HK1171673A - 抗体配制剂 - Google Patents

Description

抗体配制剂

本发明涉及针对表皮生长因子受体的抗体（抗EGFR抗体）的药物配制剂、用于制备所述配制剂的方法和配制剂的用途。

在第一方面，本发明涉及一种药物配制剂，其包含：

1至200mg/ml IgG类抗EGFR抗体；

1至100mM缓冲剂；

0.001至1%(w/v)表面活性剂；

1至500mM至少一种稳定剂；

pH范围为4.0至7.0。

依照本发明的配制剂可以以液体形式、冻干形式或以自冻干形式重建的液体形式提供。

除非下文中另有定义，在本文中如本领域中一般使用的那样使用术语。

如本文中所使用的，术语“IgG类抗EGFR抗体”包括靶向人表皮生长因子受体(EGFR)（又称为HER-1或ErbB-1(Ullrich等,Nature 309,418-425(1984);SwissProt登录号#P00533；二级登录号：O00688、O00732、P06268、Q14225、Q68GS5、Q92795、Q9BZS2、Q9GZX1、Q9H2C9、Q9H3C9、Q9UMD7、Q9UMD8、Q9UMG5），及其天然存在的同等型和变体的免疫球蛋白G(IgG)类免疫球蛋白的抗体。

可用于依照本发明的配制剂的例示性IgG类抗EGFR抗体包括西妥昔单抗(cetuximab)/IMC-C225（其记载于Goldstein等,Clin Cancer Res 1,1311-1318(1995)）、帕尼单抗(panitumumab)/ABX-EGF（其记载于Yang等,Cancer Res 59,1236-1243(1999),Yang等,Critical Reviews inOncology/Hematology 38,17-23(2001)）、尼妥珠单抗(nimotuzumab)/h-R3（其记载于Mateo等,Immunotechnology 3,71-81(1997);Crombet-Ramos等,Int J Cancer 101,567-575(2002),Boland和Bebb,ExpertOpin Biol Ther 9,1199-1206(2009)）、马妥珠单抗(matuzumab)/EMD 72000（其记载于Bier等,Cancer Immunol Immunother 46,167-173(1998),Kim,CurrOpin Mol Ther 6,96-103(2004)）、和扎鲁木单抗(zalutumumab)/2F8（其记载于Bleeker等,J Immunol 173,4699-4707(2004),Lammerts van Bueren,PNAS105,6109-6114(2008)）。

可用于依照本发明的配制剂的优选的IgG类抗EGFR抗体记载于WO2006/082515和WO 2008/017963，通过提及而将其全部内容收入本文，并且包括如下的抗体，其特征在于它们是具有大鼠单克隆抗体ICR62的结合特异性的嵌合抗体，且它们的效应器功能通过改变的糖基化得到增强。

优选抗体的特征在于它们包含大鼠ICR62抗体的至少一个（即，1、2、3、4、5、或6个）互补决定区(CDR)，或至少含有所述CDR的特异性决定残基，且包含自异源多肽衍生的序列的其变体或截短形式。“特异性决定残基”意指那些直接涉及与抗原相互作用的残基。具体地，优选的抗体包含：(a)选自下组的重链CDR1序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、和SEQ ID NO:13；(b)选自下组的重链CDR2序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、和SEQ ID NO:30；和(c)重链CDR3序列SEQ ID NO:31。优选的抗体进一步包含：(a)选自下组的轻链CDR1序列：SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；(b)轻链CDR2序列SEQ ID NO:34；和(c)轻链CDR3序列SEQ ID NO:35。

更优选的抗体的特征在于它们包含大鼠ICR62抗体的至少三个CDR，或至少含有所述CDR的特异性决定残基的其变体或截短形式。

更优选的抗体包含：

a)在重链可变域中如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:16所示的CDR2、和如SEQ ID NO:31所示的CDR3，和

b)在轻链可变域中如SEQ ID NO:33所示的CDR1、如SEQ ID NO:34所示的CDR2、和如SEQ ID NO:35所示的CDR3。

其它优选的抗体包含依照SEQ ID NO:36的大鼠ICR62抗体重链可变域，或其变体；和非鼠多肽。此外，优选的抗体可以包含依照SEQ ID NO:37的大鼠ICR62抗体轻链可变域，或其变体；和非鼠多肽。

更优选的抗体包含SEQ ID NO:38的重链可变域和SEQ ID NO:39的轻链可变域。

优选的抗体是灵长类化的(primatized)或更优选的是人源化抗体。

“人源化”抗体指包含来自非人高变区(HVR)的氨基酸残基和来自人框架区(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。人源化抗体基本上通常包含两个可变域，其中所有或基本上所有HVR（例如，互补决定区(CDR)）对应于非人抗体的那些HVR，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些FR。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体（例如非人抗体）的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。人源化可以通过本领域中已知的多种方法来实现，所述方法包括但不限于(a)将整个非人可变域嫁接至人恒定区上以生成嵌合抗体，(b)在保留或不保留至关重要的框架残基（例如，那些对于保留良好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基）的情况中仅将非人（例如供体抗体）CDR嫁接至人（例如接受体抗体）框架和恒定区上，(c)仅将非人特异性决定区（SDR或CDR；对于抗体-抗原相互作用至关重要的残基）嫁接至人框架和恒定区上，或者(d)移植整个非人可变域，但是通过替换表面残基来用人样部分“掩盖”它们。

优选地，可用于依照本发明的配制剂的抗体包含人Fc区。更优选地，人重链恒定区是Igγ-1，如SEQ ID NO:40中所列的，即，抗体是人IgG1亚类的。

优选的抗体已经被糖工程化改造成在Fc区中具有改变的寡糖结构。

具体地，与非糖工程化改造抗体相比，优选的抗体在Fc区中具有增加比率的非岩藻糖基化寡糖。优选地，非岩藻糖基化寡糖的百分比是至少20%，更优选地至少50%，至少70%，最优选地至少75%。非岩藻糖基化寡糖可以是杂合或复合类型的。

优选的抗体在Fc区中还可以具有增加比例的两分型寡糖。优选地，抗体的Fc区中的两分型寡糖的百分比是占总寡糖的至少50%，更优选地至少60%，至少70%，至少80%，或至少90%，且最优选地至少90-95%。

特别优选的抗体在Fc区中具有增加比例的两分型、非岩藻糖基化寡糖。两分型、非岩藻糖基化寡糖可以是杂合或复合的。具体地，如下的抗体是优选的，其中抗体Fc区中至少15%，更优选地至少20%，更优选地至少25%，更优选地至少30％，更优选地至少35%的寡糖是两分型、非岩藻糖基化的。

如本文中所使用的，术语“糖工程化改造的”包括对天然存在的或重组的蛋白质、多肽或其片段的糖基化样式的任何操作。糖工程化改造包括细胞糖基化机制的代谢工程化改造，包括寡糖合成途径的遗传操作以实现这些细胞中表达的糖蛋白的糖基化改变。此外，糖工程化改造包括突变和细胞环境对糖基化的影响。特别地，糖工程化改造可以导致细胞中的糖基转移酶活性改变，诸如葡糖氨基转移酶和/或岩藻糖基转移酶活性改变。

非岩藻糖基化和/或两分型的相对量是缺乏岩藻糖和/或具有两分型GlcNAc残基的碳水化合物结构相对于经N-糖苷酶F处理的蛋白质样品中通过MALDI-TOF MS鉴定的所有糖结构的百分比。

优选抗体的特征还在于它们已经被糖工程化改造成具有升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合亲和力。如本文中所使用的，术语“效应器功能”指那些可归因于抗体的Fc（天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区）的生物学活性。

优选地，升高的效应器功能是下列一项或多项：升高的Fc介导的细胞的细胞毒性（包括升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)）、升高的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、升高的细胞因子分泌、升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、升高的对天然杀死(NK)细胞的结合、升高的对巨噬细胞的结合、升高的对单核细胞的结合、升高的对多形核细胞的结合、升高的直接信号传导诱导凋亡、升高的靶物结合抗体的交联、升高的树突细胞成熟、或升高的T细胞引发。优选地，升高的Fc受体结合亲和力是升高的对Fc活化受体的结合，最优选地，升高的对FcγRIIIa的结合。

可用于依照本发明的配制剂的最优选的IgG类抗EGFR抗体的特征在于它包含SEQ ID NO:38的重链可变域和SEQ ID NO:39的轻链可变域，是人源化的，并且包含人重链恒定区Igγ-1，如SEQ ID NO:40中所列的。此抗体称作“hu-ICR62IgG1抗EGFR单抗”。可以对或不对hu-ICR62IgG1抗EGFR单抗糖工程化改造，如上文所描述的，以与非糖工程化改造抗体相比在Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。

优选地，通过重组手段，例如通过那些记载于WO 2006/082515和WO2008/017963的重组手段来生成可用于依照本发明的配制剂的抗体。此类方法是本领域中公知的，并且包括在原核或真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体多肽，并且通常纯化至药学可接受纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码轻和重链或其片段的核酸插入合适的表达载体中。在合适的宿主细胞中实施表达，所述合适的宿主细胞包括培养的细胞，优选地培养的哺乳动物细胞诸如CHO细胞、HEK 293细胞、HEK293-EBNA细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，而且还有转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。优选的宿主细胞是CHO细胞。可以已经将表达抗体所使用的宿主细胞操作为具有改变的糖基转移酶活性水平，诸如改变的葡糖胺基转移酶和/或岩藻糖基转移酶活性，从而生成具有改变的糖基化样式的抗体。优选地，已经将宿主细胞操作为表达升高的一种或多种具有β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)活性的多肽和任选地一种或多种具有甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽水平。具有GnTIII活性的多肽可以是包含GnTIII的催化域和异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域，优选地甘露糖苷酶II的高尔基定位域的融合多肽。可以与可用于本发明的IgG类抗EGFR抗体一起采用的糖工程化改造方法记载于WO2006/082515、WO 2008/017963、美国专利No.6,602,684、EP 1071700、WO1999/54342、美国专利申请公开文本No.2004/0241817、EP 1587921、WO2004/065540、等，Nature Biotechnol 17，176-180(1999)、及Ferrara等，Biotechn Bioeng 93，851-861(2006)，通过提及而将每篇的全部内容完整收入本文。

通过标准的技术，例如蛋白A亲和层析、大小排阻层析、和本领域中公知的其它技术，例如如记载于WO 2006/082515和WO 2008/017963的技术自细胞(上清液或裂解后的细胞)回收抗体。

对于依照本发明的配制剂，抗体以约1至约200mg/ml，优选地约1至约100mg/ml，更优选地约10至约75mg/ml，且最优选地约20至约50mg/ml的浓度使用。

如本文中所使用的，术语“缓冲剂”意指稳定药用制剂的pH的药学可接受赋形剂。合适的缓冲液是本领域中公知的，并且可以参见文献。例如，可以采用柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、磷酸盐或乳酸盐、和/或其相应的游离酸或碱，及其各种盐和/或酸和碱的混合物。优选的药学可接受缓冲液包括但不限于组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。优选的缓冲液是乙酸盐缓冲液，最优选的是乙酸钠缓冲液。其它优选的缓冲液是组氨酸缓冲液，即具有组氨酸，一般为L-组氨酸作为缓冲剂的缓冲液。最优选的是L-组氨酸/HCl缓冲液，其包含L-组氨酸或L-组氨酸和盐酸L-组氨酸的混合物，且用氢氯酸实现pH调节。除非另有指示，术语“L-组氨酸”在本文中用于描述缓冲剂时指L-组氨酸/HCl缓冲液。可以通过将合适量的L-组氨酸和盐酸L-组氨酸在水中溶解，或者通过将合适量的L-组氨酸在水中溶解，并通过添加氢氯酸HCl来将pH调节至期望的数值来制备L-组氨酸/HCl缓冲液。上文提及的缓冲液一般以约1mM至约100mM，优选地约10mM至约50mM，更优选地约15至30mM，且最优选地20mM的浓度使用。不管所使用的缓冲液，可以用本领域中已知的酸或碱，例如HCl、乙酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、氢氧化钠和氢氧化钾将pH调节至范围为约4.0至约7.0，优选地约5.0至约6.0，且最优选地约5.5的数值。

如本文中所使用的，术语“表面活性剂”意指药学可接受表面活性剂。优选地，使用非离子型表面活性剂。药学可接受表面活性剂的例子包括但不限于聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烃基醚(Brij)、烃基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer,Pluronic)、和十二烷基硫酸钠(SDS)。优选的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯是聚山梨酯20（聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯，以商标Tween 20^TM出售）和聚山梨酯80（聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯，以商标Tween 80^TM出售）。优选的聚乙烯-聚丙烯共聚物是那些以名称F68或Poloxamer 188^TM出售的。优选的聚氧乙烯烃基酯是那些以商标Brij^TM出售的。优选的烃基苯基聚氧乙烯酯以商品名称Triton X出售，最优选的是对叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（以商品名称TritonX-100^TM出售）。在使用聚山梨酯20(Tween 20^TM)和聚山梨酯80(Tween 80^TM)时，它们一般以范围为约0.001至约1%，优选地约0.01至约0.1%，且更优选地约0.02%至约0.05%的浓度使用。在本发明的配制剂中，表面活性剂的浓度描述为以重量/体积(w/v)表述的百分比。

如本文中所使用的，术语“稳定剂”意指保护活性药学成分和/或配制剂在制造、贮存和应用期间免于化学和/或物理降解的药学可接受赋形剂。稳定剂包括但不限于糖类、氨基酸、多元醇，例如甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、右旋糖苷、甘油、阿糖醇、丙二醇、聚乙二醇、环状糊精，例如羟丙基-β-环状糊精、磺丁基乙基-β-环状糊精、β-环状糊精、聚乙二醇，例如PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000、PEG 6000、清蛋白，例如人血清清蛋白(HSA)、牛血清清蛋白(BSA)、盐，例如氯化钠、氯化镁、氯化钙，螯合剂，例如EDTA，如下文定义的。如上文提及的，稳定剂可以以约1至约500mM的量，优选地以约10至约300mM的量，且更优选地以约120mM至约300mM的量存在于配制剂中。配制剂中可以存在超过一种选自相同或不同组的稳定剂。

如本文中所使用的，术语“糖类”包括单糖和寡糖。单糖是一种酸不可水解的单体碳水化合物，包括单糖及其衍生物，例如氨基糖。糖类通常处于其D构象。单糖的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核糖、脱氧核糖、神经氨酸。寡糖是一种分支或线性链中的由经由糖苷键连接的超过一个单体糖类单元组成的碳水化合物。寡糖内的单体糖类单元可以是相同或不同的。根据单体糖类单元的数目，寡糖是二、三、四、五糖等。与多糖相反，单糖和寡糖是水溶性的。寡糖的例子包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖和棉子糖。优选的糖类是蔗糖和海藻糖（即α,α-D-海藻糖），最优选的是蔗糖。海藻糖是海藻糖二水合物形式。糖类可以以约100至约500mM的量，优选地以约200至约300mM的量，最优选地以约240mM的量存在于配制剂中。

如本文中所使用的，术语“氨基酸”意指拥有位于羧基基团的α-位置处的氨基模块的药学可接受有机分子。氨基酸的例子包括但不限于精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸。优选地，所采用的氨基酸在每种情况中是L形式。优选地，碱性氨基酸，诸如精氨酸、组氨酸、或赖氨酸以其无机盐形式（有利地，氢氯酸盐形式，即作为盐酸氨基酸）采用。优选的氨基酸是盐酸精氨酸和甲硫氨酸。优选地，甲硫氨酸以约10至约25mM，最优选地约10mM的浓度使用。优选地，盐酸精氨酸以约100至约200mM的浓度，最优选地以约155mM的浓度使用。

稳定剂内的亚组是冻干保护剂(lyoprotectant)。术语“冻干保护剂”意指在冻干方法、随后的贮存和重建期间针对脱稳定化条件保护不稳定性活性成分（例如蛋白质）的药学可接受赋形剂。冻干保护剂包括但不限于下组：糖类、多元醇（诸如例如糖醇）和氨基酸。优选的冻干保护剂可以选自下组：糖类诸如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、神经氨酸、氨基糖诸如葡糖胺、半乳糖胺、N-甲基葡糖胺（“甲葡胺”）、多元醇诸如甘露醇和山梨糖醇、和氨基酸诸如精氨酸和甘氨酸或其混合物。冻干保护剂一般地以约10至500mM的量，优选地以约10至约300mM的量，且更优选地以约100至约300mM的量使用。

稳定剂内的亚组是抗氧化剂。术语“抗氧化剂”意指阻止活性药用成分氧化的药学可接受赋形剂。抗氧化剂包括但不限于抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸、柠檬酸、EDTA。抗氧化剂可以以约0.01至约100mM的量，优选地以约5至约50mM的量，且更优选地以约5至约25mM的量使用。

依照本发明的配制剂还可以包含一种或多种张力剂。术语“张力剂”意指用于调控配制剂张力的药学可接受赋形剂。配制剂可以是低渗的、等张的或高渗的。一般地，等张性指通常相对于人血清渗透压（250-350mOsmol/kg左右）的溶液渗透压。依照本发明的配制剂可以是低渗的、等张的或高渗的，但是优选地会是等张的。等张配制剂是液体或自固体形式，例如自冻干形式重建的液体，并且意指与其比较的一些其它溶液，诸如生理盐溶液和血清具有相同张力的溶液。合适的张力剂包括但不限于氯化钠、氯化钾、甘油和来自氨基酸或糖的组的任何组分，特别地蔗糖。张力剂一般以约5mM至约500mM的量使用。

在稳定剂和张力剂内，存在着可以以这两种方式（即它们可以同时是稳定剂和张力剂）发挥功能的一组化合物。其例子可以在糖、氨基酸、多元醇、环状糊精、聚乙二醇和盐的组中找到。可以同时作为稳定剂和张力剂的糖的例子是海藻糖。

配制剂还可以含有佐剂诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌规程和通过纳入各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸等两者确保预防微生物的存在。一般地，防腐剂以约0.001至约2%(w/v)的量使用。防腐剂包括但不限于乙醇、苯甲醇、酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵。

在第一方面，本发明涉及药物组合物，其包含：

1至200mg/ml IgG类抗EGFR抗体；

1至100mM缓冲剂；

0.001至1%(w/v)表面活性剂；

1至500mM至少一种稳定剂，

pH范围为4.0至7.0。

在一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的IgG类抗EGFR抗体的浓度范围为1至100mg/ml，优选地10至75mg/ml，最优选地20至50mg/ml。特别优选的是25mg/ml的浓度。

在另一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的缓冲剂是组氨酸缓冲液，优选地L-组氨酸/HCl缓冲液，或乙酸盐缓冲液，优选地乙酸钠缓冲液。特别优选的是L-组氨酸/HCl缓冲液（即L-组氨酸作为缓冲剂）。

优选地，缓冲剂的浓度为10至50mM，更优选地15至30mM，最优选地20mM。

优选地，缓冲剂提供5.0至6.0，更优选地5.5±0.3的pH。

在一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的表面活性剂是聚山梨酯，优选地聚山梨酯20或聚山梨酯80，最优选地聚山梨酯80。

优选地，表面活性剂的浓度为0.01至0.1％，更优选地0.02至0.05%(w/v)，最优选地0.02至0.03%。

在又一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的至少一种稳定剂选自下组：盐，优选地氯化钠，糖类，优选地海藻糖二水合物或蔗糖，和氨基酸，优选地盐酸精氨酸。

优选地，至少一种稳定剂的浓度为120至300mM。

在一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含选自盐、糖和氨基酸的组的第一稳定剂和作为第二稳定剂的甲硫氨酸。

在一个优选的实施方案中，所述第一稳定剂的浓度为120至300mM，且所述第二稳定剂甲硫氨酸以5至25mM的浓度存在。

在一个特别优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含糖类，优选地海藻糖二水合物或蔗糖，最优选地蔗糖作为第一稳定剂和甲硫氨酸作为第二稳定剂。优选地，糖类的浓度为约240mM，且优选地，甲硫氨酸的浓度为约10mM。

在另一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的IgG类抗EGFR抗体是人源化抗体，并且包含：

a)在重链可变域中SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:16的CDR2和SEQID NO:31的CDR3，和

b)在轻链可变域中SEQ ID NO:33的CDR1、SEQ ID NO:34的CDR2和SEQID No:35的CDR3。

在一个特别优选的实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的IgG类抗EGFR抗体是hu-ICR62IgG1抗EGFR单抗。

在某些实施方案中，依照本发明的配制剂中包含的IgG类抗EGFR抗体已经被糖工程化改造成与非糖工程化改造抗体相比在其Fc区中具有增加比例，优选地至少20%、至少50%或至少70%的非岩藻糖基化寡糖。

在一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含：

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体；

15至30mM缓冲剂，其选自L-组氨酸和乙酸钠；

0.02至0.05%(w/v)表面活性剂，其选自聚山梨酯20和聚山梨酯80；

120至300mM至少一种稳定剂，其选自海藻糖二水合物、蔗糖、盐酸精氨酸和氯化钠；

任选地，5至25mM甲硫氨酸作为第二稳定剂；

pH为5.5±0.3。

在一个特别优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含：

10至50mg/ml hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗；

15至30mM L-组氨酸；

0.02至0.05%(w/v)聚山梨酯80；

120至300mM至少一种稳定剂，其选自海藻糖二水合物、蔗糖、和盐酸精氨酸；

任选地，5至25mM甲硫氨酸作为第二稳定剂；

pH为5.5±0.3。

在又一个优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含：

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体，优选地hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖二水合物、0.02至0.03%(w/v)聚山梨酯80，pH 5.5；

或

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体，优选地hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗、20mM L-组氨酸、155mM盐酸精氨酸、0.02%(w/v)聚山梨酯80，pH 5.5；

或

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体，优选地hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖二水合物、0.02至0.03%(w/v)聚山梨酯80、10mM甲硫氨酸，pH 5.5；

或

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体，优选地hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗、20mM L-组氨酸、240mM蔗糖、0.02至0.03%(w/v)聚山梨酯80，pH 5.5；

或

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体，优选地hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗、20mM L-组氨酸、240mM蔗糖、0.02至0.03%(w/v)聚山梨酯80、10mM甲硫氨酸，pH 5.5。

在一个特别优选的实施方案中，依照本发明的配制剂包含：

20至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体，优选地hu-ICR62IgG1抗EGFR单抗；

20mM L-组氨酸；

0.02至0.03%(w/v)聚山梨酯80；

240mM第一稳定剂，其中所述第一稳定剂是选自下组的糖类：海藻糖二水合物和蔗糖，优选地蔗糖；

10mM甲硫氨酸作为第二稳定剂；

pH为5.5±0.3。

在某些实施方案中，依照本发明的配制剂不包含氯化钠。在某些实施方案中，配制剂不包含二价阳离子。在某些实施方案中，配制剂不包含乳糖酸。在某些实施方案中，配制剂不包含多元醇。在某些实施方案中，配制剂不包含右旋糖苷。

依照本发明的配制剂可以为液体形式、冻干形式或自冻干形式重建的液体形式。在某些实施方案中，配制剂为液体形式。

如本文中结合依照本发明的配制剂使用的，术语“液体”意指于至少约2至约8°C的温度在大气压下作为液体的配制剂。

如本文中结合依照本发明的配制剂使用的，术语“冻干的”意指通过本领域中本身已知的冷冻-干燥方法制造的配制剂。通过冷冻，接着在真空下将冰升华，并于升高的温度脱附残留水来除去溶剂（例如水）。冻干物通常具有约0.1至5%(w/w)的残留水分，并且以粉末或物理上稳定的片饼存在。冻干物以在添加重建介质后快速溶解为特征。

如本文中结合依照本发明的配制剂使用的，术语“重建形式”意指冻干并通过添加重建介质再溶解的配制剂。合适的重建介质包括但不限于注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液（例如0.9%(w/v)NaCl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性剂的溶液（例如，0.01%聚山梨酯20）、pH缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲溶液）。

依照本发明的配制剂是生理学耐受良好的，可以容易地制备，可以精确地分配，而且在贮存持续时间里、在重复冷冻和融化周期和机械压力期间就分解产物和聚集体而言是稳定的。它于冰箱温度(2-8°C)在一段超过1年的时间里是稳定的。

本发明进一步包括用于制备依照本发明的配制剂的方法。所述方法包括将IgG类抗EGFR抗体针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液更换，并在需要的情况中，通过渗滤浓缩抗体，接着将赋形剂（例如海藻糖二水合物、蔗糖、精氨酸、氯化钠、甲硫氨酸）以储备溶液添加至抗体溶液，接着将表面活性剂以储备溶液添加至抗体/赋形剂溶液，并且最终使用缓冲溶液将抗体浓度调节至期望的终浓度，由此也达到最终的赋形剂和表面活性剂浓度。

或者，也可以将赋形剂以固体添加至包含IgG类抗EGFR抗体的起始溶液。若IgG类抗EGFR抗体为固体（例如冻干物）形式，则可以通过首先将抗体在水或缓冲溶液（任选地，其包含一种或多种赋形剂）中溶解，随后以储备溶液或固体添加别的赋形剂来制备依照本发明的配制剂。有利地，也可以将IgG类抗EGFR抗体在包含所有其它赋形剂的溶液中直接溶解。可以已经在用于制备IgG类抗EGFR抗体的方法期间或该方法结束时添加依照本发明的配制剂中存在的一种或多种赋形剂，例如通过在制备抗体后实施的最终纯化步骤中将IgG类抗EGFR抗体在包含一种、超过一种或优选地所有配制剂赋形剂的溶液中直接溶解来进行。若包含抗体和赋形剂的溶液尚没有期望的pH，则这通过添加酸或碱，优选地使用已经存在于缓冲系统中的酸或碱来调节。这继之以无菌过滤。

本发明进一步包括依照本发明的配制剂用于制备可用于治疗疾病，特别是细胞增殖病症（其中表达EGFR，特别是其中与相同细胞类型的正常组织相比异常表达（例如过表达）EGFR）的用途。此类病症包括不同类型的癌症，诸如膀胱、脑、头和颈、胰腺、肺、乳腺、卵巢、结肠、前列腺、皮肤、和肾癌。可以通过本领域中已知的方法和那些记载于WO 2006/082515和WO2008/017963的方法（例如，经由免疫组织化学测定法、免疫荧光测定法、免疫酶测定法、ELISA、流式细胞术、放射性免疫测定法、Western印迹、配体结合、激酶活性等）来测定EGFR表达水平。

可以通过本领域中已知的多种方法来施用本发明的组合物。如熟练技术人员会领会的，施用路径和/或模式会随期望的结果而有所变化。

为了通过某些施用路径来施用本发明的组合物，可能有必要将组合物在稀释剂中稀释。药学可接受稀释剂包括盐水、葡萄糖、林格(Ringer)和水性缓冲溶液。

优选地，通过静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)或任何其它胃肠外施用手段诸如那些在药学领域中已知的手段来施用依照本发明的配制剂。

如本文中所使用的，短语“胃肠外施用”意指通常通过注射进行的与肠和表面施用不同的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

组合物必须是无菌的，而且是流体的，其程度使得组合物通过注射器或输注系统可投递。在水外，载体可以是等张缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等）及其合适的混合物。

可以通过本领域中已知的方法，例如超滤-渗滤、透析、添加和混合、冻干、重建及其组合来制备依照本发明的配制剂。下文可以找到制备依照本发明的配制剂的例子。

实施例更为详细地解释本发明，但是不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确地完整收录本文中所引用的所有专利和科学文献的公开内容。

实施例

依照本发明的IgG类抗EGFR抗体配制剂是基于使用如下文所概述的通用制备和分析方法和测定法得到的如下文所提供的实验结果开发的。

实施例1：配制剂组分的制备

通过一般自重组蛋白生成已知的技术来制造IgG类抗EGFR抗体hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗。制造此抗体的技术记载于WO 2006/082515和WO 2008/017963。简言之，自母细胞库将如在WO 2006/082515和WO2008/017963中所描述的那样制备的经遗传工程改造的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)在细胞培养物中扩充。使用在MabSelect SuRe^TM柱(GE)上的蛋白A亲和层析，接着是在Capto S^TM柱(GE)上的阳离子交换层析，及最终在Capto Q^TM柱(GE)上的阴离子交换层析步骤自条件化细胞培养基纯化hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗。使用Pro膜(Millipore)通过纳米过滤除去病毒，将抗体浓缩，并通过渗滤转移入期望的缓冲液中。对于制备依照这些例子的配制剂，在20mM组氨酸缓冲液（L-组氨酸/HCl缓冲液）（pH为约6.0）中以约20mg/ml的浓度提供hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗抗体。

依照本发明的配制剂的赋形剂在实践中广泛使用，并且是本领域技术人员已知的。因此，不需要在本文详细解释它们。

如下开发依照本发明的液体药物产品配制剂。

实施例2：液体配制剂的制备

对于制备液体配制剂，将hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液更换，并且在需要的情况中，通过渗滤浓缩至约50-80mg/ml的抗体浓度。在完成渗滤操作后，将赋形剂（例如，海藻糖、氯化钠、甲硫氨酸）以储备溶液添加至抗体溶液。然后，将表面活性剂以50至200倍储备溶液添加。最后，用缓冲液将蛋白质浓度调节至约25mg/ml或约50mg/ml的最终hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗抗体浓度。

将所有配制剂无菌过滤通过0.22μm低蛋白质结合滤器，并在无菌条件下填充入无菌6ml玻璃管形瓶中，用经ETFE（乙烯和四氟乙烯的共聚物）包被的橡胶塞和铝压褶帽(crimp cap)密封。填充体积是约2.4ml。将这些配制剂在不同ICH温度条件（5°C、25°C和40°C）贮存不同时间间隔，并通过摇动（于5°C和25°C以200min-1的摇动频率持续1周）和冷冻-融化压力法来施压。在应用压力测试之前和之后通过下列分析方法来分析样品：

1)UV分光光度法；

2)大小排阻层析(SEC)；

3)通过离子交换层析(IEC)；

4)通过溶液的浊度；

5)检查可见颗粒。

在Perkin Elmer λ35 UV分光光度计上以240nm至400nm的波长范围实施用于测定蛋白质含量的UV分光光度术。用相应的配制缓冲液将纯的蛋白质样品稀释至约0.5mg/ml。依照等式1计算蛋白质浓度。

等式1：

针对320nm的光散射校正280nm的UV光吸收，并乘以稀释倍数（其自纯样品和稀释缓冲液的加权质量和密度确定）。用分子除以比色皿的路径长度d和消光系数ε的乘积。

使用大小排阻层析(SEC)来检测配制剂中的可溶性高分子量种类（聚集体）和低分子量水解产物(LMW)。在具有Waters W2487双重吸光度检测仪并装备有TosoHaas TSK凝胶G3000SWXL柱的Waters Alliance 2695 HPLC仪上实施该方法。使用200mM磷酸钠，pH 7.0作为流动相通过等度洗脱模式来分开完整的单体、聚集体和水解产物，并以280nm的波长检测。

实施离子交换层析(IEC)以检测配制剂中改变hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗的净电荷的化学降解产物。该方法使用装备有UV检测仪（检测波长280nm）和Dionex ProPac WCX-10柱(4mm x 250mm)的合适的HPLC仪。分别使用水中的10mM磷酸钠缓冲液pH 6.0和10mM磷酸钠缓冲液pH 6.0+750mM NaCl作为流动相A和B，流速为1.0mL/分钟。

为了测定浊度，于室温使用HACH 2100AN浊度计以FTU（浊度单位）测量乳光。

通过使用Seidenader V90-T目视检查仪对样品分析可见颗粒。

下文添加的表1中提供了配制剂A至L的稳定性测试结果。

结果显示，为了获得最大抗体稳定性和没有颗粒的抗体配制剂，使用L-组氨酸/HCl缓冲液比使用乙酸钠缓冲液更有利，而糖类诸如海藻糖二水合物和蔗糖是最有利的稳定剂，且聚山梨酯80是最有利的表面活性剂。

Claims (20)

1.一种药物配制剂，其包含：

1至200mg/ml IgG类抗EGFR抗体；

1至100mM缓冲剂；

0.001至1%(w/v)表面活性剂；

1至500mM至少一种稳定剂，

pH范围为4.0至7.0。

2.依照权利要求1的配制剂，其中所述IgG类抗EGFR抗体浓度范围为1至100mg/ml。

3.依照权利要求1或2的配制剂，其中所述缓冲剂是组氨酸缓冲液或乙酸盐缓冲液。

4.依照权利要求1至3中任一项的配制剂，其中所述缓冲剂的浓度为10至50mM。

5.依照权利要求1至4中任一项的配制剂，其中所述缓冲剂提供5.0至6.0的pH。

6.依照权利要求1至5中任一项的配制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨酯。

7.依照权利要求1至6中任一项的配制剂，其中所述表面活性剂的浓度为0.01至0.1%(w/v)。

8.依照权利要求1至7中任一项的配制剂，其中至少一种稳定剂选自下组：盐、糖类、和氨基酸。

9.依照权利要求1至8中任一项的配制剂，其中所述至少一种稳定剂的浓度为120至300mM。

10.依照权利要求1至9中任一项的配制剂，其包含选自盐、糖和氨基酸的组的第一稳定剂和作为第二稳定剂的甲硫氨酸。

11.依照权利要求10的配制剂，其中所述第一稳定剂的浓度为120至300mM，且所述第二稳定剂甲硫氨酸的浓度为5至25mM。

12.依照权利要求1至11中任一项的配制剂，其包含：

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体；

15至30mM缓冲剂，其选自L-组氨酸和乙酸钠；

0.02至0.05%(w/v)表面活性剂，其选自聚山梨酯20和聚山梨酯80；

120至300mM至少一种稳定剂，其选自海藻糖二水合物、蔗糖、盐酸精氨酸和氯化钠；

任选地，5至25mM甲硫氨酸作为第二稳定剂；

pH为5.5±0.3。

13.依照权利要求1至12中任一项的配制剂，其包含：

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖二水合物、0.02至0.03%(w/v)聚山梨酯80，pH 5.5；

或

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体、20mM L-组氨酸、155mM盐酸精氨酸、0.02%(w/v)聚山梨酯80，pH 5.5；

或

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖二水合物、0.02至0.03%(w/v)聚山梨酯80、10mM甲硫氨酸，pH 5.5；

或

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体、20mM L-组氨酸、240mM蔗糖、0.02至0.03%(w/v)聚山梨酯80，pH 5.5；

或

10至50mg/ml IgG类抗EGFR抗体、20mM L-组氨酸、240mM蔗糖、0.02至0.03%(w/v)聚山梨酯80、10mM甲硫氨酸，pH 5.5。

14.依照权利要求1至13中任一项的配制剂，其包含：

20至50mg/ml hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗；

20mM L-组氨酸；

0.02至0.03%(w/v)聚山梨酯80；

240mM第一稳定剂，其中所述第一稳定剂是选择海藻糖二水合物和蔗糖的糖；

10mM甲硫氨酸作为第二稳定剂；

pH为5.5±0.3。

15.依照权利要求1至14中任一项的配制剂，其中所述IgG类抗EGFR抗体是人源化抗体，并且包含：

a)在重链可变域中SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:16的CDR2和SEQIDNO:31的CDR3，和

b)在轻链可变域中SEQ ID NO:33的CDR1、SEQ ID NO:34的CDR2和SEQID No:35的CDR3。

16.依照权利要求1至15中任一项的配制剂，其中所述IgG类抗EGFR抗体是hu-ICR62 IgG1抗EGFR单抗。

17.依照权利要求1至16中任一项的配制剂，其中所述IgG类抗EGFR抗体已经被糖工程化改造成与非糖工程化改造抗体相比在其Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。

18.依照权利要求1至17中任一项的配制剂，其为液体形式、冻干形式或自冻干形式重建的液体形式。

19.依照权利要求1至18中任一项的配制剂用于制备可用于治疗癌症的药物的用途。

20.如本文中所描述的发明。