CN101903050B - 各向异性植入物及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明的主题是无菌、脱水的无细胞植入物，其在通过水或体液的再水合期间呈现出各向异性膨胀并且可以发挥活细胞粘着、迁移和生长的基底的作用。移植物的胶原结构由于热或有机溶剂例如低级脂肪族醇和酮的作用而至少部分地变性，其中所述有机溶剂同时发挥防腐剂和灭菌剂特别是用于某类病毒的灭菌剂的作用。所述植入物在基本上脱水的状态下通过辐射，优选通过加速电子灭菌。所述移植物可衍生自各种动物组织，特别是哺乳动物组织，例如人类或猪的组织。适合用于本发明的组织可为例如皮肤、胎盘、心包、腹膜、肠壁、腱、血管等。所述植入物适合用于人类和兽医学，例如作为创伤和烧伤的暂时性覆盖物用于组织修复、替换和再生，并且也用作实验室细胞培养的基质。

Description

各向异性植入物及其制造方法

技术领域

本发明涉及创伤愈合和组织再生。具体地说，其涉及无菌脱水的无细胞植入物(移植物)，在其通过水和体液进行再水合期间呈现出各向异性膨胀。根据各种专业技术领域中的内容和习惯，这种类型的产品可称作植入物或移植物。在本申请中，根据上下文使用这两个术语，然而，重要的是明白它们是可以互换使用的。植入物在基本上脱水的状态(essentially dehydrated state)中使用辐射，优选使用加速电子进行灭菌。所述植入物可衍生自各种动物组织，特别是衍生自哺乳动物组织例如人类或猪组织，例如皮肤、胎盘、心包(pericardium)、腹膜、肠壁、腱、血管等。根据本发明的植入物适合用于人类医学和兽医学，例如作为暂时性创伤和烧伤覆盖物用于组织修复、替换和再生，并且也用作实验室细胞培养的基质。

背景技术

已经由于许多原因而常规地移植组织和器官。一种众所周知的技术是自体移植，其中患者一个位置的自身组织(例如皮肤、骨头、血管或脂肪组织)用于代替另一个位置的组织。然而，这并不总是可行的，并且在许多情况下患者需要接受合适供体的移植物(例如心脏、肾、视网膜和其它)。这些所谓异源移植的主要问题是组织排异反应，并且由于强烈增加的需求越来越缺少供体。因此，努力以各种方式来替代天然的异源移植。例如，可以使用组织工程从患者的细胞培养自体移植物。这些自体移植物容易克服免疫屏障，但是它们具有一些缺点：需要从患者收获组织(活组织检查)、辛苦和昂贵的培养、以及活组织检查和移植应用之间经历的长时间。在三级烧伤的情况下替换皮肤时通常使用这种技术，而该技术在其它组织和器官的情况下此时是实验性的。例如，美国专利6,878,383、6,432,710、5,858,390、5,665,372和5,660,850(Boss，Jr.等)描述了自体成纤维细胞的植入以产生增生患者组织的技术和方法。

许多年来已经在烧伤患者中使用了利用人工创造的表皮层的自体移植物。在1979年，Rheinwald和Green(Green H，等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1979；76：5665-8.)开发了连续培养用于自体移植的人类角质形成细胞的方法。从1981年开始，自体培养的表皮移植物已经在美国用于治疗大面积烧伤(O’Connor NE，等，Lancet 1981；1：75-8)。这种方法的缺点是需要长时间的时间间隔来培养自体角质形成细胞，而且，培养脆弱、难以操作、对抗生素高度敏感、感染和其它应激并且难以评价移植物的同化作用(Navsaria HA，等，Trends in Biotechnology 1995；15：91-100)。因此描述所述方法的各种改进，例如：

美国专利4,299,816(M.G.Eisinger)描述了使用人工培养的表皮细胞来改善烧伤的治疗。美国专利5,716,411(Orgill等)描述了使用由胶原基质和甘油氨基聚糖组成的生物合成覆盖物而导致烧伤和损伤的皮肤再生的治疗方法，其使细胞和血管从治疗组织一侧渗透，并且在另一侧应用自体角质形成细胞片。WO 2006/107188 A1(L.Lurvink等)描述了适合用于细胞培养的非多孔性多肽膜，和其随后用于治疗创伤和烧伤的用途。可以在M.Ehrenreich和Z.Ruszczak在组织工程(TISSUE ENGINEERING)卷12，第9期，2006的Updateon Tissue-Engineered Biological Dressings中发现这些方法的最近综述。

自体和异源(allogenic)培养的表皮移植物对于深度皮肤烧伤、活组织检查位点、脚溃疡和其它皮肤缺陷都具有很好的治疗作用(Bolivar-Flores J，等，Burns 1990；16：3-8.；Matouskova E.等，Burns 1993；19：118-23.4，5)。

方法的成功也取决于供体细胞的选择。P.Brychta等在捷克专利号CZ282711中描述了基本上根据Reinwald和Green的步骤但使用患者很好接受的异源细胞从胚胎或胎儿细胞培养的用于治疗皮肤缺陷和创伤的表皮异源移植。

还努力提高角质形成细胞的生存能力(例如通过在合成基底上培养)和机械阻力并且开发能够使培养的组织在三级烧伤上永久同化的技术。用于培养角质形成细胞的基质实例是基于透明质酸的膜(Laser skin，FIBIA，Italy)、与成纤维细胞组合的各种类型的胶原基质或者由合成聚合物(例如Prague 10的FNKV，临床烧伤药物中的实验性pHEMA)制成的基质。为了填充深度烧伤，开发皮肤替代物例如Integra(与葡萄糖氨基聚糖6-硫酸盐软骨素和异源成纤维细胞组合的胶原；Integra LifeSciences Corporation，Plainsboro，New Jersey，USA)、Dermagraft(播种有皮肤异源成纤维细胞的聚催乳激素(polygalactin)；Advanced Tissue Sciences，La Jolla，CA，USA)、或者已经提及的AlloDerm-冰冻异源皮肤(LifeCell Corporation，The Woodlands，TX，USA)。然而，所有这些皮肤替代物必须在第二步(血管化作用2～3周之后)期间被薄的自体皮肤-表皮移植物所掩蔽，目前使用异源培养来掩蔽三级烧伤是不成功的。

解决异源移植的另一个方案是使用除了人类之外其它物种的组织或器官，即所谓的异种移植。在这种情况下，也需要克服免疫系统对外来组织的排异作用，并且还需要防止由供体带给患者的导致疾病的微生物、细菌和病毒污染的可能性。非常关注防止蛋白感染素(例如著名的“疯牛病”)从动物传播给人类的可能性。另一方面，优点在于获得动物组织和器官比人类的要容易的多。

异种移植的公知实施例是用于替代人类心脏瓣膜的猪心脏瓣膜。猪瓣膜使用戊二醛进行交联(例如美国专利4.076-468，Liotta等；美国专利4.247.292.W.A.Angell)，这产生许多期望的结果：抑制了生物体的排异反应，提高异种移植的水解和酶解稳定性，而且戊二醛起到化学灭菌剂的作用。这种方法的缺点之一是所述组织机械性能的改变，并且在一些情况下甚至会从不溶的多元醛中长期释放有毒的戊二醛，其中多元醛可以在过程中形成并且不能通过简单的萃取除去。

大量的移植物以所谓的“生物学覆盖物”形式用于创伤敷料和由此的治疗支持。根据创伤的性质和其它情况，使用生物学的、合成的和半合成的覆盖物。通常认为生物学覆盖物是最有效的。用于治疗烧伤的典型生物学覆盖物例如为哺乳动物皮肤，特别是从死亡个体收获的并且在冷温度下短时间新鲜保存或者甚至冷冻时长期保存的各种厚度的人类皮肤(异源移植)或者猪皮肤(异种移植)。有很多从猪皮肤获得异种移植的经验。

“活的”创伤敷料(即含有活皮肤所有组分的未加工的异源移植或异种移植)是非常有效的，但是它们的缺点在于它们有限的贮存期限和传播感染的可能性。在许多专利中提出了一些解决方案，例如根据美国专利4,865,871(S.Livesey等)的深低温保藏方法的LifeCell Corp.，Texas，USA产品AlloDerm和XenoDerm。这种方法能够冻结和可能冻干组织和细胞而不损坏它们的结构或功能。

另一方法是如专利申请CN 19951010722(Kai Cao)中所述在室温下在硝酸银的存在下在甘油中贮存猪皮肤。

在专利申请TW 199001117733(Chang Hong Chi等)中描述了使用Co60源的γ辐射在高氯酸钠或过氧化氢溶液中进行猪皮肤的灭菌(在清洗和使用烃处理之后)。

在专利申请CN 19921005926(Guohui Li等)中描述了对医疗用途的猪皮肤进行灭菌的其它方法，其描述了在湿状态下使用钴辐射源来进行灭菌并且随后低温储存，或者在室温下使用甘油中的后续储存进行冷冻干燥。

Deutches Institut fur Zell-und Gewebeersatz gGmbH(Delitzcher St 141，04129 Leipzig，SRN)也推荐使用甘油来保存用于异源移植的人类胎盘(羊膜)。

文献UA 12391U(E.Y.Fistal等)描述了在深度烧伤之后使用冻干猪皮肤来治疗坏死创伤。

在文献RU 2185179和RU 2124354中也描述了用于治疗包括烧伤的创伤的基于胶原的生物学创伤敷料。

可以通过从移植物中除去细胞来减弱无菌和贮存期限的问题，因此该移植物变得部分或完全无细胞。可以在专利文献号CN 20031124306(Hu Jie)中发现解决这种问题的方法，其描述了作为创伤和烧伤的生物学敷料的异种移植。可以根据以上发明通过使用水和洗涤剂溶液使动物组织例如皮肤、小肠壁或胎盘部分地除去细胞，并且这在将与创伤接触的表面上进行。将保持其它部分例如表皮的细胞结构。然后使用合适的试剂例如戊二醛对所述组织进行交联，然后清洗除去所述试剂并且将所述组织以湿的状态保存在低于4℃的温度下。

其它文献CN 20051126108(Dong Qun Lin)描述了通过如下从哺乳动物皮肤中除去细胞的方法：重复利用2N～5N NaOH溶液，随后在洗涤剂溶液和水中清洗。

另一文献CN20041022506(Dai Weihua等)描述了使用酶、碱洗涤剂和其它化学试剂的组合作用制备可生物降解的无细胞皮肤的方法。

公开申请US 20050186286(Yoshihiro Takami)描述了使用蛋白水解镁和洗涤剂的组合作用从哺乳动物(例如人类或猪)皮肤中除去细胞的方法，由此制备的皮肤指定用作烧伤治疗的异源移植或异种移植。通过将无细胞皮肤后续浸渍在叠氮化合物溶液中进行灭菌。

由AelsLife制成的类似无细胞异种皮肤基质提供细胞三维迁移的骨架。这种根据制造商的生物学创伤覆盖物含有存在于活皮肤中重要的非细胞化合物和结构，并且其通过使用酶和洗涤剂除去细胞之后对猪皮肤进行低压冷冻制成。

制造商Brennen Medical Inc.的生物合成敷料E*Z DERM使用猪皮肤异种移植物，其通过使用醛使胶原交联来进行处理。

专利文献JP 19900247300(Koide Mikio)描述了使用变性胶原基质的生物学覆盖物，其通过使无细胞牛皮肤交联并且使胶原结构热诱导变性而形成。根据引用发明的这种结构适合用于使用自体角质形成细胞的用于较高治疗效率的播种。

解决问题的其它努力是各种半合成皮肤替代物，例如播种有人类成纤维细胞(即上述INTEGRA敷料)重建牛胶原的支架。

组合移植物的另一实例是根据捷克发明号281176的重组皮肤：(RK)。RK使用在无细胞猪皮肤上培养的人类角质形成细胞制备(Burns 1993；19：118-23)。干燥的皮肤用于培养人类角质形成细胞并且在皮肤培养之后与角质形成细胞层(或RK)一起从培养皿中脱离并且施用于创伤。将RK施用于和创伤以及外侧上的表皮(“上侧朝下”)接触的角质形成细胞。与简单的表皮移植物相比，RK显示出如下优点：较高的耐用性、不进行酶促作用与培养皿分离、和容易操作。与在合成基质和基于胶原的凝胶上培养的角质形成细胞相比的优点是RK的粘度与皮肤类似，并且这导致优异的创伤粘合和止血作用。RK可以使用自体和异源角质形成细胞。在表皮的表皮侧即基膜将皮肤与表皮分开的地方培养角质形成细胞。以上引用发明的发明者提到，不含细胞的皮肤可以使用γ辐射在室温下进行灭菌以得到较好的贮存期限和较高的安全性。但是，由此γ灭菌皮肤的缺点是部分降解和在湿的状态下损耗耐久性。

在专利申请TW20000118374(Yang Mei-Ru等)中描述了类似的组合生物学烧伤敷料，其中，无细胞猪皮肤中的活人类成纤维细胞与在无细胞基质的基膜侧培养的人类角质形成细胞组合。

妨碍有效接受使用这些生物学材料的一般问题是无法使用常规和可靠的灭菌方法的事实。另一妨碍广泛使用上述材料的具体问题是它们有限的或苛求的贮存期限，以及它们的制造成本。难题是脱水材料在再水合期间也呈现出各向同性膨胀，即再水合之后所有的移植物尺度(相对地)同等增加。本发明提出这些问题的解决方案。

发明内容

本发明者发现，创伤愈合和组织再生并不总是需要存在移植的异源或自体细胞，只要存在合适的材料来刺激、支持、和引导患者自身细胞的复制、分化和迁移。根据本文提供的发明，这种材料是衍生自自体(autologous)、异源(allogenic)、或者甚至异种(xenogenic)生物学材料的特殊加工的无细胞胶原基质。根据本发明，所述基质主要由胶原和相关蛋白质例如弹性蛋白、纤维蛋白或角蛋白组成。这些基质组分和它们的浓度根据组织来源及其加工方法而改变，并且为了简单起见称作“胶原”，因为在所有情况下胶原是主要的基质组分。除了蛋白质(“胶原”)之外，所述基质还含有一定含量的脂质和脂蛋白(最高达20重量％)、一定量的糖组分(多糖、糖蛋白和糖蛋白聚糖(glycoproteoglycanes))和盐。蛋白质含量通常为70％(以重量计)～95％(以重量计)，优选为80％～90％(以重量计)。

根据本发明，无细胞基质的特征在于是基本上脱水的并且主要由胶原组成，其原纤维(fibril)呈现出与它们在原始组织中类似的结构性排列(structuralorganization)，但是此外它们也是部分变性的，并且至少为脱水状态。它们优先朝向一或多个选定的方向。部分变性是有利的，因为其提高了生物降解的耐受性，因此原纤维在愈合期间提供更多的时间使宿主细胞迁移和附着。过快的植入物降解可以留下炎症病灶，这将难以愈合并且可导致结疤。胶原原纤维的部分变性也提高了湿状态下的机械强度。

胶原原纤维的朝向也使植入物在选定的方向上具有较高的强度并且引导细胞沿着植入物的表面迁移和散播，而不是穿透到植入物中。这进一步通过如下事实支持：根据本发明的无细胞基质在脱水状态下具有比冻干的生物学创伤覆盖物更低的孔隙率，所述冻干的生物学创伤覆盖物的孔隙率通常高于75％(以体积计)。根据本发明，所述植入物的孔隙率低于70％(以体积计)，优选低于60％(以体积计)，甚至更优选低于50％(以体积计)。低孔隙率和有利的原纤维朝向对于用作生物学创伤覆盖物的植入物来说是特别重要的，例如烧伤的情况下预计一旦完成愈合就自发地脱离。表皮层的再生需要角质形成细胞从创伤边缘迁移到愈合区域，其中该愈合区域是创伤和植入物表面之间的界面。细胞渗入植入物结构中不是有利的，因为这可以导致移植物对于创伤的再附着。例如，当植入物在皮下时，细胞沿其表面迁移，这将导致形成小纤维囊，在许多情况下并不希望如此。

脱水状态下保持胶原朝向也会降低植入物的切向劲度(与原纤维的取向相切)，因此甚至脱水植入物也比类似的各向异性植入物较容易弯曲和较不脆弱。实践上这是十分重要的，因为脱水植入物不需要软化剂，并且在植入物中不会形成可能导致细胞在植入物中不可控渗入、植入物崩解和可能钙化的裂缝和微裂。

胶原原纤维的各向异性排列的另一重要结果是植入物再水合期间的各向异性膨胀。根据本发明，所述植入物在再水合期间以各种速率在各个方向上膨胀。例如，根据结构各向异性和膨胀之间的关系，如果胶原结构优先朝向最长的方向(例如当使用腱时)，则大部分的水合作用膨胀将呈现为植入物直径的增加，而长度只变化一点，或者可以保持不变，稍微增加或者甚至减小。在表面植入物例如烧伤创伤覆盖物的情况下，可优选将原纤维朝向选定为与主植入物平面的表面垂直的方向。在这种情况下，水合作用膨胀将尤其表现为或者仅表现为厚度增加，而覆盖区保持基本上不变。除了上述优点之外，膨胀的各向异性具有另一实际优点：外科医生可以较好地调整植入物的形状和尺寸以满足个体患者的要求，例如，如果必须掩蔽特殊形状的创伤，则可以简单地从脱水植入物上切割相应尺寸和形状的植入物，并且其在水合作用之后将保持不变。在各向同性脱水植入物的情况下，脱水尺度必须是相对较小的以弥补水合作用膨胀的效果。另一个优点可为脱水植入物与组织附着的方式在水合作用之后仍然保持其形状，因此周围的组织保持外科医生在外科手术期间选定的张力。在各向同性植入物的情况下，周围组织由于植入物的水合作用膨胀的原因而失去其初始张力。

而且，重要的是如下事实：各向异性膨胀可以简单区分根据本发明的植入物与类似来源和目的的其它植入物。

各向异性膨胀可以用三个选定尺度的线性膨胀系数之间的比值来表示。例如，沿着“z”轴选定的方向可为厚度t并且其线性膨胀系数C_z＝(t_水合)/(t_脱水)。类似地，我们可以选择长度l作为“x”轴方向的尺度并且定义线性膨胀系数C_x＝(l_水合)/(l_脱水)。最后，我们可选择宽度w作为“y”轴方向的尺度并且定义线性膨胀系数C_y＝(W_水合)/(W_脱水)。其中下标“水合”表示水合作用之后的尺寸(尺度)和下标“脱水”表示初始脱水状态下的尺寸(尺度)。在各向同性脱水材料的情况下，我们总是发现C_z/C_y＝C_x/C_z＝C_y/C_z＝1，不论C_x、C_y和C_z的值为多少。水合作用期间各向异性膨胀的区别特点在于，比值C_x、C_y和C_z中至少一个具有不同于1的值，并且线性膨胀系数C_x、C_y和C_z中至少一个具有比其它低的值并且其值可以甚至低于1。相反地，线性膨胀系数C_x、C_y和C_z中至少一个具具有明显高于其它的值，通常高至少10％，优选超过30％。例如，线性膨胀系数C_x和C_y可具有低于1的值，而C_z具有高于1.2，优选高于1.5的值。

根据本发明，各向异性脱水植入物的胶原原纤维优先朝向最低线性膨胀系数的方向，或者视情况可以是在与膨胀系数值最高的方向垂直的平面中。

胶原原纤维在甚至完全水合的状态都可优先朝向某些方向。这种朝向通过胶原在定向状态下的部分变性或者胶原的交联(其也为变性形式)来实现。此后，胶原原纤维的朝向甚至在植入物的水合后仍基本维持。这种朝向可有利于指导细胞在某些方向的迁移和增殖，这在烧伤复原中是特别有利的。

可以使用多种已知的方法实现胶原的交联，例如醛如甲醛或戊二醛或者多价阳离子如Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺或Cr³⁺的作用。交联将进一步减少膨胀并且提高胶原基质的强度和耐水解性。这种离子交联在植入状态下通常是不稳定的，并且交联密度的逐渐降低会导致膨胀逐渐增加以及线性膨胀因子和它们相互比值的改变。这些方法的动力学是可控的，因此这些方法可例如用于在愈合组织上产生定向压力或张力。

根据本发明，无细胞基质是强烈亲水的并且它们的体积将随着水合作用而增加。水合作用最通常定义为水合状态下水的重量分数，或者单位为重量％的水含量。根据本发明，完全水合的植入物中的水含量高于33％(以重量计)并且优选高于50％(以重量计)。体积膨胀系数定义为：

C_v＝C_x*C_y*C_z＝(水合体积)/(脱水体积)＞1。

根据本发明，无细胞基质的C_v＞1.1，优选C_v＞1.5。这样一来，它们原则上不同于基本上疏水的多孔结构，后者可例如通过在例如醛的帮助下进行组织的共价交联来形成，或者它们可由合成聚合物例如聚氨酯形成。在这种情况下的水合作用期间，水填入孔中，增加植入物的质量，但是其体积不会明显增加，其C_v接近于或者基本上等于1。

从以上信息中可以总结出，本发明的主题最特别是无细胞的、无菌的、基本上脱水和至少部分变性的衍生自动物组织并且主要含有胶原的基质，其原纤维的结构排列类似于它们在原始组织中的结构排列，其意图用作人类或兽医学中的暂时性植入物，并且其基质在水合作用期间呈现出尺度的各向异性变化。

根据本发明的有利实施方式，无细胞基质的水合作用期间，当发生基质尺度的各向异性变化时，两个最大的尺度基本上保持恒定或者变小，而最小的尺度随着基质体积的增加而增加。

根据本发明，在另一有利的实施方式中，所述暂时性植入物具有基本上扁平(flat)的形状，其覆盖区通过其两个最大的尺度限定，而其厚度通过其最小的尺度限定。

根据本发明，在所述无细胞基质又一有利的实施方式中，其两个较小的尺度将增加，而其最大的尺度基本上保持恒定或者尺寸减小。

在又一有利的实施方式中，所述暂时性植入物具有基本上长的形状，例如棱柱或圆柱，其直径通过其两个最小的尺度例如其直径来限定，而其长度或高度通过其最大的尺度来限定。

根据本发明，脱水状态下有利的基质具有低于70％(以体积计)，有利地低于60％(以体积计)，最有利地低于50％(以体积计)的孔隙率。

根据本发明，在有利的实施方式中，所述无细胞基质由至少为脱水状态的胶原原纤维组成，所述胶原原纤维优先朝向水合作用线性膨胀系数具有最低值的方向，并且基本上垂直于其中线性膨胀系数最高值的方向。

根据本发明，在有利的实施方式中，所述脱水状态的无细胞基质具有低于20％(以重量计)，有利地低于10％(以重量计)和最有利低于5％(以重量计)的水含量。

根据本发明，在某些有利的实施方式中，所述基质还可含有软化剂、防腐剂、或杀菌添加剂。有利的杀菌添加剂含有优选为胶体状态和甚至更优选为银-蛋白质复合物的银。有利的软化剂或防腐剂含有易混于(miscible with)水的化合物，例如DMSO或选自乙二醇或甘油家族或它们的衍生物、三乙醇胺和糖类(sacharide)的多羟基化合物。

根据本发明，有利的无细胞基质与水成液接触时能够以高于1.1，优选高于1.5的体积膨胀因子进行体积膨胀。而且，有利的无细胞基质一旦暴露给合适的水成液，其能够达到含有超过33％水(以重量计)，优选超过50％水(以重量计)的状态。

根据本发明，有利的无细胞基质具有比最低的线性膨胀系数高10％，优选高30％的最高线性膨胀系数。优选的无细胞基质最高线性膨胀系数高出1.2，优选高出1.5，而其最低线性膨胀系数低1.1，优选低1.05。

根据本发明，在另一有利的实施方式中，所述无细胞基质的固体(干物质)主要由蛋白质组成，其中优选的蛋白质主要含有胶原。甚至更优选地，无细胞基质的固体(干物质)含有70％(以重量计)～95％(以重量计)，有利地80％(以重量计)～90％(以重量计)的胶原型蛋白质。有利地，所述基质的固体(干物质)除了蛋白质之外含有较少量的包括脂蛋白质和磷脂的脂质化合物。

根据本发明，当无细胞基质的蛋白质部分是至少部分变性时该无细胞基质是有利的。根据本发明，在另一实施方式中，至少所述无细胞基质的蛋白质部分因为与醛或多价阳离子反应而交联。

根据本发明，有利的无细胞基质衍生自哺乳动物，优选衍生自猪。

根据本发明，有利于无细胞基质的动物组织为皮肤、胎盘、心包、硬脑膜、肠、腱、或软骨。

在本发明中要求保护的由所述无细胞基质形成的暂时性植入物有利地用作创伤覆盖物，最有利用作烧伤覆盖物。

根据本发明，所述无细胞基质的另一有利的实施方式是也含有经培养的哺乳动物细胞的无细胞基质。优选的哺乳动物是猪并且经培养的哺乳动物细胞是人类自体或异源的角质形成细胞。

根据本发明，所述无细胞基质的另一有利的实施方式是在实现功能之后自发地生物降解的无细胞基质。

如上所述根据本发明的植入物的制造方法包括如下几个基本步骤：

1)收获植入物，例如猪皮肤或人类腱。该步骤基本上以与其它情况下到目前为止进行的常规收获相同的方式进行，但是重要的优点在于，根据本发明的植入物收获不像在植入物含有细胞的情况下那样苛求运输条件和后续快速处理。那些将成为最终植入物的胶原结构比细胞结构更稳定。

2)除去细胞。根据本发明，各种除细胞方法可用于这种植入物，包括现有技术描述的方法。这包括，通过表面活性剂例如洗涤剂、化学化合物例如酸和碱、或酶除去细胞，如以下专利申请和文献所述(它们包括在本申请中)：CN200310124306(Hu Jie)；CN20051126108(Dong Qun Lin)；CN20041022506 20040512(Dai Weihua等)；US 2005 0186286 A1(YoshihiroTakami)；JP19900247300(Koide Mikio)和捷克专利号281176(E.Matouskova)。

根据本发明，两步法是有利的，其中在第一步中使收获的组织暴露于合适的蛋白水解酶例如胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，在第二步中使包括潜在残留细胞的组织暴露于强烈的低渗溶液，优选暴露于过量的蒸馏水或去离子水。去离子水通过使残留细胞暴露于渗透压休克、导致细胞膜破裂而除去残留的细胞。该第二步除细胞步骤与多步提取残留酶(例如胰蛋白酶)和其它化合物的步骤一起进行。随着残留酶的除去，可溶性多肽也被除去，还有多糖、糖蛋白、和具有假定生物活性的其它化合物。水溶性化合物的除去甚至是更有效的，因为低渗溶液导致组织高度膨胀，由此增加提取物的扩散。然而，我们发现，即使是彻底的提取也不能完全除去这些水溶性化合物，在每个步骤结束时可以用UV光谱法检测到新的有机化合物。这表示新的化合物例如多肽和糖蛋白不断地从胶原结构中释放出来，因此仍保持一定水平的生物活性。

3)脱水作用。脱水通过蒸发无细胞结构中存在的水，或者使用合适的溶剂例如乙醇进行提取，而除去至少大部分水来进行。这里“大部分水”是指所谓的“自由水”，这部分自由水的结构和热力学性质与液态水的那些性质(例如熔点、蒸汽压或热容)完全相同。这是通常情况下组织中最主要的水，除了最后的20重量％左右的水，其由或多或少结合在胶原基质或者所述植入物的其它亲水组分中的水组成。这种所谓的“结合水”具有不同于自由水的热力学性质并且起到胶原的增塑剂的作用。结合水难以完全除去。“脱水植入物”是指不含有自由水的植入物，其残留的湿度含量低于20％(以重量计)，优选低于10％(以重量计)。为了提高产物的货架期，将产物的湿度含量维持在5％(以重量计)以下特别有利。如果使用水溶性溶剂进行提取，该步骤同时也导致胶原发生部分变性。为了有效地部分变性，至水提取结束时溶剂应该含有超过50重量％，优选超过70重量％的有机化合物。水提取可以分多步进行，期间逐步提高有机溶剂的浓度。合适的溶剂为低级脂肪族醇C₁～C₄，低级脂肪族酮例如丙酮，醚例如二甲醚、二乙醚、二噁烷或四氢呋喃，二醇例如乙二醇、1，2-丙二醇、二甘醇或三甘醇等。最合适的是乙醇，其不仅是胶原和其它蛋白质的有效变性剂，还是有效抵抗例如逆转录病毒的防腐剂和灭菌剂。其优点是，毒性相对较低、能方便地获得、和有可能通过蒸发完全除去其残留。如果选定的溶剂不是挥发性的，将通过挥发性溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮或水的提取来除去。

4.胶原的部分变性。变性通过加热、或者通过合适的有机试剂例如醇、醛、酮或它们合适的组合进行。还可以通过胶原的部分交联来诱导变性，例如被多价阳离子如Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺或Cr³⁺诱导。交联可改善对生物降解的耐受性，由此可以延长植入物的有效使用。

生物学覆盖物通过热处理、交联或它们组合而发生的部分变性在如下的文献中描述，这些文献因此包括在本申请中：JP19900247300(Koide Mikio)和US 4,076,468(Loiotta等)；US 4,247,292(W.A.Angell)。

胶原的变性可有利地与脱水组合进行，然而，这两个步骤也可以以任意次序单独进行。一种有利的方法是通过水蒸发进行脱水，随后在脱水状态下使用例如热处理进行变性。通过有机溶剂进行的变性可甚至通过在脱水植入物上喷洒或喷雾合适的有机试剂来进行。通过溶剂进行的变性可甚至与热变性组合，其有控制地加热植入物，同时例如蒸发水或溶剂。

重要的是在一个或两个选定方向，通常是最大尺度方向的机械张力下进行无细胞基质的脱水和变性。脱水和变性期间的张力可以通过在所需方向上保持恒定的尺度来实现。这可以通过如下实现：例如使用夹子固定无细胞基质；使用弹性附件或辊将其拉伸；附着于合适的支架；按压到粘性基底上或者通过使用真空的抽吸附着到基底等。伸展状态下的脱水和变性将导致胶原结构朝向拉伸所述无细胞胶原基质的方向(或者至少防止其在脱水和变性期间收缩的方向)。

如果变性在已经脱水的各向异性基质上进行，则通常无需将其保持在张力下，因此所述脱水的基质在直至制造或储存期间都不会超过的某一温度时其尺寸都是稳定的。这种温度极限主要取决于基质中残留的水含量，其应该不超过所述基质总质量的20％(以重量计)、优选10％(以重量计)、最优选5％(以重量计)。变性在+15℃～90℃，优选30℃～70℃的温度进行。

5)通过电离辐射进行灭菌。如果步骤4中的变性使用合适的溶剂例如乙醇进行，我们将在两个水平进行灭菌。制造过程期间的第一水平的灭菌首先降低最终灭菌过程的微生物量，其次是甚至除去那些微生物，所述微生物是第二水平的灭菌可能不能有效除去的(例如逆转录病毒)。

最终水平的灭菌通过包装在微生物和病毒不可渗透的包装纸中，使用辐照来进行。有利地，对于给定的微生物量使用最低水平的电离辐射，这将降低产物的降解。推荐的水平低于50kGray，优选低于30kGray。在γ辐射的情况下这是特别重要的。优选通过加速电子(电子束、β辐射)进行灭菌，其对于植入物材料是温和的并且可以更精确地确定剂量。重要的是认识到γ辐射和加速电子在降解机理方面的区别。本发明的发明人惊讶地发现，通过电离辐射(特别是加速电子)与化学灭菌剂(同时导致变性)特别是乙醇的组合而灭菌的植入物在湿润时保持它们优异的机械性能，并且甚至在与患者的细胞或者与在实验室中植入物上培养的细胞接触时也是无细胞毒性的。不考虑各种理论，本发明人设想，电离辐射(例如加速电子)的有利作用主要因从其它不溶性基质中释放水溶性多肽和蛋白聚糖片段而导致，而这使其生物活性提高。

植入物还可以与已知的杀菌剂或抑菌剂例如磺胺类药物、抗生素、蛋白质-银复合物或者通过胶原基质散布的胶体银组合。这在向感染或坏死创伤植入期间是特别有利的。一些添加剂同时发挥软化剂的作用，例如甘油及其双乙酸盐或者甲醛、1，2-丙二醇、二甘醇、葡萄糖、三乙醇胺或二甲基亚砜(DMSO)。这些可同时发挥温和防腐剂、软化剂和弱变性剂的作用。它们的含量可最高达50％(以重量计)，优选低于30％(以重量计)。这些软化剂与水易混溶，优选为多羟基化合物，最优选为甘油或其衍生物。它们甚至可以与银化合物组合，所述银化合物例如参见申请CN199551010722(Kai Cao)，该申请因此包括在本申请中。

因此，本发明的主题是制造如上所述无细胞、无菌、基本上脱水的基质和衍生自动物组织并且主要包含胶原结构的至少部分变性基质的方法，其基于使用包括如下步骤的方法处理所述动物组织：

a)收获组织；

b)在形成无细胞基质期间，通过酶作用、表面活性剂、酸、碱洗涤剂、低渗水溶液或它们的组合除去细胞；

c)通过除去大量水进行所述无细胞基质的脱水作用，同时所述基质维持在一个或多个选定方向的机械张力下；

d)通过升温、有机化合物、多价阳离子或它们的组合的作用使所述无细胞基质中的胶原结构发生部分变性，并且所述基质维持在一个或多个选定方向的机械张力下；或者所述基质的尺度维持基本恒定；

e)通过电离辐射进行基本上脱水和至少部分变性的基质的灭菌。

根据本发明制造无菌无细胞基质的有利方法是基质的胶原结构的部分变性使用易混于水的有机化合物进行，其选自脂肪族醇C₁～C₄、脂肪族醛(包括甲醛和戊二醛)、脂肪族酮(包括丙酮)以及包括醚(二甲醚、二乙醚、二噁烷和四氢呋喃)。

根据本发明，进行胶原结构的部分变性的有利方式在15℃～90℃，优选30℃～70℃的温度进行。

本发明人发现并且证实，根据本发明的植入物可有利地用作烧伤、下肢溃疡(crural sores)、摘取区域(harvesting areas)和其它皮肤缺陷的生物学覆盖物。脱水植入物可直接放置在出血或渗出创伤上，其将使植入物原位水合而不会显著增加创伤覆盖物面积并且将有助于减小创伤出血和渗出。通过合适的添加剂例如甘油软化的合适植入物特别适合用于这种用途。无菌植入物也可以在使用之前在无菌生理溶液中进行水合，所述生理溶液可能添加合适杀菌剂(例如呋喃妥因、硼酸溶液或蛋白性质的银(银-蛋白质复合物)的水溶液)，并且放置在创伤上。其一大优点在于，其能够紧密地掩蔽创伤表面的起伏特征(topographical featuer)，降低创伤痛苦并且具有止血作用。另一大优点在于，整个区域的愈合无需更换创伤敷料，这在其它创伤敷料的情况下是需要的，并且通常是昂贵的，对于患者尤其产生创伤(在严重烧伤的情况下甚至必须在完全麻醉的条件下进行)。与其它生物学覆盖物相比的另一优点在于，哪一侧与创伤接触并不重要。无细胞的皮肤覆盖物保护创伤并且通过支持与愈合关联的生物活性例如患者角质形成细胞的迁移和增殖来加速愈合。天然的角质形成细胞粘附到植入物的内表面(可能粘附到与患者的血液或血浆接触之后在所述植入物上产生的纤维蛋白)并且它们在其表面上迁移，使得所述植入物在发生有效愈合的时期成为皮肤的一部分。一旦完成愈合并且更新了患者的表皮层，所述植入物将干燥并且自发地自我脱附，无需任何外科手术除去，对于其它生物学覆盖物来说这是需要的，并且也会对患者产生创伤。

根据本发明的无菌无细胞植入物的另一优点在于，其适合作为自体或异源细胞培养的优异基质。因此其表面可用于培养合适的细胞，例如角质形成细胞，其将形成已知为“重组皮肤”(RK)的细胞性生物学覆盖物，并且可以施用到烧伤和其它创伤区域。这种细胞性生物学覆盖物的主要优点在于，其能够将培养的角质形成细胞的刺激作用与膜基质(即本发明的植入物)的性质组合。如果在受伤后的10天内用RK成功地防止了深度皮肤烧伤的加深，则不需要移植物，愈合会显著加快，也无需摘取区域和反复的外科手术。与异源角质形成细胞一起移植的RK在愈合期间暂时粘附，角质形成细胞掺入到再生期间的表皮中，增殖、迁移、封闭创伤，并且通过产生各种生长因子来刺激愈合。异体皮肤将保护创伤，并且为自体角质形成细胞的迁移提供天然基质。在一周的时间里，异源角质形成细胞被自身的角质形成细胞所替代。本发明将通过如下实施例和附图进一步说明。这些实施例发挥作为本发明某些有利实施方式的证明的作用，并且本领域技术人员将明显看出所附专利权利要求的范围不因为包括这些实施例而仅限于这些实施例。

附图说明

图1是显示具有乳状皮肤层的猪表皮的组织切片显微照片。

图2是显示除去细胞之后植入物的组织切片显微照片。

图3是显示脱水之后沿面取向(plane-oriented)无菌植入物的组织切片显微照片。

图4是显示在根据本发明的无菌再水合植入物的组织切片中根据VanGieson的胶原结构染色的显微照片，放大倍数：400。

图5显示制备用作烧伤覆盖物的再水合无菌植入物。

图6表示在二级烧伤上根据本发明的植入物的应用。左边照片：没有外部敷料时覆盖物对创伤的巩固和粘附。右边照片：愈合之后二级烧伤和覆盖物的自我分离。

图7是显示在由根据本发明的植入物制成的覆盖物(施用9天之后)下面非坏死三级烧伤上新形成的组织样品的组织切片显微照片。

图8表示在根据本发明的植入物上由实验室培养的人类角质形成细胞形成的重组皮肤(RK)的组织学制备的显微照片。

左边照片：重组皮肤，有人类角质形成细胞，在根据本发明的猪无细胞基质上的浸渍物中培养。

右边照片：重组皮肤，有人类角质形成细胞，在根据本发明的猪无细胞基质和空气的界面上培养。

实施例

实施例1

猪皮肤作为异种移植物

将包括乳状皮肤层的猪表皮除毛并洗净，用植皮刀切取300～400微米厚的层。所取的层的组织分布如图1所示。将切取的猪皮肤条在0.25％胰蛋白酶溶液中在37℃浸20分钟共3次、并且在4℃浸渍12小时，这除去了大部分的皮肤细胞并且使表皮分离。然后所得表皮在软化水中清洗6次(3次是洗1小时，1次是洗12小时，2次是洗0.5小时)以除去残留的细胞和胰蛋白酶。图2显示保留了非细胞结构。然后使用粘附剂将皮肤条粘至玻璃培养皿，在室温干燥至恒重。在这种状态下皮肤含有约18％水。由此干燥的无细胞皮肤具有与初始水合皮肤相同的覆盖区，但是其厚度不到一半。然后将伸展的无细胞皮肤浸在96％乙醇中15℃维持24小时。然后轻轻倒出乙醇，使皮肤与其玻璃基底脱离，从两个相对的方向上用夹子夹起，在50℃干燥1小时。

然后，将含有残留9.5重量％水的脱水无细胞异种移植物放在核准用于辐射灭菌的无菌袋中，将无菌袋热密封并暴露给25kGy的γ辐射。使用标准无菌试验来确定无菌。在再水合之后，收获组织切片。图3显示保留了结缔组织了的纤维结构，但是其更加致密并且纤维为沿面取向。图4的Van Gieson染色显示，植入物大部分由胶原型聚合物例如胶原和弹性蛋白组成。分析表明，所述植入物有约85％(以重量计)的混合物(主要是胶原，还有少量弹性蛋白和纤维蛋白)，剩余成分由脂质、多糖和糖蛋白组成。

无菌植入物的孔隙率为约55体积％，使用脱水状态的密度计算。所述植入物在35℃在等渗NaCl溶液中再水合。在再水合至恒定质量之后，水含量为62％(以重量计)。重复测量脱水状态和水合状态两种情况下的尺度，精确度为0.01mm，得到如下线性膨胀系数：

长度：C_x＝1.02±0.01

宽度：C_y＝1.03±0.03

厚度：C_z＝1.54±0.29

平面膨胀系数：C_a＝1.05±0.03

体积膨胀系数：C_v＝1.63±0.20

膨胀系数的显著差别清楚地证实了植入物再水合期间的各向异性膨胀。这种各向异性可进一步通过线性膨胀系数的比值证实：

C_x/C_y 0.98

C_z/C_x 1.52

C_z/C_y 1.49

一定的储存期间之后将所述异种移植物用作脸部深度二级烧伤的覆盖物。如图5所示，将植入物短时地浸入无菌生理溶液中，使其软化并且变得柔软，但覆盖区面积没有任何改变。然后将其放在烧伤部位，其粘附良好，如图6左图所示。在烧伤愈合期间，根据本发明所述植入物停留在其初始位置，逐渐变干，大概一周之后开始从愈合的组织自我脱离。11天之后所述创伤愈合，所述覆盖物完全脱离，如图6的右图所示。

实施例2

按实施例1制备的植入物用于三级烧伤。

小心地割下损坏的组织。从无菌包装中取出脱水移植物，用剪刀将其调整为被处理区域的面积和形状，放在出血的创伤区域上，喷射无菌抗生素溶液。所述异种移植物快速软化并粘附到创伤区域表面，该表面停止出血。所述植入物保持其脱水状态的覆盖区，但是其厚度在水合作用时增加。这导致完美吻合创伤部位。头三天，所述植入物覆盖有薄纱gras敷料作为保护层。8天之后，所述植入物干瘪成一整片痂，并且开始与所述覆盖物下面新形成的皮肤脱离。如图7所示，新的皮肤开始在所述植入物下缓慢形成。在完成愈合之后，形成健康的天然结构的皮肤，有天然的色素形成，并且没有疤痕。

实施例3

人类软骨用作异源移植物

从死亡供体的髋关节摘取软骨，将其反复浸泡在胰蛋白酶溶液和蒸馏水中以除去细胞，然后使用真空将其粘至由多孔玻璃制成的合适形状的多孔基底，使软骨的凹面粘至基底的凸面。将在该基底上的软骨置于过量的由20份(以重量计)甲醇和5份(以重量计)二甲基亚砜组成的溶液中，35℃放置48小时。由此所述无细胞植入物脱水，同时其中所含的胶原在沿面取向的状态下发生部分变性。在该时期之后，将所述无细胞异源移植物从溶液中取出，在室温利用空气流蒸发甲醇。在该步骤结束时，所述移植物含有约13％(以重量计)DMSO、约4％(以重量计)水和少于0.5％(以重量计)的甲醇。在脱离所述多孔基底之后，将所述移植物放在防水无菌袋中，用电子加速器以45kGyβ辐射剂量进行灭菌。使用标准无菌试验来确定无菌。

由此制备的植入物适合用作狗髋关节的实验性软骨替代品，在那里，其滑落至受损软骨上，利用一圈围绕软骨头部茎区的外科缝合材料进行附着。所述植入物进行原位水合，不改变其覆盖区，因此整个期间其相对于患者的关节保持稳定的位置。所述植入物保护软骨避免了融合，由此避免永久失去运动性。而且，所述植入物支持和加速软骨的愈合。当完成愈合时，所述植入物逐渐降解并且被再吸收，直到天然的软骨愈合并且恢复关节功能。

实施例4

猪皮肤作为培养角质形成细胞的基质(用于制备重组皮肤)

将实施例1的无菌无细胞基质从其无菌包装中取出，放在用于细胞培养的培养皿上，并且小心地用少许过量的蒸馏水淹没。所述无细胞异体皮肤水合而不改变其覆盖区，只有其厚度由于水合作用而变为大约两倍。小心地吸取过量的水以防止水合皮肤的任何变形，使剩余的水在室温下在层流通风橱中蒸发。然后经干燥的无细胞异体皮肤用于在受致死辐照的3T3成纤维细胞(它们不会复制，但是它们代谢和产生重要的生长因子)上培养人类角质形成细胞，这产生所谓的重组皮肤(RK)，其含有在根据本发明的异体无细胞皮肤上培养的异源角质形成细胞。如图8清楚所示，角质形成细胞层的结构由培养条件确定。当在浸渍下的植入物表面上进行培养时，产生光滑的、规则的角质形成细胞层。当在植入物/空气界面上进行培养时，角质形成细胞层自身结构化为与包括角质层(stratum corneum)和基膜(stratum basale)的天然表皮类似的形式。因此制备的RK可用于愈合烧伤、下肢溃疡和其它难以愈合的皮肤缺陷。

将RK施用到面对创伤、外侧是皮肤的角质形成细胞(“上侧朝下”)。根据本发明，在培养期间起到培养基质作用的异体皮肤在移植物应用期间发挥用于角质形成细胞转移的支持结构的作用：其保护创伤避免感染、干燥和机械损伤。与简单培养的移植物相比的优点是，较高的耐受性、无需酶促作用(仅使用两个镊子)就与培养皿脱离，且操作简单。与在基于胶原的凝胶上的角质形成细胞相比的优点是，RK的整体一致性与普通皮肤类似、因此可以非常好地附在创伤上，并具有止血作用。当与培养皿脱离时移植物不收缩，脱离期间基质上的角质形成细胞不会像通过酶促脱离那样受到影响。具有异源角质形成细胞的RK对移植物摘取区域的愈合具有刺激作用，可用于愈合深度皮肤烧伤(二级)。

这种细胞生物学覆盖物的主要优点在于，培养的角质形成细胞的刺激作用与生物膜的特性发生组合。当有可能在损伤的10天内通过施用RK防止深度皮肤烧伤加深的情况下，不需要移植，愈合显著加快、不需要摘取区域，也不需要反复的外科手术。带有移植异源角质形成细胞的RK通过愈合进行短时附着，角质形成细胞将它们自身掺入到再生期间的表皮中，增殖、迁移、封闭创伤，并且通过产生各种生长因子来刺激愈合。异体皮肤将保护创伤并为自体角质形成细胞的迁移提供天然基底。一周之内，异源角质形成细胞被患者自身的角质形成细胞所取代。

实施例5

火鸡腱

使用实施例1的方法使从火鸡腿摘取的腱不含细胞，然后将其固定在置于容器中的装置中，其中将其在辊上伸展并且通过附有12kg重量的线进行拉伸。以这种状态将其浸渍在1％氯化铝溶液中，并且在37℃下保持16小时。然后使用无热源的水将所述溶液更换3次，然后用20份(以重量计)丙酮、10份(以重量计)甘油和0.05份(以重量计)氯化钠的混合物换液，并且在12kg重量的伸展装置产生的张力下将所述结构体在这种溶液中保持25小时。然后将所述结构体干燥，并且和伸展装置一起移到预热到70℃的真空干燥室中，在该真空干燥室中在2小时期间除去剩余的溶剂，并且发生胶原的部分热诱导变性。仍然在机械张力和氮气下通过加热至88℃10分钟完成变性过程。将经干燥的、具有3％(以重量计)剩余水含量的无细胞植入物密封在塑料灭菌包装中并且使用电子加速器以15kGy的β辐射进行灭菌。使用标准无菌试验来确认无菌。

再水合期间所述无细胞植入物保持结实并且其直径增加，其长度反而收缩。在植入之后，由于交联密度的降低其进一步水合，其中交联密度可例如定义为聚合物中连接两个链的基团的摩尔分数。这还导致长度逐渐收缩和对周围组织的牵引逐渐提高，这可有利地用于例如重建或矫形外科手术。

实施例6

猪小肠

从新鲜宰杀的幼猪收获小肠，用水清洗，内侧外翻，在45℃反复浸泡在过量的3％十二烷基磺酸钠溶液中。该步骤之后，将所述肠子的一端用夹子密封，并且将另一端与加压至30mm Hg(4kPa)的软化水源连接。超压在40℃的软化水浴中保持24小时。然后用异丙醇和叔丁醇(1∶1，以重量计)的溶液更换所述软化水并且在70℃在醇溶液的内部超压中再保持6小时。最后，在室温下用甲醇更换醇的混合物三次。然后所述无细胞和脱水定向的膜用氮气膨胀并且在层流通风下使用清洁空气流干燥外侧，此后将其平整折叠在两个聚丙烯板之间并包封在防水的灭菌袋中。然后以两个阶段进行灭菌：在第一阶段中使用5kGy的γ辐射进行灭菌，然后使用15kGy剂量的加速电子进行灭菌。所述无菌无细胞膜意图填充有异源成纤维细胞的悬浮液并且植入到患者皮下以使患者的皮下结缔组织再生。

Claims (31)

1.无菌的、基本上脱水且至少部分变性的无细胞基质，其衍生自动物组织并且主要含有胶原，该胶原的原纤维与它们在原始组织中的结构行排列类似，其意图作为人类医学或兽医学中的暂时性植入物，特征在于其在水合作用期间显示出可调的其多个尺度的各向异性变化，所述可调的其多个尺度的各向异性变化能仅仅直接地增加其预定的一个尺度或多个尺度、而同时基本上抑制其它相应多个尺度或一个尺度的增加。

2.权利要求1的无细胞基质，特征在于在水合作用中其多个尺度的各向异性变化期间，两个最大的尺度基本上保持不变或者减小，而最小的尺度随着所述基质体积的增加而一起增加。

3.权利要求2的无细胞基质，特征在于所述暂时性植入物具有基本扁平的形状，其覆盖区由其两个最大的尺度确定，而其厚度由其最小的尺度确定。

4.权利要求1的无细胞基质，特征在于水合作用期间两个较小的尺度增加，而最大的尺度保持基本上不变或者减少。

5.权利要求4的无细胞基质，特征在于所述暂时性植入物具有基本上伸长的形状，其横截面由两个最小的尺度确定，而其长度或高度由其最大的尺度确定。

6.权利要求1的无细胞基质，特征在于所述脱水状态的基质具有低于70％以体积计的孔隙率。

7.权利要求1的无细胞基质，特征在于所述胶原原纤维至少为脱水状态，优先朝向水合作用的线性膨胀系数具有最低值的方向，并且基本上垂直于水合作用的线性膨胀系数具有最高值的方向。

8.权利要求1的无细胞基质，特征在于所述脱水状态的基质具有低于20％以重量计的水含量。

9.权利要求1的无细胞基质，特征在于其还包含添加的软化剂、添加的防腐剂、或添加的杀菌剂。

10.权利要求9的无细胞基质，特征在于所述添加的杀菌剂含有银。

11.权利要求9的无细胞基质，特征在于所述添加的软化剂或添加的防腐剂含有水溶性添加剂。

12.权利要求1的无细胞基质，特征在于当所述基质与合适的液体接触时，其能够以高于1.1的体积膨胀因子进行体积膨胀。

13.权利要求1的无细胞基质，特征在于当所述基质与合适的水成液接触时，其能够最高水合达到其含有超过33％水以重量计的状态。

14.权利要求1～5的无细胞基质，特征在于最高的线性膨胀系数比最低的线性膨胀系数高超过10％。

15.权利要求1～5的无细胞基质，特征在于最高的线性膨胀系数具有高于1.2的值，而最低的线性膨胀系数具有低于1.1的值。

16.权利要求1的无细胞基质，特征在于其干物质主要由蛋白质组成。

17.权利要求16的无细胞基质，特征在于所述蛋白质主要包含胶原。

18.权利要求16的无细胞基质，特征在于其干物质含有70％以重量计～95％以重量计的胶原型蛋白质。

19.权利要求16的无细胞基质，特征在于其干物质除了包含蛋白质之外，还含有少量的脂质化合物。

20.权利要求16的无细胞基质，特征在于其蛋白质组分至少部分地变性。

21.权利要求16的无细胞基质，特征在于至少其蛋白质组分由于与醛或多价阳离子的反应而交联。

22.权利要求1的无细胞基质，特征在于所述动物为哺乳动物

23.权利要求22的无细胞基质，特征在于所述哺乳动物为猪。

24.权利要求1的无细胞基质，特征在于所述动物组织为皮肤、胎盘、心包、硬脑膜、肠、腱或软骨。

25.权利要求2的无细胞基质，特征在于所述暂时性植入物为创伤区域的覆盖物。

26.权利要求1的无细胞基质，特征在于其进一步包含哺乳动物细胞。

27.权利要求1的无细胞基质，特征在于一旦所述植入物完成其功能，其将通过生物降解而自我分解。

28.权利要求25和26的无细胞基质，特征在于所述动物为猪并且培养的哺乳动物细胞为人类自体或异源角质形成细胞。

29.制造权利要求1～26中任一项的无菌、基本上脱水的无细胞基质和衍生自动物组织并且主要包含胶原结构的至少部分变性的基质的方法，特征在于使用包括如下步骤的方法处理所述动物组织：

a)收获组织；

b)在形成无细胞基质期间，通过酶、表面活性剂、酸、碱洗涤剂、低渗水溶液或它们的组合的作用除去细胞；

c)通过除去大量水进行所述无细胞基质的脱水，这期间所述基质维持在一个或多个选定方向的机械张力下；

d)通过升温、有机化合物、多价阳离子或它们的组合的作用使所述无细胞基质中的胶原结构发生部分变性，并且所述基质维持在一个或多个选定方向的机械张力下；或者在所述选定方向上所述基质的尺度维持基本恒定；

e)使用电离辐射对已基本上脱水和至少部分变性的基质进行灭菌。

30.权利要求29的方法，特征在于借助于易混于水的有机化合物进行胶原结构的部分变性，所述易混于水的有机化合物选自脂肪族醇C₁～C₄、脂肪族醛、脂肪族酮和醚。

31.权利要求29的方法，特征在于胶原结构的部分变性在15℃～90℃，的温度进行。

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