FI86196B

FI86196B - Dispersionspolymerer, deras framstaellningsfoerfarande och anvaendning.

Info

Publication number: FI86196B
Application number: FI865184A
Authority: FI
Inventors: Wolfgang Kapmeyer; Helmut Rinno
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1985-12-21
Filing date: 1986-12-18
Publication date: 1992-04-15
Also published as: PT83963A; DK167618B1; JPH0713126B2; DK618786D0; EP0227054A3; JPS62169813A; EP0227054A2; PT83963B; FI86196C; CA1307983C; AU601960B2; EP0227054B1; NO168048B; YU209386A; DE3681569D1; ATE67511T1; YU45808B; NO865190D0; FI865184A7; FI865184A0

Description

1 86196

Dispersiopolymeerit, niiden valmistusmenetelmä ja käyttö

Keksintö koskee dispersiopolymeereja, niiden valmistusmenetelmiä ja niiden käyttöä. Nämä dispersiopolymee-5 rit koostuvat lateksipartikkeleista, joiden uloin kerros muodostuu vinyylimonoraeerien kopolymeerista, jolloin toinen vinyylimonomeereista on hydroksyyliryhmän sisältävä N-alkyyliakryyliamidiyhdiste tai vastaava metakryylihappoes-teri. Näin saadaan biologisesti aktiivisia dispersiopoly-10 meereja sitomalla biologisesti aktiivisia aineita, joissa on vapaita aminoryhmiä, keksinnön mukaisen dispersiopoly-meeriosan ulkopinnalle aldehydiryhmästä johdettuihin reaktiivisiin ryhmiin. Nämä biologisesti aktiiviset lateksi-konjugaatit soveltuvat serologisiin ja immunologisiin mää-15 ritysmenetelmiin.

Tunnettua on parantaa serologisten tai immunologisten määritysmenetelmien herkkyyttä käyttämällä indikaattori- tai kantajaosia, joissa on vastaavaa immunologista reagenssia. Kantajana voidaan käyttää esimerkiksi punaso-20 luja tai soluviljelmäsoluja. Tähän sopivat myös lateksi-partikkelit, joiden halkaisija on 0,02 - 5 pm.

Edelleen tunnetaan polyhydroksiyhdisteitä, kuten sokeri tai dekstraani, joita käytetään valmiiksi polyme-roidun lateksin pinnoittamiseen (EP 0001223, Hoffmann La 25 Roche). Tällaiset lateksit eivät ole pysyviä detergentte- jä sisältävissä puskureissa, koska adsorptiolla sitoutuneet polyhydroksiyhdisteet voivat irrota lateksista tällaisen puskurin vaikutuksesta.

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa EP-A 30 82110273.8 esitetään lateksipartikkeleita, jotka sisältä vät happoamidiryhmillä sitoutuneita asetaaliryhmiä. Vesi-:\· pitoisessa väliaineessa turvotetaan aikaisemmin valmistet- .**.·. tuja lateksiytimiä vinyylimonomeerien kanssa, jotka sisäl tävät happoamidiryhmien kautta sitoutuneita asetaaliryh-: ·" 35 miä, ja nämä vinyylimonomeerit, joiden täytyy olla kyllin .·.* veteen liukenemattomia, kopolymeroidaan sitten yhdessä 2 86196 toisten monomeerien kanssa, jotka voivat olla luonteeltaan hydrofiilisia tai ionisia. Tällaisia reagensseja voidaan käyttää C-reaktiivisen proteiinin nefelometrisessä määrityksessä. Tätä varten seeruminäytteet laimennetaan voimak-5 kaasti puskurilla, tavallisesti 1:100, minkä avulla tehdään merkityksettömiksi häiritsevät seerumiproteiinit, jotka muuten johtaisivat vääriin positiivisiin tai vääriin negatiiviisiin tuloksiin. Tämä työskentelytapa on mahdollinen, koska diagnostisiin tarkoituksiin C-reaktiivisen 10 proteiinin pitoisuuksien täytyy yleensä olla suurempia kuin 5 mg/1. Mutta jos halutaan mitata hyvin pieninä määrinä esiintyvien proteiinien pitoisuuksia alueella 1-50 pg/l, näytteitä ei voida laimentaa yhtä paljon puskurilla, koska muutoin osoitettavien proteiinien pitoisuudet tule-15 vat niin pieniksi, ettei herkkyys ole riittävä.

Tunnetun tekniikan mukaisten lateksivalmisteiden herkkyyden nostaminen ei kuitenkaan ole ilman muuta mahdollista ja johtaa esimerkiksi IgE:n määrityksessä huonosti toimivaan kokeeseen. Yritys nostaa herkkyyttä johtaa 20 siihen, että vertailukäyrän mittauksen signaalit jo suhteellisen lyhyen ajan jälkeen nousevat epäspesifisesti siten, ettei arviointi ole enää mahdollista. Porrastettua vertailukäyrää ei enää ole olemassa. Syynä on se, että tällaisen epästabiilin reagenssin yksittäiset hiukkaset 25 agglutinoituvat antigeenin puuttuessa ja näin hajavalosig-naalit tai absorbanssi kasvavat.

Nyt havaittiin yllättäen, että esiintyneet tunnetun tekniikan haittapuolet voidaan voittaa, kun käytetään kan-tajahiukkasia, jotka on valmistettu kopolymeroimalla etu-30 käteen valmistetut lateksiytimet vesipitoisessa väliaineessa akryyli- tai metakryylimonomeerien kanssa, jotka : sisältävät happoamidiryhmien kautta sitoutuneita asetaali- ryhmiä, yhdessä akryyli- tai metakryylimonomeerien kanssa, • joissa on yksi tai useampi hydroksyyliryhmä.

: .'35 Keksinnön kohteena ovat siten dispersiot, jotka sisältävät lateksista muodostuvia kantajaosia, jolloin 3 86196 lateksin pinnalla on kopolymeeri, joka valmistetaan vesipitoisessa väliaineessa monomeerista, jonka päässä on ase-taali, jolla on kaava 5 9 OR-

Il / 2 CH = C - C - N - (CH-) - CH (I)

Il I 2n \ H R1 H 0R3 10 jossa n on 1 - 6; R, on H tai CH3; ja R2 ja R3 ovat samoja tai erilaisia ja ovat -(CH^,, - CH3, jolloin m on 0 - 7, tai - C - Y, jossa X, Y ja Z ovat samoja tai erilaisia ja

^ Z

15 ovat (CH2)pCH3, jolloin p on 1 - 3, ja monomeerista, jolla on kaava R-, fH'

Γ I

20 / - ,CH2»„ ' 9' <CH2> 1 - (H)

"2C V L

Il

O

jossa R on O tai NH; nonl -3; moni -4; 1 on 0-4; 25 ja Rj on H tai CH3.

Keksinnön mukaiset dispersiot (tai lateksit) voidaan valmistaa tavalliseen tapaan kopolymeroinnilla sie-mendispersiona toimivien tavallisten tunnettujen lateksi-partikkelien pinnalle, ja ne voidaan valmistaa tunnettujen 30 menetelmien avulla homo- tai kopolymeereina monomeereista.

Lateksipartikkeli, joka toimii keksinnön mukaisissa : dispersioissa siemendispersiona, ei saa olla kalvoa muo- dostava polymeeri. "Ei kalvoa muodostavalla" tarkoitetaan polymeerilateksiosia, jotka eivät muodosta kalvoa tässä : 35 esitetyissä olosuhteissa eivätkä sulaudu yhteen. Edulli- siä ovat karbosyklisten aromaattisten monovinyylideenimo- • · · 4 86196 nomeerien polymeerit, kuten styreenin, vinyylitolueenin ja vinyylinaftaliinin polymeerit tai myös näiden monomeerien seoksista keskenään ja/tai metyylimetakrylaatin ja akryy-linitriilin kanssa muodostuneet polymeerit. Erityisen 5 edullisia siemendispersioita ovat polystyreenit.

Keksinnön mukaisten modifioitujen siemenlateksien valmistamiseksi sekoitetaan perusteellisesti keskenään etukäteen valmistettu lateksi, jonka hiukkasten läpimitta on 0,02 - 2 pm, edullisesti 0,05 - 0,5 pm, noin 20 - 80 10 %:n kanssa emulgaattoria, joka on tarpeen suurimman mah dollisen yksimolekulaarisen kerroksen saamiseksi lateksin pinnalle. Mittaukset, jotka tarvitaan sen emulgaattorimää-rän määrittämiseksi, joka johtaa lateksipinnan maksimaaliseen peittämiseen, suoritetaan tensiometrin avulla. Mene-15 telmiä esitetään esimerkiksi julkaisussa Phrma, I. ja Chen, S.-R., Journal of Colloid and Interface Science 74 (1979) 90 - 102, ja ensimmäisen kerran julkaisussa Maron, S.H., Elder, M.E. ja Ulevitch, I.N., Journal of Colloid Interface Science 9 (1954) 89 - 104.

20 Sopivia emulgaattoreita ovat esimerkiksi polyglyko- lieetteri pitkäketjuisten, alifaattisten alkoholien kanssa, joissa on edullisesti 10 - 20 hiiliatomia, tai alkyy-lifenoli, jonka alkyylitähteessä on edullisesti 6-12 hiiliatomia, tai dialkyylifenolit tai trialkyylifenolit, 25 joissa alkyylitähteessä on edullisesti kussakin 3-12 hiiliatomia. Tähän sopivia esimerkkejä ovat etyleenioksi-din reaktiotuotteet lauryylialkoholin, stearyylialkoholin, : oleyylialkoholin, kookosrasva-alkoholin, oktyylifenolin, nonyylifenolin, di-isopropyylifenolin, tri-isopropyylife-: 30 nolin, di-t-butyylifenolin ja tri-t-butyylifenolin kanssa.

Sopivia ovat myös etyleenioksidin reaktiotuotteet polypro-- . : pyleeniglykolin tai polybutyleeniglykolin kanssa.

Sopivia ionisia emulgaattoreita ovat ennen kaikkea anioniset emulgaattorit, erityisesti alkyylisulfonaattien, : .1 35 aryylisulfonaattien tai alkyyliaryylisulfonaattien tai vastaavien sulfaattien, fosfaattien tai fosfonaattien ai- « • · · « · * « · 5 86196 kali- tai ammoniumsuolat, joissa haluttaessa on oksiety-leeniosa kulloisenkin hiilivetytähteen ja anionisen ryhmän välissä. Tähän sopivia esimerkkejä ovat natriumdodekyyli-sulfaatti, natriumlauryylisulfaatti, natriumoktyylifeno-5 liglykolieetterisulfaatti, natriumdodekyylibentseenisul- fonaatti, natriumlauryylidiglykolisulfaatti, ammoniumtri-t-butyylifenolipentaglykolisulfaatti ja ammoniumtri-t-butyylifenolioktaglykolisulfaatti. Edullinen on natriumdo-dekyylisulfaatti.

10 Polymerointi tapahtuu sinänsä tunnetulla menetel mällä radikaalin muodostavan initiaattorin, esim. peroksi-diyhdisteen tai alifaattisen atsoyhdisteen, läsnäollessa. Lisätty initiaattori on edullisesti vesiliukoinen; sitä lisätään 0,05 - 10 paino-%, edullisesti 0,1-3 paino-% 15 (laskettuna monomeerien kokonaismäärästä). Tunnettuja radikaalin muodostavia initiaattoreita ovat esimerkiksi vetyperoksidi, peroksidirikkihapon tai peroksidifosforihapon alkali- tai ammoniumsuolat, esimerkiksi natriumperoksidi-sulfaatti, kaliumperoksidisulfaatti ja ammoniumperoksidi-20 sulfaatti, sekä alkyylihydroperoksidit, kuten t-butyylive-typeroksidi, dialkyyliperoksidit, kuten di-t-butyyliperok-sidi, diasyyliperoksidit, kuten diasetyyliperoksidi, di-lauroyyliperoksidi ja dibentsoyyliperoksidi, tai atsodi-isovoihapponitriili, atsodikarbonamidi ja atsogamma,gam-25 ma*-bis(4-syaanivaleriaanahappo). Edullisesti lisätään peroksidirikkihapon alkali- tai ammoniumsuoloja, kuten natrium-, kalium- ja anunoniumperoksidisulfaattia.

Initiaattori lisätään haluttaessa yhdessä pelkisti-men kanssa, erityisesti pelkistävästi vaikuttavan rikkipi-::: 30 toisen hapon alkalisuolan tai maa-alkalisuolan kanssa.

Edullisia ovat sulfiitti, bisulfiitti, pyrosulfiitti, di-tioniitti, tiosulfaatti ja formaldehydisulfoksilaatti. Sa-moin käyttökelpoisia ovat myös glukoosi ja askorbiinihap-’· po.

: 35 Siemendispersioon, joka sisältää emulgaattoria ja radikaaliinitiaattoria, lisätään hydroksyyliryhmiä sisäl- 6 86196 tävän kaavan II mukaisen monomeerin ja asetaaliryhmiä sisältävän kaavan I mukaisen monomeerin monomeeriseos samalla sekoittaen. Dispersion lämpötila on 10 - 120 °C, edullisesti 50 - 90 °C.

5 Hydroksyyliryhmiä sisältäväksi monomeeriksi sopivat polyhydroksiyhdisteet, joilla on kaava II. Edullisesti lisätään mono- tai dihydroksialkyyliakryyli- tai -metakryy-liyhdisteitä. Erityisen edullisia ovat N-2,3-dihydroksi-propyylimetakryyliamidi, N-2-hydroksipropyylimetakryyli-10 amidi, 2-hydroksipropyylimetakrylaatti tai vastaavat ak-ryyliyhdisteet.

Asetaaliryhmän sisältäväksi monomeeriksi lisätään kaavan I mukaisia yhdisteitä. Edullisesti käytetään akryyli- tai metakryyliamidoalkyylialdehydidialkyyliasetaalia, 15 jossa alkyyliryhmä sisältää 2-8 hiiliatomia. Aivan erityisen sopiva on akryyli- tai metakryyliamidoasetaldehydi-di-n-pentyyliasetaali.

Kaavan I ja II mukaiset monomeerit lisätään siemen-dispersioon seoksena, jolloin saatu monomeeriseos sisältää 20 10 - 90 paino-%, edullisesti 30 - 70 paino-% kaavan II

mukaista polyhydroksiyhdistettä ja 90 - 10 paino-%, edullisesti 70 - 30 paino-% kaavan I mukaista asetaaliyhdis-tettä.

Monomeeriseokseen voidaan lisätä 30 paino-% lasket-25 tuna kokonaisseoksesta styreeniä, vinyylinaftaliinia tai - ’ vinyylitolueenia. Lisäksi monomeeriseos voi haluttaessa sisältää enintään 30 paino-% kokonaisseosmäärästä metakry-laattia, akryylihappoa tai krotonihappoa.

Edullisesti lisätään monomeereista koostuvaan seok-: 30 seen enintään 20 paino-% monomeeriseoksen määrästä dime-tyyliformamidia tai muita sopivia aineita, jotka pienentä-; vät viskositeettia.

Siemendispersioon lisätään monomeeriseosta 90-5 paino-%, edullisesti 40 - 10 paino-% laskettuna siemendis- ·' -'35 persion ja monomeeriseoksen yhteismäärästä.

• · II*

II

7 86196

Siemenpolymerointi voidaan suorittaa tavallisten menetelmien mukaisesti. Edullinen keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuoto on kuitenkin annosmenetelmä, jossa monomeeriseos jatkuvasti sekoittaen tiputetaan lateksi-5 ytimien suspensioon polymerointiolosuhteissa, ts. lämpötilassa 10 - 120 eC, edullisesti 50 - 90 °C:ssa.

Lopuksi polymeeristä poistetaan ylimääräinen mo-nomeeri ja initiaattorin sekä emulgaattorin tähteet tunnetuilla menetelmillä. Edullisesti polymeeri dialysoidaan 10 esimerkiksi NaHC03-puskuria vastaan (0,01 - 0,05 paino-%).

Keksinnön mukaisten, biologisesti aktiivisten, seu-raavassa myös lateksikonjugaatiksi kutsuttujen dispersioiden valmistamiseksi edellä esitettyjen siemenpolymeroitu-jen lateksipartikkelien suspension pH säädetään arvoon 15 alle 5, edullisesti arvoon alle 3, ja suspensiota inkuboi-daan sitoutuvan, immunologisesti aktiivisen aineen, kuten esimerkiksi vasta-aineen tai antigeenin kanssa. Labiilit proteiinin aminoryhmien ja keksinnön mukaisten lateksipartikkelien pinnalla olevan vapaan aldehydin väliset sidok-20 set pelkistetään tavalliseen tapaan. Edullisesti tähän tarkoitukseen käytetään natriumsyaaniboorihydridiliuosta neutraalissa puskurissa. Sitoutumaton immunologisesti aktiivinen aine tai muut epäpuhtaudet poistetaan reaktio-seoksesta. Tämä tapahtuu tarkoituksenmukaisesti sentrifu-25 goimalla tai pesemällä sopivaa membraania käyttäen.

Keksinnön mukaiset siemenpolymeroidut lateksit ovat erityisen stabiileja. Ne sopivat erityisen herkkien rea-genssien valmistamiseen, kun taas tunnetut dispersiot, erityisesti sellaiset, joilla on suuri herkkyys, ovat tai-: 30 puvaisia jo suhteellisen lyhyen ajan jälkeen agglutinoitu-maan epäspesifisesti. Tämä johtaa nefelometrisissä tai turbidimetrisissä mittauksissa hajavalon lisääntymiseen tai absorbanssisignaalin kasvamiseen. Vertailukäyrän mittauksen signaalit tulevat jo reagenssin muutaman tunnin .'35 seisottamisen jälkeen niin korkeiksi, ettei arviointi enää ole mahdollista. Tällainen vertailukäyrän muuttuminen mi- 8 86196 tattuna tunnetun tekniikan mukaista reagenssia käyttäen erilaisilla IgE-pitoisuuksilla esitetään kuviossa 1. Kuvio 3 esittää vastaavaa mittausta, kun on käytetty keksinnön mukaista reagenssia, joka on valmistettu esimerkin 5 3 mukaisesti. Selvästi on havaittavissa, että keksinnön mukaisella reagenssilla on selvästi vähäisempi taipumus agglutinoitua ja sen käyttö johtaa laajaan, dynaamiseen mittausalueeseen.

Keksinnön mukaisen lateksireagenssin stabiilisuus 10 tulee esille myös siten, että niillä saadaan huomattavasti alhaisempi reagenssisokea-arvo kuin tunnetun tekniikan mukaisesti valmistetuilla reagensseilla (vertaa kuvio 3 ja kuvio 1). Sekä useita kuukausia (vähintään kuusi kuukautta) jatkuneen reagenssien varastoinnin 4-8 °C:ssa jäl-15 keen että useampia päiviä (vähintään 14 päivää) jatkuneen kylmäkuivatun reagenssin lämpökäsittelyn 37 °C:ssa jälkeen saadaan lähes muuttumattomia tuloksia reagenssikäy-rälle erilaisilla IgE:n arvoille.

Tunnettujen reagenssien haittapuolet tulevat esille 20 myös siten, että niillä suoritetut nefelometriset ja tur-bidimetriset mittaukset johtavat tuloksiin, jotka eivät sovi hyvin yhteen entsyymi-immuunianalyysitulosten kanssa. Kuviossa 2 esitetään nefelometristen mittausten tulokset, jotka on saatu esimerkin 5 mukaisesti tunnetulla teknii-25 kalla mutta käyttäen IgE-reagenssia sisältävää lateksia seeruminäytteille, verrattuna entsyymi-immuunianalyysin tuloksiin. Samanlaisten nefelometristen mittausten tulokset, jotka kuitenkin on saatu käyttämällä IgE-reagenssia sisältäviä, esimerkkien 1 ja 3 mukaisesti saatuja keksin-30 nön mukaisia polymeerejä, esitetään kuvioissa 4 ja 5. Kuten havaitaan, tulokset sopivat hyvin yhteen entsyymi-im-r muunianalyysin tulosten kanssa.

^.. Myös erilaisille potilasseerumeille, joissa ei ole omaa IgE:tä, mutta joihin on lisätty samanlaiset määrät 35 puhdistettua IgE:tä, saadaan tunnetun tekniikan mukaisilla ^ reagensseilla erilaisilla seerumimatriiseilla erilaisia

II

9 86196 tuloksia. Myös tässä suhteessa saavutetaan keksinnön mukaisilla dispersioilla selvä parannus, kuten havaitaan verrattaessa taulukossa 1 esitettyjä mittaustuloksia taulukon 2 mittaustuloksiin.

5 Keksinnön mukaiset lateksivalmisteet valmistetaan helposti ja yhdistetään yhdessä herkkien, immunologisesti aktiivisten aineiden kanssa diagnostiseksi reagenssiksi. Keksinnön mukaiset dispersiopolymeerit ja niistä valmistetut biologisesti aktiiviset lateksit, lateksikonjugaa-10 tit ja -reagenssit ovat stabiileja verrattuna tunnetun tekniikan vastaaviin tuotteisiin. Ne ovat epäherkkiä mat-riisivaikutusten häiriöille, niillä suoritetut nefelomet-riset ja turbidimetriset mittaukset johtavat tulokseen, joka saavutetaan myös entsyymi-immuunianalyysillä. Verrat-15 tuna tunnettuun tekniikaan saavutetaan oleellisesti vähemmän vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia tuloksia. Lisäämällä IgE:tä sisältämättömiin seerumeihin puhdistettua IgE:tä saadaan keksinnön mukaisilla reagensseilla arvoja, jotka vaihtelevat vähemmän ja ovat lähellä teoreet-20 tista arvoa. Pienempi herkkyys häiriövaikutuksille tulee esille myös pienempinä vaihtelukertoimina (vertaa taulukot 1 ja 2).

Lateksikonjugaatteja voidaan käyttää kaikissa diagnostisissa menetelmissä, jotka mittaavat hiukkaskokomuu-25 toksia, esimerkiksi aineiden kvalitatiivisissa ja puoli-kvantitatiivisissa määrityksissä visuaalisen lateksiagglu-tinaatiokokeen avulla, tai nefelometrisissä tai turbidi-metrisissä pieninä pitoisuuksina esiintyvien proteiinien määrityksessä suorassa tai kilpailevassa agglutinaatioko-: : 30 keessa tai lateksi-hapteeni-inhibiitiokokeessa.

Esimerkki 1 : a) N-( 2,3-dihydroksipropyyli )metakryyliamidin syn- teesi 4,56 g 3-amino-l,2-propaanidiolia (0,05 mol) liuo-: .' 35 tettiin 30 ml:aan vedetöntä dimetyyliformamidia. Tämä li- • « m uos ja 13,8 g K2C03:a lisättiin 100 ml:n kolmikaulapulloon, • · · • · · 1 · · • · 10 861 96 jossa oli tiputussuppilo ja kaasun sisäänvienti- ja pois-toputki. Seos jäähdytettiin jäähauteessa 0 °C:seen. Voimakkaasti sekoittaen ja kevyesti typpeä johtaen lisättiin tipoittain 30 minuutin aikana 6,18 ml metakryylihappoklo-5 ridia (0,06 mol) 30 ml:ssa dimetyyliformamidia. Kun seosta oli sekoitettu vielä tunti jäähauteessa, seoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan ja sekoitusta jatkettiin vielä 30 minuuttia. Reaktioseos suodatettiin poimusuodattimen läpi ja jäännös heitettiin pois. Suodosta haihdutettiin 10 pyöröhaihduttimessa, kunnes syntyi viskoosi öljy. Tämä öljy liuotettiin 30 mitään metanolia, suodatettiin toisen kerran ja suodos haihdutettiin uudelleen pyöröhaihduttimessa. Loput liuottimesta poistettiin korkeavakuumissa. Saanto oli 8,52 g.

15 b) N-(2,3-dihydropropyyli)metakryyliamidin (NDPM) polymerointi polystyreeniytimen päälle Sylinterinmuotoiseen lasiastiaan, johon oli liitetty kaasun sisääntuonti- ja kaasunpoistoputki ja magneetti-sauva sekoitusta varten, lisättiin 22,3 ml polystyreenila-20 teksidispersiota, jonka kiintoainepitoisuus oli 17,9 pai-no-%, 57 ml tislattua vettä ja 50 mg natriumdodekyylisul-faattia, ja ainekset liuotettiin sekoittamalla. Polyme-rointiastia tehtiin hapettomaksi evakuoimalla ja täyttämällä astia useita kertoja typellä. Lateksi-detergentti-25 seosta kuumennettiin 70 “Crseen jatkuvasti sekoittaen. Siihen lisättiin 1 ml kaliumperoksidisulfaattiliuosta (16 mg/ml tislatussa vedessä).

Valmistettiin monomeeriseos, jossa oli 0,2 ml sty-reeniä, 0,4 ml metakryyliamidoasetaldehydidi-n-pentyyli-: 30 asetaalia, 0,025 ml metakryylihappoa ja 0,4 ml kohdassa a) saatua N-(2,3-dihydroksipropyyli)metakryyliamidia (NDPM) -\j ja tämän monomeerin liukoisuuden parantamiseksi 0,2 ml dimetyyliformamidia.

• Voimakkaasti sekoittaen polystyreenilateksisuspen- • .* 35 sioon lisättiin hitaasti tipoittain monomeeri 60 minuutin aikana. Polymerointiseoksen lämpötila pidettiin 70 °C:ssa.

« ·»» * · · ·«· * · • · * · ♦ li 11 86196

Monomeeriseoksen tiputtamisen jälkeen sekoitusta jatkettiin vielä 4 tuntia mainitussa lämpötilassa. Näin polyme-rointi oli päättynyt ja dispersio jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja suodatettiin poimusuodattimen läpi. Saa-5 tiin 73 ml lateksisuspensiota. Tätä dialysoitiin 17 tuntia NaHC03-puskuriliuosta vastaan (0,25 g/1, pH 8 - 8,2). Saatiin 80 ml lateksidispersiota, jonka kiintoainepatoisuus oli 4,7 paino-%.

Esimerkki 2 10 a) N-(2-hydroksipropyyli)metakryyliamidin synteesi 3,75 g l-amino-2-propanolia (0,05 mol), 30 ml vedetöntä asetonitriiliä ja 13,79 g K2C03:a (0,1 mol) lisättiin kolmikaulapulloon, johon oli liitetty tiputussuppilo ja kaasun sisääntuonti- ja poistoputki, ja seos jäähdytet-15 tiin jäähauteessa 0 °C:seen. Jatkuvasti sekoittaen ja kevyesti typpeä johtaen lisättiin tipoittain 30 minuutin aikana 6,18 g metakryylihappokloridia (0,06 mol) 30 ml:ssa asetonitriiliä. Seosta sekoitettiin edelleen 60 minuuttia jäähauteessa, minkä jälkeen sen annettiin lämmetä huoneen-20 lämpötilaan ja sekoitusta jatkettiin vielä 30 minuuttia. Seos suodatettiin lasisuodattimeen läpi ja jäännös heitettiin pois. Suodosta haihdutettiin pyöröhaihduttimellä, kunnes syntyi viskoosi öljy. Tämä liuotettiin 30 ml:aan metanolia ja erotettiin syntyvästä saostumasta. Suodos *;*; 25 haihdutettiin uudelleen pyöröhaihduttimessa ja loput li-uottimesta poistettiin korkeavakuumissa. Saanto oli 6,66 9· b) N- (2-hydroksipropyyli )metakryyliamidin polyme-: rointi polystyreeniytimen pinnalle 30 Polymerointi tapahtui esimerkissä 1 b) esitetyllä tavalla. Valmistettiin seos, jossa oli 24,2 ml polystyree-nilateksia, jonka kiintoainepitoisuus oli 16,5 paino-%, 54,8 ml tislattua vettä ja 50 mg natriumdodekyylisulfaat-- tia. Tämä lisättiin polymerointiastiaan ja happi poistet- : 35 tiin. Tämän jälkeen lisättiin 1 ml kaliumperoksidisul- faattiliuosta (16 mg/ml tislatussa vedessä) ja seos kuu- • · • * · * m 12 861 96 mennettiin 70 °C:seen. Valmistettiin seos, jossa oli 0,4 ml styreeniä, 0,4 ml metakryyliamidoasetaldehydidi-n-pen-tyyliasetaalia, 0,025 ml metakryylihappoa ja 0,4 ml N-(2-hydroksipropyyli)metakryyliamidia.

5 Monomeeriseos lisättiin tipoittain samalla voimak kaasti sekoittaen polystyreenilateksidispersioon 70 °C:ssa 60 minuutin aikana. Tämän jälkeen sekoitettiin vielä 4 tuntia samassa lämpötilassa. Seos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja suodatettiin poimusuodatinpaperin läpi, 10 jolloin saatiin 74 ml polymeeriliuosta. Lopuksi liuosta dialysoitiin noin 20 tuntia NaHC03-puskuria vastaan (0,25 g/1, pH 8 - 8,2). Saatiin 79 ml lateksisuspensiota, jonka kiintoainepitoisuus oli 5,4 paino-%.

Esimerkki 3 15 2-hydroksipropyylimetakrylaatin (HPM) polymerointi polystyreeniytimen pinnalle

Polymerointi tapahtui esimerkissä 1 b) esitetyllä tavalla. Valmistettiin seos, jossa oli 22,4 ml polystyree-nilateksia, jonka kiintoainepitoisuus oli 17,9 paino-%, 20 56,7 ml tislattua vettä ja 50 mg natriumdodekyylisulfaat- tia. Tämä lisättiin polymerointiastiaan ja happi poistettiin. Tämän jälkeen lisättiin 1 ml kaliumperoksidisulfaat-tiliuosta (16 mg/ml tislatussa vedessä) ja seos lämmitet-- . tiin 70 °C:seen. Valmistettiin seos, jossa oli 0,4 ml sty- 25 reeniä, 0,4 ml metakryyliamidoasetaldehydidi-n-pentyyli-asetaalia, 0,025 ml metakryylihappoa ja 0,2 ml 2-hydrok-sipropyylimetakrylaattia (HPM). Monomeeriseos lisättiin voimakkaasti sekoittaen polystyreenilateksisuspensioon 70 °C:ssa 60 minuutin aikana hitaasti tiputtaen. Lopuksi 30 seosta sekoitettiin vielä 4 tuntia samassa lämpötilassa.

Seos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja suodatet-tiin poimusuodatinpaperin läpi, jolloin saatiin 73 ml polymeeriä. Tämän jälkeen liuosta dialysoitiin noin 20 tuntia NaHC03-puskuria vastaan (0,25 g/1, pH 8 - 8,2). Näin 35 saatiin 87 ml lateksidispersiota, jonka kiintoainepitoi-suus oli 5,1 %.

Il i3 861 96

Esimerkki 4

Anti-IgE-vasta-aineiden muodostaminen keksinnön mukaiseen polymeeriin

Polymeeriin, joka oli valmistettu käyttäen N-(2,3-5 dihydroksipropyyli)metakryyliamidia esimerkin 1 mukaises ti tai käyttäen N-(2-hydroksipropyyli)metakryyliamidia esimerkin 2 mukaisesti tai käyttäen 2-hydroksipropyyli-metakrylaattia esimerkin 3 mukaisesti, sidottiin anti-IgE-vasta-aine.

10 Kulloinkin saatu polymeeri laimennettiin tislatulla vedellä 4 paino-%:n kiintoainepitoisuuteen. Antiseerumi, joka oli saatu immunisoimalla kaniinia puhdistetulla IgErlla, puhdistettiin tunnetulla menetelmällä affinitet-tikromatografisesti. Tämä konsentroitiin lopuksi kiinto-15 ainepitoisuuteen 10 mg/ml.

3,4 ml edellä esitettyä polymeeriä sekoitettiin 0,34 ml:aan anti-IgE-vasta-aineliuosta. Tämän jälkeen lisättiin 0,17 ml 20-%:sta eikosaoksietyleenisorbitaanilau-ryylihappoesteriä (^Tween20) ja sekoitettiin. Tähän li-20 sättiin 0,05 ml 1 N HCl:a siten, että pH-arvo oli noin 2. Seosta inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin 0,85 ml kyllästettyä natriumvetyfosfaat-tiliuosta (pH 6,5) ja 0,85 ml natriumsyaaniboorihydridili-uosta (25 mg/ml) ja sekoitettiin hyvin. Sitten seosta in-\ 25 kuboitiin yksi tunti huoneenlämpötilassa.

Tätä reaktioseosta sentrifugoitiin sitten kiihtyvyydellä noin 50 000 g (Beckman Zentrifuge, 20.000 UpM) 30 minuuttia. Neste heitettiin pois. Jäännös liuotettiin uudelleen 5 ml:aan glysiini-NaCl-puskuria [0,1 mol glysii-30 niä, 0,17 mol NaCl, 0,5 % eikosaoksietyleenisorbitaanilau-ryylihappoesteriä (®*rween20), pH 8,2].

Lopuksi suoritettiin ultraäänikäsittely (Bronson Sonyfier B15) 2 sekunnin ajan. Näin uudelleen dispergoitu reagenssi laimennettiin tilavuussuhteessa 1:80 edellä mai-* 35 nitulla glysiini-NaCl-puskurilla.

«#· • » i4 8 61 96

Esimerkki 5

Seeruminäytteiden IgE-konsentraatioiden mittaus

Esimerkin 4 mukaisesti sitomalla anti-IgE-vasta-aine keksinnön mukaisiin lateksivalmisteisiin valmistettu 5 IgE:n määrittämiseen tarkoitettu reagenssi lisättiin poti-lasseerumiin IgE:n määrittämiseksi. Standardina käytettiin Enzygnost-testin (Behringwerke AG) standardia, jossa korkein IgE-pitoisuus. Tämä IgE-standardi sisältää tuoteselosteen mukaan 1 000 IU/ml. Standardi laimennettiin IgE:tä 10 sisältämättömään seerumipohjaan asteittain kullakin kertaa kaksinkertaiseen tilavuuteen. Näin saatiin standardisarja, jossa oli oletetut IgE-konsentraatiot. Standardiseerumi ja myös määritettävät potilasseerumit laimennettiin suhteessa 1:5 glysiinikeittosuolapuskurilla (0,1 mol glysiiniä, 0,17 15 mol NaCl:a, pH 8,2). Mittaamista varten sekoitettiin 20 μΐ potilasseerumilaimennusta tai standardiseerumilaimennusta ja 150 μΐ reaktiopuskuria (0,1 mol glysiiniä, 0,17 mol NaCl:a, 4 % polyetyleeniglykolia (PEG) 6000, 0,5 % ^ween 20:tä, pH 8,2) BLN-kyveteissä (Behringwerke AG) ja inku-20 boitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen kyvetit mitattiin lasernefelometrissä (Behringwerke AG). Standardiseerumien mittaustuloksista piirrettiin vertailu---- käyrä puolilogaritmipaperille ja tämän jälkeen potilassee- rumien mittaustuloksia verrattiin tähän. Tyypillinen ver-25 tailukäyrä esitetään kuviossa 3.

li 15 861 96

Taulukko 1

Nefelometrisen kokeen mittaustulokset, tunnettu menetelmä

Seerumin n:o IgE-pitoisuus IU/ml 5 1 441 2 399 3 556 4 416 10 5 431 6 425 7 454 8 398 9 422 15 10 356 11 315 12 382

Keskiarvo: 416 IU/ml = 80 %:n saanto 20 Haluttu arvo: 520 IU/ml

Variaatiokerroin: 14 %

Esimerkin 5 mukaisen nefelometrisen mittauksen mittaustulokset seeruminäytteille, joita on verrattu igE-pi-25 toisuuteen 520 IU/ml. Mittaukset suoritettiin käyttäen reagenssia, joka oli tunnetun tekniikan mukainen.

16 861 96

Taulukko 2

Nefelometrisen kokeen mittaustulokset, keksinnön mukainen reagenssi 5 Seerumin n:o IgE-pitoisuus IU/ml 1 435 2 516 3 609 10 4 537 5 526 6 571 7 608 8 559 15 9 589 10 542 11 559 12 450 20 Keskiarvo: 541 IU/ml = 104 %:n saanto

Haluttu arvo: 520 IU/ml

Variaatio kerroin: 10 %

Esimerkin 5 mukaisen nefelometrisen kokeen mittaus-25 tulokset, jotka on saatu vertaamalla IgE-pitoisuuteen 520 IU/ml. Mittaukset suoritettiin keksinnön mukaisella rea-genssilla, joka oli valmistettu esimerkin 3 mukaisesti.

Claims

1. Dispersiopolymeeri, tunnettu siitä, että se koostuu lateksiosasista, joiden pinnalla on kopo- 5 lymeeri, joka on muodostettu monomeerista, jolla on kaava 0 ,0R_ 1 / CH = C - C - N - (CH_) - CH /xx Il I 2n \

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen dispersiopolymeeri, tunnettu siitä, että se on saatavissa poly- 30 meroimalla monomeeriseos, jossa on kaavan I mukaista yhdistettä ja kaavan II mukaista yhdistettä, siemendisper-sion läsnäollessa vesipitoisessa liuoksessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen dispersiopolymeeri, tunnettu siitä, että siihen on lisätty kaavan 35. ii mukaisena monomeerina mono- tai dihydroksialkyyliakryy-li- tai -metakryyliyhdisteitä. 18 861 96

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen dispersiopolymee-ri, tunnettu siitä, että siihen on lisätty kaavan II mukaisena monomeerina vähintään yhtä seuraavista yhdisteistä: N-2, 3-dihydroksipropyylimetakryyliamidi, N-2-hyd- 5 roksipropyylimetakryyliamidi, 2-hydroksipropyylimetakry- laatti tai N-2,3-dihydroksipropyyliakryyliamidi, N-2-hyd-roksipropyyliakryyliamidi tai 2-hydroksipropyyliakryyli-happoetyyliesteri.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen dispersiopolymee- 10 ri, tunnettu siitä, että kaavan I monomeerina on lisätty akryyli- tai metakryyliamidoalkyylialdehydidial-kyyliasetaalia, jossa alkyylissä on 2 - 8 hiiliatomia.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen dispersiopolymee-ri, tunnettu siitä, että kaavan I monomeerina 15 käytetään metakryyliamidoasetaldehydidi-n-pentyyliasetaa- lia.

7. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen disper-siopolymeerin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että siemendispersioon, joka koostuu lateksista, jonka 20 hiukkaskoko on 0,02 - 2 pm, lisätään emulgaattoria ja ra- dikaalinmuodostajaa ja sitten samalla sekoittaen lisätään tipoittain lämpötilassa 10 - 120 °C monomeeriseos, joka koostuu yhdisteestä, jolla on kaava - 25 II / 2 CH = C - C - N - (CH-) - CH || | 2 n (I) H R1 H jossa n on 1 - 6; Rj on H tai CH3; ja R2 ja R3 ovat samoja 30 tai erilaisia ja ovat -(CH2)m - CH3, jolloin m on 0 - 7, tai - C - Y, jossa X, Y ja Z ovat samoja tai erilaisia ja . ^ Z ovat (CH2)pCH3, jolloin p on 1 - 3, 35 ja yhdisteestä, jolla on kaava i9 86196 ί1 [ϊ] /\/~ ,αν«-?- (“2)ι-η (ΙΙ) 5 112C C OH Il J" o jossa R on O tai NH; n on 1 - 3; m on 1 -4; 1 on 0 - 4; ja Rx on H tai CH3.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monomeeriseoksessa käytetään kaavan II mukaisena yhdisteenä mono- tai dihydroksialkyy-liakryyli- tai -metakryyliyhdisteitä ja kaavan I mukaisena yhdisteenä akryyli- tai metakryyliamidoalkyylialdehydidi- 15 alkyyliasetaalia, jossa alkyylissä on 2 - 8 hiiliatomia.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monomeeriseokseen on lisätty kaavan II mukaisena yhdisteenä N-2,3-dihydroksipropyylime-takryyliamidia, N-2-hydroksipropyylimetakryyliamidia, 2- 20 hydroksipropyylimetakrylaattia tai vastaavia akryyliyhdis-teitä ja kaavan I mukaisena yhdisteenä akryyli- tai met-akryyliamidoalkyyliasetaalialdehydidi-n-pentyyliasetaalia.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monomeeriseos sisältää li- 25 säksi enintään 30 paino-% kokonaisseosmäärästä laskettuna styreeniä, vinyylinaftaliinia tai vinyylitolueenia.

10. B, H 0B3 jossa n on 1 - 6; Rx on H tai CH3; ja R2 ja R3 ovat samoja tai erilaisia ja ovat -(CH2)m - CH3, jolloin m on 0 - 7, tai X s' - C - Y, jossa X, Y ja Z ovat samoja tai erilaisia ja 15 ^ Z ovat (CH2)pCH3, jolloin p on 1 - 3, ja monomeerista, jolla on kaava Γ»'

20 I | y ' (CH2'„ - 1 - (CHjl! - H (II) I H» 0 25 jossa R on O tai NH; n on 1 - 3; m on 1 - 4; 1 on 0 - 4; ja R) on H tai CH3.

11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monomeeriseos sisältää lisäksi enintään 30 paino-% laskettuna kokonaisseosmäärästä 30 metakryylihappoa, akryylihappoa tai krotonihappoa.

12. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monomeeriseos sisältää kaavan .I ja II mukaisten monomeerien, styreenin, vinyylinafta-liinin tai vinyylitolueenin ja joko metakryylihapon, ak-'35 ryylihapon tai krotonihapon lisäksi vielä enintään 20 pai-*...· no-% kokonaisseosmäärästä laskettuna dimetyyliformamidia. 20 861 96

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen dispersiopoly-meeri, tunnettu siitä, että siihen on liitetty vasta-aineita, antigeenejä tai hapteeneja.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukaisen dispersiopoly-5 meerin käyttö diagnostiseen antigeenien, vasta-aineiden tai hapteenien osoittamiseen.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukaisten dispersiopoly-meerien käyttö nefelometrisissä ja turbidimetrisissä menetelmissä tai hiukkaslaskumenetelmissä. li 2i 86196