CN1341029A - 与ELAGIGILTV肽相结合的肠细菌OmpA蛋白用于治疗黑素瘤的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肠细菌膜蛋白OmpA,特别是肺炎克氏杆菌,与一种抗原或半抗原用于制备设计产生或增强针对肿瘤细胞的细胞毒性T应答的药物组合物的用途。本发明还涉及该化合物用于预防或治疗感染或癌症的用途,特别是与肿瘤抗原相关的癌症,诸如黑素瘤,和包含一些该化合物的药物组合物。

Description

与ELAGIGILTV肽相结合的肠细菌OmpA 蛋白用于治疗黑素瘤的用途

本发明涉及肠细菌，特别是肺炎克氏杆菌(Klebsillla pneumoniae)，OmpA膜蛋白，连同一种抗原或半抗原用于制备意欲产生或增强针对传染性因子或肿瘤细胞的细胞毒性T应答的药物组合物的用途。本发明包括这些化合物用于预防和治疗感染或癌症，特别是与肿瘤抗原相关的癌症，诸如黑素瘤的用途，和包含一些这些化合物的药物组合物。

接种疫苗是预防或治疗病毒或细菌感染的有效方法。接种疫苗运动在这些领域的成功使之有可能将至今在传染病学领域中用途的疫苗概念延伸到癌症和自身免疫疾病领域。单独施用于宿主的疫苗抗原的免疫原性常常不足以诱导免疫应答，因此必需与佐剂相伴或与载体蛋白偶联来诱导(或增强)免疫原性。在这些条件下，只能诱导体液类型的免疫应答。现在，在抗病毒治疗的过程中，产生能够识别并消灭病毒的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是及其重要的(Bachmann等人，1994，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24：2228-2236；P.Borrow，1997，病毒性肝炎杂志(J.Virol.Hepat.)4：16-24)，正如许多研究证明的，在体内显示针对病毒表位的应答的保护性作用(A.M.Arvin，1992，传染病杂志(J.Inf.Dis.)166：S35-S41；Koszinowski等人，1987，免疫学通讯(Immunol.Lett.)16：185-192)。

CTL应答的重要性在抗肿瘤应答中同样获得了证明，特别是针对黑素瘤细胞的应答(回顾见Rivoltini等人，1998，免疫学评论性回顾(Crit.Rev.Immunol.)18：55-63)。已经定义了多种抗原的CTL表位(与I型分子相互作用并呈递给CD8＋T淋巴细胞的肽序列)。

然而，困难在于在体内产生CTL，因为这些肽的免疫原性是微弱的(Melief，1992，癌症研究进展(Adv.Cancer Res.)58：143-175；Nandaz和Sercaz，1995，细胞(Cell)82：13-17)。

因此，研究针对鉴定使之有可能诱导CTL的新的佐剂或抗原投递系统。由于它们在呈递抗原和刺激免疫系统、树突细胞中的有效性，例如已经用于产生抗病毒CTL应答(B.Ludewig等人，1998，病毒学杂志(J.Virol.)72：3812-3818；P.Brossard等人，1997，免疫学杂志(J.Immunol.)158：3270-3276)或抗癌CTL应答(F.O.Nestle等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4：328-332)。这些方法在于，给来自体内的树突细胞装载感兴趣的抗原(肽或溶胞产物)，并将这些细胞重新移植到患者体内。其它方法在于，用编码感兴趣抗原的基因转染来自体内的树突细胞，并重新注射这些经转染细胞(E.Gilboa等人，1998，癌症免疫学免疫疗法(Cancer Immunol.Immunother.)46：82-87)。这些方法已经成功的用于小鼠和最近用于人(F.J.Hsu等人，1996，自然医学(Nat.Med.)2：52-58)，但是由于细胞必需进行体外处理(细胞转化或抗原内化)并移植到宿主生物体内，因而仍然是复杂的。相似的，用途病毒类颗粒(G.T.Layton等人，1993，免疫学杂志(J.Immunol.)151：1097-1107)或不完全弗氏佐剂(IFA)(Valmori等人，1994，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24：1458-1462)使之有可能产生CTL应答。然而，对应于CTL表位的抗病毒药物当存在这种佐剂时可能导致特异性耐受状态，这可能在某些情况中产生与期望相反的效果，即免疫应答降低(Toes等人，1996，美国国家科学院展(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)93，7855-7860)。

由此，现在非常需要当与分子(特别是抗原或半抗原)相结合时能够产生针对所述分子的CTL的化合物。这种化合物能够(特别是)用于制备意欲诱导抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、或抗肿瘤的CTL类型的免疫保护的疫苗组合物。

令人惊讶的是，已经证明革兰氏阴性细菌外膜蛋白，特别是肠细菌OmpA蛋白，诸如肺炎克氏杆菌P40蛋白(WO 95/27787和WO 96/14415中描述的蛋白质)，具有引发针对与之共价或非共价相结合的分子的CTL应答的特性，优选不需加入另一种佐剂。

由此，本发明涉及肠细菌OmpA蛋白或其片段或者编码所述OmpA蛋白的核酸序列或其片段，用于制备意欲在体外或体内(优选体内)产生或增强针对传染性因子或肿瘤细胞的细胞毒性T应答的药物组合物的用途和用于制备意欲产生或增强所述细胞毒性T应答的药物组合物的用途。

在本发明中，术语“蛋白质”意欲表示肽或多肽，术语“OmpA”(“外膜蛋白”)意欲表示A型外膜蛋白。

表述“OmpA蛋白片段”意欲表示(特别是)OmpA蛋白氨基酸序列所含的任何氨基酸序列片段，当其与传染性因子或肿瘤细胞特异的抗原或半抗原相结合时，能够产生或增强针对所述感染性介质或所述肿瘤细胞的细胞毒性T应答，该OmpA蛋白片段包含至少5个氨基酸，优选至少10个氨基酸，或更优选至少15个氨基酸。

表述“传染性因子或肿瘤细胞特异的抗原或半抗原”意欲表示(特别是)传染性因子(诸如病毒、细菌、酵母、真菌、或寄生虫)或肿瘤细胞表达的任何化合物或其结构类似物，其单独或与免疫佐剂相结合时能够诱导对所述传染性因子或所述肿瘤细胞特异的免疫应答。

在此描述中，表述“抗原或半抗原的类似物”意欲表述(特别是)与所述抗原或半抗原具有结构相似性、能够在预先用所述相似化合物免疫的生物体内诱导针对所述抗原或半抗原的免疫学应答的化合物。

本发明的一个主题是本发明中要求保护的用途，特征为所述药物组合物还包含与所述肠细菌OmpA蛋白相结合的、对所述传染性因子或所述肿瘤细胞特异的抗原或半抗原。

优选的，本发明包括本发明中要求保护的用途，特征为所述传染性因子是病毒颗粒、细菌、酵母、真菌、或寄生虫。

在特定实施方案中，本发明包括本发明中要求保护的肠细菌OmpA蛋白或其片段的用途，特征为所述肠细菌OmpA蛋白或其片段用途提取方法由所述肠细菌的培养物获得。

用于提取细菌膜蛋白的方法对于本领域技术人员是知道的，因而在此描述中将不再详述。例如，可能会提及Haeuw J.H.等人(1998，欧洲生化杂志(Eur.J.Biochem.)255：446-454)描述的提取方法，但是不受其限制。

在另一个优选的实施方案中，本发明还包括本发明中要求保护的肠细菌OmpA蛋白或其片段的用途，特征为所述肠细菌OmpA蛋白或其片段通过重组途径获得。

用于制备重组蛋白的方法在当今对于本领域技术人员是众所周知的，因而在此描述中将不再详述；然而，可以参照实施例中描述的方法。在可能用于产生这些重组蛋白的细胞中，当然应当提及细菌细胞(P.O.Olins和S.C.Lee，1993，E.coli中异源基因表达的最新进展，生物技术中的现行观点(Curr.Op.Biotechnology)4：520-525)、酵母细胞(R.G.Buckholz，1993，用于表达异源基因产物的酵母系统，生物技术中的现行观点(Curr.Op.Biotechnology)4：538-542)、动物细胞特别是哺乳动物细胞培养物(C.P.Edwards和A.Aruffo，1993，基于COS细胞的瞬时表达系统的现行应用，生物技术中的现行观点(Curr.Op.Biotechnology)4：558-563)、和昆虫细胞，用于昆虫细胞的方法可能采用例如杆状病毒(V.A.Luckow，1993，用于表达人类基因产物的杆状病毒系统，生物技术中的现行观点(Curr.Op.Biotechnology)4：564-572)。

完全优选的是，本发明中要求保护的用途的特征为所述肠细菌是肺炎克氏杆菌。

本发明特别涉及本发明中要求的用途，特征为所述肺炎克氏杆菌OmpA蛋白的氨基酸序列或其片段包含：a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)最佳对比后，与序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列；或c)a)中定义的序列的至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列。

表述“最佳对比后，与给定的核酸或氨基酸序列具有至少80％同源性的核酸或氨基酸序列”意欲表示与所述给定序列最佳对比后包括与所述给定序列具有至少80％百分率同一性的序列。

为了本发明的目的，术语两种核酸或氨基酸序列之间的“百分率同一性”意欲表示最佳对比后获得的所比较的两种序列之间相同核苷酸或氨基酸残基的百分率，该百分率完全是统计学的，两种序列之间的差异随机分布于其全长。两种核酸或氨基酸序列之间的序列比较通常通过将这些序列最佳对比后比较来进行，所述比较通过片段或通过“比较窗”来进行，从而鉴定并比较局部区域的序列相似性。除了手工操作，用于比较的序列最佳对比可以通过Smith和Waterman(1981，应用数学进展(Ad.App.Math.)2：482)的局部同源性算法、Neddleman和Wunsch(1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443)的局部同源性算法、Pearson和Lipman(1988，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：2444)的相似性搜索方法、用途这些算法的计算机软件(威斯康星遗传学软件包(Genet ics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，或者BLAST N或BLAST P比较软件)产生。

两种核酸或氨基酸序列之间的百分率同一性通过比较经比较窗最佳对比的这两种序列来测定，待比较的核酸或氨基酸序列在比较窗中的区域相对于用于这两种序列间最佳对比的参考序列可能包含添加或删除。百分率同一性的计算方法是，测定两种序列之间核苷酸或氨基酸残基相同的同一位置的数目，将此同一位置数目除以比较窗中的总位置数目，并将得数乘以100，从而获得这两种序列之间的百分率同一性。

例如，可以利用BLAST程序“BLAST 2 sequences”，可以由站点http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html获得，所用参数为缺省值(特别是“开放缺口补偿”参数：5和“延伸缺口补偿”参数：2；所选矩阵是例如由程序提供的“BLOSUM 62”矩阵)，待比较的两种序列之间的百分率同一性由程序直接计算。

在所述与参考OmpA序列具有至少80％同源性的序列中，优选能够诱导特异针对与之相结合的抗原或半抗原的CTL活性的肽序列，或其编码序列，例如，CTL活性用途下文实施例中所述标准技术来测量。

本发明还包括本发明中要求保护的用途，特征为所述抗原或半抗原选自蛋白质、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂类、或能够特异诱导针对所述传染性抗原或所述肿瘤细胞的CTL应答的任何化合物。

本发明的一个主题是本发明中要求的用途，特征为所述抗原或半抗原与所述OmpA蛋白或其片段偶联或混合。

本发明还包括本发明中要求的用途，特征为所述抗原或半抗原通过共价连接(特别是化学偶联)与所述OmpA蛋白或其片段偶联。

在特定实施方案中，本发明中要求的用途的特征为在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述抗原或半抗原中导入一种或多种连接元件，从而有助于化学偶联；所述导入的连接元件优选氨基酸。

如本发明中要求的，有可能导入一种或多种连接元件，特别是氨基酸，从而有助于OmpA蛋白或其片段与所述抗原或半抗原之间的偶联反应。如本发明中要求的，OmpA蛋白或其片段与所述抗原或半抗原之间的共价偶联可能在OmpA蛋白或其片段的N或C末端进行。能够进行这种偶联的双功能试剂将由选择用来进行偶联的OmpA蛋白或其片段的末端和待偶联的所述抗原或半抗原的本性来确定。

在另一个特定的实施方案中，本发明中要求的用途的特征为当所述抗原或半抗原的本质是肽时，所述抗原或半抗原与所述OmpA蛋白或其片段之间的偶联通过基因重组产生。

由与所述OmpA蛋白或其片段偶联衍生的缀合物可以通过基因重组制备。嵌合或杂合蛋白(缀合物)可以用途重组DNA技术，通过在编码所述OmpA蛋白或其片段的DNA序列中插入或添加编码其本质是肽的所述抗原或半抗原的序列而产生。

用于合成杂合分子的方法包括在基因工程中用于构建编码期望多肽序列的杂合多核苷酸的方法。有利的是，例如可以参考由D.V.Goeddel(1990，基因表达技术，酶学方法(Methods in Enzymology)185：3-187)描述的用于获得编码融合蛋白的基因的技术。

另一方面，本发明涉及本发明中要求的用途，特征为药物组合物包含编码所述杂合蛋白的核酸构建物，或包含含编码所述杂合蛋白的核酸构建物的载体，或包含所述核酸构建物、能够表达所述杂合蛋白的经转化宿主细胞。

本发明还包括本发明中要求的用途，用于制备意欲消除传染性因子或抑制肿瘤生长的药物组合物。

优选的是，本发明中要求的用途涉及意欲预防或治疗传染病或癌症的药物组合物的制备，优选与肿瘤抗原相关的癌症。

在肿瘤表达相关肿瘤抗原、可以用本发明中要求的用途预防或治疗的癌症中，可能特别提及(但是不受其限制)：·乳腺癌、肺癌、结肠癌、和胃癌(Kawashima等人，1999，癌症研究(Cancer Res.)59：431-435)；·间皮瘤、骨肉瘤、脑癌(Xie等人，1999，国家癌症学会会刊(J.Natl.Cancer.Inst.)91：169-175)；·黑素瘤(Zheuten等人，1998，Bratilsl.Lek.Listy 99：426-434)；·胰囊腺瘤(Hammel等人，1998，欧洲胃肠病学和肝病学杂志(Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.)10：345-348)；·结肠直肠癌(Ogura等人，1998，抗癌研究(Anticancer Res.)18：3669-3675)；·肾细胞癌(Jantzer等人，1998，癌症研究(Cancer Res.)58：3078-3086)；和·卵巢和宫颈癌(Sonoda等人，1996，癌症(Cancer)77：1501-1509)。

本发明的一个主题特别是本发明中要求的肠细菌OmpA蛋白或其片段的用途，用于制备意欲预防或治疗传染病，特别是病毒、细菌、真菌、或寄生虫起源，或癌症，优选与肿瘤抗原相关的，特别是黑素瘤的药物免疫组合物。

本发明还包括本发明中要求的用途，特征为所述药物组合物的装载(Vehicled)形式使之有可能改进其稳定性和/或其免疫原性，特别是脂质体的形式。

优选的是，本发明包括本发明中要求的用途，特征为所述载体(Vehicle)是包含编码所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述杂合蛋白的核酸构建物的病毒载体(Vector)，或能够表达所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述杂合蛋白的经转化宿主细胞。

本发明还包括本发明中要求的用途，特征为所述核酸构建物、或包含在所述载体或所述经转化细胞中的核酸构建物，所含核酸序列选自序列SEQ ID NO.1、具有序列SEQ ID NO.1至少15个连续核苷酸(优选30个连续核苷酸)的片段、或与所述序列之一最佳对比后具有至少80％同源性的序列。

优选的是，本发明的一个主题是本发明中要求的肠细菌OmpA蛋白或其片段，与抗原或半抗原相结合用于制备意欲产生针对肿瘤细胞的细胞毒性T应答的药物组合物的应用，如本发明所要求保护的，特征为所述抗原或半抗原是序列SEQ ID NO.3：ELAGIGILTV的肽，且细胞毒性T应答针对黑素瘤细胞。

同样优选的是，本发明的一个主题是本发明中要求的肠细菌OmpA蛋白或其片段的用途，与序列ELAGIGILTV的肽相结合用于制备意欲治疗或预防恶性黑素瘤的药物组合物。

另一方面，本发明的一个主题是上文定义的药物组合物，特别是：-药物组合物，特征为包含肠细菌OmpA蛋白或其片段，其通过混合或共价偶联与序列ELAGIGILTV的肽相结合；或-药物组合物，特征为包含含编码肠细菌OmpA蛋白或其片段的核酸和编码序列ELAGIGILTV的肽的核酸的核酸构建物。

如上文为本发明中要求的用途而定义的，本发明中要求的所述药物组合物可以(例如)包含肠细菌OmpA蛋白或其片段，通过共价连接(通过化学合成)将用途重组OmpA或由提取方法获得的OmpA与序列ELAGIGILTV的肽偶联，或者通过基因重组而偶联。

同样如上文为本发明中要求的用途而定义的，本发明中要求的所述药物组合物可以(例如)包含所含核酸构建物包含编码肠细菌OmpA蛋白或其片段的核酸和/或编码肽序列ELAGIGILTV的核酸的载体，或者能够表达肠细菌OmpA蛋白或其片段和/或肽序列ELAGIGILTV的经转化宿主细胞。

本发明的一个主题是药物组合物，特征为它包含序列SEQ ID NO.2的肺炎克氏杆菌OmpA蛋白、其序列与序列SEQ ID NO.2最佳对比后具有至少80％同源性的蛋白质、所述序列SEQ ID NO.2 OmpA蛋白的至少5个氨基酸的片段，其通过混合或偶联与肽序列ELAIGILTV相结合。

本发明的一个主题是药物组合物，特征为它包含含编码肺炎克氏杆菌OmpA蛋白序列SEQ ID NO.2、其序列与序列SEQ ID NO.2最佳对比后具有至少80％同源性的蛋白质、或所述OmpA蛋白序列SEQ ID NO.2的至少5个氨基酸的片段的核酸和编码肽序列ELAGIGILTV的核酸的核酸构建物。

根据本发明，所述组合物的装载形式使之有可能改进其稳定性和/或其免疫原性，诸如脂质体，或病毒载体、或能够表达所述OmpA蛋白或其片段和所述肽序列ELAGIGILTV的经转化细胞的形式。

根据本发明，所述组合物将优选优选包含于制药学可接受介质中。

为了本发明的目的，制药学可接受的介质是本发明化合物在其中给药的介质，优选能够给人注射的介质。它可能由水、盐的水溶液、或基于右旋糖和/或甘油的水溶液组成。

根据本发明，所述组合物还可以包含去污剂。

本发明中要求的组合物还可以包含去污剂，特别是任何形式的制药学可接受的表面活性剂，诸如例如阴离子、阳离子、非离子、或兼性表面活性剂。优选使用去污剂Zwittergent 3-12和辛基葡糖吡喃糖苷，甚至更优选Zwittergent 3-14。

本发明还包括本发明中要求的组合物，特征为它们不包含其它用于诱导CTL应答的佐剂。优选的，除了本发明药物组合物特征性肠细菌OmpA蛋白或其片段或者编码肠细菌omA蛋白或其片段的核酸，本发明中要求的所述药物组合物不包含免疫佐剂。

下文的图例和实施例意欲例证本发明，绝非限制其范围。

图例：

图1A、1B、1C、和1D：效应细胞抗MELAN-A和抗TRP-2的CTL活性测量。

在用与3μg rP40混合的50μg hELA(图1A)、与300μg rP40混合的50μg hELA(图1B)、与rP40偶联的50μghELA(图1C)、或与300μgrP40混合的TRP-2肽(图1D)免疫之后，在评估它们杀伤可能经(长方形)或可能未经(菱形)相关预肽脉冲的靶细胞的能力之前，用经照射和用1μM相关肽预脉冲的EL-4 A2/Kb细胞(图1A、1B、或1C)或EL-4细胞(图1D)刺激引流淋巴结细胞。

图1A-1D的X轴点对应于效应T细胞(活性淋巴细胞)与靶细胞(EL-4A2/Kb或EL-4)混合的比率。

图2A、2B、2C、和2D：与由标准免疫方案获得的CTL活性比较，当存在rP40蛋白时效应细胞抗MELAN-A的CTL活性测量。

在单独用hELA(50μg)(ELA，图2A)、与300μgrP40混合的hELA(ELA＋P40，图2B)、与300μg rP40偶联的hELA(ELA/P40，图2C)、或以IFA为佐剂与50μg P30肽混合的hELA(ELA＋IFA＋TT，图2D)(IFA指不完全弗氏佐剂，TT指破伤风类毒素)免疫之后，在评估它们杀伤可能经(长方形)或可能未经(菱形)hELA肽预脉冲的EL-4 A2/Kb靶细胞的能力之前，在体外用经照射和用1μM相关肽预脉冲的EL-4 A2/Kb细胞刺激引流淋巴结细胞2周。

                    实施例实施例1：编码肺炎克氏杆菌P40蛋白的基因的克隆

通过PCR扩增用途肺炎克氏杆菌IP I145(Nguyen等人，1998，基因(Gene))基因组DNA获得编码P40蛋白的基因。将编码该基因的基因片段插入各种表达载体，受各种启动子的控制，特别是Trp操纵子。P40蛋白的核苷酸序列和肽序列分别由下文的序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2表示。用pvaLP40表达载体转化E.coli K12生产菌株。以包涵体的形式生产重组P40蛋白(rP40)，产量相当高(g蛋白质/g干生物量大于10％)。

此实施例仅仅是rP40蛋白表达的例示，此例示有可能延伸至其它细菌菌株和其它表达载体。实施例2：用于rP40融合蛋白的发酵的方法

在装有250ml含氨苄青霉素(100μg/ml，Sigma)和四环素(8μg/ml，Sigma)的TSB(胰胨豆胨培养基，Difco)培养基的锥形瓶中，接种上述经转化E.coli菌株。于37℃温育过夜后，用200ml此培养液接种发酵罐(Biolaffite，法国)中的2L培养基。在传统方法中，培养液可能包含已知促进高密度细菌细胞生长的添加维生素和/或酵母提取物的化学试剂。

在发酵过程中控制的参数是：pH、搅拌、温度、充氧水平、和混合源(甘油或葡萄糖)的供应。一般而言，pH调至7.0，温度固定在37℃。通过恒速(12ml/h)供应甘油(87％)来控制生长，从而将溶氧张力信号维持在30％。当培养液的混浊度(于580nm测量)达到80时(培养大约24小时后)，通过加入吲哚丙烯酸(IAA)至终浓度25mg/L来处理蛋白质生产。诱导大约4小时后，通过离心收获细胞。获得的净生物量为大约200g。实施例3：用于提取并纯化rP40蛋白的方法提取rP40

将培养液离心(4000rpm，10min，4℃)后，将细胞重悬于25mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)。用溶菌酶处理(0.5g/L，1h，室温，温和搅拌)后获得不溶性成分即包涵体。将通过离心(15min，10,000rpm，4℃)获得的包涵体沉淀用含5mM MgCl₂的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)吸收，然后离心(15min，10,000rpm)。

将包涵体在含7M尿素(变性剂)和10mM二硫苏糖醇(还原二硫桥)25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中于37℃溶解2小时。离心(15min，10,000rpm)使之有可能消除不溶性颗粒。

然后重悬于13倍体积的含NaCl(8.76g/L)和Zwittergent 3-14(0.1％，w/v)的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中。将溶液于室温接触空气温和搅拌过夜(从而通过稀释和二硫桥的再氧化促进蛋白质复性)。纯化rP40蛋白-阴离子交换层析步骤

再次离心后，将溶液用含0.1％Zwittergent 3-14(100倍缓冲液体积)的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)于4℃透析过夜。

将透析液上样至用上述缓冲液以线性流速15cm/h平衡的含强阴离子交换剂类载体(Biorad Macro Prop High Q凝胶)的层析柱。于280nm检测蛋白质。用含0.2M NaCl和0.1％Zwittergent 3-14的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)以线性流速60cm/h洗脱rP40蛋白。-阳离子交换层析步骤

合并含rP40蛋白的收集液，并通过超滤浓缩。对于大约100ml体积，借助Amicon细胞系统搅拌，用途YM10型Diaflo膜(截留阈值10kDa)；对于较大体积，借助Millipore Minitan切向流过滤系统，用途截留阈值10kDa的膜板。将由此浓缩收集液用含0.1％Zwittergent 3-14的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)于4℃透析过夜。

将透析液上样至用含0.1％Zwittergent 3-14的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)平衡的含强阳离子交换剂类载体(Biorad Macro Prop HighS凝胶)的层析柱。用0.7M NaCl浓度以线性流速61cm/h洗脱rP40蛋白。电泳特征显示大约95％的纯度。通过SDS-PAGE监测蛋白质状态。由肺炎克氏杆菌膜提取的P40蛋白根据其是否处于本性或天然形式而具有特征性电泳(泳动)行为。事实上，天然形式(β-折叠结构)的分子量小于由变性剂(诸如尿素或盐酸胍)作用或存在SDS时于100℃加热产生的变性形式(α-螺旋结构)。不管进行后者时是否存在0.1％(w/v)Zwittergent 3-14，rP40蛋白在复性结束时不正确复性。另一方面，用含0.1％(w/v)Zwittergent 3-14的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)透析后获得完全复性。然而，应当注意的是，只有在室温的稀释步骤和处理在Zwittergent 3-14(不含去污剂阴性结果)中进行时获得这种复性。实施例4：CTL的产生

为几种抗原定义了针对黑素瘤细胞的抗肿瘤CTL应答。这些抗原包括于下列三类之一：a)黑素瘤特异性排异抗原，诸如MAGE家族(由van der Bruggen等人综述，科学(Science)254：1643)；b)来自正常蛋白质突变的抗原。这一组包括MUM-1(Coulie等人，1995，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92：7976-7980)；CDK4(Wolfel等人，1995，科学(Science)296：1281-1284)；和HLA-A2(Brandel等人，1996，实验医学杂志(J.Exp.Med.)183：2501-2508)；c)黑素瘤和黑素细胞表达的分化抗原。这一组包括酪氨酸酶(Wolfel等人，1994，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)4：759和Brichard等人，1996，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)26：224)；gp100(Kang等人，1995，免疫学杂志(J.Immunol.)155：1343；Cox等人，1994，科学(Science)264：716；和Kawakami等人，1995，免疫学杂志(J.Immunol.)155：3961)；gp75(Wang等人，1996，实验医学杂志(J.Exp.Med.)183：1131)；和Mart-1/MelanA(参阅美国专利5,620,886)。

在所有这些抗原中，Mart-1/MelanA似乎是用于免疫治疗的最佳候选者，这有几个原因。首先，该抗原是根据CTL应答鉴定的，所述CTL应答在体内是浸润黑素瘤的淋巴细胞，在体外是外周血细胞，这说明了该抗原在天然应答中的较大相关性，所述天然应答在体内是针对黑素瘤的(Kawakami等人，1994，实验医学杂志(J.Exp.Med.)180：347)。此外，Mart-1/MelanA在所有检查的黑素瘤上表达，使之成为免疫治疗干预的优选靶。最后，由Mart-1/MelanA衍生的肽能够在患有黑素瘤(表达HLA-A2组织相容性抗原)的患者体内诱导特异性CTL应答(Rivoltini等人，1995，免疫学杂志(J.Immunol.)154：2257；Valmori等人，1998，免疫学杂志(J.Immunol.)160：1750)。

HLA-A2是在高加索人中表达的最常见的等位基因。已经为该等位基因定义了Mart-1/MelahA的CTL表位。由大多数人类CTL系识别的抗原肽包括第27-35位氨基酸AAGIGILTV(Kawakami等人，1994，实验医学杂志(J.Exp.Med.)180：347)。此外，关于与HLA-A*0201的结合亲和力和CTL克隆的识别的研究已经证明，用于这两种功能的最佳肽是第26-35位十肽EAAGIGILTV(Romero等人，1997，免疫学杂志(J.Immunol.)159：2366)。然而，这些肽在体外(Valmori等人，1998，免疫学杂志(J.Immunol.)160：1750)和在体内(Jaeger等人，1996，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)66：162)似乎是微弱的免疫原。

当将Mart-1/MelanA的T表位氨基酸序列与A*0201的肽基序(Rammensee等人，1995，免疫遗传学(Immunogenetics)41：178)进行比较时，第26-35位和第27-35位肽似乎在第2位具有非优势锚定残基，由此微弱结合HLA-A*0201分子(Kawakami等人，1995，免疫学杂志(J.Immunol.)154，3961)，这可以解释其微弱的免疫原性。以编号WO 98/58951公开的国际专利申请描述了第26-35位肽的类似物，其中第2位丙氨酸用亮氨酸替代(序列命名为ELA)。

用于下文实验的hELA肽是专利申请WO 98/58951的主题，该专利属于路德维格癌症研究学会(Institut Ludwig de Recherche sur leCancer)。hELA是在黑素细胞和黑素瘤上表达的蛋白质Melan-A/Mart-1第26-35位十肽(EAAGIGILTV)的类似物。虽然Melan-A/Mart-1第26-35位十肽能够结合HLA-A0201分子(Romero等人，1997，免疫学杂志(J.Immunol.)159：2366-2374)，但是它在体外和体内是微弱的免疫原(Valmori等人，1998，免疫学杂志(J.Immunol.)160：1750-1758)。hELA类似物通过用亮氨酸替代Melan-A/Mart-1第26-35位十肽的第二位氨基酸(丙氨酸)来产生。根据关于将肽锚定至HLA-A0201分子所需残基的分析，所述替代在体外导致黑素瘤患者CTL的更有效识别和更好的免疫原性(Valmori等人，1998，免疫学杂志(J.Immunol.)160：1750-1758)。将C57B1/6 x BDA/s品系(Vitiello等人，1991，实验医学杂志(J.Exp.Med.)173：1007-1015)的HLA-A*0201/Kb(A2/Kb)转基因小鼠用于该研究以测试ELA。在这些小鼠中表达的I型MHC分子是由人类HLA-A0201分子(发现的最常见的同种异型)的α1和α2结构域和鼠Kb分子的α3结构域构成的嵌合分子。

序列SEQ ID NO.4 TRP-2肽是对应于酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)第181-188位氨基酸(VYDFFVWL)的八肽。TRP-2在黑素细胞和黑素瘤中表达。已经证明该抗原在C57BL/6(H-2Kb)小鼠中诱导针对黑素瘤提供保护的CTL应答(Bloom等人，1997，实验医学杂志(J.Exp.Med.)185：453-459)。A：用与肽(Melan-A或TRP-2类似物)混合的rP40免疫之后抗Melan-A和抗TRP-2的CTL的产生实验方案

A2/Kb小鼠通过尾基皮下注射接受：-与3或300μg rP40混合的50ug ELA；-与300μg rP40共价偶联的50μg ELA。

C57BL/6小鼠通过尾基皮下注射接受：-与300μg rP40混合的50ug TRP-2肽(第181-188位)。细胞毒性效应细胞的产生

免疫后10天，处死小鼠并由引流淋巴结回收淋巴细胞，以在体外用相关肽进行刺激。

将这些淋巴细胞(4-5×10⁶)，在24孔板中，在添加10mM HEPES、10％FCS、和50μMβ-2-巯基乙醇的DMEM中，与2-5×10⁵个经照射(10kRad)和经脉冲(用1μM相关肽于37℃1h)的EL-4 A2/Kb细胞或EL4细胞一起培养。每周一次刺激2次后，测定细胞的细胞毒性活性。细胞毒性活性的测量

将EL-4 A2/Kb细胞或EL4细胞与⁵¹Cr在存在或不存在相关肽的条件下温育1h，清洗，然后以各种比率与效应细胞一起在96孔板中体积200μl于37℃温育4-6小时。然后将细胞离心，并在100μl上清液中测量⁵¹Cr释放。如下计算特异性溶胞百分率：％特异性溶胞＝(实验释放－自发释放)/(总释放－自发释放)×100。结果

如图1A-1D所示，用在与hELA(图1B)或TRP-2(图1D)的混合物中的最佳剂量的rP40(300μg)免疫小鼠诱导强烈的特异性CTL应答。在用与hELA偶联的rP40(图1C)免疫后也观察到这种应答。另一方面，单独用肽或单独用rP40(结果未显示)或者用在与亚最佳剂量rP40(3μg)的混合物中的hELA肽免疫不诱导任何CTL活性(图1A)。这些结果证明与免疫原性肽混合或偶联的rP40分子使之有可能在不加入佐剂的情况下在体内诱导特异性CTL应答。B：用与肽(Melan-A类似物)混合的rP40免疫之后抗Melan-A的CTL的产生，与标准免疫方案比较实验方案

A2/Kb小鼠接受：-50μl IFA(不完全弗氏佐剂)，通过尾基皮下注射；3周后，50μghELA，同时存在50μg由破伤风类毒素(TT)衍生的辅助T p30肽(Panina-Bordignon等人，1989，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)19：2237)，以IFA为佐剂。此方案被描述用于产生抗肽CTL(Valmori等人，1994，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24：1458)并作为阳性对照用途。-50μg hELA或与50μg hELA混合或偶联的300μg rP40。细胞毒性效应细胞的产生

最终免疫后10天，处死小鼠并由引流淋巴结回收淋巴细胞，以在体外用相关肽刺激。

将这些淋巴细胞(4-5×10⁶)，在24孔板中，在添加10mM HEPES、10％FCS、和50μMβ-2-巯基乙醇的DMEM中，与2-5×10⁵个经照射(10kRad)和经脉冲(用1μM相关肽于37℃ 1h)的EL-4 A2/Kb细胞(经HLA-A*0201/Kb基因转染的鼠细胞)一起培养。

每周一次刺激1次、2次、或3次后，测定细胞的细胞毒性活性。

根据上述方法测量细胞毒性活性。结果

用与hELA偶联的非佐剂的rP40免疫后，测量到与用hELA＋P30/IFA免疫后观察到的可比的抗hELA的CTL活性(参照图2C和2D)。相似的，rP40＋hELA肽混合物(其自身也无佐剂的)产生CTL，其方式与用于产生CTL的传统方案获得的相似(参照图2B和2D)。

单独用肽(参照图2A)或单独用rP40蛋白(未显示)免疫后，无论在哪天刺激效应细胞，没有检测到CTL活性。

Claims (24)

1.与序列SEQ ID NO.3 ELAGIGILTV的肽相结合的肠细菌OmpA蛋白或其片段用于制备意欲产生针对黑素瘤细胞的细胞毒性T应答的药物组合物的用途。

2.权利要求1中的与序列SEQ ID NO.3的肽相结合的肠细菌OmpA蛋白或其片段用于制备意欲治疗或预防恶性黑素瘤的药物组合物的用途。

3.权利要求1或2的用途，特征为所述肠细菌OmpA蛋白或其片段用途提取方法由所述肠细菌培养物获得。

4.权利要求1或2的用途，特征为所述肠细菌OmpA蛋白或其片段由重组途径获得。

5.权利要求1-4之一的用途，特征为所述肠细菌是肺炎克氏杆菌。

6.权利要求5的用途，特征为所述opmA蛋白或其片段的氨基酸序列包含：

a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；

b)与序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列；

或

c)a)中定义的序列的至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列。

7.权利要求1-6之一的用途，特征为所述序列SEQ ID NO.3肽与所述OmpA蛋白或其片段偶联或混合。

8.权利要求6的用途，特征为所述序列SEQ ID NO.3肽与所述OmpA蛋白或其片段通过共价连接而偶联。

9.权利要求8的用途，特征为通过共价连接的偶联是通过化学合成产生的偶联。

10.权利要求9的用途，特征为在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述序列SEQ ID NO.3肽中导入一种或多种连接元件，从而有助于化学偶联。

11.权利要求10的用途，特征为所述导入的连接元件是氨基酸。

12.权利要求8的用途，特征为由所述序列SEQ ID NO.3肽与所述OmpA蛋白或其片段之间的偶联产生的杂合蛋白通过基因重组获得。

13.权利要求12的用途，特征为药物组合物包含编码所述杂合蛋白的核酸构建物。

14.权利要求13的用途，特征为所述核酸构建物包含于载体或能够表达所述杂合蛋白的转化的宿主细胞中。

15.权利要求1-14之一的用途，用于制备能够通过皮下或皮内途径施用的药物组合物。

16.权利要求1-15之一的用途，特征为所述药物组合物的运载形式使之有可能改进其稳定性和/或其免疫原性。

17.权利要求1-16任一项定义的药物组合物。

18.权利要求17的药物组合物，特征为它包含通过混合或偶联与序列SEQ ID NO.3肽相结合的序列SEQ ID NO.2肺炎克氏杆菌OmpA蛋白、其序列与序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的蛋白质、或所述序列SEQ ID NO.2 OmpA蛋白的至少5个氨基酸的片段。

19.药物组合物，特征为它含有一种核酸构建物，该核酸构建体包含编码序列SEQ ID NO.2肺炎克氏杆菌OmpA蛋白、其序列与序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的蛋白质、或所述序列SEQ ID NO.2 0mpA蛋白的至少5个氨基酸的片段的核酸，和编码序列SEQ ID NO.3肽的核酸。

20.权利要求17-19之一的组合物，特征为所述药物组合物以一定形式运载使之有可能改进其稳定性和/或其免疫原性。

21.权利要求20的组合物，特征为所述载体是脂质体、或病毒载体或能够表达所述OmpA蛋白，或其片段，和所述序列SEQ ID NO.3肽的转化的宿主细胞。

22.权利要求17-21之一的组合物，特征为所述组合物包含于制药学可接受的介质中。

23.权利要求17-22之一的组合物，特征为所述组合物还包含去污剂。

24.权利要求17-23之一的组合物，不含任何其它用于诱导CTL应答的佐剂。

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