HK1117175B - 抗真菌蛋白与其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗真菌蛋白基因和其cDNA序列，其是通过探查丝毛红曲菌 (Monascus pilosus)的全基因组序列和单基因数据库而获得的。所述基因可编码抗真菌蛋白MAFP1。从丝毛红曲菌的培养液中得到分子量约为7kDa的纯化蛋白通过N端蛋白测序和比对分析被确定为MAFP1蛋白。经纯化的MAFP1蛋白可抑制如宛氏拟青霉 (Paecilomyces variotii)和黍蠕孢菌(Helminthosporium panici)等病原菌的生长。通过 PCR试验发现，所述抗真菌蛋白的基因存在于其他红曲霉菌种中，如巴克红曲菌(M. Barkeri)、佛罗里达红曲菌(M.floridanus)、月孢红曲菌(M.lunisporas)、丝毛红曲菌、红色红曲菌(M.ruber)等等。也已经证明，丝毛红曲菌及红色红曲菌的mafp1基因和其 cDNA均具有相同的DNA序列。

Description

抗真菌蛋白与其用途

技术领域

本发明涉及一种抗真菌蛋白与其用途。提供所述蛋白的制备方法。本发明也涉及抗真菌蛋白的序列和编码所述蛋白序列的DNA、含有所述DNA序列的载体、经所述DNA序列转化的细胞以及治疗和/或控制真菌疾病的方法。

背景技术

已知有200多种动物病原真菌和30多种常见的植物病原真菌可对人类的健康和经济造成巨大的冲击。目前，用于控制人类病原真菌的药物主要以小分子为主，例如多烯(polyene)类、唑(azole)类、氟康唑(fluconazole)、两性霉素B(amphotericin B)等等。随着药物滥用数目的增加，真菌菌株的抗药性变得越来越严重。急需研发新的抗真菌药物(参见，Selitrennikoff，C.P，2001，Antigungal proteins，Appl.Envirion.Microbiol.67，2883-2894，和Liu Y.，Ryan，M.E.，Lee，H.M.，Simon，S.，Tortora，G.，Lauzon，C.，Leung，M.K.and Golub，L. M.，2002，A chemically modified tetracycline(CMT-3)is a new antifungalagent.Antimicrob.Agents Chemother.46，1447-1454)。

已知植物、细菌、真菌、昆虫、鸟类和哺乳动物都可以产生抗真菌蛋白(参看，Kaiserer，L.，Oberparieiter，C.，Weiler-，R.Burgstaller，W.，Leiter，E.和Marx，F.，2003，Characterization of the Penicillium chrysogenum antifungal protein PAF.Arch Microbiol.180，204-210)。这些蛋白虽然具有不同的氨基酸序列和四级结构，但分子量小、高碱性以及含有大量半胱氨酸为大多数抗真菌蛋白的主要分子特征(参看，Selitrennikoff等人，2001)。

已研究少数几个丝状真菌的抗真菌蛋白，如巨曲霉(Aspergillus giganteus)的AFP蛋白(参看，Wnendt，S.，Ulbrich，N.和Stahl，U.，1990，Cloning and nucleotide sequence of acDNA encoding the antifungal-protein of Aspergillus giganteus and preliminarycharacterization of the native gene.Nucleic Acids Res.18，3987；Wnendt，S.，Ulbrich，N.和Stahl，U.，1994，Molecular cloning，sequence analysis and expression of the gene encoding anantifungal protein from Aspergillus giganteus.Curr.Genet.25，519-523；Theis，t.，Marx，F.，Salvenmoser，W.，Stahl，U.和Meyer，V.，2005，New insights into the target site and mode ofaction of the antifungal protein of Aspergillus giganteus.Res.Microbilol.156，47-56；以及Theis，T.，Wedde，M.，Meyer，V.和Stahl，U.，2003，The antifungal protein from Aspergillusgiganteus causes membrane permeabilization.Antimicrob.Agents Chemother.47，588-593)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的PAF蛋白(参看，Marx，F.，Hass，H.，Reindl，M.，Stoffler，G.，Lottspeich，F.和Redl B.，1995，Cloning，structural organization and regulation ofexpression of the Penicillium chrysogenum paf gene encoding an abundantly secreted proteinwith antifungal activity.Gene167，167-171；以及Kaiserer等人，2003)和黑曲霉(Aspergillusniger)的Anafp蛋白(参看，Lee，G.D.，Shin，S.Y.，Maeng，C.Y.，Jin，Z.Z.，Kim，K.L和Hahm，KS.，1999，Isolation and characterization of a novel antifungal peptide fromAspergillus niger.Biochem.Biophys.Res.Commun.263，646-651)。以上这些抗真菌蛋白均为分泌蛋白，而且可抑制多种真菌的生长，但对细菌和酵母菌并无影响。这些抗真菌蛋白具有相似的分子特征，但抗真菌蛋白PAF与AFP的氨基酸序列仅有42％的序列相似性(参看，Kaiserer等人，2003)。这些真菌所衍生的抗真菌蛋白主要抑制曲霉菌属(Aspergillus spp.)和镰刀菌属(Fusarium spp.)的真菌(参看，Theis等人，2003；和Kaiserer等人，2003)。PAF蛋白也可以抑制人类和动物的病原真菌，如Abaidia属、被孢霉属(Mortierella spp.)、根毛霉属(Rhizomucor spp.)和根霉属(Rizopus spp.)。这些蛋白不仅可作为植物病原真菌的生物控制药剂，而且具有发展为人类和动物抗真菌药物的潜力(参看，，L.，Papp.T.，Letter，E.Marx，F.，，I.和，C.，2005，Sensitivity of different Zygomycetes to the Penicillium chrysogenum antifungal protein(PAF).J.Basic microbial.45，136-141)。另外，已有文献报导，通过将巨曲霉的AFP蛋白的cDNA转染至水稻中，可以增强水稻对稻热病病原菌稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的抵抗力，因而可将AFP蛋白用于稻热病害的防治(参看，Coca，M.，Bortolotti，C.，Rufat，M.，Penas，G.，Eritja，R.，Tharreau，D.，del Pozo A，M.，Messeguer，J.和San Segundo，B.，2004，Transgenic rice plants expressing the antifungal AFP protein from Aspergillus giganteus showenhanced resistance to the rice blast fungus Magnaporthe grisea.Plant Mol.Biol.54，245-259；以及Moreno，A.B.，Martinez Del Pozo，A.和San Segundo B.2006，Biotechnologically relevant enzymes and proteins:Antifungal mechanism of the Aspergillusgiganteus AFP against the rice blast fungus Magnaporthe grisea.Appl.Microbiol.Biotechnol.72(5)：883-895)。

宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)和淡紫拟青霉(P.lilacinus)是拟青霉(Paecilomyces)菌属中最普遍的菌种，而且最常造成人类感染。眼内炎及心内膜炎是分别由宛氏拟青霉和淡紫拟青霉引起的两种最常见的感染，并且预后极其不良。对于这些感染的标准治疗的失败率约为40％。采用联合疗法或研发新型的抗真菌剂将是未来治疗发展的方向(参看，Ortoneda，M.，Capilla，J.，Pastor，F.J.，Pujol，I.，Yustes，C.，Serena，C.和Guarro，J.(2004)In vitro interaction of approved and novel drugs against Paecilomyces spp.Antimicrob.Agents Chemother.48，2727-2729)。黍蠕孢菌(Helminthosporium panici)是植物环斑病的病原菌。利用生物分子技术达到有效的真菌感染防治并减少真菌疾病对人类健康、经济作物和畜产动物所造成的损失是一个不可忽视的课题。

红曲霉(Monascus)菌种是东亚地区重要的传统发酵真菌，用于制造酒类、红糟(anka)、豆腐(sufu)、酱油等发酵产品。另外，红曲霉菌种也可以产生多种代谢产物及各种酶，如莫那可林K(monacolin K)(参看，Endo，A.，Hasumi，K.和Negishi，S.(1985)Monacolins J and L，new inhibitors of cholesterol biosynthesis produced by Monascus rubber.J.Antibiot.(Tokyo)38(3):420-2)、桔霉素(citrinin)(参看，Hajjaj，H.，klaebe，A.，Goma，G.，Blanc，P J.，Barbier，E.和Francois，J.(2000)Medium-chain fatty acids affect citrininproduction in the filamentous fungus Monascus rubber，Appl.Environ.Microbiol.66(3)：1120-5)、GABA(参看，Su，Y.C.，Wang，J.J.，Lin，T.T.和Pan，T.M.(2003)Productionof the secondary metabolites gamma-aminobutyric acid and monacolin K by Monascus.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.30(1)：41-6)、红色和黄色色素(参看，Carels，M.和Shepherd，D.(1977)The effect of different nitrogen sources on pigment production and sporulation of Monascusspecies in submerged，shaken culture.Can.J.Microbiol.23(10)：1360-72；以及Tseng，Y.Y.，Chen，M.t.和Lin，C.F.(2000)Growth，pigment production and protease activity ofMonascus purpureus as affected by salt，sodium nitrite，polyphosphate and various sugars.J.Appl.Microbiol.88(1)：31-7)以及蛋白酶(参看，Tsai，M.S.，Hseu，T.H.和Shen，Y.S.(1978)Purification and characterization of an acid protease from Monascus kaoliang.Int.J.ProteinRes.12，293-302)，因此在药物研发和工业用酶的应用上具有无穷的潜力。在这些应用中，已知桔霉素具有抑制细菌生长的活性。然而，尚未有文献公开报导红曲霉菌种对真菌生长具有抑制活性。早期通过完成红曲霉的全基因组测序和解码，我们探查到一个可能的抗真菌蛋白基因，由此推测红曲霉菌种可能具有抗真菌活性。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种由红曲霉菌种获得的经分离并纯化的抗真菌蛋白MAFP1。优选的是，红曲霉菌种选自由巴克红曲菌(Monascus barkeris)、佛罗里达红曲菌(Monascus floridanus)、月孢红曲菌(Monascus lunisporas)、丝毛红曲菌(Monascuspilosus)和红色红曲菌(Monascus ruber)组成的群组。更优选的是，红曲霉菌种选自由巴克红曲菌BCRC33309＝ATCC16966、佛罗里达红曲菌BCRC33310＝IMI282587、月孢红曲菌BCRC33640＝ATCC204397、丝毛红曲菌BCRC38072(保存在食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)生物资源保藏与研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)(331Shih-Pin Road，Hsinchu，300Taiwan))、BCRC38093(保存在FIRDI的BCRC中)和BCRC31502＝ATCC16363、红色红曲菌BCRC31523＝ATCC16378、BCRC31533＝ATCC16246、BCRC31534＝ATCC16366、BCRC31535＝ATCC18199、BCRC33314＝ATCC16371和BCRC33323＝ATCC18199组成的群组。

本发明的另一目的在于提供一种包含编码抗真菌蛋白MAFP1的核苷酸序列的经分离并纯化的聚核苷酸。

本发明的另一目的在于提供一种编码抗真菌蛋白MAFP1的重组载体核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种包含本发明的重组载体的重组宿主细胞。

本发明的另一目的在于提供一种包含本发明的抗真菌蛋白和合适载剂的组合物，其中所述蛋白的量足以提供保护而免于真菌疾病。

本发明的另一目的在于提供一种控制植物真菌的方法，所述方法包含对植物施用足以提供保护而免于真菌疾病的量的本发明的抗真菌蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种在其基因组中并入有编码本发明抗真菌蛋白的转基因的转基因生物体。

本发明的另一目的在于提供一种治疗患者的真菌疾病的方法，所述方法包含对所述患者投与足以提供保护而免于真菌疾病的量的本发明抗真菌蛋白。

本发明的又一目的在于提供一种经分离并纯化的引物对，所述引物对可以扩增编码本发明抗真菌蛋白的核苷酸。

本发明的又一目的在于提供一种PCR分析试剂盒，所述PCR分析试剂盒包含本发明的引物对。

以下部分详细描述本发明。在本发明的具体实施方式和权利要求书中可易于发现本发明的其他特征、目的和优势。

附图说明

图1显示红曲霉抗真菌蛋白MAFP1的氨基酸序列。

图2显示丝毛红曲菌的抗真菌蛋白MAFP1、巨曲霉(A.giganteus)的AFP蛋白和P.chrysogenus的PAF蛋白的成熟区域(A)和全长蛋白(B)的序列比对。

图3显示以SFDS PAGE分析经纯化的红曲霉抗真菌蛋白MAFP1。泳道1：标记蛋白，泳道2：经纯化MAFP1蛋白。

图4显示红曲霉抗真菌蛋白MAFP1的抗真菌活性分析。通过双重培养研究经纯化MAFP1蛋白对病原真菌宛氏拟青霉(BCRC33174)和黍蠕孢菌(BCRC35004)的抗真菌能力，并观察真菌的生长情况。(—)MAFP1:无MAFP1的对照组；(+)MAFP1:具有不同量MAFP1蛋白的实验组。A至H分别表示具有0.4μg、0.2μg、0.1μg、0.05μg、0μg、0.8μg、0.64μg和0.32μgMAFP1蛋白的纸盘。

具体实施方式

本发明描述红曲霉菌种的一种新颖基因(下文称为mafp1)，所述基因的特征在于与编码巨曲霉的抗真菌蛋白AFP的基因和编码产黄青霉的PAF的基因相似。已发现，由所述新颖基因编码的蛋白(下文称为MAFP1)具有抗真菌活性并可用于治疗和/或控制真菌疾病。

定义

除非本文另外定义，否则本发明中所用的科技术语将具有所属领域技术人员通常所理解的含义。术语的含义和范畴应清晰明了，然而，在任何含糊不清的情况下，本发明所提供的定义优先于任何字典或外在定义。

关于本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白与核酸化学以及杂交所使用的术语和其技术通常为所属领域熟知的和普遍使用的。除非另外说明，否则通常根据所属领域熟知以及如在本说明书通篇中所引用并讨论的各种通用和更具体文献中所述的常规方法执行本发明的方法和技术。如所属领域通常所实施或如本文所述，根据制造商说明书执行酶促反应和纯化技术。关于本文所述的分析化学、合成有机化学和医药化学所用的术语以及实验程序和技术为所属领域熟知的和普遍使用的。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、调配和传递以及患者治疗。

如根据本发明所使用，除非另外说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：

本文提到的术语“经分离并纯化的蛋白”意思是目标蛋白(1)至少不含通常可与所述蛋白一起被发现的某些其他蛋白，(2)基本上不含相同来源(例如，来自相同菌种)的其他蛋白，(3)由来自不同菌种的细胞表达，(4)已与所述蛋白天然缔合的至少约50％聚核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分离开，(5)不与经分离蛋白所天然缔合的蛋白的部分缔合(通过共价或非共价相互作用)，(6)可操作性地与其非天然缔合的多肽缔合(通过共价或非共价相互作用)或(7)非天然发生。合成起源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任何组合均可以编码所述经分离蛋白。优选的是，经分离蛋白大体上不含在其天然环境中发现的干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的蛋白或多肽或其他污染物。也可以使用所属领域中熟知的蛋白纯化技术，通过分离而使经分离并纯化的蛋白大体上无天然缔合组分。

术语“抗真菌蛋白”意思是具有抗真菌性质的蛋白，例如抑制真菌细胞的生长，杀死真菌细胞或破坏或延迟真菌生命周期的进程，如孢子萌发、孢子形成和交配。

术语“氨基酸序列”意思是天然发生的蛋白分子的氨基酸序列。“氨基酸序列”和类似术语(如“多肽”或“蛋白”)并非意在将氨基酸序列限制为与所引用的蛋白分子缔合的完整、天然氨基酸序列。氨基酸序列包括寡肽、肽、多肽或蛋白序列和其片段或部分，以及天然发生或合成的分子。

术语“生物功能等效物”指的是关于本发明抗真菌蛋白的等效物，其含有与本发明的新颖肽(如MAFP1)展现序列相似性的序列或部分并且呈现与本文所揭示的多肽相同或相似的功能特性(包括抗真菌活性)。例如，本发明抗真菌蛋白的生物功能等效物在氨基酸序列中可能存在一些变化，所述氨基酸序列与所述蛋白的氨基酸序列不同但基本上一致，并且与本文所阐述的蛋白的性质基本一致(只是一致性程度或大或小)。

本文提到的术语“经分离并纯化的聚核苷酸”意思是目标聚核苷酸(1)不与目标聚核苷酸所天然缔合的所有或部分其他聚核苷酸缔合(共价地或非共价地)，(2)与其非天然缔合的分子缔合，或(3)天然中不发生与任何其他聚核苷酸的缔合。所述聚核苷酸可为合成起源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任何组合。优选的是，本发明的经分离并纯化的聚核苷酸包含单一编码区。虽然聚核苷酸包括单一编码区，但其仍可以含有不对聚核苷酸的功能造成不利影响的其他核苷酸。例如，5′和3′非翻译区可以含有不同数目的核苷酸。优选的是，其他核苷酸在单一编码区以外。

术语“核苷酸序列”意思是长度为至少10个碱基的单链或双链核酸聚合物。在某些实施例中，包含聚核苷酸在内的核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的经修饰形式。所述修饰包括碱基修饰(如溴尿嘧啶核苷和次黄嘌呤核苷衍生物)、核糖修饰(如2′，3′-二脱氧核糖)和核苷酸间键合修饰(如二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)和磷醯胺酸酯(phosphoroamidate))等。本发明的核苷酸序列可包括用于检测分析的标记，包括放射性同位素标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。

术语“载体”是指用于将编码信息转移到宿主细胞中的任何分子(例如，核酸、质粒、附加体或病毒)。此术语也包括“重组载体”、“表达载体”或“表达构建体”。术语“表达载体”或“表达构建体”指的是适用于转化宿主细胞并且含有引导和/或控制(结合宿主细胞)一个或一个以上所操作性连接的异源编码区的表达的核苷酸序列的载体。表达构建体可包括(但不限于)影响或控制转录、翻译和(如果存在内含子)与内含子操作性连接的编码区的RNA剪接的序列。载体优选为可自主复制和表达其所连接核酸的载体。

术语“宿主细胞”意思是已经用核酸序列转化，或能够经核酸序列转化从而表达所关注的选定基因的细胞。此术语包括母细胞的后代，而不管后代与最初母细胞的形态或遗传标记(genetic mark-up)是否相同，只要存在所选基因即可。

术语“转化”意思是细胞遗传特征的改变，当细胞经修饰而含有新DNA时，称其为经转化的。例如，当细胞通过转染、转导或其他技术而自其自然状态进行遗传性修饰时，称其为经转化的。

术语“转基因生物体”指的是其中生物体的一个或一个以上(优选为基本上全部)细胞中引入有外源性基因的任何生物体。基因借助于周密遗传操作(例如通过微注射或重组载体感染)引入细胞前驱体中而直接或间接引入细胞中。术语遗传操作不仅包括传统的杂交育种或体外受精，而且还包括引入可在染色体中整合或可在染色体外复制DNA的重组DNA分子。转基因动物包括动物或来源于转基因动物的器官、组织或细胞。转基因植物包括植物、植物后代、转基因植物的种子或来源于经转化植物细胞或原生质体的细胞。

术语“一致性”指的是两个或两个以上多肽分子或者两个或两个以上核酸分子之间如通过比较其序列而确定的序列关系。“一致性”度量两个或两个以上序列中较小者之间一致匹配的百分比。

术语“相似性”在所属领域中关于相关概念使用；然而，与“一致性”相比，“相似性”是度量包括一致匹配和保守性替换匹配的关联性。

除非本文另外要求，否则单数术语包括复数形式，而复数术语包括单数形式。

红曲霉抗真菌蛋白和其基因

本发明的一个目标在于提供一种经分离并纯化的来自红曲霉菌种的抗真菌蛋白。本发明的另一目标在于提供包含编码所述抗真菌蛋白的核苷酸序列的经分离并纯化的聚核苷酸。通过探查红曲霉全基因组数据库并进行比较分析，发现编码抗真菌蛋白的红曲霉抗真菌蛋白和基因。

使用tblastn将巨曲霉的抗真菌蛋白AFP(保藏号：embICAA37523.1I)和产黄青霉的PAF(保藏号：gbIAAA92718.1|)二者的氨基酸序列与来自丝毛红曲菌BCRC38072全基因组序列数据库(食品工业发展研究所(FIRDI)内部数据库)的单基因数据库的序列进行比较。BLAST程序(包括blastp、blastn、blastx、tblastn、tblastx和类似程序)可由美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)和其他来源(BLAST Manual，Altschul等人，NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894)公开获得。获得与AFP和PAF的蛋白序列具有约30％相似性的单基因重叠群(unigene contig)，并由Vector NTI(InforMax)软件进行分析以供开放阅读框(ORF)预测。由ORF预测识别279个碱基对cDNA(SEQ ID NO：1)，可将其翻译为由92个氨基酸(SEQ ID NO：2)组成的蛋白。所述抗真菌蛋白命名为MAFP1。发现以SEQ ID NO：2显示的序列具有单肽(位置1-18)、前肽(位置19-34)和成熟蛋白(位置35-92)(见图1)。表明可由红曲霉细胞分泌出此蛋白。

使用blastn将如SEQ ID NO：l所示的序列与红曲霉全基因组数据库进行比较，并获得抗真菌蛋白的基因组DNA序列(SEQ ID NO：4)，命名为mafp1基因。使用blastn将如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示的序列与NCBI DNA数据库进行比较，并使用tblastn将如SEQ ID NO：2所示的序列与NCBI和Swiss-Prot蛋白数据库进行比较来识别与MAFP1的DNA和蛋白序列相似的已公开序列。使用Vector NTI软件的比对程序来比对MAFP1(SEQ ID NO：2)、巨曲霉的AFP(保藏号：embICAA37523.1I)和产黄青霉的PAF(保藏号：gbIAAA92718.1|)的氨基酸序列，从而找到氨基酸序列的高度保守序列(AAXGXVAXP)(见图2(B))。已发现在单肽和前肽区域中存在高度保守的区域。MAFP1的成熟蛋白序列(SEQ ID NO：3)与巨曲霉的AFP和产黄青霉的PAF的氨基酸序列分别具有29％和31％的相似性。成熟MAFP1序列中位置8、15、28、36、43和54处的六个半胱氨酸为真菌源的抗真菌蛋白的高度保守残基。通过blastn比较，在NCBI nr数据库的DNA序列中未发现与MAFP1的cDNA(SEQ ID NO：1)和基因组DNA序列(mafp1，SEQ ID NO：4)相似的DNA序列。因此，可推断：MAFP1为新颖蛋白，并且mafp1为新颖基因。

本发明的保护范围涵盖与本发明的抗真菌蛋白生物功能等效的肽、多肽和蛋白，这些肽、多肽和蛋白包括在抗真菌蛋白基本序列中含有保守氨基酸变化的氨基酸序列。在所述氨基酸序列中，基本序列中的一个或一个以上氨基酸经其他氨基酸替换，所述其他氨基酸的电荷和极性与天然氨基酸的相似，即为保守性氨基酸替换，此替换导致沉默变化(silent change)。

在基本多肽序列内氨基酸的取代基可选自天然发生氨基酸所属类别的其他成员。

氨基酸可分为以下四类：(1)酸性氨基酸、(2)碱性氨基酸、(3)中性极性氨基酸和(4)中性非极性氨基酸。所述各类中的代表性氨基酸包括(但不限于)(1)酸性(带负电)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电)氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)中性非极性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。

可通过用属于所述类别中一类的一个氨基酸替换属于同一类的另一氨基酸而使基础蛋白序列发生保守氨基酸改变。抗真菌蛋白的生物功能等效物可具有20个或更少的保守氨基酸改变、更佳为10个或更少的保守氨基酸改变，最佳为5个或更少的保守氨基酸改变。因此，编码核苷酸序列(基因、质粒DNA、cDNA或合成DNA)将具有相应的碱基替换，从而使其可编码抗真菌蛋白的生物功能等效形式。

因此，本文涵盖的生物功能等效肽、多肽和蛋白与本发明抗真菌蛋白的基础氨基酸序列或其中的相应部分应具有约80％或更高的序列相似性，优选为85％或更高的序列相似性，最优选为约90％或更高的序列相似性。

虽然本发明的抗真菌多肽优选具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其生物功能等效物，但具有与此抗真菌多肽相同或相似的抗真菌活性的所述序列的片段和变异体也属于本发明。因此，SEQ ID NO：2中的8个或8个以上氨基酸的连续序列可展现此活性。

SEQ ID NO：2片段可为其中自N端、C端、多肽中间或其组合缺失一个或一个以上氨基酸的截短形式。所述片段可以是SEQ ID NO：2的天然发生突变体或合成突变体，并且应保留SEQ ID NO：2的抗真菌活性。

SEQ ID NO：2的变异体包括在天然或合成序列中已插入一个或一个以上氨基酸的形式。所述变异体也可以是SEQ ID NO：2的天然发生突变体或合成突变体，并且应保留SEQID NO：2的抗真菌活性。

上述形式的组合，即含有氨基酸缺失和添加两者的抗真菌蛋白形式，也属于本发明。其中也可以存在氨基酸替换。

本发明所涵盖的SEQ ID NO：2的片段和变异体与SEQ ID NO：2的相应区域优选应具有约70％或更高的序列相似性，更优选为约80％或更高的序列相似性，最优选为约90％或更高的序列相似性。

适用于本发明的本发明抗真菌蛋白的其他生物功能等效形式包括多肽或其如上文所述的生物功能等效物与其他肽、多肽或蛋白的结合物，从而形成展现与本发明抗真菌蛋白相同、相似或更高抗真菌活性的融合产物。

生物功能等效物也包括与抵抗本发明抗真菌蛋白的抗体(包括单克隆与多克隆抗体)反应(即，特异性地与抗体结合)并且展现相同或相似抗真菌活性的肽、多肽和蛋白。

用于产生多肽或蛋白的生物功能等效物的方法包括所属领域已知的任何合适方法，如直接化学合成或在如微生物、植物和动物系统的异源生物系统中合成；组织培养；细胞培养；或活体外翻译系统。用于改变氨基酸序列的方法为所属领域所熟知，如基因工程技术(例如定点突变)，从而改变核苷酸序列或氨基酸序列和重组蛋白的表达。

本发明不仅包括如SEQ ID NO：1或4所示的DNA序列，而且还包括生物功能等效核苷酸序列。短语“生物功能等效核苷酸序列”表示编码展现与SEQ ID NO：2相同或相似抗真菌活性的肽、多肽和蛋白的DNA和RNA，包括染色体组DNA、质粒DNA、cDNA、合成DNA和mRNA核苷酸序列，即，当以功能可操作性方式引入宿主细胞中以使其被表达时，其产生展现出足以抵抗所述细胞上的病原真菌的水平的抗真菌活性的肽、多肽或蛋白。

本发明的生物功能等效核苷酸序列包括编码基础抗真菌蛋白序列中的保守性氨基酸变化从而在其中产生沉默变化的核苷酸序列。与编码野生型抗真菌蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID NO：2)相比，所述核苷酸序列含有相应的碱基替换。

除编码基础抗真菌蛋白序列中的保守性氨基酸变化的核苷酸序列以外，本发明的生物功能等效核苷酸序列包括含有其他碱基替换、添加或缺失的核苷酸序列。所述核苷酸序列包括含有与SEQ ID NO：1或4中所含相同的内在遗传信息的核苷酸，并且所述核苷酸编码赋予宿主细胞和生物体上与SEQ ID NO：2相同或相似的真菌抗性的肽、多肽或蛋白。所述核苷酸序列可以称为SEQ ID NO：1或4中所示DNA的“遗传等效修饰形式”，且可由本文所述的方法来识别。

在cDNA、质粒DNA、染色体组DNA、合成DNA或编码本发明抗真菌蛋白的其他核苷酸(如SEQ ID NO：1)中发生的突变优选保存编码序列的阅读框。此外，所述突变优选不产生可杂交生成二级mRNA结构(其会不利影响mRNA翻译，如环或发夹)的互补区域。

虽然可预定突变位点，但无需预定突变本身的性质。例如，为选择给定位点的突变的最佳特征，可在目标密码子处进行随机突变。或者，可在特定基因座处通过合成含有突变序列的寡核苷酸来引入突变，突变序列侧翼有限制位点从而使得与天然cDNA序列片段连接。连接之后，所得重构核苷酸序列编码具有所需氨基酸插入、替换或缺失的衍生形式核酸序列。在每种情况下，均可通过(例如)实例4中所述的方法对所表达的突变体针对所需抗真菌活性进行筛选。

有用遗传等效修饰形式的SEQ ID NO：1或4的DNA的具体实例包括具有展现与SEQ ID NO：1或4的高度序列一致性的核苷酸序列的DNA。此一致性范围可为与SEQ IDNO：1或4的DNA或其相应部分具有约70％或更高序列一致性，更优选为约80％或更高序列一致性，最优选为约90％或更高序列一致性。

可使用传统的DNA-DNA或DNA-RNA杂交技术或通过使用聚合酶链反应(PCR)方法扩增容易地分离所述遗传等效修饰形式。所述形式在通过传统转化技术引入对病原真菌具有正常敏感性的宿主细胞中时应具有赋予对所述病原菌的抗性的能力。

抗真菌蛋白的片段和变异体(如SEQ ID NO：2)可由cDNA、质粒DNA、染色体组DNA、合成DNA或mRNA来编码。所述核酸与具有SEQ ID NO：1或4中所示核苷酸序列的DNA或其相应mRNA的相应区域或部分应具有约70％或更高的序列相似性，优选为约80％或更高的序列相似性，且最优选为约90％或更高的序列相似性。

在本发明中，与具有SEQ ID NO：1或4中所示核苷酸序列的DNA生物功能等效的核酸包括：

通过自然或人工突变(如部分核苷酸缺失、插入、添加等等)改变长度的DNA，使得在将SEQ ID NO：1或4的全长视为100％时，生物功能等效序列具有SEQ ID NO：15长度的约60％至约120％的近似长度，优选为其约80％至约110％；或

含有部分(通常为全长的约20％或更少，优选为约10％或更少，更优选为约5％或更少)自然或人工突变的核苷酸序列，使得所述序列编码不同氨基酸，但其中所得多肽保留本发明抗真菌多肽(如SEQ ID NO：2)的抗真菌活性。以此方式产生的经突变DNA通常编码与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有约70％或更高、优选约80％或更高且更优选约90％或更高序列一致性的多肽。

在本发明中，用于产生人工突变的方法不受特定限制，且可由所属领域中的任何常规方法产生所述突变。由任何所述方法产生的本文所公开的DNA序列的生物功能等效物可通过使用实例中所述的技术分析其所编码的肽、多肽或蛋白来选择。

由于遗传密码的简并性，即对于蛋白中天然发生的大多数氨基酸而言存在一个以上密码子，因此在实施本发明时可使用含有与本发明的DNA基本相同的遗传信息且编码与由SEQ ID NO：1或4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列大体相同的氨基酸序列的其他DNA(和RNA)序列。此原则也应用于本文所论述的任何其他核苷酸序列。

本发明DNA的生物功能等效形式也包括经设计用于增强在特定宿主细胞中的表达的合成DNA。宿主细胞通常呈现优选的密码子使用模式，因而经设计用于增强在特定宿主中的表达的合成DNA应反映密码子在宿主细胞中的使用模式。

适用于本发明的SEQ ID NO：1或4的DNA的其他生物功能等效形式包括经修饰以编码与其他肽、多肽或蛋白的结合物从而编码与其之融合产物的DNA生物功能等效形式。

虽然编码抗真菌蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID NO：2)的一个实施例由SEQ ID NO：1或4显示，但应了解，本发明也包括与SEQ ID NO：1或4的序列和其互补序列杂交并且编码与本发明的抗真菌蛋白具有相同或相似抗真菌活性的肽、多肽或蛋白的核苷酸序列。所述核苷酸序列优选为在中等至高严格度的条件下与SEQ ID NO：1或4或其互补序列杂交。

如果上文所述的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：2的抗真菌作用具有约25％或更小不同的肽、多肽或蛋白时，则认为所述核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1或4的DNA大体上等效的生物功能。

载体和宿主系统

本发明的另一目的在于提供一种含有如SEQ ID NO：1或4中所示的核酸序列的载体。为表达生物活性MAFP1，可将编码MAFP1或生物功能等效物的核酸序列插入适当表达载体中，即含有用于转录和翻译所插入的编码序列所必需的元件的载体。根据本发明，可使用所属领域技术人员熟知的方法来建构含有编码MAFP1的序列和适当转录和翻译控制元件的表达载体。所述方法包括活体外重组DNA技术、合成技术和活体内基因重组。一般选择载体以在所采用的特定宿主细胞中发挥作用(即，载体与宿主细胞机器相容以使得可发生基因扩增和/或基因表达)。

本发明的另一目的在于提供一种经如SEQ ID NO：1或4中所示的核酸序列或含有此序列的表达载体转化的宿主细胞。根据本发明，可使用多种含有并表达编码MAFP1的序列的宿主系统。所述宿主系统包括(但不限于)微生物，如经重组噬菌体、质粒或柯斯质粒(cosmid)DNA表达载体转化的细菌；经酵母表达载体转化的酵母；经病毒表达载体感染的昆虫细胞系统；经病毒表达载体或经细菌表达载体转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。在载体被建构并且将编码MAFP1的核酸序列插入载体中的适当位点后，可将所完成的载体插入合适宿主细胞中以供扩增和/或多肽表达。以表达载体使MAFP1蛋白转化至所选宿主细胞中可通过熟知方法来完成，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、微注射、脂质转染、二乙氨基葡聚糖(DEAE-dextran)转染法或其他已知技术。所选方法将在部分程度上随所用宿主细胞类型而改变。当在适当条件下培养时，宿主细胞可合成MAFP1蛋白，而随后MAFP1蛋白可自培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接自产生MAFP1蛋白的宿主细胞中收集(如果不被分泌出去)。适当宿主细胞的选择将取决于多种因素，如所希望的表达水平、为达成活性而希望的或必需进行的多肽修饰(如糖基化作用或磷酸化作用)和折叠成生物活性分子的简易性。

效用

根据本发明，令人惊奇地发现MAFP1蛋白为分泌蛋白，且可有效抑制病原真菌的生长。因此，本发明的MAFP1蛋白可用于治疗、控制和/或预防动物、植物或微生物的真菌疾病。可直接通过向受检者投与抗真菌蛋白或通过以包含编码抗真菌蛋白的DNA分子的载体转化受检者以使得在受检者中表达所编码的抗真菌蛋白来使用抗真菌蛋白，从而提供保护而免于真菌疾病。

除了本发明抗真菌蛋白的所述用途以外，本文所涵盖的核酸序列也具有各种其他用途。例如，其在核酸杂交实施例中也可作为探针或引物。因此，预期包含由与SEQ ID NO：1或4的14个核苷酸长的连续DNA片段的序列相同或与其互补的至少14个核苷酸长的连续序列组成的序列区域的核酸片段将发现特殊效用。更长的连续的一致或互补序列，例如约20、30、40、50、100、200bp等的序列(包括所有中间长度和可达且包括409个碱基对的全长序列)，也将用于某些实施例中。

所述核酸引物特异性扩增编码抗真菌蛋白的序列或与其杂交的能力将使其可用于检测给定样品中编码抗真菌蛋白序列的存在与否。然而，预见其他用途，包括使用序列信息制备突变物种或引物以用于制备其他遗传结构。

抗真菌组合物

本发明也提供包含本发明抗真菌蛋白的抗真菌组合物，所述组合物特别适用于治疗、控制和/或预防真菌疾病。所述组合物可含有合适载剂、稀释剂、溶剂、惰性物质或其他添加剂，并且视情况含有其他抗真菌活性物质、赋形剂、助剂、肥料或生长调节剂。

本发明的抗真菌组合物可由所属领域已知的方式来制造，例如借助于包含以下步骤的常规方法：混合、溶解、粒化、制造糖衣药丸、研磨、乳化、包囊、包埋和/或冻干步骤。

抗真菌组合物可通过借助于多种途径投至动物体内而用于抑制病原真菌生长或将其杀死，所述投药途径包括(但不限于)经口、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、经肠、局部、舌下或直肠方式，或通过使用标准农业技术(例如，喷雾或种子处理)将组合物直接应用于植物或植物环境以使得组合物接触病原真菌。

如前所述，本发明的抗真菌蛋白可与其他包括展现抗真菌活性的其他肽、多肽和蛋白在内抗真菌剂组合使用，从而提供更广泛范围的活性(即，控制其他的病原菌)或提供用于控制相同病原真菌的多种作用模式。

本文所涵盖的抗真菌组合物也包括可产生本发明抗真菌多肽的宿主细胞(如细菌和真菌细胞)形式的抗真菌组合物。

转基因生物体

以所述方式分离的cDNA可转移至适当转化/表达载体中以供引入宿主细胞中。另一方面，本发明的抗真菌基因可用于产生表达编码本发明新颖抗真菌蛋白的核酸片段的转基因生物体。产生转基因生物体的方法为所属领域所熟知，如通过微注射或重组载体感染。所述方法通常包含以含有操作性连接至编码MAFP1抗真菌蛋白的编码区的启动子的DNA片段转化合适的宿主细胞。所述编码区通常操作性连接至转录终止区，从而使得启动子能够驱动编码区在细胞中的转录，并由此为所述细胞提供活体内产生重组蛋白的能力。

转基因生物体可表达编码一个或一个以上本文所公开的新颖抗真菌蛋白的基因或基因片段。通过以编码MAFP1抗真菌多肽(如SEQ ID NO：2)的重组核酸序列转化合适的宿主细胞(如植物细胞)，经编码抗真菌蛋白的表达可导致形成对真菌展现抗性的生物体。如本文所用的术语“转基因生物体”意指其中已并入有DNA序列的生物体，所述DNA序列包括(但不限于)通常可能不存在的基因、通常不转录为RNA或翻译为蛋白(“经表达”)的DNA序列，以及想要引入未转化生物体中的任何其他基因或DNA序列(如通常可存在于未转化生物体中但想要经基因工程改造或改变表达的基因)。

一种以上的转基因将被并入经转化宿主植物细胞的基因组中。当将一种以上编码MAFP1抗真菌蛋白的DNA片段并入所述生物体的基因组中时，情况就是这样。在某些情况下，可能需要在经转化转基因生物体中并入且稳定表达一种、两种、三种、四种或甚至更多种的抗真菌蛋白(天然的或经重组工程改造的)。

也可能需要向转基因生物体的基因组中并入其他DNA片段，其中所述DNA编码与所公开的抗真菌蛋白非同源的其他抗真菌蛋白或改良产物质量或生物体性能的各种其他蛋白。因此，由所述DNA编码的其他类型蛋白可包括抗细菌、抗病毒或杀昆虫蛋白。

转基因生物体可为任何方便的生物体，如非人类哺乳动物、植物或微生物，例如用于实验室测试程序的，如啮齿动物，例如小鼠或大鼠，和例如用于农业的，如水稻、马铃薯和烟草。然而，显然本发明可应用于对MAFP1显示抑制作用的真菌具有易感性的每种生物体。

引物

在某些实施例中，有利的是使用寡核苷酸引物。对所述引物的序列进行设计以便利用PCR技术来检测、扩增或突变抗真菌蛋白基因的规定片段。可基于SEQ ID NO：1或4中所示DNA的核苷酸序列设计用于PCR的引物和用于杂交筛选的探针。引物优选应不具有自身互补序列，且在其3′端也不具有互补序列，从而防止形成二聚体。引物可含有限制位点。引物经退火至DNA，且进行足够多的PCR循环，从而产生易于通过凝胶电泳和染色观测的产物。引物长度通常为至少14个核苷酸，一般长度为至少20个核苷酸，优选长度为至少24个核苷酸，更优选长度为28个核苷酸。所述引物能够特异性启动编码与SEQ ID NO：2具有相同或相似抗真菌活性的抗真菌多肽或蛋白的基因。来自其他物种的相关抗真菌蛋白基因的片段也可使用所述引物通过PCR来扩增。经扩增的片段可经纯化并插入适当载体中，且通过此项技术中已知的常规方式繁殖。

提供以下实例以有助于所属领域技术人员实施本发明。即使如此，实例不应理解为过度限制本发明，因为所属领域的一般技术人员在不偏离本发明发现的精神或保护范围的情况下可对本文所述实施例进行修改和变动。

实例

材料

用于以下实例的红曲霉菌株选自台湾生物资源保藏与研究中心(BCRC)中保存的红曲霉菌株：丝毛红曲菌(BCRC38072、BCRC38093和BCRC31502)、巴克红曲菌(BCRC33309)、佛罗里达红曲菌(BCRC33310)、月孢红曲菌(BCRC33640)、红色红曲菌(BCRC31534、BCRC31523、BCRC31535、BCRC33314、BCRC33323和BCRC31533)、高梁红曲菌(M.kaoliang)BCRC31506＝CBS302.78、紫红曲菌(M.purpureus)(BCRC31541＝ATCC16379、BCRC33325＝IFO30873、BCRC31615＝DSM1379、BCRC31499＝ATCC16360＝ATCC26311和BCRC31542＝ATCC16365＝ATCC16426)以及血红红曲菌(M.sanguineus)BCRC33446＝ATCC200613。

用于测试红曲霉菌株或经分离并纯化的抗真菌蛋白MAFP1的抗真菌活性的真菌菌株选自黍蠕孢菌BCRC35004和宛氏拟青霉BCRC33174。

将真菌菌株接种到PDA(Patato Dextrose Agar，Difico Co.)培养板上，在25℃下培养7-14天。

实例1红曲霉菌种中的mafp1基因分布

为观察各种红曲霉菌种中是否存在mafp1基因(SEQ ID NO：1)，使用引物设计软件(Vector NTI(InforMax)Primer Design)设计用于扩增mafp1基因的引物。引物可经配对为3组：(1)引物H160-5F(SEQ ID NO：6)和引物H160-3R(SEQ ID NO：7)，可用于扩增mafp1基因的全长序列；(2)引物H160-5S(SEQ ID NO：8)和引物H160-3R，可用于扩增编码包含前肽和成熟MAFP1区域的序列的核苷酸序列；以及(3)引物H160-5P(SEQ ID NO：9)和引物H160-3R，可用于扩增编码包含成熟MAFP1区域的序列的核苷酸序列。

在25℃下，将红曲霉菌株在YM培养基(7％甘油、3％葡萄糖、3％MSG(L-谷氨酸一钠)、1.2％多聚蛋白胨(polypetone)、0.2％NaNO₃和0.1％MgSO₄-7H₂O，pH6.0)中培养9天。通过真空过滤经3M滤膜分离真菌体和培养液体。使用合适量真菌体通过常规苯酚提取法获得真菌的染色体DNA。

使用上段中提到的3个引物对进行PCR扩增来检测红曲霉菌种中是否存在mafp1基因。使用由红曲霉菌株获得的100ng染色体DNA作为PCR模板。PCR反应溶液包含0.2μl10nM dNTP、2.5μl10X PCR缓冲液、5皮摩尔(pmole)正向引物和反向引物以及5UTaq酶。用于扩增mafp1基因的PCR条件为(1)94℃下5分钟；(2)30次循环：94℃下40秒钟、55℃下40秒钟以及72℃下30秒钟；(3)72℃下3分钟；以及(4)保持在4℃下。PCR扩增结果显示于表1中。

表1.对红曲霉菌株中mafp1基因的PCR扩增检测

 

菌株	mafp1基因a
		丝毛红曲菌BCRC38072	+
丝毛红曲菌BCRC38093	+
		丝毛红曲菌BCRC31502	+
红色红曲菌BCRC31523	+
		红色红曲菌BCRC31533	+
红色红曲菌BCRC31534	+
		红色红曲菌BCRC31535	+
红色红曲菌BCRC33314	+
		红色红曲菌BCRC33323	+
巴克红曲菌BCRC33309	+
		佛罗里达红曲菌BCRC33310	+
月孢红曲菌BCRC33640	+
		高梁红曲菌BCRC31506
紫红曲菌BCRC31542
		紫红曲菌BCRC31499
紫红曲菌BCRC31541
		紫红曲菌BCRC31615
紫红曲菌BCRC33325
		血红红曲菌BCRC33446

a：“+”表示所有三个引物对均可用于扩增mafp1基因片段；“-”表示所有三个引物对均不可用于扩增mafp1基因片段。

结果显示在巴克红曲菌BCRC33309、佛罗里达红曲菌BCRC33310、月孢红曲菌BCRC33640、丝毛红曲菌(BCRC38072、BCRC38093和BCRC31502)和红色红曲菌(BCRC31523、BCRC31533、BCRC31534、BCRC31535、BCRC33314和BCRC33323)中存在mafp1基因。在高梁红曲菌BCRC31506、紫红曲菌(BCRC31499、BCRC31542、BCRC31541、BCRC31615和BCRC33325)和血红红曲菌BCRC33446中未发现mafp1基因。表明如巴克红曲菌、佛罗里达红曲菌、月孢红曲菌、丝毛红曲菌s和红色红曲菌的红曲霉菌种可具有抗真菌活性。

实例2各种红曲霉菌种中其cDNA的mafp1基因的序列比较

mafp1基因的克隆和测序

在25℃下，将红曲霉菌株在YM培养基(7％甘油、3％葡萄糖、3％MSG(L-谷氨酸一钠)、1.2％多聚蛋白胨、0.2％NaNO₃和0.1％MgSO₄-7H₂O，pH6.0)中培养9天。通过真空过滤经3M滤膜分离真菌体和培养液体。使用合适量真菌体通过习知苯酚提取法获得真菌的染色体DNA。使用引物H160-5F和H160-3R进行PCR扩增。使用由红曲霉菌株获得的100ng染色体DNA作为PCR模板。PCR反应溶液包含0.2μl10nM dNTP，2.5ul10X PCR缓冲液、5皮摩尔正向引物和反向引物以及5U Taq酶。用于扩增mafp1基因的PCR条件为(1)94℃下5分钟；(2)30次循环：94℃下40秒钟、55℃下40秒钟以及70℃下30秒钟；(3)72℃下3分钟；以及(4)保持在4℃下。mafp1基因全长序列的经PCR扩增核苷酸片段经纯化并克隆至pGEM-T载体(Promega)中。提取质粒DNA以供测序。

mafp1cDNA的克隆和测序

在25℃下，将红曲霉菌株在YM培养基(7％甘油、3％葡萄糖、3％MSG(L-谷氨酸一钠)、1.2％多聚蛋白胨、0.2％NaNO₃和0.1％MgSO₄-7H₂O，pH6.0)中培养9天。通过真空过滤经3M滤膜分离真菌体和培养液体。使用合适量真菌体通过RiboPure^TM-酵母试剂盒(Ambion)获得真菌的总RNA。使用Improm-II^TM逆转录系统试剂盒(ReverseTranscription system kit，Promega)制备第一链cDNA。在PCR中使用mafp1基因的特异性引物对(H160-5F和H160-3R)来扩增全长mafp1cDNA片段。使用合适量的第一链cDNA作为PCR模板。PCR反应溶液包含0.2μl10nM dNTP、2.5μl10X PCR缓冲液、5皮摩尔H160-5F和H160-3R以及5U Taq酶。用于扩增mafp1cDNA的PCR条件为(1)94℃下5分钟；(2)30次循环：94℃下40秒钟、55℃下40秒钟以及72℃下1分钟；(3)72℃下3分钟；以及(4)保持在4℃下。将经扩增PCR产物纯化并克隆至pGEM-T载体(Promega)中。提取质粒DNA以供测序。

各种红曲霉菌种中其cDNA的mafp1基因的序列比较结果显示于表2中。

表2 红曲霉菌种中的mafp1基因和其cDNA的序列相似性分析

结果显示，丝毛红曲菌BCRC38093、丝毛红曲菌BCRC31502和红色红曲菌BCRC31533中的mafp1基因和其cDNA的序列与丝毛红曲菌BCRC38072的mafp1基因和其cDNA的序列具有100％的序列相似性。证明所有这些红曲霉菌株具有相同的mafp1基因，并且所转录的mRNA相同。可推断，所述菌株可产生相同的MAFP1蛋白。

实例3 病原菌双重培养分析

为证实红曲霉真菌的抗真菌活性，将两种红曲霉菌种(丝毛红曲菌BCRC38072和BCRC38093)与病原真菌(黍蠕孢菌BCRC35004)的圆形真菌块(0.5cm直径)分置于一PDA平板的两侧，并在28℃下培养。观察病原真菌生长被抑制的情况。初步结果显示两种菌株均可抑制黍蠕孢菌BCRC35004的生长。

丝毛红曲菌BCRC38093是丝毛红曲菌BCRC38072的突变体。两者具有相同的mafp1序列(如表2所示)，并且具有相同的抗真菌活性。在以下纯化实例中使用丝毛红曲菌BCRC38093。

实例4 红曲霉抗真菌蛋白(MAFP1)的纯化、N端测序和抗真菌活性分析

MAFP1的纯化

将在25℃下培养9天之后的400mL丝毛红曲菌BCRC38093培养液利用0.22μm的滤膜以转速4,500rpm离心分离以去除杂质。使用30kDa的滤膜处理经离心的培养基，并收集含有小于30kDa分子的溶液，调节至pH6.6。将10ml的CM Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)树脂与40ml蛋白溶液于室温下混合16小时。将混合物填充到空色谱柱中。将未结合的蛋白冲洗出来。利用100ml的溶液A(10mM磷酸钠缓冲液中的25mM NaCl，pH6.6)洗提色谱柱，并使用具有不同比例的溶液A与溶液B(10mM磷酸钠缓冲液中的1M NaCl，pH6.6)的溶液洗提所述蛋白。溶液A的浓度梯度为由95％、80％、75％、50％至0％。每一梯度均使用100ml溶液，并将所洗提出的各部分独立分装至15ml试管内。

从各试管取1ml溶液用TCA沉淀，并进行SDS-PAGE分析。MAFP1蛋白的分子量约为7kDa。将含有MAFP1蛋白的溶液收集在一个试管内。利用3kDa滤膜对溶液进行低速(2,000rpm)离心。收集含有大于3kDa的蛋白的溶液，并以1kDa滤膜进行浓缩和脱盐。使用经纯化的MAFP1蛋白进行病原菌拮抗分析与蛋白N端测序。

N端测序

使经纯化的MAFP1溶液经TCA沉淀，并使用15％的丙烯酰胺SDS-PAGE进行分析。使用不同浓度的溶菌酶作为蛋白定量参考。电泳后，将蛋白自凝胶转移至PVDF膜上，并以0.1％考马斯亮兰(Coomassie Brilliant Blue)R-250染色(见图3)。将MAFP1蛋白色带切下，并以甲醇脱色。用双蒸水(ddH₂O)冲洗所述膜数次并置于阴暗处干燥。使用Applied Biosystems Procise494型测序仪对处理后的MAFP1蛋白进行N端测序。

经纯化MAFP1蛋白的N端测序结果显示，经纯化MAFP1蛋白的N端为LSKYGGECSLQHNTC(SEQ ID NO：5)。经纯化蛋白的N端序列与成熟形式MAFP1蛋白(SEQ ID NO：3)的前15个氨基酸序列一致。证明经纯化蛋白为成熟形式的MAFP1蛋白。

抗真菌活性分析

进行病原菌拮抗剂量分析以证实经纯化MAFP1蛋白的抗真菌活性。将病原真菌(宛氏拟青霉BCRC33174和黍蠕孢菌BCRC35004)的真菌块置于PDA平板中心处。在病原真菌的真菌块周围放置具有不同浓度MAFP1溶液(含有0至0.8μg的经纯化MAFP1蛋白)的6mm纸盘。将平板在28℃下培养并观察病原真菌生长被抑制的情况。结果显示于图4中。结果显示，0.2μg的MAFP1蛋白可显著抑制宛氏拟青霉的生长。结果也显示0.4μg的MAFP1蛋白可显著抑制黍蠕孢菌的生长。据观察，MAFP1的浓度越高，对病原真菌生长的抑制活性越强。证明来自红曲霉菌种的MAFP1蛋白是具有抗真菌活性的蛋白，可抑制人类病原菌(如宛氏拟青霉)和植物病原菌(如黍蠕孢菌)的生长。

Claims (7)

1.一种经分离并纯化的抗真菌蛋白，其由

LSKYGGECSLOHNTCTYLKGGKNQVVHCGSAANQKCKSDRHHCEYDEHHKTV

NCQTPV的氨基酸序列所组成。

2.一种包含根据权利要求1所述的抗真菌蛋白和合适载剂的组合物，其中以足以提供对真菌疾病抵御的量提供所述蛋白。

3.根据权利要求2所述的组合物，其包含其他抗真菌剂。

4.一种控制植物真菌的方法，所述方法包含对植物施用足以提供对真菌疾病抵御的量的根据权利要求1所述的抗真菌蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗真菌蛋白是由根据权利要求2或3所述的组合物提供的。

6.一种根据权利要求1所述的抗真菌蛋白作为制备治疗患者的真菌疾病药物的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述抗真菌蛋白是由根据权利要求2或3所述的组合物提供的。