CN111202845A - 包含抗cd20抗体的药物配制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含抗CD20抗体的药物配制剂及其制备方法和应用。该药物配制剂包含：1)50‑200mg/ml抗CD20抗体；2)10‑50mM缓冲剂，所述缓冲剂为组氨酸缓冲剂；3)105‑420mMα,α‑二水合海藻糖；4)5‑20mM甲硫氨酸；和5)0.01‑0.12％非离子型表面活性剂；所述包含抗CD20抗体的药物配制剂的pH为5.5±2.0；优选地，该药物配制剂中还可包含透明质酸酶。本发明制备得到的包含抗CD20抗体的药物配制剂表现出优异的稳定性。

Description

包含抗CD20抗体的药物配制剂及其制备方法和应用

本申请要求申请日为2018年11月22日的中国专利申请CN201811403257.6的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。另外，本申请引用申请日为2010年03月17日的中国专利申请CN 201010150303.3的全文。

技术领域

本发明涉及一种包含抗CD20抗体的药物配制剂及其制备方法和应用。

背景技术

抗体的药学用途在过去数年里已经增加。在许多情况中，经由静脉内(IV)路径注射或输注此类抗体。但是，静脉输注对于输液环境要求较高，且操作复杂。而皮下注射的优点在于它容许医学从业人员在相当短的时间内对患者实施药物，进行干预。此外，还可以训练患者自己实施皮下注射。通常，经由皮下路径的注射限于约2ml。对于需要多剂的患者，可以在身体表面的多个部位注射多个单位剂量配制剂。

皮下施用的下列抗体已有市售产品。

HUMIRA^TM(阿达木单抗(Adalimumab))是一种针对肿瘤坏死因子α(TNFα)的单克隆抗体，其目前在欧洲以用于皮下应用的、0.8ml注射体积中的40mg剂量形式销售(浓度：50mg抗体/ml注射体积)。

XOLAIR^TM(奥马珠单抗(Omalizumab))是一种针对免疫球蛋白E的单克隆抗体(抗IgE)，其目前以150mg冻干粉末(含有抗体、蔗糖、组氨酸和一水合盐酸组氨酸和聚山梨酯20)形式销售，所述冻干粉末应当用皮下注射用水重建以产生125mg/ml注射剂量。

美罗华(利妥昔单抗)是一种针对CD20抗原的单克隆抗体，其目前以应用于皮下施用、500mg/50ml/瓶的剂量形式销售。

对皮下注射胃肠外药物一般限于小于2ml的体积，这是由于皮下(SC)组织中对水力传导的此粘弹性阻力和注射后产生的反压力[Aukland K.和Reed R.,“Interstitial-Lymphatic Mechanisms in the control of Extracellular Fluid Volume”,hysiologyReviews,1993；73:1-78]，及由于疼痛的感觉所致。

尽管目前在市场上可购得适合于皮下施用的高度浓缩的稳定的人源化抗CD20抗体配制剂。但是，高浓度蛋白质配制剂的制备是非常有挑战性的，需要使每种配制剂适合于所使用的特定蛋白质，因为每种蛋白质具有不同的聚集行为。怀疑聚集体至少在一些情况中引起治疗性蛋白质的免疫原性。针对蛋白质或抗体聚集体的免疫原性反应可以导致中和性抗体，其可以使治疗性蛋白质或抗体无效。似乎蛋白质聚集体的免疫原性在与皮下注射的关联时最成问题，由此重复施用增加免疫应答的风险。

即使抗体具有非常相似的整体结构，但是不同的抗CD20抗体在氨基酸组成(特别是在负责结合抗原的可变区中)方面有所不同。进一步地，抗体在进行翻译后修饰等步骤后，会导致一系列的变化，诸如电荷和糖基化变体等等。因此，如何针对不同种类的抗CD20抗体提供高浓度的、稳定的、可供皮下注射的药物配制剂成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中人源化抗CD20抗体制剂种类单一，且不同种类的人源化抗CD20抗体所适用的制剂环境不同的缺陷，而提供了一种包含抗CD20抗体的药物配制剂及其制备方法和应用。本发明所提供的包含抗CD20抗体的药物配制剂稳定性良好。

在第一方面，本发明提供了一种包含抗CD20抗体的药物配制剂。

本发明中，所述包含抗CD20抗体的药物配制剂可按本领域常规的施用方式进行施用，一般而言，包含抗体的药物配制剂应为非胃肠道的施用方式。优选地，所述包含抗CD20抗体的药物配制剂为静脉施用或皮下施用。

本发明提供了一种包含抗CD20抗体的药物配制剂，其包含：

1)50-200mg/ml抗CD20抗体，所述抗CD20抗体的重链可变区选自如中国专利申请CN 201010150303.3中SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：36所示的序列或其突变序列，所述抗CD20抗体的轻链可变区选自如中国专利申请CN 201010150303.3中SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37所示的序列或其突变序列；

2)10-50mM缓冲剂，所述缓冲剂为组氨酸缓冲剂；

3)105-420mMα,α-二水合海藻糖；

4)5-20mM甲硫氨酸；和

5)0.01-0.12％非离子型表面活性剂；

所述包含抗CD20抗体的药物配制剂的pH为5.5±2.0。

本发明中，优选地，所述包含抗CD20抗体的药物配制剂包含：

1)50-200mg/ml抗CD20抗体，所述抗CD20抗体的重链可变区选自如中国专利申请CN 201010150303.3中SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：36所示的序列或其突变序列，所述抗CD20抗体的轻链可变区选自如中国专利申请CN 201010150303.3中SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37所示的序列或其突变序列；

2)10-40mM缓冲剂，所述缓冲剂为组氨酸缓冲剂；

3)105-420mMα,α-二水合海藻糖；

4)5-20mM甲硫氨酸；和

5)0.03-0.12％非离子型表面活性剂；

所述包含抗CD20抗体的药物配制剂的pH为5.5±2.0。

本发明中，所述包含抗CD20抗体的药物配制剂可以以液体形式提供或者可以以冻干形式提供。可以通过重建冻干配制剂以提供比冻干步骤前的混合物中的蛋白质浓度大大约2-40倍的重建配制剂中的蛋白质浓度来提高重建的配制剂中的抗体浓度。

本发明中，所述抗CD20抗体的浓度优选为50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml或200mg/ml。

本发明中，优选地，所述抗CD20抗体的重链可变区为如中国专利申请CN201010150303.3中SEQ ID NO：16所示的序列或其突变序列，所述抗CD20抗体的轻链可变区为如中国专利申请CN 201010150303.3中SEQ ID NO：35所示的序列或其突变序列。

本领域技术人员知晓，所述抗CD20抗体的重链可变区和轻链可变区可分别连接重链恒定区和轻链恒定区，优选连接来源于健康人B淋巴细胞的重链恒定区IgG1、轻链恒定区κ，从而获得完整的重链和轻链，将不同的重链和轻链进行组合获得所需的抗体分子。

本发明中，所述缓冲剂的浓度优选为10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或50mM。

本领域技术人员知晓，所述组氨酸缓冲剂一般是指包括组氨酸根离子的缓冲剂。所述组氨酸缓冲剂优选为L-组氨酸缓冲剂，更优选为L-组氨酸盐酸盐缓冲剂。

当所述缓冲剂为组氨酸盐缓冲剂时，所述缓冲剂的浓度优选为20mM。

本发明中，所述包含抗CD20抗体的药物配制剂的pH优选为4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。

本发明中，所述α,α-二水合海藻糖的浓度优选为105mM、150mM、200mM、210mM、250mM、300mM、350mM、400mM或420mM。

本发明中，所述甲硫氨酸的浓度优选为5mM、10mM、15mM或20mM。

本发明中，所述甲硫氨酸优选为L-甲硫氨酸。

本发明中，所述非离子型表面活性剂的浓度优选为0.01％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、0.1％(w/v)、0.11％(w/v)或0.12％(w/v)。

本发明中，所述非离子型表面活性剂可为本领域常规的非离子型表面活性剂，优选为聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188和聚乙烯-聚丙烯共聚物中的一种或多种，更优选为聚山梨酯80。

当所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯80时，所述非离子型表面活性剂的浓度优选为0.06％(w/v)。

本发明中，优选地，所述抗CD20抗体制剂还包含透明质酸酶。

其中，所述透明质酸酶的浓度优选为1000-12000U/ml，其中基于假定的比活性100000U/mg，所述量对应于约0.01-0.15mg蛋白质；所述透明质酸酶的浓度更优选为1000-4000U/ml，甚至更优选为1200U/ml、1400U/ml、1600U/ml、1800U/ml、2000U/ml、2200U/ml、2400U/ml、2600U/ml、2800U/ml、3000U/ml、3200U/ml、3400U/ml、3600U/ml、3800U/ml、4000U/ml、8000U/ml或12000U/ml。

其中，所述透明质酸酶优选为PH20，更优选为rHuPH20。

所述PH20优选为购自苏州康聚的PH20。

所述rHuPH20优选为购自苏州康聚的rHuPH20。

本领域技术人员知晓，上述透明质酸酶的浓度对应于最初对配制剂添加的透明质酸酶量。透明质酸酶以组合的最终配制剂存在或者供共施用使用，例如作为共配制剂。所要求保护的配制剂的重要问题是在它准备好使用和/或注射时，它具有所要求保护的组成。

本领域技术人员知晓，透明质酸酶可以自动物、人样品衍生或者基于重组DNA技术来制造，如下文进一步描述的。

本领域中，已经提出了通过使用少量可溶性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)来促进治疗性蛋白质和抗体的皮下注射。已经显示了，此类可溶性透明质酸酶糖蛋白(作为组合的配制剂或者通过共施用)的添加促进对下皮施用治疗性药物。通过快速解聚胞外空间中的乙酰透明质酸HA，sHASEGP降低间质的粘性，由此提高水力传导，并且容许安全且舒适地将较大体积施用入皮下组织中。经由降低的间质粘性由sHASEGP诱导的升高的水力传导容许更大的分散，这潜在地提高SC施用的治疗性药物的系统生物利用度。

因此，包含可溶性透明质酸酶糖蛋白的本发明的高度浓缩的稳定的药物配制剂特别适合于皮下注射。本领域技术人员清楚地理解，可以提供包含抗CD20抗体和可溶性透明质酸酶糖蛋白的此类配制剂来以一种单一组合配制剂形式或备选地以可以在临皮下注射前混合的两种分开的配制剂形式施用。或者，可以将抗CD20抗体和可溶性透明质酸酶糖蛋白以分开注射在身体的不同部位，优选地在彼此紧密相邻的部位施用。也有可能以连续注射形式注射依照本发明的配制剂中存在的治疗剂，例如首先是可溶性透明质酸酶糖蛋白，接着注射抗CD20抗体配制剂。这些注射也可以以相反的次序实施，即通过首先注射抗CD20抗体配制剂，接着注射可溶性透明质酸酶糖蛋白来进行。在以分开注射施用抗CD20抗体和可溶性透明质酸酶糖蛋白的情况中，必须给蛋白质中的一种或两者提供如所附权利要求书中所规定浓度的缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂，但是排除透明质酸酶。然后，可以在例如L-组氨酸/HCl缓冲液(pH为约6.5)、100至150mM NaCl和0.01至0.1％(w/v)聚山梨酯20或聚山梨酯80中提供透明质酸酶。在一个优选的实施方案中，以如所附权利要求书中规定的浓度给抗CD20抗体提供缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂。

如上文记录的，可以认为可溶性透明质酸酶糖蛋白是抗CD20配制剂中的别的赋形剂。可溶性透明质酸酶糖蛋白可以在制造抗CD20配制剂时添加至抗CD20配制剂或者可以在注射前不久添加。或者，可以以分开注射提供可溶性透明质酸酶糖蛋白。在后一种情况中，可溶性透明质酸酶糖蛋白可以在分开的管形瓶中冻干形式提供，在皮下注射发生前必须用合适的稀释剂重建，或者可以由制造商以液体配制剂提供。抗CD20配制剂和可溶性透明质酸酶糖蛋白可以以分开的实体获得或者也可以以包含注射组分两者和关于其皮下施用的指令的试剂盒提供。还可以提供适合于重建和/或施用配制剂中的一种或两者的合适指令。

许多可溶性透明质酸酶糖蛋白是现有技术中已知的。为了进一步限定此类可溶性透明质酸酶糖蛋白的功能、作用机制和特性，提供了以下背景信息。

SC(皮下)间质基质由糖胺聚糖的粘弹性凝胶内包埋的纤维状蛋白质的网络构成。乙酰透明质酸(HA)，即一种非硫酸化重复线性二糖是SC组织的主要糖胺聚糖。HA由成纤维细胞以一种高分子量兆道尔顿粘性聚合物分泌入间质中，随后，其局部地，在淋巴中、及在肝中经由溶酶体透明质酸酶和外切糖苷酶的作用降解。身体中的约50％乙酰透明质酸是由SC组织生成的，其中它以约0.8mg/gm湿重组织找到[AuklandK.和ReedR.,“Interstitial-Lymphatic Mechanisms in the control of Extracellular Fluid Volume”,PhysiologyReviews”,1993；73:1-78]。估计平均70kg成人含有15克HA，其中每天周转(合成和降解)30％[LaurentL.B.等,“Catabolism of hyaluronan in rabbit skin takesplace locally,in lymph nodes and liver”,Exp.Physiol.1991；76:695-703]。作为皮下基质的凝胶样组分的主要成分，HA显著促成其粘性。

糖胺聚糖(GAG)是胞外基质(ECM)的复杂线性多糖。GAG以N-取代的己糖胺和糖醛酸(在乙酰透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)、软骨素(C)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸乙酰肝素(HS)、和肝素(H)的情况中)，或半乳糖(在硫酸角质素(KS)的情况中)的重复二糖结构为特征。除了HA外，所有都以与核心蛋白共价结合方式存在。GAG及其核心蛋白在结构上称为蛋白聚糖(PG)。

在哺乳动物中，主要在结缔组织、皮肤、软骨中，及在滑液中找到乙酰透明质酸(HA)。乙酰透明质酸也是眼的玻璃体的主要组分。在结缔组织中，与乙酰透明质酸有关的水合水产生组织间的水合基质。乙酰透明质酸在与细胞运动性有关的生物学现象，包括快速发育、再生、修复、胚胎发生、胚胎学发育、伤口愈合、血管发生、和肿瘤发生中发挥关键的作用(Toole,CellBiol.Extracell.Matrix,Hay(编),PlenumPress,NewYork,1991；第1384页-第1386页；Bertrand等,Int.J.Cancer哦1992；52:1-6；Knudson等,FASEBJ.1993；7:1233-1241]。另外，乙酰透明质酸水平与肿瘤攻击性相关联[Ozello等,Cancer Res.1960；20:600-604；Takeuchi等,Cancer Res.1976；36:2133-2139；Kimata等,Cancer Res.1983；43:1347-1354]。

在许多细胞的胞外基质中，特别地在软结缔组织中找到HA。已经给HA分配各种生理学功能，诸如在水和血浆蛋白质稳态中[LaurentT.C.等,FASEBJ.,1992；6:2397-2404]。HA生成在增殖细胞中增加，并且可以在有丝分裂中发挥作用。它还已经牵涉移动和细胞迁移。HA似乎在细胞调节、发育、和分化中发挥重要的作用[Laurent等,见上文]。

已经在临床医学中广泛使用HA。其组织保护和流变学特性已经证明为可用于眼科手术(例如以在白内障手术期间保护角膜内皮)。血清HA是肝疾病和各种炎性状况，诸如类风湿性关节炎的诊断。由HA积累引起的间质水肿可以引起各个器官的功能障碍[Laurent等,见上文]。

乙酰透明质酸蛋白质相互作用也牵涉胞外基质或“基质”的结构。

透明质酸酶是遍及动物界找到的一组一般中性或酸性活性酶。透明质酸酶就底物特异性和作用机制而言有所变化(WO2004/078140)。存在着三大类透明质酸酶：

1.哺乳动物型透明质酸酶(EC3.2.1.35)，其是以四糖和六糖作为主要终产物的内切-β-N-乙酰基己糖胺酶。它们具有水解和转糖苷酶活性两者，并且可以降解乙酰透明质酸和硫酸软骨素(CS)，一般地C4-S和C6-S。

2.细菌透明质酸酶(EC4.2.99.1)降解乙酰透明质酸及以各种程度降解CS和DS。它们是内切-β-N-乙酰基己糖胺酶，其通过主要生成二糖终产物的β消除反应运行。

3.来自水蛭、其它寄生物、和甲壳动物的透明质酸酶(EC3.2.1.36)是经由水解β1-3连接生成四糖和六糖终产物的内切-β-葡糖醛酸糖苷酶。

哺乳动物透明质酸酶可以进一步分成两组：中性活性和酸性活性酶。人基因组中存在着6种透明质酸酶样基因，即HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。HYALP1是一种假基因，并且尚未显示HYAL3拥有针对任何已知底物的酶活性。HYAL4是一种软骨素酶，并且展现出很少的针对乙酰透明质酸的活性。HYAL1是原型酸性活性酶，而PH20是原型中性活性酶。一般地，酸性活性透明质酸酶，诸如HYAL1和HYAL2在中性pH(即pH7)缺乏催化活性。例如，HYAL1在体外超过pH4.5具有很少的催化活性[FrostI.G.和Stern,R.,“Amicrotiter-based assay for hyaluronidase activity notrequiring specializedreagents”,Anal.Biochemistry,1997；251:263-269]。HYAL2是一种在体外具有非常低的比活性的酸性活性酶。

透明质酸酶样酶也可以以那些一般经由糖基磷脂酰肌醇锚锁定质膜的酶，诸如人HYAL2和人PH20[Danilkovitch-Miagkova等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2003；100(8):4580-4585；Phelps等,Science1988；240(4860):1780-1782]，和那些一般可溶的酶，诸如人HYAL1[Frost,I.G.等,“Purification,cloning,and expression of human plasmahyaluronidase”,Biochem.Biophys.Res.Commun.1997；236(l):10-15]为特征。然而，存在着物种间的变化：例如牛PH20非常松散地附着于质膜，并且没有经由磷脂酶敏感性锚来锚定[Lalancette等,Biol.Reprod.,2001；65(2):628-36]。牛透明质酸酶的此独特特征已经容许使用可溶性牛睾丸透明质酸酶作为临床使用的提取物(WydaseTM,HyalaseTM)。其它PH20种类是脂质锚定的酶，其一般在不使用去污剂或脂肪酶的情况中是不可溶的。例如，人PH20经由GPI锚而锚定于质膜。尝试生成人PH20，不会将质锚引入多肽中的DNA构建体生成无催化活性的酶，或不溶性的酶[Arming等,Eur.J.Biochem.,1997；1；247(3):810-4]。以可溶性和膜结合形式两者找到天然存在的弥猴精子透明质酸酶。虽然64kDa膜结合形式在pH7.0拥有酶活性，但是54kDa形式仅在pH4.0有活性[Cherr等,Dev.Biol.,1996；10；175(l):142-53]。如此，PH20的可溶性形式经常在中性条件下缺乏酶活性。

如上文所记录的且依照WO2006/091871和美国专利No.7,767,429中的教导，可以将少量可溶性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)引入配制剂中以便于将治疗性药物施用入下皮中。通过快速解聚胞外空间中的HA，sHASEGP降低间质的粘性，由此提高水力传导，并且容许安全且舒适地将较大体积施用入SC组织中。经由降低的间质粘性由sHASEGP诱导的升高的水力传导容许更大的分散，这潜在地提高SC施用的治疗性药物的系统生物利用度。

在下皮中注射时，sHASEGP对HA的解聚定位于SC组织中的注射部位。实验证据显示sHASEGP在小鼠中以半衰期13至20分钟在间质空间中局部失活，在CD-1小鼠中静脉内单剂后在血液中没有可检出的系统吸收。在血管区室内，sHASEGP在多至0.5mg/kg剂量的情况中在小鼠和猕猴中分别表明2.3和5分钟的半衰期。与HA底物在SC组织中的连续合成组合，sHASEGP快速清除导致其它共注射分子的瞬时的且局部有活性的渗透增强，该效应在施用后24至48小时内完全可逆[BywatersG.L.等,“Reconstitution of the dermal barrierto dye spread after Hyaluronidase injection”,Br.Med.J.,1951；2(4741):1178-1183]。

在其对局部液体分散的影响外，sHASEGP还充当吸收增强剂。大于16千道尔顿(kDa)的大分子大多排除在经由扩散通过毛细管的吸收之外，并且大多经由引流淋巴结吸收。因此，皮下施用的大分子，诸如例如治疗性抗体(分子量约150kDa)必须穿过间质基质，之后到达引流淋巴系统，随后吸收入血管区室中。通过提高局部分散，sHASEGP增加许多大分子的吸收速率(Ka)。相对于在没有sHASEGP的情况中的SC施用，这导致升高的峰血液水平(Cmax)，而且潜在地导致升高的生物利用度[BookbinderL.H.,等,“A recombinant humanenzyme for enhanced interstitial transport of therapeutics”,J.Control.Release2006；114:230-241]。

动物起源的透明质酸酶产品已经在临床上使用超过60年，主要用于提高其它共施用的药物的分散和吸收及用于皮下输液(大体积的流体的SC注射/输注)[FrostG.I.,“Recombinant human hyaluronidase:an enabling platform for subcutaneous drugand fluid administration”,Expert Opinion on Drug Delivery,2007；4:427-440]。关于透明质酸酶作用机制的详情已经详细记载于下列出版物：Duran-ReynoldsF.，“Aspreading factor in certain snake venoms and its relation to their mode ofaction”,CR Soc Biol Paris,1938；69-81；ChainE.,“A mucolytic enzyme in testesextracts”,Nature1939；977-978；WeissmannB.,“The transglycosylative action oftesticular hyaluronidase”,J.Biol.Chem.,1955；216:783-94；Tammi,R.,Saamanen,A.M.,Maibach,H.I.,TammiM.,“Degradation of newly synthesized high molecularmass hyaluronan in the epidermal and dermal compartments of human skin inorgan culture”,J.Invest.Dermatol.1991；97:126-130；Laurent,U.B.G.,Dahl,L.B.,Reed,R.K.,“Catabolism of hyaluronan in rabbit skin takes place locally,inlymph nodes and liver”,Exp.Physiol.1991；76:695-703；Laurent,T.C.和Fraser,J.R.E.,“Degradation of Bioactive Substances:Physiology and Pathophysiology”,Henriksen,J.H.(Ed)CRCPress,BocaRaton,FL；1991.第249页-第265页；Harris,E.N.等,“Endocytic function,glycosaminoglycan specificity,and antibody sensitivity ofthe recombinant human 190-kDa hyaluronan receptor for endocytosis(HARE)”,J.Biol.Chem.2004；279:36201-36209；Frost,G.I.,“Recombinant human hyaluronidase:an enabling platform for subcutaneous drug and fluid administration”,ExpertOpinion on Drug Delivery,2007；4:427-440。在EU国家得到批准的透明质酸酶产品包括“Dessau”和在美国得到批准的动物起源的透明质酸酶产品包括VitraseTM、HydaseTM、和AmphadaseTM。

已经广泛建立了透明质酸酶产品的安全性和功效。所鉴定的最重大的安全性风险是超敏感性和/或变应原性，认为其与动物衍生的制备物的纯度缺乏相关[Frost,G.I.,“Recombinant human hyaluronidase:an enabling platform for subcutaneous drugand fluid administration”,Expert Opinion on Drug Delivery,2007；4:427-440]。应当注意，在英国、德国与美国间就动物衍生的透明质酸酶的批准剂量而言有差异。在英国，作为皮下或肌肉内注射佐剂的常用剂量是对注射直接添加的1500个单位。在美国，出于此目的使用的常用剂量是150个单位。在皮下输液中，使用透明质酸酶来帮助相对大体积的流体的皮下施用。在英国，一般以皮下使用的每500至1000ml流体给予1500个单位的透明质酸酶。在美国，认为150个单位对于每升皮下输液溶液是足够的。在德国，认为150至300个单位对于此目的是足够的。在英国，通过添加1500个单位来加速局部麻醉剂的扩散。在德国和美国，认为150个单位对于此目的是足够的。虽然有剂量差异(在英国的剂量比在美国高10倍)，但是尚无报告分别在美国和英国销售的动物衍生的透明质酸酶产品的安全性概况明显差异。

在2005年12月2日，HalozymeTherapeuticsInc.收到来自FDA的关于重组人透明质酸酶(HYLENEX^TM)的可注射配制剂的批准。FDA批准150个单位的剂量的HYLENEX^TM用于下列适应症的SC施用：

-作为佐剂以提高其它注射药物的吸收和分散

-用于皮下输液

-作为SC尿路造影术中的辅助物以改善不透射线剂的吸收。

作为所述管理审阅的一部分，建立的是，苏州康聚产透明质酸酶拥有与先前批准的动物衍生的透明质酸酶制备物相同的增强其它注射药物分散和吸收的特性，但是具有改善的安全性概况。具体地，与动物衍生的透明质酸酶相比，重组人透明质酸酶(苏州康聚产透明质酸酶)的使用使被动物病原体污染和传染性海绵状脑病的潜在风险最小化。

如下文进一步概述的详细实验工作已经显示了，令人惊讶地，所要求保护的配制剂具有有利的贮存稳定性，而且满足健康权力机构批准的所有必需要求。

认为依照本发明的配制剂中的透明质酸酶增强抗CD20抗体对系统循环的投递，例如通过增加活性物质的吸收来实现(它充当渗透增强剂)。认为透明质酸酶还通过可逆水解乙酰透明质酸(即SC间质组织的一种胞外组分)来提高治疗性抗CD20抗体经由皮下应用路径对系统循环的投递。下皮中的乙酰透明质酸水解暂时打开SC组织的间质空间中的通道，并且由此改善治疗性抗CD20抗体对系统循环的投递。另外，施用显示了人的疼痛降低和SC组织的体积衍生的肿胀较小。

透明质酸酶在局部施用时在局部具有其全部效应。换言之，透明质酸酶在数分钟中局部失活并代谢，而且尚未注意到具有系统或长期效应。在透明质酸酶进入血流时它在数分钟内快速失活排除在不同透明质酸酶产品间实施可比较的生物分布研究的实际能力。此特性还使任何潜在的系统安全性忧虑最小化，这是因为透明质酸酶产品不能在远离的部位起作用。

依照本发明的所有透明质酸酶的统一特征是其解聚乙酰透明质酸的能力，不管化学结构、物种来源、组织来源、或源自相同物种和组织的药物产品的批次的差异。它们的与众不同之处在于如下的实情，尽管具有不同结构，它们的活性是相同的(除了效力外)。

依照本发明的配制剂的透明质酸酶以对本文中所描述的稳定的药物配制剂中的抗CD20抗体的分子完整性没有不利影响为特征。此外，透明质酸酶仅仅修饰抗CD20抗体对系统循环的投递，但是不拥有可以提供或促成系统吸收的抗CD20抗体的治疗效果的任何特性。透明质酸酶不是可系统性生物利用的，并且在依照本发明的稳定的药物配制剂的推荐贮存条件没有不利地影响抗CD20抗体的分子完整性。因此，它被认为是依照本发明的抗CD20抗体配制剂中的赋形剂。因为它不施加治疗效果，所以它代表除治疗活性抗CD20抗体外的药学形式组分。依照本发明的许多合适的透明质酸酶自现有技术已知。优选的酶是人透明质酸酶，最优选地称为苏州康聚产透明质酸酶的酶。苏州康聚产透明质酸酶是通过水解N-乙酰基葡糖胺的C1位置与葡糖醛酸的C4位置间的β-1,4连接来解聚乙酰透明质酸的中性和酸性活性β-1,4糖基水解酶家族成员。乙酰透明质酸是一种在结缔组织，诸如皮下间质组织，和某些特化组织，诸如脐带和玻璃体液的胞内基质中找到的多糖。乙酰透明质酸的水解暂时地降低间质组织的粘性，并且促进注射流体或局部漏出液或渗出物的分散，如此便于其吸收。透明质酸酶的效果是局部的，并且在24至48小时内发生的组织乙酰透明质酸完全重建的情况中可逆。经由水解乙酰透明质酸的结缔组织渗透性升高与透明质酸酶在其提高共施用分子的分散和吸收能力方面的功效相关联。

人基因组含有数种透明质酸酶基因。仅PH20基因产物拥有生理学胞外条件下的有效透明质酸酶活性，并且充当铺展剂，而酸性活性透明质酸酶没有此特性。

苏州康聚产透明质酸酶是国内目前可用于治疗用途的第一种且唯一的重组人透明质酸酶。人基因组含有几种透明质酸酶基因；仅PH20基因产物拥有生理学胞外条件下的有效透明质酸酶活性，并且充当扩散剂。天然存在的人PH20蛋白具有将其锚定于质膜的附着于羧基端氨基酸的脂质锚。由苏州康聚开发的透明质酸酶是一种截短的删除变体，其缺乏负责脂质附着的羧基端的此类氨基酸。这生成与牛睾丸制备物中找到的蛋白质相似的可溶性中性pH活性酶。苏州康聚产透明质酸酶蛋白与35个氨基酸的信号肽一起合成，所述信号肽在分泌过程期间自N端除去。成熟的苏州康聚产透明质酸酶蛋白含有与一些牛透明质酸酶制备物中找到的N端氨基酸序列直向同源的真实N端氨基酸序列。

PH20透明质酸酶(包括动物衍生的PH20和重组人苏州康聚产透明质酸酶)通过水解N-乙酰基葡糖胺的C1位置与葡糖醛酸的C4位置间的β-1,4连接来解聚乙酰透明质酸。四糖是最小的消化产物[Weissmann,B.,“The transglycosylative action of testicularhyaluronidase”,J.Biol.Chem.,1955；216:783-94]。此N-乙酰基葡糖胺/葡糖醛酸结构未在重组生物学产物的N连接的聚糖中找到，并且因此，苏州康聚产透明质酸酶不会影响与其一起配制的抗体，诸如一种人源化抗CD20抗体的糖基化。苏州康聚产透明质酸酶自身拥有每个分子6个N连接的聚糖，其中核心结构与单克隆抗体中找到的核心结构相似。如预期的，这些N连接的结构不随时间变化，确认苏州康聚产透明质酸酶对这些N-连接的聚糖结构的酶活性的缺乏。苏州康聚产透明质酸酶的短半衰期和乙酰透明质酸的持续合成导致酶对组织的短的且局部的作用。

优选地，通过使用重组DNA技术来制备作为依照本发明的皮下配制剂中的赋形剂的透明质酸酶。因此，确保始终获得相同蛋白质(相同的氨基酸序列)，并且避免由自组织提取期间共纯化的污染性蛋白质引起的变应性反应。优选地，依照本发明的配制剂中使用的透明质酸酶是人酶，最优选的是苏州康聚产透明质酸酶。

已经在天然来源的哺乳动物透明质酸酶与来自人和其它哺乳动物的PH-20cDNA克隆间实施多重结构和功能比较。PH-20基因是重组产物苏州康聚产透明质酸酶使用的基因；然而，重组药物产物是一种由PH-20基因编码的完整蛋白质的447个氨基酸的截短型式。就氨基酸序列而言的结构相似性在任何比较中很少超过60％。功能比较显示苏州康聚产透明质酸酶的活性与先前批准的透明质酸酶产品的活性非常相似。此信息与过去50年期间的临床发现一致，即不管透明质酸酶来源，透明质酸酶的临床安全性和单位功效是等同的。

苏州康聚产透明质酸酶在依照本发明的抗CD20抗体SC配制剂中的使用容许施用较高体积的药物产品，并且潜在地增强皮下施用的CD20抗体。

依照本发明的稳定的药物配制剂的摩尔渗透压浓度是350±50mOsm/kg。

优选地，依照本发明的稳定的药物配制剂基本上没有可见的(人眼检查)颗粒。亚-可见的颗粒(如通过光遮蔽测量的)应当满足下列标准：

-每个管形瓶≥10μm颗粒的数目最大不超过6000

-每个管形瓶≥25μm颗粒的数目最大不超过600

本发明中，优选地，所述包含抗CD20抗体的药物配制剂包含：

1)100mg/ml抗CD20抗体；

2)20mM L-组氨酸盐酸盐缓冲剂；

3)210mM二水合α,α-海藻糖；

4)10mM甲硫氨酸；

5)0.06％(w/v)聚山梨酯80；和

6)2000U/ml透明质酸酶，所述透明质酸酶为购自苏州康聚产透明质酸酶。

本发明中，优选地，所述包含抗CD20抗体的药物配制剂包含：

1)120mg/ml抗CD20抗体；

2)20mM L-组氨酸盐酸盐缓冲剂；

3)210mM二水合α,α-海藻糖；

4)10mM甲硫氨酸；

5)0.06％(w/v)聚山梨酯80；和

6)2000U/ml透明质酸酶，所述透明质酸酶为购自苏州康聚产透明质酸酶。

实施例中给出了优选的配制剂的备选组成。

在第二方面，本发明提供了上述包含抗CD20抗体的高度浓缩的药物配制剂的制备方法，其包括如下步骤：将各组分与溶剂混合，溶解，过滤，即可。

其中，所述溶剂可为本领域常规的可施用于人体的溶剂，例如超纯水。

其中，所述过滤可为本领域常规过滤的方法和步骤，一般而言，将溶解后的溶液过0.2-0.45μm的滤膜，即可。

在第三方面，本发明还以包含注射组分两者和关于其皮下施用的合适指令的试剂盒形式提供了药物组合物，其由药学活性抗CD20抗体或此类抗体的混合物的高度浓缩的稳定的药物配制剂和合适量的至少一种透明质酸酶组成。

在第四方面，本发明还涉及包含依照本发明的高度浓缩的稳定的药物配制剂的注射装置。此类配制剂可以由药学活性抗CD20抗体或此类抗体分子的混合物和如下文所概述的合适的赋形剂组成，并且另外可以包含可溶性透明质酸酶糖蛋白作为组合配制剂或作为共施用的分开配制剂。

在第五方面，本发明提供了包含抗CD20抗体药物配制剂在制备治疗适用于抗CD20抗体治疗的疾病或病症的药物中的应用，诸如优选地，癌症或非恶性疾病的药物的用途，包括以有效治疗所述疾病或病症的量对受试者施用本文中所描述的配制剂。优选地，与化疗剂伴随或序贯共施用抗CD20抗体。

对配制剂添加透明质酸酶容许增加可以安全且舒适地皮下施用的注射体积。优选的注射体积是1至15ml。已经观察到依照本发明的配制剂的施用提高治疗性抗体的分散、吸收和生物利用度。经由SC路径施用的大分子(即大于16kDa)经由引流淋巴液优先吸收入血管区室中[Supersaxo,A.等,“Effect of Molecular Weight on the LymphaticAbsorption of Water-Soluble Compounds Following Subcutaneous Administration”,1990；2:167-169；Swartz,M.A.,“Advanced Drug Delivery Review,The physiology ofthe lymphatic system”,2001；50:3-20]。如此，这些大分子引入系统循环的速率相对于静脉内输注是减缓的，因此潜在地导致输注相关反应的频率/强度降低。

依照本发明的皮下CD20抗体(优选地一种人源化抗CD20抗体配制剂的生成要求制造工艺的最终纯化步骤中的高抗体浓度(约120mg/ml)。因此，将额外的工艺步骤(超滤/渗滤)添加至CD20抗体，优选地一种人源化抗CD20抗体的常规制造工艺。依照本发明的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂也可以以稳定化的蛋白质配制剂提供，所述稳定化的蛋白质配制剂可以用合适的稀释剂重建以生成高抗CD20抗体浓度重建的配制剂。

优选地，使用依照本发明的CD20抗体SC配制剂来治疗癌症，优选地CD20表达癌症。

如本专利说明书中所使用的，术语“约”意指规定所提供的特定数值可以以某种程度变化，诸如例如意指给定数值中包括范围为±10％，优选地±5％，最优选地±2％的变化。

除了上述测定法外，各种体内测定法是熟练从业人员可用的。例如，可以将患者身体内的细胞暴露于任选地用可检测标记物，例如放射性同位素标记的抗体，并且可以例如通过外部扫描放射性或者通过分析自先前暴露于抗体的患者采集的活组织检查来评估抗体对患者中的细胞的结合。

涵盖的是，也可以使用依照本发明的CD20抗体SC配制剂来治疗各种非恶性疾病或病症，其包括如本文中所限定的自身免疫性疾病；子宫内膜异位症；硬皮病；再狭窄；息肉，诸如结肠息肉、鼻息肉或胃肠息肉；纤维腺瘤；呼吸系统疾病；胆囊炎；神经纤维瘤病；多囊肾病；炎性疾病；皮肤病症，包括银屑病和皮炎；血管疾病；牵涉血管上皮细胞的异常增殖的状况；胃肠溃疡；门内特里埃(Menetrier)氏病、分泌型腺瘤或蛋白质损失综合征(proteinloss syndrome)；肾病症；血管生成性病症(angiogenic disorder)；眼病，诸如年龄相关黄斑变性、推测的眼组织胞浆菌病综合征、来自增殖性糖尿病视网膜病变的视网膜新血管化、视网膜血管化、糖尿病视网膜病变、或年龄相关黄斑变性；骨相关病理学，诸如骨关节炎、佝偻病和骨质疏松；脑缺血事件后的损伤；纤维变性或水肿疾病，诸如肝硬变、肺纤维化、结节病(carcoidosis)、甲状腺炎(throiditis)、系统性高粘滞综合征(hyperviscosity syndrome systemic)、OsierWeber-Rendu疾病、慢性阻塞性肺疾病(occlusive pulmonary disease)、或烧伤、创伤、辐射、中风、缺氧或缺血后的水肿；皮肤的超敏感性反应；糖尿病视网膜病和糖尿病肾病；格-巴二氏综合征(Guillain-Barresyndrome)；移植物抗宿主病或移植排斥；佩吉特(Paget)氏病；骨或关节炎症；光老化(例如由对人皮肤的UV辐射引起的)；良性前列腺肥大；某些微生物感染，包括选自下组的微生物病原体：腺病毒、汉坦病毒、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、耶尔森氏菌(Yersiniaspp.)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)；由血小板聚集引起的血栓；生殖状况，诸如子宫内膜异位症、卵巢过度刺激综合征、先兆子痫、功能障碍性子宫出血、或月经频多；滑膜炎；粥样斑；急性和慢性肾病(包括增殖性肾小球肾炎和糖尿病诱导的肾病)；湿疹；肥厚性瘢痕形成；内毒素性休克和真菌感染；家族性腺瘤病息肉病；神经变性性疾病(例如阿耳茨海默(Alzheimer)氏病、AIDS相关痴呆、帕金森(Parkinson)氏病、肌萎缩侧索硬化、视网膜色素变性、脊柱性肌萎缩(spinal muscular atrophy)和小脑变性)；骨髓增生异常综合征；再生障碍性贫血；缺血性损伤；肺、肾或肝的纤维化；T细胞介导的超敏感性疾病；婴儿肥大性幽门狭窄；泌尿阻塞综合征(urinary obstructive syndrome)；银屑病关节炎；和桥本(Hasimoto)氏甲状腺炎。疗法优选的非恶性适应症如本文中所限定的。

在适应症是癌症的情况中，可以用抗体配制剂和化疗剂的组合治疗患者。联合施用包括共施用或同时施用(其使用分开的配制剂或单一药物配制剂进行)和以任意次序的连续施用，其中优选地，存在着所有活性剂同时施加其生物学活性的时间段。如此，可以在施用依照本发明的抗体配制剂之前、或之后施用化疗剂。在此实施方案中，化疗剂的至少一次施用与依照本发明的抗体配制剂的至少一次施用间的时机优选地是约1个月或更小，且最优选地约2周或更小。或者，可以在单一配制剂或分开的配制剂中对患者同时施用化疗剂和依照本发明的抗体配制剂。

用所述抗体配制剂的治疗会导致癌症或疾病的体征或症状的改善。例如，在所治疗的疾病是癌症的情况中，此类疗法可以导致存活(总体存活和/或无进展存活)的改善和/或可以导致客观临床响应(部分的或完全的)。此外，用化疗剂和抗体配制剂的组合治疗可以对患者产生协同或大于叠加的治疗益处。

优选地，所施用配制剂中的抗体是裸抗体。然而，所施用的抗体可以与细胞毒剂缀合。优选地，免疫缀合物和/或其结合的抗原被细胞内在化，导致免疫缀合物在杀死其结合的癌细胞方面的治疗功效升高。在一个优选的实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱类、加利车霉素(calioheamicin)、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。优选的免疫缀合物是与曲妥单抗-DM1(T-DM1)，如它们记载于WO2003/037992的，更优选的是免疫缀合物T-MCC-DM1类似的一种人源化抗CD20抗体-美登木素生物碱类免疫缀合物。

对于皮下投递，可以经由合适的装置，诸如(但不限于)注射器；注射装置(例如INJECT-EASETM和GENJECTM装置)；输注泵(诸如例如Accu-ChekTM)；注射笔(诸如GENPENTM；无针装置(例如MEDDECTORTM和BIOJECTORTM)；或者经由皮下贴片投递系统来施用配制剂。

用于预防或治疗疾病的所述抗CD20抗体配制剂的施用量和施用时机会取决于所治疗患者的类型(物种、性别、年龄、重量，等等)和状况和所治疗的疾病或状况的严重性。对于合适的剂量确定也重要的是疾病过程、抗体是为了预防还是治疗目的施用、先前的疗法、患者的临床史和他对抗体的响应。最后的剂量确定凭主治内科医生决断。在一次或一系列治疗里对患者适当地施用抗体。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至50mg/kg(例如，0.1-20mg/kg)的所述抗CD20抗体是对患者施用的候选初始剂量。

所述抗CD20抗体的优选剂量范围会是约0.05mg/kg至约30mg/kg体重。如此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg或30mg/g(或其任何组合)的一剂或多剂。根据患者的类型(物种、性别、年龄、重量，等等)和状况及抗CD20抗体的类型，所述第一剂量可以与抗CD20抗体的第二剂量不同。可以每日或间歇地，例如每三至六天或甚至每一至三周施用此类剂量。可以施用初始的较高加载剂量，接着是较低的一剂或多剂。所述人源化抗CD20抗体优选的剂量范围是300mg/m²至900mg/m²。更优选地，所述抗CD20抗体的优选剂量范围是约375mg/m²至约800mg/m²。所述抗CD20抗体的优选特定剂量是约375mg/m²、约625mg/m²和约800mg/m²的剂量。还优选的是固定剂量的所述抗CD20抗体。

在一个实施方案中，B细胞淋巴瘤，优选地非何杰金氏淋巴瘤的固定剂量如下。优选的是每剂约1200mg至约1800mg所述抗CD20抗体。更优选的是选自下组的剂量：每剂约1300mg、约1500mg、约1600mg和约1700mg所述抗CD20抗体。最优选地，用于B细胞淋巴瘤患者，优选地非何杰金氏淋巴瘤患者的固定剂量是每剂约1400mg所述抗CD20抗体(例如一种人源化抗CD20抗体)，其可以依照多种日程表施用，包括约每2个月(包括约每8周)、约每3个月(包括约每12周)、约2年(或更多)，等等。

在另一个实施方案中，用于白血病患者，优选地慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的固定剂量如下。优选的是每剂约1600mg至约2200mg所述抗CD20抗体。更优选的是选自下组的剂量：每剂约1700mg、约1800mg、约1900mg、和约2100mg所述抗CD20抗体。在一个实施方案中，用于白血病患者，优选地CLL患者的固定剂量是每剂约1870mg所述抗CD20抗体(例如一种人源化抗CD20抗体)。

在又一个实施方案中，用于自身免疫性疾病，诸如类风湿性关节炎、多发性硬化、狼疮肾炎、糖尿病、ITP、和血管炎患者的固定剂量如下。优选的是每剂约1200mg至约2200mg所述抗CD20抗体，例如每剂约1500mg所述抗CD20抗体(例如一种人源化抗CD20抗体)。

若施用化疗剂，它通常以其已知的剂量施用，或者任选地由于药物的组合作用或可归因于化疗剂施用的负面副作用而降低。可以依照制造商的指令或如熟练从业人员凭经验确定的那样使用此类化疗剂的制备和剂量给药日程表。此类化学疗法的制备和剂量给药日程表也记载于Chemotherapy Service Ed.,M.C.Perry,Williams&Wilkins,Baltimore,MD(1992)。

优选地，以皮下注射施用依照本发明的药学活性抗CD20抗体的稳定的药物配制剂，其中优选地，以3周的时间间隔(q3w)将施用重复几次。最优选地，在1至10分钟，优选地2至6分钟，最优选地3±1分钟的时段内施用注射流体的全部体积。最优选地，施用2ml/分钟，即例如约240mg/分钟。对于许多没有给予其它静脉内(IV)化疗剂的患者，此类皮下施用导致患者便利增加及在家自己施用的潜力。这导致改善的顺从性，并且会降低/消除与IV施用有关的成本(即，IV施用的护理成本、躺椅租费、患者出行等)。依照本发明的皮下施用最可能会与输注相关反应的频率和/或强度降低有关。

在一个优选的实施方案中，药物可用于预防或降低患有表达CD20的癌症的此类患者中的转移或进一步扩散。药物可用于延长此类患者的存活持续时间，延长此类患者的无进展存活，延长响应的持续时间，导致经治疗的患者的统计学显著的且临床上有意义的改善，如通过存活的持续时间、无进展存活、响应率或响应的持续时间所测量的。在一个优选的实施方案中，药物可用于提高患者组中的响应率。

在本发明的上下文中，可以在表达CD20的癌症的抗CD20抗体治疗中使用一种或多种额外的其它生长抑制剂、细胞毒剂、化疗剂、抗血管生成剂、抗癌剂或细胞因子、或增强此类药剂的效果的化合物。优选地，抗CD20抗体治疗不与所述额外的细胞毒剂、化疗剂或抗癌剂、或增强此类药剂的化合物一起使用。

此类药剂包括例如：烷化剂或具有烷基化作用的药剂，诸如环磷酰胺(cyclophosphamide)(CTX；例如)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)(CHL；例如瘤可宁顺铂(cisplatin)(CisP；例如)、白消安(busulfan)(例如，马利兰)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、链脲菌素(streptozotocin)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)(TEM)、丝裂霉素C(mitomycinC)，等等；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(MTX)、依托泊苷(etoposide)(VP16；例如凡毕士)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)(6MP)、6-硫鸟嘌呤(6-thiocguanine)(6TG)、阿糖胞苷(cytarabine)(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)(例如，希罗达)、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)，等等；抗生素，诸如放线菌素D(actinomycinD)、多柔比星(doxorubicin)(DXR；例如阿霉素)、柔红霉素(daunorubicin)(道诺霉素(daunomycin))、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)等；生物碱，诸如长春花生物碱诸如长春新碱(vincristine)(VCR)、长春碱(vinblastine)，等等；及其它抗肿瘤剂，诸如帕西他赛(paclitaxel)(例如泰素)和帕西他赛衍生物、细胞抑制剂、糖皮质激素诸如地塞米松(dexamethasone)(DEX；例如地卡特隆)和皮质类固醇诸如泼尼松(prednisone)、核苷酶抑制剂诸如羟基脲、氨基酸消减酶(aminoaciddepletingenzyme)诸如天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸(leucovorin)和其它叶酸衍生物、和相似的多种多样的抗肿瘤剂。也可以使用下列药剂作为额外的药剂：氨磷汀(arnifostine)(例如)、更生霉素(dactinomycin)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)(氮芥)、链佐星(streptozocin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、多柔比星脂质体(doxorubicinlipo)、吉西他滨(gemcitabine)(例如健择)、柔红霉素脂质体(daunorubicinlipo)(例如)、丙卡巴肼(procarbazine)、丝裂霉素(mitomycin)、多西他赛(docetaxel)(例如泰索帝)、阿地白介素(aldesleukin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、克拉屈滨(cladribine)、喜树碱(camptothecin)、CPT 11(伊立替康(irinotecan))、10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊达比星(idarubicin)、美司钠(mesna)、干扰素β、干扰素α、米托蒽醌(mitoxantrone)、托泊替康(topotecan)、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤、普卡霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睾内酪(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶芥(uracilmustard)、长春瑞滨(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)。优选地，抗CD20抗体治疗不与此类额外的药剂一起使用。

上文所描述的细胞毒剂和抗癌剂及抗增殖性靶物特异性抗癌药物，如蛋白质激酶抑制剂在化学疗法方案中的使用一般在癌症疗法领域中得到充分表征，并且其在本文中的使用归入关于监测耐受性和效力及关于控制施用路径和剂量的相同考虑，伴有一些调整。例如，细胞毒剂的实际剂量可以随通过使用组织培养方法测定的患者的培养细胞应答而变化。一般地，与在没有额外的其它药剂的情况中使用的量相比，剂量会是降低的。

有效细胞毒剂的典型剂量可以在制造商推荐的范围中，并且在通过体外应答或动物模型中的应答指示的情况中，可以降低多至约一个数量级的浓度或量。如此，实际剂量会取决于内科医生的判断、患者的状况、和治疗方法的效力，其基于原代培养的恶性细胞或组织培养组织样品的体外响应性，或合适的动物模型中观察到的响应。

在本发明的上下文中，在表达CD20的癌症的抗CD20抗体治疗外，可以实施有效量的电离辐射和/或可以使用放射性药物。放射源可以是在所治疗的患者外部或内部。在来源在患者外部时，已知疗法为外部束放射疗法(EBRT)。在放射源在患者内部时，治疗称作近程治疗(BT)。本发明的上下文中使用的放射性原子可以选自下组，包括但不限于镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131、和碘-111。也有可能用此类放射性同位素标记抗体。优选地，抗CD20抗体治疗不与此类电离辐射一起使用。

放射疗法是一种用于控制不可切除的或不能手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗。已经在组合放射疗法与化学疗法时看到改善的结果。放射疗法基于如下的原则，即对靶区域投递的高剂量放射会导致肿瘤和正常组织两者中的繁殖性细胞(reproductivecell)死亡。放射剂量方案一般在放射吸收剂量(Gy)、时间和分级方面限定，并且必须由肿瘤学家仔细限定。患者接受的放射量会取决于各种考虑因素，但是两项最重要的是肿瘤相对于身体的其它重要结构或器官的位置和肿瘤已经扩散的程度。经历放射疗法的患者的典型治疗过程会是在1至6周时段里的治疗日程表，以单一每日分数约1.8至2.0Gy一周5天对患者施用10-80Gy的总剂量。在本发明的一个优选的实施方案中，在用本发明和放射的联合治疗来治疗人患者中的肿瘤时存在着协同。换言之，在与放射，任选地有额外的化学治疗剂或抗癌剂组合时，依靠包含本发明的CD20抗体配制剂的药剂对肿瘤生长的抑制得到增强。例如，辅助放射疗法的参数包含在WO99/60023中。

其它治疗方案可以与抗体组合，包括但不限于第二(第三、第四等)化疗剂(换言之，不同化疗剂的“混合物(cocktail)”)；另一种单克隆抗体；生长抑制剂；细胞毒剂；化疗剂；抗血管生成剂；和/或细胞因子等；或其任何合适的组合。

在上述治疗方案外，患者可以进行癌细胞的手术除去和/或放射疗法。

在本发明的另一个实施方案中，提供了制品，其含有本发明的药物配制剂且提供其使用指令。此制品包含容器。合适的容器包括例如瓶、管形瓶(例如多或双室管形瓶)、注射器(诸如多或双室注射器)和试管。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳配制剂，并且容器上或与容器结合的标签可以指示使用指导。容纳配制剂的容器可以是多次使用管形瓶，其容许重建配制剂的重复施用(例如2至6次施用)。制品可以进一步包括从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用指令的包装插页。

依照本发明配制的抗体优选是基本上纯的，且期望地基本上同质的(即没有污染性蛋白质等，其中认为依照本发明的配制剂中的透明质酸酶不是依照本发明的抗CD20单克隆抗体的污染性蛋白质)。

本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且明确涵盖全长抗体、遗传工程抗体如单克隆抗体、或重组抗体、多克隆抗体、自至少两种全长抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体、及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指自基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可以在单克隆抗体的生成期间生成的可能的变体(此类变体一般以少量存在)外，构成群体的抗体个体相同和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在其特异性外，单克隆抗体的有利之处在于它们不受其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体为自基本上同质的抗体群体获得的特征，并且不应解释为要求通过任何特定的方法生成抗体。例如，可以通过第一次由ID Bernstein等人(Nature,256:495(1975))描述的杂交瘤方法来生成，或者可以通过重组DNA方法(见例如美国专利No.4,816,567)来生成要依照本发明使用的单克隆抗体。也可以使用Clarkson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所描述的技术自噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。因而，术语“人单克隆抗体”指具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的，展现出单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体是由杂交瘤生成的，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的自具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，例如转基因小鼠获得的B细胞。本文中的术语“单克隆抗体”明确包括所谓的嵌合抗体，其中重和/或轻链的一部分与自特定物种衍生的或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与自另一物种衍生的或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化(primatized)”抗体，其包含自非人灵长类(例如旧世界猴(OldWorldMonkey)、猿等)衍生的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般至少包含其抗原结合部分或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；双抗体、单链抗体分子、免疫毒素、和自抗体片段形成的多特异性抗体。另外，抗体片段包含具有VH链特征，即能够与VL链装配在一起，结合CD20抗原的单链多肽。“抗体片段”还包含此类如下的片段，其本身不能提供效应器功能((ADCC/CDC)，但是在与合适的抗体恒定域组合后以依照本发明的方式提供此功能。

“全长抗体”是包含抗原结合可变区及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。优选地，全长抗体具有一种或多种效应器功能。

本文中的“氨基酸序列变体”抗体是具有与主要种类抗体不同的氨基酸序列的抗体。通常，氨基酸序列变体会与主要种类抗体拥有至少约70％的同源性，且优选地，它们会与主要种类抗体至少约80％，更优选地至少约90％同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体的氨基酸序列内或附近的某些位置拥有替代、删除、和/或添加。本文中的氨基酸序列变体的例子包括酸性变体(例如脱酰胺化的抗体变体)、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基端前导延伸(例如VHS-)的抗体、在其一条或两条重链上具有C端赖氨酸残基的抗体等，并且包括对重和/或轻链的氨基酸序列的改变的组合。本文中特别感兴趣的抗体变体是相对于主要种类抗体，在其一条或两条轻链上包含氨基端前导延伸，任选地进一步包含其它氨基酸序列和/或糖基化差异的抗体。

本文中的“糖基化变体”抗体是附着有与附着于主要种类抗体的一个或多个碳水化合物模块不同的一个或多个碳水化合物模块的抗体。本文中的糖基化变体的例子包括具有附着于其Fc区的G1或G2寡糖结构，而不是G0寡糖结构的抗体、具有附着于其一条或两条轻链的一个或两个碳水化合物模块的抗体、没有附着于抗体的一条或两条重链的碳水化合物的抗体等，及糖基化变化的组合。此外，术语“糖基化变体”还包括糖工程化改造抗体诸如那些记载于WO 1’331‘266和USP7’517’670的。

抗体“效应器功能”指那些可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调，等等。

根据重链恒定域的氨基酸序列，全长抗体可以归入不同“类”。存在着5类主要的全长抗体：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，这些中的几种可以进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定域分别称作α[阿尔法]、δ[德耳塔]、ε[厄普西隆]、γ[伽马]、和μ[谬]。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维结构是公知的。

在本文中，单克隆抗体的“生物学活性”指抗体结合抗原，并且产生可以在体外或在体内测量的可测量生物学应答的能力。此类活性可以是拮抗的(例如在抗体是CD20抗体的情况中)或激动的。

术语“人源化抗体”指其中的框架或“互补决定区”(CDR)已经进行过修饰以包含与亲本免疫球蛋白的特异性相比不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR嫁接入人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。特别优选的CDR对应于那些代表下文对嵌合和双功能性抗体所记录的识别抗原的序列的。大体上，人源化抗体指来自接受体高变区的残基用来自具有期望特异性、亲和力和性能的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区的残基替换的人免疫球蛋白(接受体抗体)。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在接受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。做出这些修饰以进一步改进抗体性能。一般地，人源化抗体会包含至少一个、通常为两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。任选地，人源化抗体还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(见例如Riechmann,L.等,Nature332(1988)323-327；及Neuberger,M.S.等,Nature314(1985)268-270)。

术语“嵌合抗体”指通常通过重组DNA技术制备的，包含来自一种来源或物种的可变区，即结合区和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是特别优选的。此类鼠/人嵌合抗体是包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段的所表达免疫球蛋白基因的产物。本发明所涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是那些其中类或亚类已经自初始抗体的类或亚类修饰或改变的。此类“嵌合”抗体也称为“类转换抗体”。用于生成嵌合抗体的方法牵涉本领域现在公知的常规重组DNA和基因转染技术(见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.AcadSci.USA81(1984)6851-6855；US5,202,238和US 5,204,244)。

如本文中所使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.和vandeWinkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374)。基于此类技术，可以生成针对极其多种靶物的人抗体。人抗体的例子记载于例如Kellermann,S.A.等,Curr.Opin.Biotechnol.13(2002)593-597。

如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或者自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或抗体而言转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然自人种系VH和VL序列衍生及与其相关，但在体内可以不天然存在于人抗体种系全集内的序列。

如本文中所使用的，“特异性结合”指特异性结合CD20抗原的抗体。优选地，结合亲和力是10-9mol/l或更低(例如10-10mol/l)的Kd值的，优选地具有10-10mol/l或更低(例如10-12mol/l)的Kd值。用标准的结合测定法，诸如表面等离振子共振技术来测定结合亲和力。

如本文中所使用的，术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但是优选的是双链DNA。

“恒定域”不直接牵涉抗体对抗原的结合，但是牵涉效应器功能(ADCC、补体结合和CDC)。

如本文中所使用的，“可变区”(轻链可变区(VL)、重链可变区(VH))意为直接牵涉抗体结合抗原的轻链和重链对之每种。人轻链和重链可变域具有相同的一般结构，并且每个域包含通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接的，其序列广泛保守的四个框架(FR)区。框架区采用β-片层构象，而CDR可以形成连接b-片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持其三维结构，并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，并且因此提供本发明的又一个目的。

术语“抗体的抗原结合部分”或“高变区”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是与如本文中所限定的高变区残基不同的那些可变域区。因此，抗体的轻链和重链包含自N至C端的域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区。CDR和FR区依照Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。

术语“CD20”和“CD20抗原”在本文中可互换使用，包括由细胞天然表达的或者在用CD20基因转染的细胞上表达的人CD20的任何变体、同等型和物种同系物。本发明的抗体对CD20抗原的结合通过灭活CD20而介导对表达CD20的细胞(例如，肿瘤细胞)的杀伤。可以通过下列一项或多项机制而发生对表达CD20的细胞的杀死：细胞依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、诱导细胞死亡和/或凋亡、同型聚集等。

如本领域中认可的，CD20的同义词包括B淋巴细胞抗原CD20、B淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16、和Bp35。

依照本发明的术语“抗CD20抗体”是特异性结合CD20抗原的抗体。

寡糖组分可以显著影响与治疗性糖蛋白的功效有关的特性，包括物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、与免疫系统的相互作用、药动学、和特定(specific)生物学活性。此类特性可能不仅取决于寡糖的存在或缺乏，而且还取决于寡糖的具体结构。可以做出寡糖结构与糖蛋白功能间的一些概括。例如，某些寡糖结构经由与特定碳水化合物结合蛋白的相互作用而介导糖蛋白自血流的快速清除，而其它寡糖结构可以被抗体结合，并触发不想要的免疫反应。(Jenkins等,NatureBiotechnol.14:975-81(1996))。

由于哺乳动物细胞以对于人应用最相容的形式糖基化蛋白质的性能，它是用于生成治疗性糖蛋白的优选的宿主(Cumming等,Glycobiology1:115-30(1991)；Jenkins等,NatureBiotechnol.14:975-81(1996))。细菌糖基化蛋白质非常罕见，并且与其它类型的常见宿主，诸如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞一样，其产生与自血流快速清除、不想要的免疫相互作用、和(在一些特定的情况中)降低的生物学活性有关的糖基化样式。在哺乳动物细胞中，在过去二十年期间最常使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在给予合适的糖基化样式外，这些细胞容许遗传稳定的、高生产性克隆细胞系的一致生成。它们可以使用无血清培养基在简单的生物反应器中培养至高密度，并容许开发安全且可再现的生物工艺。其它通常使用的动物细胞包括幼仑鼠肾(BHK)细胞、NS0-和SP2/0小鼠黑素瘤细胞。新近，还已经测试了自转基因动物的生成。(Jenkins等,Nature Biotechnol.14:975-981(1996))。

所有抗体在重链恒定区中的保守位置处都含有碳水化合物结构，其中每种同种型拥有独特的一批N连接的碳水化合物结构，其易变地影响蛋白质装配、分泌或功能性活性(Wright,A.和Morrison,S.L.,TrendsBiotech.15:26-32(1997))。根据加工程度，附着的N连接的碳水化合物结构变化得相当大，并且可以包括高甘露糖的、多分支的及双触角的复合寡糖。通常，存在着特定糖基化位点处附着的核心寡糖结构的异质加工，使得甚至单克隆抗体以多种糖形存在。同样地，已经显示了细胞系间存在抗体糖基化的重大差异，而且甚至对不同培养条件下培养的给定细胞系看到轻微差异(Lifely,M.R.等,Glycobiology5(8):813-22(1995))。

一种在维持简单的生产工艺并潜在地避免显著的、不想要的副作用的情况中获得效力大幅升高的方式是通过工程化改造单克隆抗体的寡糖组分来增强其天然的、细胞介导的效应器功能，如记载于Umana,P.等,Nature Biotechnol.17:176-180(1999)及美国专利No.6,602,684的。IgG1型抗体(即在癌症免疫疗法中最常使用的抗体)是在每个CH2域中的Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。附着于Asn297的两个复合双触角寡糖掩埋于各CH2域间，与多肽主链形成广泛的接触，并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是至关重要的(Lifely，M.R.等,Glycobiology5:813-822(1995)；Jefferis,R.等,Immunol.Rev.163:59-76(1998)；Wright,A.和Morrison,S.L.,TrendsBiotechnol.15:26-32(1997))。

先前显示了β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)(一种催化两分型寡糖形成的糖基转移酶)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高由工程化改造的CHO细胞生成的抗成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性。(见Umana,P.等,NatureBiotechnol.17:176-180(1999)；及WO 99/154342，在此通过提及而收录其全部内容)。抗体chCE7属于具有高肿瘤亲和力和特异性，但是在缺乏GnTIII酶的标准工业细胞系中生产时具有太少的效力以致在临床上无用的一大类未缀合的单克隆抗体(P.等,NatureBiotechnol.17:176-180(1999))。所述研究第一次显示了可以通过工程化改造抗体生成细胞以表达GnTIII来获得ADCC活性的大幅升高，其还导致恒定区(Fc)结合的两分型寡糖(包括两分型非岩藻糖基化寡糖)比例的增加，高于天然存在的抗体中找到的水平。

术语“CD20抗原的表达”意图指示细胞中，优选地在B细胞，更优选地分别来自肿瘤或癌症，优选地非实体瘤的B细胞的细胞表面上的CD20抗原的显著水平的表达。可以通过本领域中已知的标准测定法来确定患有“表达CD20的癌症”的患者。优选地，“CD20抗原的表达”还意图指示细胞中，优选地在B细胞，更优选地自身免疫性疾病的B细胞的细胞表面上的CD20抗原的显著水平的表达。使用例如免疫组织化学(IHC)检测、FACS或者经由相应mRNA的基于PCR的检测来测量CD20抗原表达。

“患者”或“受试者”指患有依照本发明的状况或疾病的任何哺乳动物，且优选的是人。

如本文中所使用的，优选地，术语“表达CD20的癌症”指淋巴瘤(优选地B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞性白血病。此类淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括例如：(a)滤泡性淋巴瘤、(b)小无核裂细胞淋巴瘤(SmallNon-CleavedCellLymphoma)/伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤、散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)、(c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)、结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)、(d)套细胞淋巴瘤(MCL)、(e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、弥漫性混合细胞淋巴瘤、成免疫细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)、(f)毛细胞白血病、(g)淋巴细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症、(h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、(i)浆细胞新生物、浆细胞骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和(j)何杰金氏病。

优选地，表达CD20的癌症是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。表达CD20的癌症的其它例子包括：套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏淋巴瘤、毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、边缘区淋巴瘤、移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、HIV相关淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、或原发性CNS淋巴瘤。

如本文中所使用的，“自身免疫性疾病”指因个体自身组织引起的和针对个体自身组织的疾病或病症。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于关节炎(arthritis)(类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、幼年型类风湿关节炎(juvenile rheumatoidarthritis)、骨关节炎(osteoarthritis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis))、银屑病(psoriasis)、皮炎(dermatitis)、多肌炎(polymyositis)/皮肌炎(dermatomyositis)、中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermal necrolysis)、全身性硬皮病和硬化(systemicscleroderma and sclerosis)、与炎性肠病有关的应答、克罗恩(Crohn)氏病、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome)、成人型呼吸窘迫综合征(adult respiratory distress syndrome，ARDS)、脑膜炎(meningitis)、脑炎(encephalitis)、葡萄膜炎(uveitis)、结肠炎(colitis)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、变应性状况、湿疹(eczema)、哮喘(asthma)、涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的状况、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、自身免疫性心肌炎(autoimmune myocarditis)、白细胞粘附缺陷(leukocyte adhesion deficiency)、系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus,SLE)、幼发型糖尿病(juvenile onset diabetes)、多发性硬化(multiplesclerosis)、变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis)、与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病(tuberculosis)、结节病(sarcoidosis)、肉芽肿病(granulomatosis)，包括韦格纳(Wegener)氏肉芽肿病、粒细胞缺乏(agranulocytosis)、血管炎(vasculitis)(包括ANCA)、再生障碍性贫血、戴-布二氏(DiamondBlackfan)贫血、免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症(autoimmune neutropenia)、全血细胞减少症(pancytopenia)、白细胞减少症(leukopenia)、涉及白细胞渗出的疾病，中枢神经系统(CNS)炎性病症，多器官损伤综合征(multiple organ injury syndrome)、重症肌无力(myasthenia gravis)、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病(anti-glomerular basement membrane disease)、抗磷脂抗体综合征(anti-phospholipid antibody syndrome)、变应性神经炎(allergicneuritis)、贝切特(Bechet)病，卡斯尔曼(Castleman)氏综合征，古德帕斯丘(Goodpasture)氏综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、雷诺(Reynaud)氏综合征，斯耶格伦氏(Sjorgen)综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，大疱性类天疱疮(pemphigoidbullous)、天疱疮(pemphigus)、自身免疫性多内分泌病(autoimmunepolyendocrinopathies)、肾病(nephropathy)、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic throbocytopenic purpura,TTP)、自身免疫性血小板减少症(autoimmunethrombocytopenia)、自身免疫性睾丸和卵巢疾病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症(primary hypothyroidism)；自身免疫性内分泌疾病，包括自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis)、慢性甲状腺炎(chronic thyroiditis)(桥本甲状腺炎(Hashimoto’sThyroiditis))、亚急性甲状腺炎(subacute thyroiditis)、特发性甲状腺功能减退症(idiopathic hypothyroidism)、阿狄森(Addison)氏病、格雷夫斯(Graves)氏病、自身免疫性多内分泌腺综合征(autoimmune polyglandular syndromes)(或多腺性I内分泌病综合征)、I型糖尿病，又称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和席汉(Sheehan)氏综合征；自身免疫性肝炎、淋巴样间质性肺炎(lymphoid interstitial pneumonitis,HIV)、梗阻性细支气管炎(bronchiolitisobliterans)(非移植物)对NSIP、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre’syndrome)、大血管血管炎(largevessel vasculitis)(包括风湿性多肌痛(polymyalgiarheumatica)和巨细胞性(高安(Takayasu)氏)动脉炎)、中血管血管炎(mediumvesselvasculitis)(包括川畸(Kawasaki)氏病和结节性多动脉炎(polyarteritisnodosa))、强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、贝格尔(Berger)氏病(IgA肾病)、急进性肾小球肾炎(rapidly progressive glomerulonephritis)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)、口炎性腹泻(Celiacsprue)(麸质肠病(glutenenteropathy))、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、冠状动脉疾病等。

“生长抑制剂”在本文中使用时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是表达CD20的癌细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的表达CD20的细胞的百分比的。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1阻滞和M期阻滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(长春新碱和长春碱)、紫杉烷(taxane)、和拓扑异构酶II抑制剂，诸如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷、和博来霉素。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可见“TheMolecularBasisofCancer”，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplasticdrugs”，Murakami等(WBSaunders:Philadelphia,1995)，尤其是第13页。

“治疗/处理”指治疗性处理和防范性或预防性措施两者。需要治疗的对象包括那些已经患有疾病的对象及那些要预防疾病的对象。因此，本文中要治疗的患者可以已经诊断为患有疾病或者可以有疾病的素因或者对疾病易感。

如本文中所使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylatingagents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXANTM)；磺酸烃基酯类(alkylsulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOLTM)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTINTM)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSARTM)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogenmustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1l和加利车霉素ω11(见例如Angew，ChemieIntl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括蒽环类抗生素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCINTM、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXILTM)、脂质体多柔比星TLCD-99(MYOCETTM)、PEG化的脂质体多柔比星(CAELYXTM)、和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)(GEMZARTM)、替加氟(tegafur)(UFTORALTM)、卡培他滨(capecitabine)(XELODATM)、埃博霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinicacid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSKTM多糖复合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOLTM)、清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERETM)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春药类(vincas)(其阻止微管蛋白聚合形成微管)，包括长春碱(vinblastine)(VELBANTM)、长春新碱(vincristine)(ONCOVINTM)、长春地辛(vindesine)(ELDISINETM)、FILDESINTM)、和长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINETM))；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovovin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoicacid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)(TARGRETINTM)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOSTM或OSTACTM)、依替膦酸钠(etidronate)(DIDROCALTM)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)(ZOMETATM)、阿伦膦酸盐(alendronate)(FOSAMAJXTM)、帕米膦酸盐(pamidronate)(AREDIATM)、替鲁膦酸盐(tiludronate)(SKELIDTM)或利塞膦酸盐(risedronate)(ACTONELTM)；曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPETM疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTINTM疫苗、LEUVECTINTM疫苗和VAXIDTM疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECANTM)；rmRH(例如ABARELIXTM)；BAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(Pfizer)；哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或依托昔布(etoricoxib))、蛋白体抑制剂(例如PS341)；保特佐米(bortezomib)(VELCADETM)；CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(Rl1577)；orafenib、ABT510；Bcl-2抑制剂诸如奥利默森钠(oblimersensodium)(GENASENSETM)；pixantrone；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(见下文定义)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法(任选地进一步包含干扰素-(CHVP/干扰素-))的缩写)、FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)、CVP(环磷酰胺、长春新碱、和泼尼松龙)、MCP(米托蒽醌、苯丁酸氮芥和泼尼松龙)、FC(氟达拉滨和环磷酰胺)、ICE(异环磷酰胺、卡铂、和依托泊苷)、和地塞米松、阿糖胞苷、和顺铂(DHAP)，地塞米松、多柔比星脂质体、和长春新碱(DVD)等。

“抗血管生成剂”指阻断或以一定程度干扰血管形成的化合物。抗血管生成因子可以例如是结合牵涉促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。本文中优选的抗血管生成剂是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如贝伐单抗(AVASTINTM)。

术语“细胞因子”指由一种细胞群体释放的作为细胞间介导物对另一细胞起作用的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子、和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素、甲状旁腺素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素；松弛素原、糖蛋白激素诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、和黄体生成素(LH)、肝生长因子；成纤维细胞生长因子、促乳素、胎盘催乳激素、肿瘤坏死因子α和β、Mullerian抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素；激活蛋白、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子诸如NGF-β、血小板生长因子；转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β、胰岛素样生长因子-I和-II、红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子；干扰素诸如干扰素-α、-β和-γ、集落刺激因子(CSF)诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、和粒细胞-CSF(G-CSF)，白介素(IL)诸如IL-1、IL-lα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11和IL-12，肿瘤坏死因子诸如TNF-α或TNF-β，及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文中所使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等同物。

术语“有效量”指提供期望效果的量。在配制剂成分诸如依照本发明的透明质酸酶的情况中，有效量是以如下方式提高共施用的抗CD20抗体的分散和吸收，使得抗CD20抗体能以治疗有效方式起作用必需的量，如上文所概述的。在药用药物物质的情况中，它是活性成分有效治疗患者中的疾病的量。在疾病是癌症的情况中，有效量的药物可以降低癌细胞的数目；降低肿瘤大小；抑制(即以某种程度减缓且优选地停止)癌细胞浸润入周围器官中；抑制(即以某种程度减缓且优选地停止)肿瘤转移；以某种程度抑制肿瘤生长；和/或以某种程度减轻一种或多种与癌症有关的症状。就药物可以阻止生长和/或杀死存在的癌细胞的程度而言，它可以是细胞抑制的和/或细胞毒性的。有效量可以延长无进展存活，产生客观响应(包括部分响应PR或完全响应CR)，增加总体存活时间，和/或改善一种或多种癌症症状。

术语“药物配制剂”指处于使得容许活性成分的生物学活性有效的形式，且不含对于会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分制剂。此类配制剂是无菌的。

“无菌”配制剂是无菌的或没有所有活的微生物及其孢子。

“稳定的”配制剂是其中的所有蛋白质在于预期的贮存温度，例如2-8℃贮存后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的配制剂。优选地，配制剂在贮存后基本上保留其物理和化学稳定性，及其生物学活性。一般地，基于配制剂的预期保存期选择贮存期。此外，优选地，配制剂在冷冻(至例如-20℃)和融化配制剂后，例如1或多个循环的冷冻和融化后是稳定的。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，并且综述见例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,VincentLeeEd.,Marcel Dekker,Inc.,New York,New York,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug DeliveryRev.10:29-90(1993)。可以于选定的温度对稳定性测量选定的时间段。可以以多种不同方式定性和/或定量评估稳定性，包括评估聚集体形成(例如使用大小排阻层析，通过测量浊度，和/或通过目视检查进行)；使用阳离子交换层析或毛细管区带电泳，评估电荷异质性；SDS-PAGE分析以比较缩小的和完整的抗体；评估抗体的生物学活性或抗原结合功能；等。不稳定性可以牵涉下列任何一项或多项：聚集、脱酰胺化(例如Asn脱酰胺化)、氧化(例如Met氧化)、异构化(例如Asp异构化)、剪裁(clipping)/水解/片段化(例如铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、不成对的半胱氨酸等。

通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington’sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干配制剂或水溶液形式为贮存制备依照本发明使用的抗体的治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在所采用的剂量和浓度对于接收者无毒。

如本文中所使用的，术语“表面活性剂”意指药学可接受表面活性剂。在本发明的配制剂中，表面活性剂的量以重量/体积表述的百分比描述。最常使用的重量/体积单位是mg/mL。药学可接受表面活性剂的合适的例子包括聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(Tween)、聚乙烯-聚丙二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烃基醚，例如聚氧乙烯单月桂基醚、烃基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer,Pluronic)、和十二烷基硫酸钠(SDS)。最合适的聚氧乙烯山梨聚糖-脂肪酸酯是聚山梨酯20(以商标Tween20TM出售)和聚山梨酯80(以商标Tween80TM出售)。最合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物是那些以名称F68或Poloxamer188TM出售的。优选的聚氧乙烯-硬脂酸酯是那些以商标MyrjTM出售的。最合适的聚氧乙烯烃基醚是那些以商标BrijTM出售的。最合适的烃基酚聚氧乙烯醚以商标Triton-X出售。

如本文中所使用的，术语“缓冲液”意指药学可接受缓冲液。如本文中所使用的，术语“提供pH5.5±2.0的缓冲剂”指通过其酸/碱共轭组分的作用提供包含其的溶液抵抗pH变化的试剂。依照本发明的合适的药学可接受缓冲剂包括但不限于组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、葡糖酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液、和磷酸盐缓冲液。优选的缓冲液包含L-组氨酸或L-组氨酸与盐酸L-组氨酸的混合物，其具有等张剂和用本领域中已知的酸或碱的潜在pH调节。最优选的是L-组氨酸。

“组氨酸缓冲液”是包含氨基酸组氨酸的缓冲液。组氨酸缓冲液的例子包括盐酸组氨酸、乙酸组氨酸、磷酸组氨酸、硫酸组氨酸。发现本文中的例子中鉴定的优选组氨酸缓冲液是盐酸组氨酸。在一个优选的实施方案中，过用稀释的氢氯酸滴定L-组氨酸(游离碱，固体)或者通过以限定的量和比率溶解L-组氨酸和盐酸L-组氨酸(例如以水合物形式)来制备盐酸组氨酸缓冲液。

“等张的”意指感兴趣的配制剂与人血液具有基本上相同的渗透压。等张配制剂一般会具有约300mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。可以使用蒸汽压或凝固点降低型渗压计来测量等渗压性。

如本文中所使用的，术语“等张剂”意指药学可接受等张剂。使用等张剂来提供等张配制剂。等张配制剂是液体或自固体形式，例如冻干形式重建的液体，并且意指与其比较的一些其它溶液，诸如生理盐溶液和血清具有相同张力的溶液。合适的等张剂包括但不限于盐，包括但不限于氯化钠(NaCl)或氯化钾、糖类和糖醇，包括但不限于葡萄糖、蔗糖、海藻糖或甘油和来自下组的任何组分：氨基酸、糖类、盐和其组合。等张剂一般以约5mM至约350mM的总量使用。

如本文中与依照本发明的配制剂结合使用的术语“液体”意指温度为至少约2至约8℃时为液体的配制剂。

如本文中与依照本发明的配制剂结合使用的术语“冻干的”意指如下干燥的配制剂，即冷冻配制剂，然后通过本领域中已知的任何冷冻-干燥方法，例如商品化的冷冻-干燥装置自冷冻内容物升华冰。

如本文中所使用的，“盐”意指约1mM至约500mM量的盐。盐的非限制性例子包括阳离子钠、钾、钙或镁与阴离子氯、磷酸根、柠檬酸根、琥珀酸根、硫酸根的任何组合的盐或其混合物。

如本文中所使用的，术语“氨基酸”意指约1至约100mg/mL量的氨基酸，包括但不限于精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和脯氨酸。

本文中的“糖类”包含通用组成(CH2O)n及其衍生物，包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原糖、非还原糖等。本文中糖类的例子包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、右旋糖苷、甘油、右旋糖苷、赤藓糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇(sylitol)、山梨糖醇、甘露糖醇、蜜二糖(mellibiose)、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖(stachyose)、麦芽糖、乳酮糖(lactulose)、麦芽酮糖(maltulose)、葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽酮糖等。依照本发明的定义中还包括葡糖胺、N-甲基葡糖胺(所谓的“甲葡胺”)、半乳糖胺和神经氨酸及依照本发明的糖类的组合。本文中的优选的糖类是非还原性二糖类，诸如海藻糖或蔗糖。依照本发明的最优选的糖类是海藻糖。

术语“稳定剂”指药学可接受稳定剂，如例如但不限于如上文部分中所描述的氨基酸和糖及如本领域中已知的任何种类和分子量的商品化右旋糖苷。

术语“抗氧化剂”意指药学可接受抗氧化剂。这可以包括赋形剂诸如甲硫氨酸、苯甲醇或用于使氧化最小化的任何其它赋形剂。

术语“治疗方法”或其等同用语在应用于例如癌症时指为了减少或消除患者中癌细胞数目，或为了减轻癌症症状而设计的规程或作用过程。“治疗癌症或另一种增殖性病症的方法”不必意指癌细胞或其它病症实际上会得到消除，细胞数目或病症实际上会得到降低，或癌症或其它病症的症状实际上会得到减轻。经常，即使成功概率较低也会实施治疗癌症的方法，但是鉴于患者的医学史和估计的存活期望，其仍然被认为诱导总体有益的作用过程。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明制备得到的包含抗CD20抗体的药物配制剂稳定性良好。其中，具体地：

不含透明质酸酶的抗CD20抗体的药物配制剂经10轮冻融试验后，其性能参数如下：SEC-HPLC(％)检测单体≥97.0，高分子量物质≤2.0；IEC-HPLC(羧肽酶B处理)(％)后酸性峰≤25.0；还原CE-SDS(％)检测轻链和重链含量≥97.0，非糖基化重链含量≤1.0；非还原CE-SDS(％)检测后主峰≥95.0；CDC活性(％)与参比品相比，活性在95-125；每个供试品容器(瓶)中含10μm及10μm以上的微粒数不超过6000粒，含25μm含及25μm含以上的微粒数不超过600粒；pH值为5.5±0.2；渗透压为340-346；仍能符合抗体制剂的质量标准。

含透明质酸酶的抗CD20抗体(120mg/ml)的药物配制剂在经4轮冻融试验或储存温度为2-8℃下放置6个月后，其性能参数如下：SEC-HPLC(％)检测单体≥97.0，高分子量物质≤2.0；IEC-HPLC(羧肽酶B处理)(％)后酸性峰≤25.0；还原CE-SDS(％)检测轻链和重链含量≥97.0，非糖基化重链含量≤1.0；非还原CE-SDS(％)检测后主峰≥96.0；CDC活性(％)与参比品相比，活性在90-115；酶活性大于4000U/ml每个供试品容器(瓶)中含10μm及10μm以上的微粒数不超过6000粒，含25μm及25μm以上的微粒数不超过600粒；pH值为5.5±0.5；渗透压为321-396；复合抗体制剂的质量标准。

附图说明

图1为本发明的配制剂和对照配制剂中不同浓度抗CD20抗体的ΔG值。

图2为实施例3、4和对比例1、2的配制剂在40℃加速试验下的DLS图，其中(a)对比例1，(b)对比例2，(c)实施例3，(d)实施例4。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，通过一般自重组蛋白生成已知的技术来制造人源化抗CD20抗体。自母细胞库将经遗传工程改造的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)在细胞培养物中扩充。自细胞培养物流体收获一种人源化抗CD20抗体单克隆抗体，并使用固定化的蛋白A亲和层析、阳离子交换层析、除去病毒污染的过滤步骤，接着进行阴离子交换层析和超滤/渗滤步骤来纯化。本申请中抗CD20抗体的制备方法参照中国专利(ZL 201010150303.3)中所公开的制备方法。

具体制备方法如下：

1.抗CD20人源化单克隆抗体的制备

根据人源化重链可变区序列(如中国专利申请CN 201010150303.3中所示的SEQID NO：16)和轻链可变区序列(如中国专利申请CN 201010150303.3中所示的SEQ ID NO：35)，设计并合成编码重链和轻链可变区序列的PCR引物寡核苷酸片段。相邻寡核苷酸片段约有18个碱基重叠，PCR引物寡核苷酸片段一般长约54个碱基。混合同等量的各个PCR引物片段，进行重叠延伸PCR反应。

PCR反应体系：dNTPs0.2μM(最终浓度)；每个PCR引物片段1μl；10×buffer3μl；clonedpfu(Invitrogen)1μl；加水至30μl。

PCR反应条件：94℃3min→(94℃30s→56℃30s→72℃1min)×30→72℃10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段，经EcoRI酶切后，克隆到pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)载体中，转化到大肠杆菌TOPO10(Invitrogen)后在LB/Kanamycin平板上进行筛选，取10个白色菌斑接种于含有Kanamycin的LB液体培养液中培养，用QIAGEN质粒提取试剂盒(QIAquickPCRpurificationkit)提取质粒并进行测序，确定重链和轻链可变区序列。

2.构建表达载体

从正常人B细胞分离RNA，用PCR方法获得人重链恒定区Fc片段和轻链恒定区κ片段，并将其预先构建到pcDNA3.1(Invitrogen)表达载体中，经DH5α细菌转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。重链可变区由Eco47III/NheI从pCR-BluntII-TOPO的阳性克隆切下，克隆连入pcDNA3.1-Fc表达载体中。轻链可变区由AscI/BsiWI从pCR-BluntII-TOPO的阳性克隆切下，克隆连入pcDNA3.1-κ表达载体中。再次经过DH5α细菌(转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。测序结果与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的编码序列一致)。

3.转染CHO细胞及筛选阳性克隆

细胞系及培养条件：CHO-S细胞(Invitrogen)培养条件为1×CD-CHO(GIBCO)，1×HT(GIBCO)，8mM谷氨酰胺(GIBCO)，培养于37℃，8％CO₂温箱。

转染CHO-S细胞采用DMRIE-C转染试剂盒(Invitrogen)，按照试剂盒说明书操作。转染后的第三天，细胞培养于上述的培养液并加有500μg/mlG418(GIBCO)和12.5μg/ml嘌呤霉素(Sigma)进行加压筛选。加压约14天后，挑出单克隆，以直接竞争ELISA挑选阳性克隆。挑选出的阳性克隆培养于六孔板中，每个克隆细胞数为2.5×10⁵/ml。六孔板培养后的第四天，检测每个克隆细胞数，并用直接竞争ELISA的方法检测每个克隆细胞抗体表达量。表达率(productionrate)以以下公式计算：pg/cell/day＝10⁹×ug/ml(fromELISA，＝mg/L)(Daysinculture)×(Day0seededviacells/ml+Day3-4harvestedviacells/ml)/2)×1000。对每个克隆细胞抗体表达率进行比较，挑选出表达率最高的表达株，大批量培养。人源化抗-CD20抗体是从细胞培养物上层清液中通过蛋白A的亲和层析柱来纯化的。

下述实施例中，购自苏州康聚的透明质酸酶(rHuPH20)为散剂，一般在-70℃之下贮存。使用时，将该透明质酸酶散剂配制入最终的缓冲液，缓冲液的配方为：20mM L-组氨酸/HCl缓冲液、10mM甲硫氨酸、210mM二水合α,α-海藻糖和0.06％(w/v)聚山梨酯80，透明质酸酶的浓度为2000U/mL。

依照本发明的配制剂的其它赋形剂在实践中广泛使用，并且是本领域技术人员已知的。因此，不需要在这里详细解释它们。

如下开发依照本发明的供皮下施用的液体药物产品配制剂。

实施例1：高度浓缩的抗CD20抗体原液的制备

为了制备液体配制剂，将人源化抗CD20抗体针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，并且在需要的情况中，通过渗滤浓缩成约130mg/ml的抗体浓度。完成渗滤操作后，将α,α-二水合海藻糖、苏州康聚产透明质酸酶和聚山梨酯80以储备溶液添加至抗体溶液。最后，用缓冲液将蛋白质浓度调节至约120mg/ml。

表1

组分	浓度
		抗CD20抗体	120mg/mL
L-组氨酸	3.4mM
		L-组氨酸盐酸盐-水合物	16.6mM
L-甲硫氨酸	10mM
		吐温80(聚山梨酯80)	0.06％
α,α-二水合海藻糖	210mM

将所有配制剂无菌过滤通过0.22μm低蛋白质结合滤器，并在无菌条件下填充入无菌6ml玻璃管形瓶中，用经ETFE(乙烯和四氟乙烯的共聚物)包被的橡胶塞和Alucrimp帽密封。填充体积是约3.0ml。

效果实施例1

将实施例1的配制剂分别在40℃条件下贮存不同时间间隔、通过冷冻-融化压力法来施压(在-70℃速冻后，再放室温融化至液体状态为一次冻融)。

在应用压力测试之前和之后通过下列分析方法来分析样品：

1)UV分光光度法：用相应的配制缓冲液将样品按重量稀释至约0.5mg/ml，使用Thermo Biomate 3S分光光度计在波长280nm下通过紫外吸收光谱学来测定蛋白质浓度。

2)大小排阻层析(SEC)：使用大小排阻层析(SEC)来检测配制剂中的可溶性高分子量种类(聚集体)和低分子量水解产物(片段)。在装备有UV检测仪(检测波长280nm)和TSKG3000SWXL柱(7.5x300mm)的AgilentTechnologies,Inc.1200系列HPLC上实施SEC。使用0.20M磷酸钾和0.25M氯化钾(pH6.2)以0.3ml/分钟的流速通过等度洗脱概况来分开完整的单体、聚集体和水解产物。

3)离子交换层析(IEC)：实施离子交换层析(IEC)以检测配制剂中改变抗CD20抗体的净电荷的化学降解产物。出于此目的，将抗CD20抗体与羧肽酶B一起温育以催化碱性氨基酸的水解。在具有UV检测仪(检测波长280nm)和ThermoProPacWCX-10(4x250mm)柱的AgilentTechnologies,Inc.1100系列HPLC上实施离子交换层析。使用10mM PB(pH7.4)(流动相A)和10mM磷酸钾中溶解的500mM氯化钾(流动相B)的线性梯度以1.0mL/分钟的流速分开酸性和碱性变体。

4)抗CD20抗体活性的补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法：实施补体依赖性细胞毒性测定(CDC)测定法以测定抗CD20抗体的体外活性。使用补体依赖性细胞毒性(CDC)效力测定法来测量抗体在存在人补体的情况中裂解Raji细胞的能力。在96孔组织培养微量滴定板中实施该测定法。在此测定法中，将在测定稀释剂中稀释的不同浓度的抗CD20抗体参照物质、对照、或样品在存在固定量的人补体的情况中与Raji细胞一起温育。将板于37℃/5％CO₂在湿润的培养箱中温育1至2小时。在温育期结束时，将50μL含40％CCK-8的反应缓冲液添加至每孔，水平震动混匀放回培养箱培养3小时。在酶标仪上读取450nm吸光度。记录A450nm，根据参考品及样品的量效关系，使用软件GraphPad Prism 5进行拟合并计算活性。

5)毛细管凝胶电泳法

还原CE-SDS检测方法如下：

仪器型号为Beckman Coulter/PA800 plus，采用非涂层-熔融石英毛细管检测(内径50mm，有效长度和切割长度分别为20cm和30.2cm)，使用二极管阵列检测器(PAD)(220nm检测波长，100mm×200mm规格的孔塞)，100mM Tris-HCl pH9.0和1％SDS为流动相，供试品用水稀释至5mg/ml，后加入SDS running buffer等，再经pH8.0，0.2％SDS蛋白变性剂变性，70℃下孵育10分钟，最终检测时的浓度为1mg/ml，取100ml供试品至检测小管中进行检测。

非还原CE-SDS检测方法如下：

仪器型号为Beckman Coulter/PA800 plus，采用非涂层-熔融石英毛细管检测(内径50mm，有效长度和切割长度分别为20cm和30.2cm)，使用二极管阵列检测器(PAD)(220nm检测波长，100mm×200mm规格的孔塞)，100mM Tris-HCl pH9.0和1％SDS为流动相，供试品用水稀释至5mg/ml，后加入SDS running buffer等，再经pH8.0，0.2％SDS蛋白变性剂变性，70℃孵育5分钟，最终检测时的浓度为1mg/ml，取100ml供试品至检测小管中进行检测。

6)蛋白粒径的检测(DLS)

样品处理：待其完全溶解后使用。若样品为原液，不需复溶，平衡至室温后使用。

样品检测：取100μl供试品放至可抛弃型低容量样品池中(避免产生气泡)，按仪器(Malvern ZMV 2000)指示，打开样品测量池盖，将样品池放入样品测量池(倒三角面朝外)，盖上池盖。点击“Start”，即开始测量，点击“Result”，可获得粒度分布结果，点击“Number”和“Volume”，获得数量和体积分布结果图。

7)不溶性微粒检测：使用天大天发GWJ-8微粒检测仪对样品进行微粒检测。

具体数据可参见表2和表3。

表2 40℃储存抗CD20抗体不同时间点的稳定性数据

注：初始状态是指抗CD20抗体浓缩液制备得到时，W是指周，M是指月。

表3 冻融试验中抗CD20抗体的稳定性数据

注：初始状态是指抗CD20抗体浓缩液制备得到时，T是指冻融次数，例如3T是指冻融3次。

实施例2：人源化抗CD20液体配制剂的制备

为了制备液体配制剂，将重组人源化抗CD20抗体(如专利号ZL201010150303.3中所披露的)针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，并且在需要的情况中，浓缩成约150mg/ml的抗体浓度。在达到目标浓度后，然后，将α,α-二水合海藻糖、苏州康聚产透明质酸酶和聚山梨酯80以储备溶液添加至抗体溶液。最后，用最终配制缓冲液将蛋白质浓度调节至约120mg/ml的浓度。

表4

组分	浓度
		抗CD20抗体	120mg/mL
L-组氨酸	3.4mM
		L-组氨酸盐酸盐-水合物	16.6mM
L-甲硫氨酸	10mM
		吐温80(聚山梨酯80)	0.06％
α,α-二水合海藻糖	210mM
		透明质酸酶	2000U/mL

将所有配制剂无菌过滤通过0.22μm低蛋白质结合滤器，并在无菌条件下填充入无菌2ml玻璃管形瓶中，用氟树脂层状丁基橡胶塞子加塞并用铝/塑料掀开型(flip-off)封条加帽。填充体积是约1.2ml。

效果实施例2

将实施例2的配制剂分别在2-8℃(药品储存温度)、和25℃(加速试验)贮存不同时间间隔，通过冷冻-融化压力法来施压。通过以下分析方法在每个稳定性时间点分析样品：

1)UV分光光度法；

2)大小排阻层析(SEC)；

3)离子交换层析(IEC)；

4)抗CD20抗体药物配制剂活性的补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法；

5)电泳方法；

6)蛋白粒径。

7)不溶性微粒

8)酶活性：使用rHuPH20作为透明质酸酶的体外酶测定法作为活性测定法。该测定法基于在乙酰透明质酸(透明质酸钠)结合阳离子沉淀剂时形成不溶性沉淀物。通过将rHuPH20与乙酰透明质酸底物一起温育，然后用酸化的血清清蛋白沉淀未消化的乙酰透明质酸来测量酶活性。以640nm波长测量浊度并且源自对乙酰透明质酸底物的酶活性的浊度降低是酶活性的测量。使用用人HuPH20测定参照标准品的稀释液产生的标准曲线运行该规程，并自曲线读出样品活性。

1)～7)的检测方法同效果实施例1。具体数据可参见表5、表6和表7。

表5 25℃储存抗CD20抗体药物配制剂不同时间点的稳定性数据

注：初始状态是指抗CD20抗体药物配制剂制备得到时，W是指周，M是指月。

表6 冻融试验中抗CD20抗体药物配制剂的稳定性数据

注：初始状态是指抗CD20抗体药物配制剂制备得到时，T是指冻融次数，例如3T是指冻融3次。

表7 2-8℃储存抗CD20抗体药物配制剂在不同时间点的稳定性数据

注：初始状态是指抗CD20抗体药物配制剂制备得到时，M是指月，ND是指未进行检测。

实施例3：抗CD20抗体药物配制剂

为了制备液体配制剂，将抗CD20抗体针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，并且在需要的情况中，通过渗滤浓缩成80mg/ml的抗体浓度。完成渗滤操作后，将聚山梨酯80以储备溶液添加至抗体溶液。最后，用缓冲液将蛋白质浓度调节至80mg/ml。将该配制剂通过0.22μm低蛋白质结合滤器无菌过滤，并在无菌条件下分装于2ml无菌无热原冻存管中，填充体积是约1.5ml。

表8

组分	浓度
		抗CD20抗体	80mg/mL
L-组氨酸	3.4mM
		L-组氨酸盐酸盐-水合物	16.6mM
L-甲硫氨酸	10mM
		吐温80(聚山梨酯80)	0.06％
α,α-二水合海藻糖	210mM

实施例4：抗CD20抗体药物配制剂

为了制备液体配制剂，将抗CD20抗体针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，并且在需要的情况中，通过渗滤浓缩成约120mg/ml的抗体浓度。完成渗滤操作后，将聚山梨酯80以储备溶液添加至抗体溶液。最后，用缓冲液将蛋白质浓度调节至120mg/ml。

表9

组分	浓度
		抗CD20抗体	120mg/mL
L-组氨酸	3.4mM
		L-组氨酸盐酸盐-水合物	16.6mM
L-甲硫氨酸	10mM
		吐温80(聚山梨酯80)	0.06％
α,α-二水合海藻糖	210mM

将该配制剂通过0.22μm低蛋白质结合滤器无菌过滤，并在无菌条件下分装于2ml无菌无热原冻存管中，填充体积是约1.5ml。

实施例5：人源化抗CD20液体配制剂的制备

为了制备液体配制剂，将重组人源化抗CD20抗体(如专利号ZL201010150303.3中所披露的)针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，并且在需要的情况中，浓缩成约150mg/ml的抗体浓度。在达到目标浓度后，然后，将α,α-二水合海藻糖、苏州康聚产透明质酸酶和聚山梨酯80以储备溶液添加至抗体溶液。最后，用最终配制缓冲液将蛋白质浓度调节至约120mg/ml的浓度。

表10

组分	浓度
		抗CD20抗体	120mg/mL
L-组氨酸	3.4mM
		L-组氨酸盐酸盐-水合物	16.6mM
L-甲硫氨酸	10mM
		吐温80(聚山梨酯80)	0.06％
α,α-二水合海藻糖	210mM
		透明质酸酶	2000U/mL

将所有配制剂无菌过滤通过0.22μm低蛋白质结合滤器，并在无菌条件下填充入无菌10ml管制注射剂瓶中，用覆聚乙烯-四氟乙烯膜氯化丁基橡胶塞子加塞并用铝/塑料掀开型(flip-off)封条加帽。填充体积是约7ml。

效果实施例3

将实施例3的配制剂分别在2-8℃(药品储存温度)贮存不同时间间隔，在每个稳定性时间点分析样品，检测方法同效果实施例2。具体数据可参见表11。

表11

对比例1：对照配制剂

为了制备液体配制剂，将抗CD20抗体针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，并且在需要的情况中，通过渗滤浓缩成80mg/ml的抗体浓度。完成渗滤操作后，将聚山梨酯80以储备溶液添加至抗体溶液。最后，用缓冲液将蛋白质浓度调节至80mg/ml。将该配制剂通过0.22μm低蛋白质结合滤器无菌过滤，并在无菌条件下分装于2ml无菌无热原冻存管中，填充体积是约1.5ml。

表12

组分	浓度
		抗CD20抗体	80mg/mL
枸橼酸	3.18mM
		枸橼酸钠	22.1mM
氯化钠	154mM
		吐温80(聚山梨酯80)	0.07％

对比例2：对照配制剂

为了制备液体配制剂，将抗CD20抗体针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，并且在需要的情况中，通过渗滤浓缩成120mg/ml的抗体浓度。完成渗滤操作后，将聚山梨酯80以储备溶液添加至抗体溶液。最后，用缓冲液将蛋白质浓度调节至120mg/ml。将该配制剂通过0.22μm低蛋白质结合滤器无菌过滤，并在无菌条件下分装于2ml无菌无热原冻存管中，填充体积是约1.5ml。

表13

组分	浓度
		抗CD20抗体	120mg/mL
枸橼酸	3.18mM
		枸橼酸钠	22.1mM
氯化钠	154mM
		吐温80(聚山梨酯80)	0.07％

效果实施例4

采用差示扫描荧光法(DSF)对实施例3、4和对比例1、2的配制剂进行热力学参数研究，结果见表14。由表14可知，无论何种浓度，抗CD20抗体在两种配制剂中各阶段的Tm值均相差不大，没有明显差别，说明在高浓度的条件下，初步判定抗CD20抗体在两种配制剂中的热力学稳定性相差不大。

表14

另外，按照上述实施例和对比例中的方法，分别制备不同抗CD20抗体浓度(10mg/ml、40mg/ml和120mg/ml)的配制剂和对照配制剂，变性处理后采用差示扫描荧光法(DSF)检测本发明的配制剂和对照配制剂中不同浓度(10mg/ml、40mg/ml和120mg/ml)抗CD20抗体的ΔG值，结果见图1。由图1中曲线可明显发现，抗CD20抗体在本发明的配制剂中不同浓度下的ΔG值几乎保持一致，说明抗CD20抗体在该配制剂中，随着浓度的升高，没有明显聚集或变性的趋势；而在对照配制剂中，随着抗CD20抗体浓度的不断增加，样品ΔG值整体呈下降趋势，且在10mg/ml到40mg/ml段下降尤为明显，说明在该配制剂中，如果浓度达到一定程度，会有聚集或变性趋势。由此可预测，本发明的配制剂更有利于形成稳定的抗CD20抗体的高浓度制剂。

效果实施例5

将实施例3、4和对比例1、2的配制剂分别在40℃加速稳定性试验中进行不同时间间隔(0、7D和1M)，在每个稳定性时间点分析样品，检测方法参见效果实施例1。具体数据参见表15～18。

表15：40℃储存实施例3配制剂不同时间点的稳定性数据

注：初始状态是指抗CD20抗体药物配制剂制备得到时，D是指天，M是指月。

表16：40℃储存实施例4配制剂不同时间点的稳定性数据

注：初始状态是指抗CD20抗体药物配制剂制备得到时，D是指天，M是指月。

表17：40℃储存对比例1配制剂不同时间点的稳定性数据

注：初始状态是指抗CD20抗体药物配制剂制备得到时，D是指天，M是指月。

表18：40℃储存对比例2配制剂不同时间点的稳定性数据

注：初始状态是指抗CD20抗体药物配制剂制备得到时，D是指天，M是指月。

实施例3、4和对比例1、2的配制剂0点、40℃7天及1个月时的DLS检测结果见图2。由图2(a)可以看出，对比例1的样品在0点检测即出现较多粒径大于100nm的团聚体，在经过40℃加速稳定性放置后，该范围粒径内团聚体明显增加，结合不溶性微粒结果，该浓度下团聚体并未形成不溶性微粒，但趋势仍然明显。由图2(b)可以看出，对比例2的样品虽然0点及40℃加速稳定性放置后粒径大于100nm的团聚体较对比例1少，但从不溶性微粒结果来看，其都以大于10μm的颗粒形式出现，且40℃放置一个月后颗粒数大幅增加。由图2(c)可以看出，实施例3的样品即使在40℃加速稳定性放置1月后，样品中均未出现大于100nm粒径的团聚体，且不溶性微粒都在100个/ml以下，说明单抗在此处方下未发生明显聚集，性质稳定。由图2(d)可以看出，实施例4的样品0点出现少量粒径大于100nm的团聚体，且不溶性微粒较多，但即使经过40℃加速稳定性放置1月后，其在亚可见微粒及可见微粒范围内都未出现明显变化。从整体来看，抗体在高浓度情况时，在本发明的配制剂中的稳定性优于对照配制剂。

由表15～18可知，SEC主峰比例随着时间的推移而降低，且可明显观察到，在0点及40℃加速稳定性放置7天和1月后，实施例3和4的样品的SEC主峰比例均高于对比例1和2的样品，且对比例1和2的样品的SEC主峰降低明显较实施例3和4的样品剧烈，说明本发明的配制剂更有利于该单抗在高浓度时的纯度维持。

由表15～18可知，单抗中的酸峰含量随时间的变化不断增加，实施例3和4的样品在各阶段酸峰含量的增长几乎相近，40℃放置7天后，实施例3和4的样品的酸峰的增长明显高于对比例1和2的样品，40℃放置1月后，单抗在本发明的配制剂及对照配制剂中的酸峰比例几乎相近。因此，可认为该单抗在高浓度时在本发明的配制剂中的稳定性略优于对照配制剂。

由表15～18可知，单抗的CE纯度随时间的变化不断降低，经过40℃加速稳定性放置后，对比例1和2样品的CE纯度较实施例3和4的样品下降得更为明显。实验结果表明，本发明的配制剂更有利于该单抗在高浓度情况下纯度的维持。

由表15～18可知，随着时间的变化，低分子量峰不断增加，40℃放置7天后，实施例3和4的样品的低分子量峰略低于对比例1和2样品，但在40℃放置1月后，两种配制剂中的低分子量峰含量趋于一致，综合整个加速稳定性实验结果来看，可认为两种配制剂对于抗体蛋白小分子片段的降解保护作用相近。

综上所述，通过DSC/DSF对抗体分子热稳定性的评估以及40℃加速稳定性试验，由DLS、SEC-HPLC、CEX-HPLC、还原及非还原CE-SDS和不溶性微粒一系列检测结果可以得出结论，该抗体在高浓度情况下，在两种配制剂中的Tm值、酸峰含量及低分子量峰的差异不大，但在单抗聚集程度(亚可见微粒及可见微粒)、SEC主峰含量及CE纯度方面，本发明的配制剂明显优于对照配制剂。因此，本发明的配制剂更有利于高浓度抗体配制剂的长期稳定性。

Claims (17)

1.一种包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，其包含：

1)50-200mg/ml抗CD20抗体，所述抗CD20抗体的重链可变区选自如中国专利申请CN201010150303.3中SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：36所示的序列或其突变序列，所述抗CD20抗体的轻链可变区选自如中国专利申请CN 201010150303.3中SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37所示的序列或其突变序列；

2)10-50mM缓冲剂，所述缓冲剂为组氨酸缓冲剂；

3)105-420mMα,α-二水合海藻糖；

4)5-20mM甲硫氨酸；和

5)0.01-0.12％非离子型表面活性剂；

所述包含抗CD20抗体的药物配制剂的pH为5.5±2.0。

2.如权利要求1所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，其包含：

1)50-200mg/ml抗CD20抗体，所述抗CD20抗体的重链可变区选自如中国专利申请CN201010150303.3中SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：36所示的序列或其突变序列，所述抗CD20抗体的轻链可变区选自如中国专利申请CN 201010150303.3中SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37所示的序列或其突变序列；

2)10-40mM缓冲剂，所述缓冲剂为组氨酸缓冲剂；

3)105-420mMα,α-二水合海藻糖；

4)5-20mM甲硫氨酸；和

5)0.03-0.12％非离子型表面活性剂；

所述包含抗CD20抗体的药物配制剂的pH为5.5±2.0。

3.如权利要求1所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，所述抗CD20抗体的浓度为50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml或200mg/ml；

和/或，所述抗CD20抗体的重链可变区为如中国专利申请CN 201010150303.3中SEQ IDNO：16所示的序列或其突变序列，所述抗CD20抗体的轻链可变区为如中国专利申请CN201010150303.3中SEQ ID NO：35所示的序列或其突变序列；

和/或，所述抗CD20抗体还含有人IgG1重链恒定区和人κ轻链恒定区。

4.如权利要求1所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，所述缓冲剂的浓度为10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或50mM；

和/或，所述组氨酸缓冲剂为L-组氨酸缓冲剂，更优选为L-组氨酸盐酸盐缓冲剂。

5.如权利要求1所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，所述包含抗CD20抗体的药物配制剂的pH为4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。

6.如权利要求1所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，所述α,α-二水合海藻糖的浓度为105mM、150mM、200mM、210mM、250mM、300mM、350mM、400mM或420mM。

7.如权利要求1所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，所述甲硫氨酸的浓度为5mM、10mM、15mM或20mM；

和/或，所述甲硫氨酸为L-甲硫氨酸。

8.如权利要求1所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，所述非离子型表面活性剂的浓度w/v为0.01％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％或0.12％；

和/或，所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯80。

9.如权利要求1-8中任一项所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂中还包含透明质酸酶；

所述透明质酸酶的浓度优选为1000-12000U/ml，更优选为1000-4000U/ml，甚至更优选为1200U/ml、1400U/ml、1600U/ml、1800U/ml、2000U/ml、2200U/ml、2400U/ml、2600U/ml、2800U/ml、3000U/ml、3200U/ml、3400U/ml、3600U/ml、3800U/ml、4000U/ml、8000U/ml或12000U/ml；

所述透明质酸酶优选为PH20，更优选为rHuPH20；所述PH20优选为购自苏州康聚的PH20。

10.如权利要求9所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，

所述包含抗CD20抗体的药物配制剂包含：

1)100mg/ml抗CD20抗体；

2)20mM L-组氨酸盐酸盐缓冲剂；

3)210mMα,α-二水合海藻糖；

4)10mM甲硫氨酸；

5)0.06％(w/v)聚山梨酯80；和

6)2000U/ml透明质酸酶。

11.如权利要求9所述的包含抗CD20抗体的药物配制剂，其特征在于，

所述包含抗CD20抗体的药物配制剂包含：

1)120mg/ml抗CD20抗体；

2)20mM L-组氨酸盐酸盐缓冲剂；

3)210mMα,α-二水合海藻糖；

4)10mM甲硫氨酸；

5)0.06％(w/v)聚山梨酯80；和

6)2000U/ml透明质酸酶。

12.一种如权利要求1-11中任一项所述的包含抗CD20抗体药物配制剂在制备治疗适用于抗CD20抗体治疗的疾病或病症的药物中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的适使用于抗CD20抗体治疗的疾病或病症是癌症或非恶性疾病。

14.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疾病选自下组：B细胞非何杰金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小无核裂细胞淋巴瘤/伯基特氏淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦Waldenstrom氏巨球蛋白血症、急性淋巴细胞性白血病ALL、慢性淋巴细胞性白血病CLL、小淋巴细胞性淋巴瘤SLL、B细胞幼淋巴细胞白血病、浆细胞赘生物、浆细胞骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和何杰金氏病。

15.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疾病选自下组：地方性伯基特氏淋巴瘤、散发性伯基特氏淋巴瘤、非伯基特氏淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤DLCL、弥漫性混合细胞淋巴瘤、成免疫细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤和血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤。

16.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疾病选自下组：关节炎、银屑病、皮炎、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、全身性硬皮病和硬化、与炎性肠病有关的应答、克罗恩Crohn氏病、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、变应性状况、湿疹、哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的状况、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮SLE、幼发型糖尿病、多发性硬化、与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病、结节病、肉芽肿病、粒细胞缺乏、血管炎、再生障碍性贫血、戴-布Diamond Blackfan二氏贫血、免疫性溶血性贫血、恶性贫血、纯红细胞再生障碍PRCA、因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病，中枢神经系统CNS炎性病症，多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗磷脂抗体综合征、贝切特Bechet病，卡斯尔曼Castleman氏综合征，古德帕斯丘Goodpasture氏综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、雷诺Reynaud氏综合征，斯耶格伦氏Sjorgen综合征，史-约Stevens-Johnson二氏综合征，天疱疮、肾病、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜ITP、血栓性血小板减少性紫癜TTP、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性睾丸和卵巢疾病、原发性甲状腺功能减退症；自身免疫性内分泌疾病、慢性甲状腺炎、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退症、阿狄森Addison氏病、格雷夫斯Graves氏病、胰岛素依赖性糖尿病IDDM和席汉Sheehan氏综合征；自身免疫性肝炎、淋巴样间质性肺炎HIV、梗阻性细支气管炎对NSIP、格-巴Guillain-Barre二氏综合征、强直性脊柱炎、贝格尔Berger氏病、原发性胆汁性肝硬变、口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化ALS和冠状动脉疾病。

17.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疾病选自下组：溃疡性结肠炎、变应性脑脊髓炎、变应性神经炎、大疱性类天疱疮、自身免疫性多内分泌病、大血管血管炎、中血管血管炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、成人型呼吸窘迫综合征ARDS、肾小球肾炎、韦格纳Wegener氏肉芽肿病、抗嗜中性粒细胞抗体ANCA、自身免疫性溶血性贫血AIHA、抗肾小球基底膜病、自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、自身免疫性甲状腺炎、桥本Hashimoto甲状腺炎、非移植物梗阻性细支气管炎、风湿性多肌痛、巨细胞性动脉炎、川畸Kawasaki氏病、结节性多动脉炎、IgA肾病、急进性肾小球肾炎和麸质肠病。

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