DE20213920U1

DE20213920U1 - Diagnostikum zum Nachweis der den von Willebrand-Faktorspaltenden Aktivität von ADAMTS13

Info

Publication number: DE20213920U1
Application number: DE20213920U
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 2002-07-03
Filing date: 2002-09-10
Publication date: 2003-01-16
Anticipated expiration: 2012-09-11
Also published as: WO2004005451A3; JP2005535315A; US20050239153A1; WO2004005451A2; EP1520035A2; US7291479B2

Description

B2G1

Dr. Meyer-Dulheuer

5 Martina Böhm Oswaltstraße 23

60439 Frankfurt am Main

Diagnostikum zum Nachweis der den von Willebrand-Faktor-spaltenden Aktivität von ADAMTS13

9. September 2002

B2G1

Dr. Meyer-Dulheuer

Diagostikum zum Nachweis der den von Willebrand-Faktor spaltenden Aktivität von ADAMTS13

Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostikum zum Nachweis der vWF-spaltenden ADAMTS13-Aktivität.

Die thrombotische, thrombozytopenische Purpura (TTP) ist eine Erkrankung, bei der die klassischen Symptome der Thrombozytopenie, der mikroangiopathischen-hämolytischen Anämie und neurologische Symptome beobachtet werden. Ungewöhnlich große Molekülaggregate des von Willebrand-Faktors (vWF) werden im Plasma von TTP-Patienten gefunden und als Ursache für die Bildung von vWF- und blutplättchenreichen Thromben angesehen. Der von WiIIebrand-Faktor wird von Endothelzellen in Form von großen Molekülaggregaten freigesetzt, die im normalen Plasma durch das Zusammenwirken einer Reduktase und einer Metalloprotease gespalten werden.

Es ist bekannt, dass ein Mangel an einer spezifischen Metalloprotease, die den vWF zwischen den Peptidbindungen Tyr842 und Met843 spaltet, bei Patienten mit angeborener und erworbener TTP beobachtet wird. Diese Metalloprotease ist kürzlich in reiner Form isoliert, als ein neues Mitglied der ADAMTS-Familie identifiziert und dann als ADAMTS13 bezeichnet worden (1, 2). Unabhängig davon wurde durch eine Genomanalyse (3) in vier verschiedenen menschlichen Stammbäumen mit angeborener TTP das für den Proteasemangel verantwortliche Gen auf Chromoson 9q34 lokalisiert und als neues Mitglied der ADAMTS-Familie identifiziert.

Die vWF-spaltende Proteaseaktivität von ADAMTS13 wird normalerweise durch Inkubation einer vWF-Probe mit verdünntem Plasma bei niedriger lonenstärke in Gegenwart eines zweiwertigen Metallions und Harnstoffs oder Guanidinhydrochlorids gemessen. Der Nachweis der Proteolyse wird durch eine Multi-

9. September 2002 :

B2G1

Dr. Meyer-Dulheuer

meranalyse mittels der SDS-Agarosegelelektrophorese oder durch Bruchstückanalyse mit SDS-PAGE und anschließendem Immun-Blotting, also dem Nachweis der Proteine auf einer Cellulosemembran mittels der Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt (4, 5). Der Abbau des von Willebrand-Faktors kann auch durch die Messung der Kollagen-Bindungsaktivität des vWF oder durch einen spezifischen ELISA-Nachweis ermittelt werden. Kürzlich ist auch ein rekombinanter, monomerer vWF, der am N-Terminus mit dem Grünfluoreszierenden Protein markiert worden ist, zur Bestimmung der Proteolyse eingesetzt worden.

Da sich inzwischen gezeigt hat, dass auch bei anderen Krankheiten als bei TTP geringe Proteaseaktivitäten für vWF zu beobachten sind, stellte sich die Aufgabe, ein verbessertes und einfaches Diagnostikum zum in-vitro-Nachweis der proteolytischen Aktivität von ADAMTS13 zu entwickeln, das auch erlaubt, den für TTP charakteristischen schweren Proteasemangel von einem milden Proteasemangel zu differenzieren, welcher als Begleiterscheinung auch bei anderen Krankheiten auftritt. Ein derartiges Diagnostikum sollte auch eine Überwachung der Therapie von TTP-Patienten sowie eine zuverlässige Quantifizierung der Proteaseaktivität in beliebigen Medien ermöglichen.

Es wurde nun gefunden, dass diese Aufgabe durch ein Diagnostikum zum Nachweis der vWF spaltenden Aktivität der Protease ADAMTS13 im Blutplasma gelöst wird, welches einen von ADAMTS 13-Aktivität freien von Willebrand-Faktor (vWF) enthält, dessen Aktivitätsabfall durch seine verminderte Fähigkeit zur Aggregation von Blutplättchen nach Inkubation mit dem zu untersuchenden Blutplasma festgestellt werden kann.
30

Dieses Diagnostikum beruht auf der Wechselbeziehung zwischen der Größe des multimeren vWF und dessen Ristocetin-Cofaktor-Aktivität (RCO:C). Die mit dem erfindungsgemäßen Diagnostikum erzielten Ergebnisse wurden ausführlich mit denen der Immun-Blotting-Methode verglichen. Das erfindungsgemäße Diagnostikum wurde zur Ermittlung der Aktivität der den von Willebrand-Faktor spaltenden Protease (ADAMTS13) an 14 TTP-Patienten während akuter Anfälle, im Verlauf der Therapie und in Remission, außerdem in 80 gesunden Pro-

B2G1

Dr. Meyer-Dulheuer

banden sowie in 23 Patienten mit Thrombozytopenie und/oder Hämoiyse und in 14 Patienten mit dem Antiphospholipidsyndrom (APS) eingesetzt.

Dabei wurde in folgender Weise vorgegangen: 10 1. Plasmaproben

Mit Zitrat versetzte Plasmaproben wurden von 14 Patienten bei 22 akuten TTP-Anfällen vor dem Plasmaaustausch mit frischgefrorenem Plasma gewonnen. Die anfängliche Diagnose basierte auf klinischen Symptomen (vor allen neurologischen Störungen) und Laborbefunden wie schwerer Thrombozytopenie und dem Nachweis einer mikroangiopathischen, hämolytischen Anämie. Von 11 Patienten wurden auch Plasmaproben in Remission gewonnen. Von 10 Patienten konnte auch Blut während der Plasmaustauschtherapie erhalten werden. Außerdem wurden Plasmaproben von 23 Patienten mit akuter Thrombozytopenie und/oder Hämoiyse, 14 Patienten mit Antiphospholipid-Syndrom und 80 gesunde Probanden analysiert. Blutplättchenarmes Plasma wurde durch Zentrifugation über 40 Minuten bei 4⁰C und 2500 g hergestellt. Der Überstand wurde anschließend bei -20⁰C bis zum Gebrauch gelagert.

2. Bestimmung der vWF-spaltenden Aktivität durch das erfindungsgemäße Diagnostikum

Plasmaproben wurden 1:21 verdünnt (Endvolumen 210 &mgr;&Igr;) mit 5 mM Tris-HCL-Puffer, pH 8, der 12,5 mM Bariumchlorid (BaCI₂) und 1 mM PefaBloc SC, einem Inhibitor von Serumproteasen (AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany) versetzt und dann 5 Minuten bei 37°C zur Aktivierung der Protease inkubiert. Als Substrat wurde ein gereinigter vW-Faktor (Concendre de Facteur Willebrand Humain Tres Haute Purite, LFB France) eingesetzt. Das Konzentrat, welches frei von detektierbarer vWF-spaltender Proteaseaktivität war, wurde mit aqua ad iniectabilia auf eine Konzentration von 100 U/ml rekonstituiert, aufgeteilt und bei -20⁰C bis zu Verwendung gelagert. Vor der Einwirkung der Protease wurde das Substrat aufgetaut, im Verhältnis 1:20 mit 5 M Harnstoff in 5 mM Tris-HCI, pH 8

9. September 2002 ;

B2G1 &Sgr; : :.: :·..:.: : ,· Dr. Meyer-Dulheuer

verdünnt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 100 &mgr;&Igr; der Substratlösung zum verdünnten Plasma gegeben und über Nacht bei 37⁰C einwirken gelassen. Danach wurde die restliche Ristocetin-Cofaktor-Aktivität (vWF:RCo) mit einem kommerziellen Test von Dade Behring, Marburg, ermittelt. Die vWF-spaltende Aktivität einer von 80 offensichtlich gesunden erwachsenen Personen gewonnenen Plasmamischung in einer Verdünnung von 1:21 wurde als 100% definiert. Zur Eichung wurden Reihenverdünnungen des Plasmapools mit hitzebehandeltem Plasmapool hergestellt. Für die Hitzebehandlung wurde der Plasmapool 30 min bei 60⁰C inkubiert und anschließend 5 min bei 13000 UPM (Biofuge A, Heraeus) zentrifugiert, um Proteinaggregate zu sedimentieren. Das so behandelte Plasma enthielt keine detektierbare vWFspaltende Proteaseaktivität. Die verschiedenen Verdünnungen wiesen somit definierte, prozentuale Mengen an vWF-spaltender Proteaseaktivität auf, welche gegen die verbleibende Ristocetin-Cofaktor-Aktivität aufgetragen wurde. Die so gewonnene Eichkurve ist in Fig. 1 (A) dargestellt.

3. Bestimmung der vWF-spaltenden Aktivität durch die Immun-Blotting-Methode

Zur Messung der vWF-spaltenden Proteaseaktivität durch die Immun-Blotting-Methode wurde eine Variante der zuerst von Furlan et al. und Tsai (4, 5) beschriebenen Methode verwendet. Plasmaproben wurden im Verhältnis 1:5 mit 5 mM Tris-Puffer, pH 8 einschließlich 12,5 mM BaCI₂ und 1 mM PefaBloc SC verdünnt und die Aktivierung und Einwirkung der Protease in gleicher Weise durchgeführt, wie es für den Ristocetin-Cofaktor-Test beschrieben ist. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Dinatrium-EDTA bis zu einer Endkonzentration von 23,5 mM gestoppt. Die Multimeranalyse wurde durch SDS-Elektrophorese auf einer 1,4%-igen Agarose (Seakem HGT von Biozym Diagnostics, Hess. Oldenburg, Deutschland) durchgeführt und zum Immun-Blotting wurde ein mit Peroxidase konjugierter Anti-vWF-Antikörper (P0226 von Dako-Glostrup, Dänemark) eingesetzt. Zur quantitativen Bestimmung wurden Reihenverdünnungen von normalem Plasma getestet, wie es bereits vorstehend beschrieben ist. Die Ergebnisse eines Testes sind beispielhaft in Fig. 1 (B) gezeigt.

9. September 2002 ;

B2G1 *i &iacgr; : . : f ·..· . : ·" ,· Dr. Meyer-Dulheuer

4. Inhibitortest

Zur Testung der inhibitorischen Aktivität gegen die vWF spaltende Protease (ADAMST13) wurden Plasmaproben, entweder rein oder verdünnt mit hitzbehandeltem Plasmapool, mit gleichen Anteilen Plasmas gesunder Personen gemischt. Zum Vergleich wurde das Plasma 1:1 mit hitzebehandeltem Plasmapool gemischt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37°C wurde in den Mischungen die vWF spaltende Aktivität mit dem erfindungsgemäßen Diagnostikum oder der Immuno-Blott-Methode bestimmt. Die vWF spaltende Proteaseaktivität der Testprobe wurde durch die Aktivität der Vergleichsmischung geteilt und mit 100 multipliziert, um die Restaktivität der vWF spaltenden Protease zu ermitteln. Zur quantitativen Bestimmung wurden Proben mit einer Restaktivität von 25 bis 75% ausgewählt und die Menge des Inhibitors, wie es für Inhibitoren des Blutgerinnungsfaktors VIII beschrieben ist, ermittelt (6). Eine Probe, die eine Inhibition der normalen vWF-spaltenden Aktivität von 50% verursacht, enthielt definitionsgemäß 1 U/ml Inhibitor.

5. Ergebnisse

Genauigkeit und Wiederholbarkeit des Ristocetin-Cofaktor Tests

Die Genauigkeit der mit dem erfindungsgemäßen Diagnostikum erzielten Ergebnisse wurde bewiesen, indem 282 Plasmaproben von Patienten und gesunden Personen mittels beider Methoden getestet wurden. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt und zeigen die gute Übereinstimmung der neuen Methode mit der herkömmlichen Immun-Blotting Methode. Dort wird gezeigt, dass das Immun-Blotting Verfahren die Einordnung der Plasmaproben in folgende Kategorien ermöglicht: Schwerer Proteasemangel (<12,5%); mittelschwerer Proteasemangel (12,5 - 25%); milder Proteasemangel (25 - 50%); normale Proteaseaktivität (>50%). Bei 72 Plasmaproben mit schwerem Proteasemangel (<12,5%) wurden übereinstimmende Ergebnisse nach beiden Methoden erhalten. Bei 19 Plasmaproben, die nach der Immun-Blotting Methode einen mittelschweren Proteasemangel zeigten, wurden mit dem erfindungsgemäßen Diagnostikum

9. September 2002 : ; ;·· .*::.

B2G1 I : :.: I·..:.· ·*,· Dr. Meyer-Dulheuer

Ristocetin-Cofaktor Methode Proteaseaktivitäten von 9 bis 39% festgestellt, während bei 64 Plasmaproben, die nach der Immun-Blotting Methode einem milden Proteasemangel zeigten, mit dem erfimdungsgemäßen Diagnostikum Proteaseaktivitäten zwischen 20 und 60% gemessen wurden. 127 Proben zeigten nach beiden Methoden normale Proteaseaktivitäten. Die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Diagnostikums wurden auf der y-Achse von Fig. 2 aufgetragen.

Die mit dem erfindungsgemäßen Diagnostikum erzielten Ergebnisse sind reproduzierbar, wie sich durch die sehr geringen Fehlergrenzen innerhalb einer Testreihe und zwischen verschiedenen Testreihen zeigt. Die klinische Anwendbarkeit des neuen Diagnostikums konnte durch die an 52 Patienten erzielten Messergebnisse gezeigt werden, wobei 22 Anfälle von akuter TTP sowie andere thrombotische, thrombozytopenische oder hämolytische Erkrankungen untersucht wurden. Ein schwerer Mangel an der den vWF-spaltenden Protease (ADAMTS13) wurde nur bei Patienten mit akuter klassischer TTP beobachtet. Patienten mit niedrigen Inhibitorkonzentrationen reagierten auf den Plasmaaustausch mit einem Anstieg der vWF-spaltenden Aktivität, während der Mangel an der vWF-spaitenden Protease in Patienten mit hoher Inhibitorkonzentration bestehen bleibt, obwohl die Plasmaaustausch-Therapie zur klinischen Remission führt.

Das erfindungsgemäße Diagnostikum erlaubt die Messung der vWF-spaltenden Proteaseaktivität von ADAMTS13. Der Vergleich des erfindungsgemäßen Assays mit dem bekannten Immun-Blotting-Verfahren zeigt die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Diagnostikums. Die damit erzielten Ergebnisse sind reproduzierbar und erfordern im Gegensatz zur herkömmlichen Immun-Blotting Methode keine spezielle Laborausrüstung oder besondere Erfahrung. Das mit dem erfindungsgemäßen Diagnostikum durchführbare Nachweisverfahren kann über Nacht durchgeführt werden und ist deshalb weniger zeitaufwendig, als das Immun-Blotting. Die Methode erlaubt eine schnelle Diagnose und einen alsbaldigen Beginn der Therapie, was für eine erfolgreiche Behandlung eines akuten Anfalls wesentlich ist.

9. September 2002 : *, '." .'Jj₁.* j '· *··· .·* ·

B2G1 : : ; . : &idigr;·..; . · ;* ,· Dr. Meyer-Dulheuer

Mit der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass das erfindungsgemäße Diagnostikum zum Nachweis der vWF-Aktivität und damit zur Detektion der vWF-spaltenden Aktivität von ADAMTS13 geeignet ist und sich damit auch andere Erkrankungen sicher diagnostizieren lassen könnten, falls sie auf einen Mangel der Protease ADAMTS13 zurückgeführt werden müssen.

Mit dem erfindungsgemäßen Diagnostikum kann in jedem normal ausgestatteten Gerinnungslabor eine schnelle und sichere Diagnose der TTP erfolgen. Die schnelle Diagnose erniedrigt die Anzahl der notwendigen Plasmaaustauschbehandlungen, was die Kosten der Therapie ganz erheblich erniedrigt.

9. September 2002 · · ··· ." I I

Claims

Diagnostikum zum Nachweis der vWF spaltenden Aktivität von ADAMTS13 im Blutplasma, dadurch gekennzeichnet, dass es einen von ADAMTS13-Aktivität freien von Willebrand Faktor (vWF) enthält, dessen Aktivitätabfall durch seine verminderte Fähigkeit zur Aggregation von Blutplättchen nach Inkubation mit dem zu untersuchenden Blutplasma festgestellt werden kann.