持纤维母细胞生长。

需要注意的是本发明不同于现有技术所公开的方法，本发明不采用一般常用的高渗盐溶液、脱水和/或冷冻处理等步骤，来制备软骨移植物，此不仅简化处理步骤且使制备过程更加容易，同时能够维持本发明软骨移植物中胶原蛋白纤维的完整性和/或机械强度。再者，本发明方法不同于现有技术在于本方法不使用交联剂(cross-linking agent)(如，戊二醛、甲醛和其他类似物)使软骨移植物的蛋白交联，因此，可降低或减少软骨移植物的毒性和免疫原性。

依据本发明内容可任选的实施方式，所述经SCF处理的软骨移植物可以利用任何目前已知的方法(如，以前述的灭菌剂处理)进行灭菌，且存放于干燥且无菌的状态下备用。在某些实施方式中，软骨移植物是以伽马射线照射进行灭菌，放射线照射强度为10-60kGy，如，10、20、30、40、50和60kGy。在较佳的实施方式中，所述软骨移植物是以伽马射线照射进行灭菌，放射线照射强度为10-30kGy，如，10、15、20、25和30kGy。

本发明所制备的去细胞软骨移植物适用于美容或整形手术，或者是用来治疗骨软骨疾病，即，将本发明方法所制备的去细胞软骨移植物移植至治疗位点(例如，软骨病灶处)。所述治疗骨软骨疾病包含修复或回复受损性、损伤性、创伤性或老化软骨和/或修复软骨缺损。

因此，本发明另一方面是提供一种治疗患有骨软骨疾病个体的方法。所述方法包含以下步骤：施用本发明软骨移植物至一个体的治疗部位(如、病灶处)。举例而言、所述骨软骨疾病包含，但不限于，先天性缺陷、骨折、半月板损伤或缺损、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育不良和脊柱侧弯、骨质疏松症、牙周病、牙骨质流失、骨软化、佝偻病、纤维性骨瘤、肾性骨营养不良、脊柱融合、椎间盘重建或切除、柏哲德变形性骨炎、半月板损伤、类风湿性关节炎、骨关节炎、或者是创伤性或手术性软骨损伤。可以预见的是当移植本发明经SCF处理的软骨移植物至病灶处后，相邻的软骨细胞会被活化且迁徙至软骨移植物上的孔洞结构处，细胞会开始生长直到病灶处受损的软骨被取代，且本发明SCF处理的软骨移植物最终会被降解，不会残留毒性残留物于个体体内。

下文提出多个实验例来说明本发明的某些实施方式，以利本领域技术人员实作本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料和方法

细胞培养

NIH-3T3纤维母细胞培养于高浓度葡萄糖DMEM(含10％胎牛血清(FBS)、100单位/毫升的盘林西林和100毫克/毫升的链霉素)中，置于37℃、5％CO2，潮湿环境下培养。

分离软骨细胞

从猪关节软骨上分离软骨细胞。所述软骨以培养基冲洗，再转移至消化培养基(DMEM、10％FBS、1％P/S、0.1毫克/毫升的链霉素)(含H型胶原蛋白)，在37℃下，培养24小时。离心(300×g，5分钟)收集细胞。

H&E染色

切片的软骨组织置于二甲苯(xylene)中浸渍10分钟，以去除石蜡，重复此步骤一次。去除石蜡的组织通过梯度浓度的酒精溶液进行脱水，其中酒精的浓度分别为100％至95％、85％和75％。在进行脱水的步骤中，组织样本于各浓度的酒精溶液内仅放置2分钟后，再以大量去离子水润洗。于脱水后，组织以苏木素(hematoxylin)染色3-5分钟，接着，以去离子水和75％酒精清洗。经苏木素染色的软骨再以1％伊红Y(Eosin Y)染色30秒，再依序以去离子水、95％和100％乙醇清洗。

爱尔新蓝(Alcian blue)染色

依据“H&E染色”一节所揭示的步骤将软骨组织切片去除石蜡和脱水。接着，样本以爱尔新蓝染色30分钟，再以自来水冲洗2分钟，并以去离子水润洗。经爱尔新蓝染色的软骨样本以核固红溶液(nuclear fast red solution)复染5分钟，再以自然水清洗1分钟。

所述软骨样本接着依序通过95％酒精，和100％酒精(二次，每次2分钟)，接着以树脂封固剂固定。

3T3细胞在软骨移植物上的生长

当3T3细胞生长至80％满(confluent)时，接着利用酶处理收集细胞(0.25％胰蛋白酶溶于1mM EDTA)，离心500xg，5分钟。将收集的细胞重悬于培养基中，最终浓度为2x10⁶细胞/毫升。本发明经SCF处理的软骨移植物以培养基预润，进行隔夜培养，接着将其置于低附着24-孔盘(Corning)。将一半的细胞悬浮液(200微升)移至每一经SCF处理的软骨移植物的一侧，置于培养箱中培养2小时，确保细胞已吸附至表面。依照前述的步骤，剩余的细胞悬浮液置于经SCF处理软骨移植物的另一侧(即，尚未接触细胞的那侧)。每一接种细胞的软骨移植物培养于2毫升的培养基中，培养7天，再以10％福马林固定以进行以下分析。

原代软骨细胞(primary chondrocytes)在软骨移植物上的生长(Recellularization)

所述软骨移植物置于24孔盘(200毫克/孔)中，接着将新鲜分离的软骨细胞接种至软骨移植物上。在每个培养孔中，培养基内的最终细胞数量为1.2x10⁷细胞。培养基一周替换三次。于培养2周后，收集软骨移植物，接着以10％福马林固定再进行分析。

抗压强度测定

软骨样本置于PBS溶液中至少16小时进行复水，接着基于样本形状的不同，分别测量样本的高度和/或直径；若软骨样本为条状，则测量其长度；另，若软骨样本为盘状则测量其直径。本试验是利用Lloyd机器(LRX Instrument，England)测量抗压强度。每一试验一开始的预载量为2N，以及负载速度为0.18毫米/分钟，当负载过程中样本的高度和/或直径降低65％时中止试验。

实施例1制备软骨移植物及其特性分析

1.1制备去细胞软骨移植物

将猪关节灭菌后取下软骨。以水清洗软骨后，依序实际使用需求，将其切成符合需求的尺寸和形状。

首先，于室温下，将软骨基质浸置于氢氧化钠溶液中(1N)3小时，接着，置于过氧化氢溶液(5％)中，4℃，48小时。于各溶液处理后，以大量清水清洗软骨基质，以确实移除残留溶液。

接着，所述软骨基质以scCO₂处理，处理条件为350巴，37℃，处理100分钟，以完全去除残留的细胞物质，并产生去细胞软骨移植物；再以伽马射线(30kGy)照射所述软骨移植物后，将其储存于干燥且无菌的环境下备用。

1.2实施例1.1的软骨移植物的特性分析

于SCF处理前，可在软骨腔隙中观察到残留的细胞物质，即，在软骨中的小空间内含有软骨细胞(图1，(A))；然而，在不同压力下以SCF处理后，可观察到腔隙中残留的细胞物质已完全消失(图1，(B)、(C)和(D))，此一结果确认，SCF处理是能够有效去除软骨上细胞物质的方法。经SCF处理后的软骨最终再以H&E染色、DAPI和爱尔新蓝染色确认，其中无细胞核(图2)或酸性多醣类(如，软骨中的糖胺聚醣)(图3)可被染出。综合图1至图3的结果可以确认，本发明经SCF处理的软骨移植物上并未残留任何细胞物质(如，细胞核或碳水化合物)。

再者，经SCF处理的软骨移植物上的孔洞可相对完整地被保留下来(图4)，其可用以支持3T3细胞及原代软骨细胞于软骨移植物上生长，细胞生长实验结果可观察到原代软骨细胞不仅会迁徙至实施例1.1的软骨移植物的孔洞上，还会嵌入至其中的腔隙(数据未标明)。

实施例1.1中经SCF处理的软骨移植物的机械特性优于天然软骨，在抗压强度测定中，与天然软骨相比，实施例1.1中经SCF处理的软骨移植物能够抵抗至少二倍的压力(图5)。

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求书所界定者为准。

Claims (9)

1.一种制备去细胞软骨移植物的方法，其特征在于，其包含：

(1)切割一动物的软骨以产生多个软骨基质；

(2)在室温下以氢氧化钠处理所述步骤(1)的所述多个软骨基质3至24小时；

(3)以一灭菌剂处理所述步骤(2)中经氢氧化钠处理的所述多个软骨基质，其中所述灭菌剂选自于以下所组成的群组中：一醇类、一氧化剂、一放射线、一酚化合物和一四级铵化合物；以及

(4)以一超临界二氧化碳于压力150-350巴和温度30-50℃下，处理所述步骤(3)中经灭菌的所述多个软骨基质100分钟，以去除所述多个软骨基质中的细胞，并制得所述去细胞软骨移植物，

其中，所述方法不采用高渗盐溶液、脱水或冷冻处理，且所述方法不使用交联剂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述软骨是取自猪的一鼻软骨、一肋软骨、一耳软骨或一膝软骨。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，各所述去细胞软骨移植物的外形是盘状、条状、椎状或颗粒。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇类是乙醇或异丙醇。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是过氧化氢。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酚化合物是对羟苯甲酸酯、苯甲酸或水杨酸。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述四级铵化合物是氯化苄烷铵、烷基二甲基苄基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵和氯化铵。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述温度是37℃且所述压力是350巴。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，各所述去细胞软骨移植物可承受的压力为一天然软骨的至少两倍。