CN111808832B

CN111808832B - 一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因及其片段Rscta和应用

Info

Publication number: CN111808832B
Application number: CN202010507899.1A
Authority: CN
Inventors: 舒灿伟; 赵美; 周而勋; 杨媚; 李赞丰
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2040-06-05
Also published as: CN111808832A

Abstract

本发明公开了一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因及其片段Rscta和应用。本发明提供了水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因以及其片段Rscta，阳离子转运ATP酶基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被显著诱导表达；根据该水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta合成的dsRNA，体外处理使得水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因沉默，进而显著降低水稻纹枯病菌的致病力；所述dsRNA能够用于制备水稻纹枯病菌防治制剂，且将包含片段Rscta的重组载体转化入植株后，能够得到抗水稻纹枯病菌转基因植物；因此，该水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因或其片段Rscta在防治水稻纹枯病菌、制备水稻纹枯病菌防治制剂、构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中均具有广泛的应用前景。

Description

一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因及其片段Rscta和应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因及其片段Rscta和应用。

背景技术

由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病(Rice sheath blight)是水稻的重要病害之一，危害程度仅次于稻瘟病。水稻纹枯病在我国每年的发病面积超过2亿亩，是发病面积最广的水稻病害。病害发生严重的稻区可造成严重的产量损失。该病的病原菌不仅可以侵染水稻，还可以侵染十字花科等多达260种植物。但是，目前有关植物抗立枯丝核菌以及该菌基因功能的研究甚少，也没有研发出高抗纹枯病的水稻品种；究其原因主要是该菌是一种腐生性比较强的真菌，其细胞中具有多个细胞核。

寄主诱导的基因沉默技术是一种基于RNA干扰(RNAi)的策略，它包括在寄主植物中表达合适的RNAi结构，靶向病原菌必需基因，并在相互作用过程中将双链RNA(dsRNA)或小干扰RNA(SiRNA)转移到病原菌中，从而使目的基因沉默，从而抑制毒力；目前，该技术已被证明是一种在寄主中沉默外源病原基因的有效策略，广泛应用于植物抗病和害虫防治。病毒诱导基因沉默技术(Virus-induced gene silencing)简称VIGS技术，基于同源RNA互补结合降解的RNAi原理，是利用植物对病毒的天然防御机制发展的一种瞬时、快速鉴定植物基因功能的技术，是用基因序列验证基因功能的一种反向遗传学方法。2010年，Nowara利用基于BSMV的VIGS载体在小麦体内实现了对小麦白粉菌基因GTF1和GTF2的沉默，对白粉菌侵染钉的生长产生显著影响；因此，提出利用VIGS鉴定植物病原基因功能的新途径。

阳离子转运ATP酶是催化阳离子转化，并将ATP转化为ADP和磷酸盐的一类蛋白，它可以将阳离子从膜的一侧转运到另一侧。阳离子转运ATP酶在真核生物中参与了主动运输、ATP代谢、细胞能动性、生长发育和蛋白质选择等等重要进程。目前，有关阳离子转运ATP酶基因功能的研究主要集中在人类和动物上，有关植物病原真菌的研究非常少。孙董董等采用生物信息学的方法分析了禾谷炭疽菌、希金斯炭疽菌和胶孢炭疽菌中的P型ATP酶基因家族的信息，但没有做过基因功能的研究(孙董董等，3种炭疽菌P型ATP酶基因家族分析，热带作物学报，2015)。彭陈在其学位论文中研究了一个MoCTA1基因的功能，发现该基因的缺失突变体对病菌的致病力有一定影响(稻瘟菌P型ATP酶的基因家族分析及其基因MoCTA1、MoCTA3的研究，安徽农业大学，2012)，但通过基因序列比对发现，水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因与MoCTA1基因不存在同源性，进化关系较远。

虽然水稻纹枯病菌的全基因组序列已被公布(Zheng A et al，The evolutionand pathogenic mechanisms of the rice sheath blight pathogen，Nat.Commun，2013)，为该菌的基因功能研究提供了丰富的信息，对于创制抗水稻纹枯病的品种起着重要的作用。但是，目前已知的可用于该病防治的基因信息非常少，缺乏单一基因用于抗性品种的培育，且该病原菌具有多核的性质，缺乏稳定的遗传转化体系。因此，亟需利用新的分子生物学技术开展水稻抗纹枯病的研究，培育抗病新品种，这也是现代农业生产利用高科技提高农作物产量、较少使用农药、保护生态环境和促进农业可持续发展的关键措施之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中对于水稻纹枯病的致病相关基因研究的缺陷和不足，提供一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因及其片段Rscta和应用。

本发明的第一个目的是提供一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因。

本发明的第二个目的是提供一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta。

本发明的第四个目的是提供所述ATP酶基因或所述片段Rscta在防治水稻纹枯病菌或制备水稻纹枯病菌防治制剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述ATP酶基因或所述片段Rscta在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种水稻纹枯病菌防治制剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因，所述基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，全长cDNA序列的长度为2484bp。

所述基因的全长DNA序列如SEQ ID NO：2所示，全长DNA序列的长度为3026bp，包含10个内含子，分别位于第94～142位、181～282位、410～463位、1137～1186位、1334～139位、1529～1578位、1848～1904位、2084～2137位、2427～2485位、2692～2740位。

所述基因的编码序列如SEQ ID NO：3所示，编码序列的长度为2484bp，其编码827个氨基酸。

本发明还提供了一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，由827个氨基酸组成，蛋白质的分子量为93.12kDa。

本发明研究发现，水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因是水稻纹枯病菌与致病力有关的基因，该基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被诱导，表达量持续升高；因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

所述ATP酶基因或所述片段Rscta在防治水稻纹枯病菌或制备水稻纹枯病菌防治制剂中的应用。

所述ATP酶基因或所述片段Rscta在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用。

本发明还提供了一种水稻纹枯病菌防治制剂，含有能够抑制所述ATP酶基因表达的物质。

优选地，所述物质为dsRNA或包含片段Rscta的重组载体或重组菌。

优选地，所述dsRNA的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。

另外，本发明还提供了一种构建抗水稻纹枯病菌转基因植物的方法，体外合成含有水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的dsRNA，用于体外处理并沉默水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因；

或者将水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta构建到TRV2载体中，用注射法将该TRV2-Rscta沉默载体注射到植株中，获得表达水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的转基因植株；

或者利用转基因植株中产生dsRNA，用于沉默接种的水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因，降低水稻纹枯病菌在植株上的致病力。

根据本发明提供的水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因或其片段Rscta的序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与片段Rscta等同的基因：

(1)通过数据库检索获得；(2)以片段Rscta为探针筛选其它丝核菌基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据片段Rscta序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从丝核菌或其它近缘真菌的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在片段Rscta的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。

本发明具有以下有益效果：

本发明获得了一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因，该基因是水稻纹枯病菌(土传真菌病害)的致病力关键基因，该基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被显著诱导表达，根据该水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta合成的dsRNA，能够体外处理使得水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因沉默，进而显著降低水稻纹枯病菌的致病力；

本发明还提供了一种水稻纹枯病菌防治制剂，含有能够抑制所述水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因表达的物质，所述物质为dsRNA或包含片段Rscta的重组载体或重组菌；将高效沉默水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因的重组载体转化入植株，得到抗水稻纹枯病菌转基因植物，该植物对水稻纹枯病菌具有显著的抗病性，有效地解决了生产上由纹枯病菌引起的土传真菌病害的难题，进而有效地防控土传真菌病害；

另外，该方法只是在植物中表达一个小片段的基因，不产生蛋白质等产物，不会产生转基因食品带来的潜在风险；因此，该水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因或其片段Rscta在防治水稻纹枯病菌、制备水稻纹枯病菌防治制剂、以及构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中均具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的扩增结果图；其中，M：DNA分子量标准；1：PCR产物。

图2是水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因在水稻纹枯病菌侵染过程的基因表达分析结果图。

图3是dsRNA体外处理水稻纹枯病菌24h、48h和72h的RNA提取结果图；其中，M：DNA分子量标准；1：24h提取的RNA；2：48h提取的RNA；3：72h提取的RNA；4：96h提取的RNA。

图4是dsRNA体外处理水稻纹枯病菌0h、24h、48h和72h的转录水平结果图。

图5是VIGS载体信息图。

图6是本发明构建得到的TRV2-Rscta沉默载体的图谱。

图7是本发明构建得到的TRV2-Rscta沉默载体转化至根癌农杆菌GV3101的菌落验证结果图；其中，M：DNA分子量标准；1、2：菌落。

图8是接种水稻纹枯病菌6d后的本氏烟草的表型图。

图9是接种水稻纹枯病菌6d后的本氏烟草的真菌生物量和靶基因转录水平分析结果图；其中，(A)图为接种水稻纹枯病菌6d后的本氏烟草的真菌生物量分析结果图；(B)图为接种水稻纹枯病菌6d后的本氏烟草的靶基因转录水平分析结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的克隆

1、实验方法

水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的克隆，包括以下步骤：

S1.水稻纹枯病菌RNA的提取

水稻纹枯病菌RNA的提取使用TaKaRa总RNA提取试剂盒(code No.9769)。称取0.1g水稻纹枯病菌菌丝于液氮中迅速研磨成粉末，加入到含有Buffer RL裂解液的1.5mL灭菌离心管中，将裂解液12000rpm，4℃离心5min。将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌离心管中。加入样品裂解步骤中上清液1/2体积的无水乙醇，立即将混合液(含沉淀)全部转入到RNASpin Column(含2mL Collection Tube)中。12000rpm，离心1min，弃滤液。依次将500μL的Buffer RWA，600μL的Buffer RWB，600μL的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液。然后空管12000rpm离心1min。将RNA Spin Column安置于1.5mL的RNase Free Collection Tube，在RNA Spin Column膜中央处加入125μL的RNaseFree ddH₂O(65℃预热)，室温静置5min。12000rpm离心2min洗脱RNA，得到水稻纹枯病菌RNA。

S2.cDNA第一链的合成

以步骤S1得到的水稻纹枯病菌RNA为模板，利用TARAKA PrimeScript反转录试剂盒(code No.6210A)合成cDNA。在微量离心管中加入2000ng Total RNA、1μL Oligo dTPrimer、1μL dNTP Mixture(10mM each)、补充RNase Free ddH₂O至10μL。轻轻混匀，离心数秒后，65℃保温5min，冰上迅速冷却。依次加4μL5×PrimeScript II Buffer、0.5μL RNaseInhibitor(40U/μL)、1μL PrimeScript II RTase(200U/μL)、补充RNase Free ddH₂O至20μL，缓慢混匀。42℃保温50min，95℃保温5min(酶失活)，得到水稻纹枯病菌cDNA，冰上冷却后，-20℃保存备用。

S3.片段Rscta的克隆

片段Rscta的克隆引物，0493F:5'-tgaagaaggagaggagagg-3'，如SEQ ID NO:7所示；0493R:5'-ctggtcggcggtattatc-3'，如SEQ ID NO:8所示。

以步骤S2得到的水稻纹枯病菌cDNA为模板，使用擎科(code No.TP001)高保真聚合酶，进行PCR扩增反应。反应条件为：98℃，2min；98℃，10s，58℃，15s，40个循环；最后72℃，10min。使用TAE缓冲液制作1.0％的琼脂糖凝胶，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。使用Axygen PCR清洁试剂盒试剂盒进行PCR产物纯化。

2、实验结果

水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，全长DNA序列如SEQ ID NO：2所示，编码序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的扩增结果如图1所示，可以看出，本发明成功扩增得到水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta，大小为286bp。

实施例2水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因在水稻纹枯病菌侵染水稻过程的表达分析

1、实验方法

水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因在水稻纹枯病菌侵染水稻过程的表达分析，包括以下步骤：

S1.接种喷雾的制备

首先使用PDA平板(培养皿直径90mm，8mL PDA培养基)将本实验室保存的水稻纹枯病菌(R.solani AG-1IA)GD-118菌株(舒灿伟等，一种优化的适用于双向电泳的水稻纹枯病菌蛋白质提取方法，华中农业大学学报，2017)活化，黑暗条件下，28℃培养2d。之后使用灭菌后的刀片将带有真菌的PDA平板切割成边长约为1mm大小的正方形菌丝块，转移至锥形瓶中(含200mL PDB)，黑暗条件下，28℃，180r/min，震荡培养2d后，整瓶匀浆成液体，使OD600为1.0，即可用于接种。

S2.水稻的种植和接种

分别使用10％的次氯酸钠与30％的双氧水对水稻种子(水稻品种：日本晴)进行消毒，再将种子置于无菌培养皿内，使用无菌水浸泡3d以上直至发芽，然后将发芽的种子转移至含有10cm无菌土的方盆(长：80cm；宽：40cm；高：15cm)内。接种选择水稻三叶一心期，在盆内无水干燥条件下使用S1中匀浆后的液体进行接种，每株水稻接种5mL，30℃，湿度90％以上利于发病。

S3.样品的荧光定量PCR分析

为了验证不同基因在水稻纹枯病菌侵染水稻过程中的表达量，选取了接种后的6个时间点，24h，48h，72h，96h和120h后，收集整株水稻为样品。使用TaKaRa植物RNA提取试剂盒(code No.9769)进行不同时间的水稻样品总RNA的提取，具体方法同“实施例1的步骤S1”。

利用TARAKA PrimeScript反转录试剂盒(code No.6210A)进行RNA反转录，具体方法同“实施例1的步骤S2”将反转录所得的cDNA产物稀释10倍后用于实时荧光定量PCR。利用Primer Premier 5.0软件设计片段Rscta的荧光定量PCR引物，0493qPCR F:5'-tcttatggccgcccagac-3'，如SEQ ID NO:9所示；0493qPCR R:5'-agctggaccttcttgagc-3'，如SEQ ID NO:10所示。引物的特异性通过凝胶电泳、测序和溶解曲线检验。试验使用Bio-Rad CFX real-time PCR system，反应体系为20μL，其中包含10μL MIX、0.2μM上/下游引物、2μL cDNA模板和适量的纯水。每个样品进行三次技术重复。水稻纹枯病菌的内参基因使用GAPDH进行样品间的基因表达的均一化处理，引物GAPDH F:5'-ggtcggcaaagtcataccat-3'，如SEQ ID NO:11所示；引物GAPDH R:5'-tctgcgtccttcttggagata-3'，如SEQ ID NO:12所示。结果采用2^-ΔΔCt法进行分析。

2、实验结果

水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因在水稻纹枯病菌侵染过程的基因表达分析结果如图2所示，可以看出，阳离子转运ATP酶基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被诱导，且随着时间延长表达量持续升高，表明该基因在水稻纹枯病菌与水稻的互作过程中可能起到关键作用。

实施例3片段Rscta dsRNA的合成和体外沉默实验

1、实验方法

S1.片段Rscta dsRNA的体外合成

使用T7 RNA Polymerase(Thermo Fisher Scientific，Catalog number:EP011)合成片段Rscta的dsRNA。通过在任一扩增引物的5'末端添加T7启动子序列，可以使用PCR将T7 RNA聚合酶启动子添加到任何DNA序列中。最小的T7 RNA聚合酶启动子序列是：5'-taatacgactcactatagg-3'。在上下游引物5'末端分别添加T7启动子序列，即上游引物T7-0493 F:5'-taatacgactcactataggtcgcccacagcatctacaa-3'，如SEQ ID NO:13所示；下游引物T7-0493 R:5'-taatacgactcactataggtcccaacgagcc aatcc-3'，如SEQ ID NO:14所示。以水稻纹枯病菌的cDNA为模板进行PCR扩增得到dsRNA的模板，经过转录纯化后得到阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的dsRNA。

S2.dsRNA对水稻纹枯病菌的体外沉默实验

从培养2d的水稻纹枯病菌PDA平板边缘取边长2mm正方形菌饼放入直径60mm的培养皿中(含有7mLPDB)，静置培养48h后，以500ng/mL加入dsRNA，并在处理0h、24h、48h、72h和96h时收集菌丝样品，并使用TaKaRa植物RNA提取试剂盒(code No.9769)进行不同时间的水稻样品总RNA的提取，具体方法同“实施例1的步骤S1”每次处理重复三次，实验重复三次。

2、实验结果

dsRNA的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。

dsRNA体外处理水稻纹枯病菌24h、48h和72h的RNA提取结果如图3所示，可以看出，各时间段样品提取出的RNA质量良好。

dsRNA体外处理水稻纹枯病菌0h、24h、48h和72h的转录水平结果如图4所示，可以看出，阳离子转运ATP酶基因的转录水平在24h有显著降低，并随着处理时间的增加持续降低，72h的沉默效率在80％左右，证明体外施用dsRNA处理病原菌沉默相关基因的表达是切实可行的。

实施例4 TRV2-Rscta沉默载体构建和转化烟草研究

1、实验方法

S1.TRV2-Rscta沉默载体构建及农杆菌转化

根据水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的编码序列，设计引物两端包含EcoRI和BamHI酶切位点的特异性引物，上游引物VIGS-0493F：5'-ccggaattctgaagaaggagaggagagg-3'，如SEQ ID NO:15所示；下游引物VIGS-0493R：5'-cgcggatccctggtcggcggtattatc-3'，如SEQ ID NO:16所示。以水稻纹枯病菌cDNA为模板，使用擎科公司高保真酶(code No.TP001)进行PCR扩增，将扩增产物回收后，和载体pYL156同时在37℃下双酶切5h。将酶切后的目的片段和载体利用T₄DNA连接酶，16℃过夜连接，将连接好的产物转化入E.coil DH5α感受态，测序确定无误后，扩繁提取质粒，保存备用。其中，VIGS载体信息如图5所示。

S2.根癌农杆菌感受态的制备及电击转化

将根癌农杆菌单菌落接于4mL含Rif(25μg/mL)的LB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养2d。取培养液3mL的接种量转接至200mL LB培养液中，200r/min、28℃振荡培养至对数生长期(细胞浓度OD₆₀₀＝0.6)。离心弃去废液，收集菌体。用预冷的无菌双蒸水将菌液重悬洗涤3次，后用2mL无菌预冷的10％w/v甘油重悬菌体。取100μL菌悬液于1.5mL离心管，-70℃保存备用。加3μL质粒于菌液中，轻轻混匀并转移至无菌预冷的电击杯中，电击后迅速加入1mL LB液体培养基，混匀并转移细胞至1.5mL的离心管中，在28℃摇床中200r/min培养2h；取100μL菌液涂布于含Rif(25μg/mL)和Kan(50μg/mL)的LB平板中，倒置放于28℃培养箱中培养2天，观察转化子生长情况，取未质粒DNA的农杆菌在同样电击条件下的结果作为对照。挑取单菌落使用pYL156载体引物进行PCR验证。上游引物PYL156 F:5'-aattcactgggagatgatacgctg-3'，如SEQ ID NO:17所示；下游引物PYL156 R:5'-cctatggtaagacaatgagtcggc-3'，如SEQ ID NO:18所示。

S3.农杆菌培养和烟草瞬时转化

农杆菌单克隆加入5mL的液体LB培养基(25μg/mL Rif和50μg/mL Kan)中，放于28℃摇床中进行200r/min过夜培养，将1mL菌液加入50mL LB(25μg/mL Rif和50μg/mL Kan)中，放于28℃摇床中进行200r/min振荡培养。当培养物OD₆₀₀＝0.6时，6000rpm，5min低温离心收集菌体，弃去废液。将菌体重悬于注射基质(10mM MES、10mM MgCl₂、100μM乙酰丁香酮)中，使OD₆₀₀＝0.4。把两种农杆菌菌株(TRV1与TRV2+靶标基因片段)以1:1混合，室温静置4h，不要摇动。最后利用注射器将含有注射基质的农杆菌注射于最嫩的叶片中。

S4.致病力检测和生物量测定

从注射后的第10天起，本氏烟草的白化现象就非常明显，这表明了在本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，我们选择了从注射VIGS系列载体后的第10天，进行活体接种。对接菌后第6天(post-inoculation day，dpi)进行本氏烟草的病情指数统计，通过统计叶片病斑和凋萎叶片的数量进行致病力的检测。提取接种水稻纹枯病菌6d后本氏烟草(转基因植株和阴性对照)中部叶片的总DNA，以立枯丝核菌(R.solani)内部转录间隔区ITS序列为靶标片段。上游引物Rs F:5'-gccttttctaccttaatttggcag-3'，如SEQ ID NO:19所示；下游引物Rs R:5'-gtgtgtaaattaagtagacagcaaatg-3'，如SEQ ID NO:20所示。同时，以烟草actin基因为内参基因，上游引物EF1a:5'-tggtgtcctcaagcctggtat-3'，如SEQ ID NO:21所示；下游引物EF1b:5'-acgcttgagatccttaaccgc-3'，如SEQ ID NO:22所示。具体方法同“实施例2的步骤S3”结果采用2-ΔΔCt法进行分析(苏晓峰，2014)。

2、实验结果

本发明构建得到的TRV2-Rscta沉默载体的图谱如图6所示，可以看出，载体全长9930bp，经对比与实际测序结果相同。

本发明构建得到的TRV2-Rscta沉默载体转化至根癌农杆菌GV3101的菌落验证结果如图7所示，条带大小为717bp，条带单一明亮且大小正确，说明TRV2-Rscta沉默载体已成功转进根癌农杆菌GV3101。

接种水稻纹枯病菌6d后的本氏烟草的表型如图8所示，可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，发病程度减弱，抗性增强。

接种水稻纹枯病菌6d后的本氏烟草的真菌生物量和靶基因转录水平分析结果如图9所示，其中，(A)图为接种水稻纹枯病菌6d后的本氏烟草的真菌生物量分析结果图；(B)图为接种水稻纹枯病菌6d后的本氏烟草的靶基因转录水平分析结果图；可以看出，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，仅为野生型的20％，转基因植物体内阳离子转运ATP酶基因的表达量下降了约60％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因及其片段Rscta和应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2484

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcggttct gccgcaccat tgtcttgact gcctctgtcc taggctcgct ggtttcagcc 60

caggatggta cttccaagaa gtttgagtac cagagcgatg ttagtcgtct gagaaacatc 120

gtcattaatt cggaagtgtt cctgcgcgag ctcatttcca atgcaaacga cgctttggag 180

aagcttcgtc tcatcagctt gacggacaag tcttaccaaa tcccagactc gcctctcaat 240

atcacgatca agctcgtgaa ggatggcgaa ggcactggtg gacgcgttat tattactgac 300

accggtattg gtatgactgc tgatgaactg gccaaaaacc ttggcaccct cgccaagtct 360

ggtacaagcg agttcctgaa caaggcggaa aaggatacta gcggaaacct gattggccag 420

ttcggtcttg gtttctattc tagcttcctc gtcgccgaca aagttcaggt tgcctctctc 480

ccacctgtct ccaaggcaaa cccagatcca ctccaacaca tctttacaag tggatcggat 540

gatagcaact ttgaaatctc tgttgaccct cgcggaaact cgctcggcca ttctggaacc 600

gaaattacta tgtacttgaa ggatgaggca ttggaattct tagacgagca acgtgtgcgc 660

gaccttgttt ccaaacattc ggcatttgcg acttcgttcc cactctacct ccagaccttc 720

aaaactgaag aagtccctga cgaggaagct attgctgctg ccaaggcagc tgaacccgag 780

tcgacttcca catctgccgc cgagcctgaa aagactaagg aagccgagac cgatgaggac 840

gaagctatca ttgaggatgt caaggaagat gacgagaaga aagaagaacc tgcatctcct 900

cctactccca tgaagaacgt tacgaccgag gaatgggtcc gtctgaatga ccaagctcct 960

ctatggatga gggaaccaaa agatgtaacc aaagacgagg tcaatcagtt cttcatgtcc 1020

actttcaagg agcacaacgg tcctctcgcc cacagcatct acaagggtga ctctggtcca 1080

gtttcgttcc gcaccatgtt cttcatccca tcggatctga acgagaagtt ctggcaaagc 1140

gcgaagcccg agttgaacaa catccgtctc atggttaagc gcgtcttcat taccagcgac 1200

ctcggaccca atgccatgcc taaatggctc agttggctca aggctatcgt tgatgccgat 1260

gacctccctc tcaacgtctc ccgtgaaact ctccaatcaa accggttcct tcgtcagatt 1320

cccaatatcc tcgtccgtcg cttcatcaac ttggtcgata ggatgtctaa ggacgaggag 1380

aacccagaac ttttccgtaa attcatgaag atttatggct cggttgttaa gctgggagct 1440

gttgaaagcc ccaaggaaca acaaaagctg gctggattgg ctcgttggga tactaatttg 1500

aggaatttca ccagtctgga tcagtacgtc gaaaacagaa agaagggtca gactcagatt 1560

ttctacctcg ccggaattgg ccagcgccct gatgaattgg ccaaatcttt gttcgttgaa 1620

aagcttcatg cgcgtggata tgaagtcttg ttactcaatg accctatgga cgagatcctc 1680

atgtctcacc ttcgtaactg gaagggtctg cagttccagg acgctgccaa gaagggtctg 1740

aagttcgggg acgaggatga agatgccgag gaagaaaagg cccgccagga gaagctcaag 1800

gagacgttca agcctctctt ggagtacctc aagaacgaga cctccaacgt tgttcttgat 1860

gttatcttgt ccaatcgtct tgttaccagc ccttgtgcaa ttgtcgccga ctcgtatggc 1920

tacagcgcaa acatggaacg tcttatggcc gcccagactg gaggaaagat gaaggagaat 1980

gactttatgc acgattgggc gaagaagcaa aagttccttg aaatcaaccc gaactccccg 2040

ctgattgaag gaatgctcaa gaaggtccag gctttgattg acattgaaga aggagaggag 2100

agggacagtc aacttgaaga ggaactaaag gaagttgcat ctattctcgt tgacggagcc 2160

ctcgtccgct ctggtttcga ggttcccgat tccaatctac gcaggttctt cactcgtatg 2220

gatcgcgtcc ttcgccgttc tctcggtgtc tctgagaccg ccaagggcga cgaaactgtt 2280

aagcccgctc ctccagtcga tgatactcct ctcgaagagc ctggtgtcct accggaaggt 2340

gcatttgagg acatcattga taataccgcc gaccagaaaa ccttccaacc caaagtcgat 2400

gtcaaagtcg acgcactgaa tgacgaagaa atcgaggaga tgttgaacaa gaaggagcag 2460

gaggttaagc gtgatgagtt gtga 2484

<210> 2

<211> 3026

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcggttct gccgcaccat tgtcttgact gcctctgtcc taggctcgct ggtttcagcc 60

caggatggta cttccaagaa gtttgagtac caggtaggtt gcatacatgt taccgtggtc 120

acctggtcta acttgcttcc agagcgatgt tagtcgtctg agaaacatcg tcattaattc 180

gctgtacagt cacaagtacg tatttatggc aaatttagtg gcgttcgctg accttgcttc 240

agggaagtgt tcctgcgcga gctcatttcc aatgcaaacg acgctttgga gaagcttcgt 300

ctcatcagct tgacggacaa gtcttaccaa atcccagact cgcctctcaa tatcacgatc 360

aagctcgtga aggatggcga aggcactggt ggacgcgtta ttattactgg taagcattta 420

caataaaagt tgaacggacg acagtgttga tacaatttcg cagacaccgg tattggtatg 480

actgctgatg aactggccaa aaaccttggc accctcgcca agtctggtac aagcgagttc 540

ctgaacaagg cggaaaagga tactagcgga aacctgattg gccagttcgg tcttggtttc 600

tattctagct tcctcgtcgc cgacaaagtt caggttgcct ctctcccacc tgtctccaag 660

gcaaacccag atccactcca acacatcttt acaagtggat cggatgatag caactttgaa 720

atctctgttg accctcgcgg aaactcgctc ggccattctg gaaccgaaat tactatgtac 780

ttgaaggatg aggcattgga attcttagac gagcaacgtg tgcgcgacct tgtttccaaa 840

cattcggcat ttgcgacttc gttcccactc tacctccaga ccttcaaaac tgaagaagtc 900

cctgacgagg aagctattgc tgctgccaag gcagctgaac ccgagtcgac ttccacatct 960

gccgccgagc ctgaaaagac taaggaagcc gagaccgatg aggacgaagc tatcattgag 1020

gatgtcaagg aagatgacga gaagaaagaa gaacctgcat ctcctcctac tcccatgaag 1080

aacgttacga ccgaggaatg ggtccgtctg aatgaccaag ctcctctatg gatgaggtat 1140

gtcatccacg tgaagcaatg aagtagcaat actcatcgtc tttcagggaa ccaaaagatg 1200

taaccaaaga cgaggtcaat cagttcttca tgtccacttt caaggagcac aacggtcctc 1260

tcgcccacag catctacaag ggtgactctg gtccagtttc gttccgcacc atgttcttca 1320

tcccatcgga tctgtgcgta attctcatga aattcacacc taatctcttt ctcattgttt 1380

aatttccaca ggaacgagaa gttctggcaa agcgcgaagc ccgagttgaa caacatccgt 1440

ctcatggtta agcgcgtctt cattaccagc gacctcggac ccaatgccat gcctaaatgg 1500

ctcagttggc tcaaggctat cgttgatggt aagcttacct attcgtcaaa tatgtgcaaa 1560

tggctcatcg ttttccagcc gatgacctcc ctctcaacgt ctcccgtgaa actctccaat 1620

caaaccggtt ccttcgtcag attcccaata tcctcgtccg tcgcttcatc aacttggtcg 1680

ataggatgtc taaggacgag gagaacccag aacttttccg taaattcatg aagatttatg 1740

gctcggttgt taagctggga gctgttgaaa gccccaagga acaacaaaag ctggctggat 1800

tggctcgttg ggatactaat ttgaggaatt tcaccagtct ggatcaggta agaaagcttt 1860

gctgaaattt caatgcgagt actgatgaac ggtatctgca acagtacgtc gaaaacagaa 1920

agaagggtca gactcagatt ttctacctcg ccggaattgg ccagcgccct gatgaattgg 1980

ccaaatcttt gttcgttgaa aagcttcatg cgcgtggata tgaagtcttg ttactcaatg 2040

accctatgga cgagatcctc atgtctcacc ttcgtaactg gaagtgagta cattttgtgt 2100

acacacatta ctagaatact cacctccatt tccacagggg tctgcagttc caggacgctg 2160

ccaagaaggg tctgaagttc ggggacgagg atgaagatgc cgaggaagaa aaggcccgcc 2220

aggagaagct caaggagacg ttcaagcctc tcttggagta cctcaagaac gagacctcca 2280

acgttgttct tgatgttatc ttgtccaatc gtcttgttac cagcccttgt gcaattgtcg 2340

ccgactcgta tggctacagc gcaaacatgg aacgtcttat ggccgcccag actggaggaa 2400

agatgaagga gaatgacttt atgcacgtaa gtgatatttt gcactcatcg gccccctttg 2460

atagtatctg acgcacttat ttcaggattg ggcgaagaag caaaagttcc ttgaaatcaa 2520

cccgaactcc ccgctgattg aaggaatgct caagaaggtc caggctttga ttgacattga 2580

agaaggagag gagagggaca gtcaacttga agaggaacta aaggaagttg catctattct 2640

cgttgacgga gccctcgtcc gctctggttt cgaggttccc gattccaatc tgtgagtagc 2700

aaattttaca agcacttcta ctgcaggata ctaataccag acgcaggttc ttcactcgta 2760

tggatcgcgt ccttcgccgt tctctcggtg tctctgagac cgccaagggc gacgaaactg 2820

ttaagcccgc tcctccagtc gatgatactc ctctcgaaga gcctggtgtc ctaccggaag 2880

gtgcatttga ggacatcatt gataataccg ccgaccagaa aaccttccaa cccaaagtcg 2940

atgtcaaagt cgacgcactg aatgacgaag aaatcgagga gatgttgaac aagaaggagc 3000

aggaggttaa gcgtgatgag ttgtga 3026

<210> 3

<211> 2484

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcggttct gccgcaccat tgtcttgact gcctctgtcc taggctcgct ggtttcagcc 60

caggatggta cttccaagaa gtttgagtac cagagcgatg ttagtcgtct gagaaacatc 120

gtcattaatt cggaagtgtt cctgcgcgag ctcatttcca atgcaaacga cgctttggag 180

aagcttcgtc tcatcagctt gacggacaag tcttaccaaa tcccagactc gcctctcaat 240

atcacgatca agctcgtgaa ggatggcgaa ggcactggtg gacgcgttat tattactgac 300

accggtattg gtatgactgc tgatgaactg gccaaaaacc ttggcaccct cgccaagtct 360

ggtacaagcg agttcctgaa caaggcggaa aaggatacta gcggaaacct gattggccag 420

ttcggtcttg gtttctattc tagcttcctc gtcgccgaca aagttcaggt tgcctctctc 480

ccacctgtct ccaaggcaaa cccagatcca ctccaacaca tctttacaag tggatcggat 540

gatagcaact ttgaaatctc tgttgaccct cgcggaaact cgctcggcca ttctggaacc 600

gaaattacta tgtacttgaa ggatgaggca ttggaattct tagacgagca acgtgtgcgc 660

gaccttgttt ccaaacattc ggcatttgcg acttcgttcc cactctacct ccagaccttc 720

aaaactgaag aagtccctga cgaggaagct attgctgctg ccaaggcagc tgaacccgag 780

tcgacttcca catctgccgc cgagcctgaa aagactaagg aagccgagac cgatgaggac 840

gaagctatca ttgaggatgt caaggaagat gacgagaaga aagaagaacc tgcatctcct 900

cctactccca tgaagaacgt tacgaccgag gaatgggtcc gtctgaatga ccaagctcct 960

ctatggatga gggaaccaaa agatgtaacc aaagacgagg tcaatcagtt cttcatgtcc 1020

actttcaagg agcacaacgg tcctctcgcc cacagcatct acaagggtga ctctggtcca 1080

gtttcgttcc gcaccatgtt cttcatccca tcggatctga acgagaagtt ctggcaaagc 1140

gcgaagcccg agttgaacaa catccgtctc atggttaagc gcgtcttcat taccagcgac 1200

ctcggaccca atgccatgcc taaatggctc agttggctca aggctatcgt tgatgccgat 1260

gacctccctc tcaacgtctc ccgtgaaact ctccaatcaa accggttcct tcgtcagatt 1320

cccaatatcc tcgtccgtcg cttcatcaac ttggtcgata ggatgtctaa ggacgaggag 1380

aacccagaac ttttccgtaa attcatgaag atttatggct cggttgttaa gctgggagct 1440

gttgaaagcc ccaaggaaca acaaaagctg gctggattgg ctcgttggga tactaatttg 1500

aggaatttca ccagtctgga tcagtacgtc gaaaacagaa agaagggtca gactcagatt 1560

ttctacctcg ccggaattgg ccagcgccct gatgaattgg ccaaatcttt gttcgttgaa 1620

aagcttcatg cgcgtggata tgaagtcttg ttactcaatg accctatgga cgagatcctc 1680

atgtctcacc ttcgtaactg gaagggtctg cagttccagg acgctgccaa gaagggtctg 1740

aagttcgggg acgaggatga agatgccgag gaagaaaagg cccgccagga gaagctcaag 1800

gagacgttca agcctctctt ggagtacctc aagaacgaga cctccaacgt tgttcttgat 1860

gttatcttgt ccaatcgtct tgttaccagc ccttgtgcaa ttgtcgccga ctcgtatggc 1920

tacagcgcaa acatggaacg tcttatggcc gcccagactg gaggaaagat gaaggagaat 1980

gactttatgc acgattgggc gaagaagcaa aagttccttg aaatcaaccc gaactccccg 2040

ctgattgaag gaatgctcaa gaaggtccag gctttgattg acattgaaga aggagaggag 2100

agggacagtc aacttgaaga ggaactaaag gaagttgcat ctattctcgt tgacggagcc 2160

ctcgtccgct ctggtttcga ggttcccgat tccaatctac gcaggttctt cactcgtatg 2220

gatcgcgtcc ttcgccgttc tctcggtgtc tctgagaccg ccaagggcga cgaaactgtt 2280

aagcccgctc ctccagtcga tgatactcct ctcgaagagc ctggtgtcct accggaaggt 2340

gcatttgagg acatcattga taataccgcc gaccagaaaa ccttccaacc caaagtcgat 2400

gtcaaagtcg acgcactgaa tgacgaagaa atcgaggaga tgttgaacaa gaaggagcag 2460

gaggttaagc gtgatgagtt gtga 2484

<210> 4

<211> 827

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Arg Phe Cys Arg Thr Ile Val Leu Thr Ala Ser Val Leu Gly Ser

1 5 10 15

Leu Val Ser Ala Gln Asp Gly Thr Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Gln Ser

20 25 30

Asp Val Ser Arg Leu Arg Asn Ile Val Ile Asn Ser Glu Val Phe Leu

35 40 45

Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Asn Asp Ala Leu Glu Lys Leu Arg Leu

50 55 60

Ile Ser Leu Thr Asp Lys Ser Tyr Gln Ile Pro Asp Ser Pro Leu Asn

65 70 75 80

Ile Thr Ile Lys Leu Val Lys Asp Gly Glu Gly Thr Gly Gly Arg Val

85 90 95

Ile Ile Thr Asp Thr Gly Ile Gly Met Thr Ala Asp Glu Leu Ala Lys

100 105 110

Asn Leu Gly Thr Leu Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Asp Thr Ser Gly Asn Leu Ile Gly Gln Phe Gly Leu Gly

130 135 140

Phe Tyr Ser Ser Phe Leu Val Ala Asp Lys Val Gln Val Ala Ser Leu

145 150 155 160

Pro Pro Val Ser Lys Ala Asn Pro Asp Pro Leu Gln His Ile Phe Thr

165 170 175

Ser Gly Ser Asp Asp Ser Asn Phe Glu Ile Ser Val Asp Pro Arg Gly

180 185 190

Asn Ser Leu Gly His Ser Gly Thr Glu Ile Thr Met Tyr Leu Lys Asp

195 200 205

Glu Ala Leu Glu Phe Leu Asp Glu Gln Arg Val Arg Asp Leu Val Ser

210 215 220

Lys His Ser Ala Phe Ala Thr Ser Phe Pro Leu Tyr Leu Gln Thr Phe

225 230 235 240

Lys Thr Glu Glu Val Pro Asp Glu Glu Ala Ile Ala Ala Ala Lys Ala

245 250 255

Ala Glu Pro Glu Ser Thr Ser Thr Ser Ala Ala Glu Pro Glu Lys Thr

260 265 270

Lys Glu Ala Glu Thr Asp Glu Asp Glu Ala Ile Ile Glu Asp Val Lys

275 280 285

Glu Asp Asp Glu Lys Lys Glu Glu Pro Ala Ser Pro Pro Thr Pro Met

290 295 300

Lys Asn Val Thr Thr Glu Glu Trp Val Arg Leu Asn Asp Gln Ala Pro

305 310 315 320

Leu Trp Met Arg Glu Pro Lys Asp Val Thr Lys Asp Glu Val Asn Gln

325 330 335

Phe Phe Met Ser Thr Phe Lys Glu His Asn Gly Pro Leu Ala His Ser

340 345 350

Ile Tyr Lys Gly Asp Ser Gly Pro Val Ser Phe Arg Thr Met Phe Phe

355 360 365

Ile Pro Ser Asp Leu Asn Glu Lys Phe Trp Gln Ser Ala Lys Pro Glu

370 375 380

Leu Asn Asn Ile Arg Leu Met Val Lys Arg Val Phe Ile Thr Ser Asp

385 390 395 400

Leu Gly Pro Asn Ala Met Pro Lys Trp Leu Ser Trp Leu Lys Ala Ile

405 410 415

Val Asp Ala Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg Glu Thr Leu Gln

420 425 430

Ser Asn Arg Phe Leu Arg Gln Ile Pro Asn Ile Leu Val Arg Arg Phe

435 440 445

Ile Asn Leu Val Asp Arg Met Ser Lys Asp Glu Glu Asn Pro Glu Leu

450 455 460

Phe Arg Lys Phe Met Lys Ile Tyr Gly Ser Val Val Lys Leu Gly Ala

465 470 475 480

Val Glu Ser Pro Lys Glu Gln Gln Lys Leu Ala Gly Leu Ala Arg Trp

485 490 495

Asp Thr Asn Leu Arg Asn Phe Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val Glu Asn

500 505 510

Arg Lys Lys Gly Gln Thr Gln Ile Phe Tyr Leu Ala Gly Ile Gly Gln

515 520 525

Arg Pro Asp Glu Leu Ala Lys Ser Leu Phe Val Glu Lys Leu His Ala

530 535 540

Arg Gly Tyr Glu Val Leu Leu Leu Asn Asp Pro Met Asp Glu Ile Leu

545 550 555 560

Met Ser His Leu Arg Asn Trp Lys Gly Leu Gln Phe Gln Asp Ala Ala

565 570 575

Lys Lys Gly Leu Lys Phe Gly Asp Glu Asp Glu Asp Ala Glu Glu Glu

580 585 590

Lys Ala Arg Gln Glu Lys Leu Lys Glu Thr Phe Lys Pro Leu Leu Glu

595 600 605

Tyr Leu Lys Asn Glu Thr Ser Asn Val Val Leu Asp Val Ile Leu Ser

610 615 620

Asn Arg Leu Val Thr Ser Pro Cys Ala Ile Val Ala Asp Ser Tyr Gly

625 630 635 640

Tyr Ser Ala Asn Met Glu Arg Leu Met Ala Ala Gln Thr Gly Gly Lys

645 650 655

Met Lys Glu Asn Asp Phe Met His Asp Trp Ala Lys Lys Gln Lys Phe

660 665 670

Leu Glu Ile Asn Pro Asn Ser Pro Leu Ile Glu Gly Met Leu Lys Lys

675 680 685

Val Gln Ala Leu Ile Asp Ile Glu Glu Gly Glu Glu Arg Asp Ser Gln

690 695 700

Leu Glu Glu Glu Leu Lys Glu Val Ala Ser Ile Leu Val Asp Gly Ala

705 710 715 720

Leu Val Arg Ser Gly Phe Glu Val Pro Asp Ser Asn Leu Arg Arg Phe

725 730 735

Phe Thr Arg Met Asp Arg Val Leu Arg Arg Ser Leu Gly Val Ser Glu

740 745 750

Thr Ala Lys Gly Asp Glu Thr Val Lys Pro Ala Pro Pro Val Asp Asp

755 760 765

Thr Pro Leu Glu Glu Pro Gly Val Leu Pro Glu Gly Ala Phe Glu Asp

770 775 780

Ile Ile Asp Asn Thr Ala Asp Gln Lys Thr Phe Gln Pro Lys Val Asp

785 790 795 800

Val Lys Val Asp Ala Leu Asn Asp Glu Glu Ile Glu Glu Met Leu Asn

805 810 815

Lys Lys Glu Gln Glu Val Lys Arg Asp Glu Leu

820 825

<210> 5

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgaagaagga gaggagaggg acagtcaact tgaagaggaa ctaaaggaag ttgcatctat 60

tctcgttgac ggagccctcg tccgctctgg tttcgaggtt cccgattcca atctgttctt 120

cactcgtatg gatcgcgtcc ttcgccgttc tctcggtgtc tctgagaccg ccaagggcga 180

cgaaactgtt aagcccgctc ccccagtcga tgatactcct ctcgaagagc ctggtgtcct 240

accggaaggt gcatttgagg acatcattga taataccgcc gaccag 286

<210> 6

<211> 483

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uaauacgacu cacuauaggu cgcccacagc aucuacaagg gugacucugg uccaguuucg 60

uuccgcacca uguucuucau cccaucggau cugaacgaga aguucuggca aagcgcgaag 120

cccgaguuga acaacauccg ucucaugguu aagcgcgucu ucauuaccag cgaccucgga 180

cccaaugcca ugccuaaaug gcucaguugg cucaaggcua ucguugaugc cgaugaccuc 240

ccucucaacg ucucccguga aacucuccaa ucaaaccggu uccuucguca gauucccaau 300

auccucgucc gucgcuucau caacuugguc gauaggaugu cuaaggacga ggagaaccca 360

gaacuuuucc guaaauucau gaagauuuau ggcucgguug uuaagcuggg agcuguugaa 420

agccccaagg aacaacaaaa gcuggcugga uuggcucguu gggaccuaua gugagucgua 480

uua 483

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaagaagga gaggagagg 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctggtcggcg gtattatc 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcttatggcc gcccagac 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agctggacct tcttgagc 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtcggcaaa gtcataccat 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tctgcgtcct tcttggagat a 21

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taatacgact cactataggt cgcccacagc atctacaa 38

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taatacgact cactataggt cccaacgagc caatcc 36

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccggaattct gaagaaggag aggagagg 28

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgcggatccc tggtcggcgg tattatc 27

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aattcactgg gagatgatac gctg 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cctatggtaa gacaatgagt cggc 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gccttttcta ccttaatttg gcag 24

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtgtgtaaat taagtagaca gcaaatg 27

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tggtgtcctc aagcctggta t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acgcttgaga tccttaaccg c 21

Claims

1.一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因的抑制剂在在防治水稻纹枯病菌或制备水稻纹枯病菌防治制剂中的应用，其特征在于，所述抑制剂为dsRNA或包含片段Rscta的重组载体或重组菌，其中，水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的核苷酸序列如SEQID NO：5所示，所述dsRNA的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.权利要求2所述片段Rscta在防治水稻纹枯病菌或制备水稻纹枯病菌防治制剂中的应用。

4.权利要求2所述片段Rscta在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用。

5.一种水稻纹枯病菌防治制剂，其特征在于，含有dsRNA或包含水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的重组载体或重组菌，水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因片段Rscta的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述dsRNA的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。