FI83973C - Ett foerfarande foer immobilisering av cellbundna enzymer. - Google Patents

Description

1 83973

Menetelmä soluun sidottujen entsyymien immobilisoimiseksi Tämä keksintö kohdistuu menetelmään entsyymien immobilisoimiseksi, ja erityisesti menetelmään muuttaa soluun sidottuja entsyymejä solumassaentsyymipartikkeleiksi.

Immobilisoidut entsyymituotteet, varsinkin kolonnikäyttoön tarkoitetut immobilisoidut entsyymituotteet, ovat olleet nopeasti kasvava ala viime vuosina. Tutkimuspyrkimykset ovat suuntautuneet immobilisoitujen entsyymivalmisteiden tuottamiseen yhä halvemmalla hinnalla, paremmalla fysikaalisella kestävyydellä, korkeammalla yksikköaktiivisuudella, ja partikkelikoolla ja -muodolla, jotka aiheuttavat kolonnin käytön aikana minimi painehäviön, sekä myöskin korkean partikkeli-kestävyyden kulumista vastaan. Viime vuosina tällä alalla työskentelevät ovat tuoneet esille melkoisen määrän jokseenkin tyydyttäviä menetelmiä entsyymien immobilisoimiseksi.

Tämä keksintö on kohdistettu erityisesti soluun sidottujen mikrobientsyymien muuttamiseksi partikkelimuotoon immobili-soiduiksi entsyymeiksi, jotka on tehty mikro-organismin solu-massasta. Jäljempänä esitetty pohdinta entsyymin immobili-soinnista on yhteydessä tämän tyyppiseen immobilisoituun entsyymituotteeseen.

Kaiken kaikkiaan, tekniikan edistyessä, tuote- ja menetelmä-heikkoudet kuten ei-optimaalinen partikkelikoon jakautuminen, säätämätön partikkelimuoto ja melko alhaisen tuotesaannon kustannusvaikutus, joita pidettiin pitkään merkityksettöminä heikkouksina immobilisointiprosessissa, tulivat pääasiallisiksi heikkouksiksi, jotka täytyi välttää. Esimerkiksi glutaraldehydiä on kaupallisesti käytetty US-patentin 3 980 521, opetusten mukaan soluun sidottujen entsyymien ristisitomiseen. Kuitenkin glutaraldehydi ei ole ideaalinen ristisidosaine, ainakaan soluun sidotuille entsyymeille, 2 83973 reagoiden vain -NH2~ ja -SH-ryhmien kanssa. Monet mikro-organismilajien solut reagoivat huonosti glutaraldehydin kanssa.

Polyatsetidiiniesipolymeeria voidaan käyttää edullisesti ristisidontatarkoituksiin, kuten esitetään US-patentissa 4 436 813, ja julkaisussa HA Novel Method of Immobilization and Its Use in Aspartic Acid Production", Wood et al., B^o/ Technology, December 1984, ss. 1081-1084. Tämä patentti ja julkaisu on tässä esitetty viittaamalla. Polyatsetidiini-esipolymeerin ristisidossysteemi on käyttökelpoisempi soluun sidottujen entsyymien immobilisoimiseksi kuin glutaralde-hydi, koska ristisidosreaktiot tapahtuvat polyatsetidiini-esipolymeerin ja -COOH- ja-OH-ryhmien kuten myös -NH2~ ja -SH-ryhmien välillä.

Tapaukset, joihin tämän keksinnön käyttö kohdistuu, ovat sellaisia, jolloin haluttu entsyymimuoto muodostuu mikro-organismisolupartikkeleista, ja soluaineksista, ja risti-sidosreagenssista (-reagensseista), ja valinnaisesti apu-ristisidosaineista, esim. proteiineista ja/tai agglomerointi-aineista, esim. polyelektrolyyteistä, ja/tai hienoksi jauhetuista täyteaineista. Tällaista entsyymituotemuotoa on tässä vaihtelevasti nimitetty solumassapartikkeleiksi ja/tai solu-massan partikkelimuodoksi. On huomattava parenteettisesti, että edellä referoitu prosessi US-patentin 4 436 813 ja edellä mainitun julkaisun mukaan on kohdistettu ensisijaisesti entsymaattisesti aktiivisten mikro-organismisolujen ja soluainesten immobilisointiin kantajapartikkeleille. Keksijän yritykset käyttää polyatsetidiiniesipolymeerin risti-sidontaa tuottamaan partikkelimuotoisia solumassaentsyymi-tuotteita, osoittivat prosessin materiaalipuutteellisuuksien olemassaolon. Reaktioseos muodostuu polyatsetidiiniesipolymeerin vesipitoisesta dispersioliuoksesta ja yksittäisistä mikro-organismisoluista minkä tahansa läsnäolevan soluainek-sen kanssa, edellyttäen kovetusreaktion suorittamista en masse.

3 83973

Haluttu partikkelikokofraktio voidaan saada murskaamalla ja seulomalla reaktiotuote, mutta halutun partikkelikoko-fraktion kokonaissaanto on tavallisesti alhainen, ja myös yksittäisten partikkeleiden muotoa ei ole säädetty. Täten ristisitomalla solumassakoostumus saadaan aikaan immobili-soitu entsyymituote, jossa partikkelin muoto ja koko ei ole säädetty.

Keksinnön tarkoituksena on saada aikaan korkeasaantoinen menetelmä partikkelimuotoisen, solumassasta immobilisoidun entsyymituotteen valmistamiseksi, jonka tuotteen partikkelit ovat fysikaalisesti hyvin kestäviä, jolloin myös partikkeleiden muoto ja koko voidaan säätää.

Lyhyesti, tämän keksinnön menetelmä sisältää entsymaattisesti aktiivisten mikro-organismisolujen osittaisen ristisidonnan glutaraldehydin kanssa vesipitoisessa suspensiossa, minkä jälkeen poistetaan vesi, sitten sekoitetaan saatu konsis-tenssiltaan tahnamainen solumassa polyatsetidiiniesipolymee-rin kanssa. Seos antaa sopivan konsistenssin partikkelin muotoiluun. Sitten seoksesta valmistetaan halutun muotoisia ja kokoisia partikkeleita, jonka jälkeen ne kuivataan. Poly-atsetidiiniesipolymeerin kovetus tapahtuu kuivausvaiheessa.

Keksinnön mukaan valmistetut immobilisoidut entsyymituotteet, joita käytetään täytekerroksessa, antavat hyvin pienen paine-häviön (esim. painehäviön, joka on vain noin 50 % vastaavan, aikaisemmalla tavalla valmistetun tuotteen painehäviöstä) ja hyvän fysikaalisen lujuuden ja kestävyyden kulumista vastaan, ja lisäksi, immobilisoidut entsyymituotteet ovat melko halpoja valmistaa johtuen suuresta partikkelisaannosta. On myös havaittu, että keksinnön mukaan valmistetulla halutun suoritusmuodon omaavalla immobilisoidulla entsyymituotteella on suuri volymetrinen aktiivisuus.

Ristisidontareaktiot soluainesten ja polyatsetidiiniesipoly-meerin välillä entsyymin ristisitomiseksi uudelleenkäytettä- 4 83973 väksi koostumukseksi, on esitetty edellä referoidussa US-patentissa 4 436 813 ja edellä mainitussa julkaisussa, ja siten sitä ei tarvitse pohdiskella tässä yksityiskohtaisesti.

Tyypillinen polyatsetidiiniesipolymeeri vesipitoisessa liuok-sessa, kuten on kuvattu seuraavassa, esim. Polycup 172 (Hercules, Inc.)

O O

Il II + Cl —C-R-CNHCH0-CH~-N-CHn-CH~NH--

^ Z Z

CH„ CH0 v / 2

CH

OH _ jossa R on tyypillisesti CH^-)-^ on ristisidottu lämmön avulla, poistamalla vesi tai säätämällä pH alkaaliseen pH-arvoon. Osa kovetusreaktioista on esipolymeerin reaktiota käytettävissä olevien -NH2~, -OH-, -SH-, -COOH-ryhmien kanssa, jotka ovat peräisin entsymaattisesti aktiivisen mikro-organismisolun soluaineksista.

Jos reaktiomassaa ei ole ennen kovetusta jaettu yksittäisiin partikkeleihin, ristisidottu solumassatuote on yksi ainoa materiaalikappale, se on koherentti massa, joka täytyy sitten jakaa osiin halutun partikkelin muodon omaavaksi entsyymi-tuotteeksi. Kuten on jo painotettu, tällaisen konversion tuloksena saadaan melko vähän halutun kokoisia partikkeleita, ja sen lisäksi yksittäisten partikkeleiden muotoa ei voida lainkaan säätää.

Olisi tietenkin toivottavaa muotoilla solumassa erillisiksi partikkeleiksi ennen polyatsetidiiniesipolymeerin ristisi-dontaa. Valitettavasti, polyatsetidiiniesipolymeerin ja solu-massan seos, esim. soluliete, ei sovellu hyvin muotoiltavaksi koherenteiksi partikkeleiksi.

5 83973 Tämän keksinnön parannus kohdistuu mikro-organismin solu-massan muuttamiseen tahnaksi, joka soveltuu sekoitettavaksi täydellisesti vesipitoisen polyatsetidiiniesipolymeerin kanssa ja, sen jälkeen jaettavaksi erillisiksi partikkeleiksi. Myöhemmin, kun partikkelit kuivuvat, tapahtuvat polyatse-tidiiniristisidosreaktiot.

Mikro-organismisolujen muuttaminen melko koherentiksi tahna-maiseksi massaksi suoritetaan mikro-organismisolujen osittaisella ristisidonnalla glutaraldehydillä vesipitoisessa dispersiossa.

Entsymaattisesti aktiivinen soluliete, joka on saatu fer-menttorista suodattamalla tai sentrifugoimalla kasvuliuos, on lähtöaine tämän keksinnön käyttämiselle. Solulietettä voidaan käyttää sellaisenaan tai ensin homogenisoida se. Koska fermenttori ei ehkä ole immobilisointilaitteen välittömässä läheisyydessä, on todettu, että vaihtoehtoisesti homogenisoitu soluliete voidaan varastoida jäädytettynä. Todellakin, solumassan jäädyttäminen, ja sitten sulattaminen saattaa olla hyödyllistä mieluummin kuin olla aktiivisuutta pienentävä haitta kokonaisprosessissa.

Ei tunneta niiden reaktioiden yksityiskohtaista kemiaa, jotka ottavat osaa osittaiseen ristisidontaan mikro-organismisolujen, soluainesten ja glutaraldehydin välisessä reaktiossa. Todellakin, kuten tiedetään, ristisidonnan kemiaa glutaraldehydillä ei ole tähän mennessä täysin selvitetty. Viittaus tehdään seuraaviin: Douglas J. Ford, 2. Reaction of Glutaraldehyde with Proteins, Cincinnatin yliopisto; ja Hardy, The Nature of the Cross-linking of Proteins by Glutaraldehyde, osa I, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions, Voi, 1, s. 958, 1976. Kuitenkin glutaraldehydin reaktio mikro-orga-nismisolujen kanssa tunnetaan käytännön tuloksin.

Glutaraldehydiä on esitetty entsyymimenetelmään ristisidontaa varten tuottamaan partikkelimuotoista solumassaentsyymiä, 6 83973 mikä osoitetaan edellä mainitussa US-patentissa 3 980 521.

Glutaraldehydiä on myös esitetty stabilisoimaan mikro-organis-misolujen soluun sidottuja entsyymejä, mikä osoitetaan US-patentissa 3 779 869. Tätä keksintöä käytettäessä glutaralde-hydin käyttö kohdistuu molempiin edellä mainittuihin patentteihin, ollen kuitenkin melko erilainen kuin ne. Vaikka risti-sidosreaktioiden tapahtuminen on toivottavaa, laajassa mittauksessa niiden reaktioiden tarkka määrää, joissa glutar-aldehydi estää entsyymin häviötä yksittäisistä mikro-organis-misoluista (katso US-patenttia 3 779 869) , tai voidaan muuttaa soluja ja soluosia koherentiksi, kovalenttisesti sitoutuneeksi matriisiksi (katso US-patenttia 3 980 521), ei voida käyttää tämän keksinnön hyväksi.

Tätä keksintöä käytettäessä glutaraldehydillä käsittelyn tarkoitus on tuottaa reaktiotuoteseos, josta sitten voidaan vettä poistamalla muodostaa taikinamainen massa, joka voidaan sekoittaa vesipitoisen polyatsetidiiniesipolymeerin kanssa seokseksi, jolla on koherentti konsistenssi, josta partikkelit voidaan muotoilla. Etsitty tavoite on partikkeleita muodostavan kyvyn kehittäminen.

Solulietteen käsittelyssä glutaraldehydillä voidaan reaktio-seokseen lisätä -NH2-ryhmiä sisältäviä ristisidosapuaineita, esim. polyeteeni-imiiniä, kitosaania, albumiinia, gelatiinia. Myös flokkuloivia aineita voidaan lisätä. Edelleen saattaa olla hyödyllistä käsitellä soluliete metalli-ionikompleksia muodostavalla aineella, kuten EDTA:lla. Jäljempänä kuvatut yksityiskohdat, jotka käsittävät tämän keksinnön haluttuja suoritusmuotoja, eivät ole todennäköisesti käyttökelpoisia jokaisessa yksityiskohdassaan muihin soluun sidottuihin entsyymeihin. Leikkaus- ja rasituskokeita suositellaan edullisilla glutaraldehydipitoisuuksilla, jotta varmistutaan, onko risti-sidosapuaineiden sisällyttäminen ja/tai polymeeristen flokku-lointiaineiden sisällyttäminen tarpeellista, tai ehkäpä on välttämätöntä saavuttaa käyttökelpoinen konsistenssi ja sopiva I: 7 83973 vesipitoisuus kuivatussa, osittain ristisidotussa solumassassa.

Voidaan myös todeta, että kun lopulliseen solumassaan halutaan hienoksi jakautuneita täyteaineita ja/tai entsyymin-stabiloimisaineita (esim. metalli-ioneja), immobilisoitu ent-syymituote voidaan parhaiten liittää solumassaan osittaisella ristisidonnalla glutaraldehydin kanssa.

On todettu, että veden määrä solulietteessä, ja glutaraldehydin ja jonkin valinnaisen aineen, kuten flokkulointiaine, ristisidosapuaine, entsyyminstabilointi-ionit, mukana lisätyn veden osittaisesti ristisidotussa reaktioseoksessa, jne. ei ole kriittinen tekijä. Kaikki ylimääräinen vesi voidaan suodattaa tai sentrifugoida pois osittain ristisidotusta solu-massasta. Kuitenkin solumassan kuiva-aineen ja glutaraldehydin suhteelliset osuudet ovat tärkeitä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä glutaraldehydin määrä on 5 %:n ja 40 %:n paino/paino välillä, riippuen solulietteen kuiva-aineesta, ensisijaisesti 10 %:n ja 20 %:n paino/paino välillä. Jos glutaraldehydin määrä on alle 5 % paino/paino, osittaisesti ristisidotun solumassan suodatettavuus saattaa huonontua, ja jos glutaraldehydin määrä on yli 40 % paino/paino, entsyymisaannon talteenotto immobili-soidussa entsyymituotannossa saattaa olla epätyydyttävä.

Keksinnön mukaisen menetelmän edullisissa suoritusmuodoissa kuivatun, osittain ristisidotun solumassan vesipitoisuus on 70 % - 90 % paino/paino, ensisijaisesti 80 % - 85 % paino/ paino. Jos vesipitoisuus on vähemmän kuin 70 % paino/paino, immobilisoidun entsyymituotepartikkelin painehäviöominaisuu-det eivät ehkä ole tyydyttäviä, ja jos vesipitoisuus on yli 90 % paino/paino, partikkelin muotoiluvaiheen suoritus saattaa olla epätyydyttävää. Täten, keksintöä käytettäessä kuivatun solumassan melko kapea 70 % - 90 % vesipitoisuusalue on suhteellisen kriittinen.

8 83973 Tätä keksintöä käyttävät huomaavat pian käyttökelpoisimman konsistenssialueen. Partikkelin muodostumiskyky on vesi-pitoisuusalueen 70 - 90 % molemmilla puolilla melko heikko.

On todettu, että käyttökelpoisimman konsistenssin vesipitoisuus vaihtelee entsyymistä toiseen.

Edellä esitetyssä vesipitoisuusalueessa on kuivatulle, osittain ristisidotulle solumassalle otettava huomioon, että polyatsetidiiniesipolymeeri lisättynä antaa vesipitoisen liuoksen, jossa on kiintoainetta 10 - 15 %. Haluttu 80 - 85 %:n vesipitoisuuden alue edellyttää varsinaisesti noin 12 %:n poly-atsetidiiniesipolymeeriliuosta, ja solujen kuivapainon suhteen käytetään paremmin käyvää polyatsetidiiniesipolymeerin pitoisuutta.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä polyatsetidiiniesipolymeerin määrää lisätään 5 %:n ja 30 %:n paino/paino (kuiva-aineesta laskettuna) väliltä, mieluummin 10 - 20 %:n paino/paino solulietteen kuiva-painon suhteen.

Jos määrä on alle 5 % paino/paino, saavutettu painehäviön alenemisen muutos on epätyydyttävän alhainen partikkelimuotoi-sessa tuotteessa, ja jos määrä on yli 30 % paino/paino immo-bilisoidun entsyymin partikkelituotteen entsyymisaanto on epätyydyttävän alhainen. Täten, jos tietty soluun sidottu entsyymi tarvitsisi vähemmän kuin 10 % ja enenmmän kuin 20 % polyatsetidiiniesipolymeeriä saantoa tai tuotestabiilisuutta varten, ei ole aihetta omaksua lopullisesti edellä annettua, mitä suositeltavinta 80 - 85 %:n vesipitoisuuden aluetta.

Kuten on jo aikaisemmin osoitettu, lopullisen reaktioseoksen koossapysyvyys ja konsistenssi ovat sopivia partikkelimuotoi-luun halutun partikkelimuotoilun tekninen suoritustapa on suulakepuristaa reaktioseos, sitten osittain kuivata (kuivaus kovettaa polyatsetidiiniesipolymeeriä), jonka jälkeen muodostetaan palloja, jonka jälkeen edelleen kuivataan, jälkimmäisen ollessa valinnainen. Tämän jälkeen voidaan marumeri-soida GB-patentin 1 362 265 menetelmällä.

li 9 83973

Vesipitoisuudesta huolimatta, solulietteen ja polyatsetidiini-esipolymeerin (ja jonkin muun aineosan) vesipitoiset seokset muodostavat aikaisemman tietämyksen perusteella kiintoaine-vedessä-faasin ja jakautumisen aikana, esim. suulakepuris-tuksessa, yhdistävät yhdeksi ainoaksi massaksi. Vesipitoinen, entsymaattisesti aktiivisten mikro-organismisolujen ja solu-ainesten matriisi, joka on yhdistetty osittaisella glutaral-dehydin ristisidonnalla, on ilmeisesti alkanut muodostua jonkinlaiseksi vesi-kiintoaineessa-faasiksi sekä vedeksi. Jälkimmäinen poistetaan suodattamalla. Kun vesipitoisuus- ja polyatse-tidiiniesipolymeeriosuudet pidetään edellä mainituissa rajoissa lopullisessa seoksessa, (taikinamainen massa) matriisi, joka on valmistettu tämän keksinnön mukaan, osoittaa kiinteän faasin tunnusomaiset piirteet, jotka sallivat matriisin jakautumisen, esim. suulakepuristamalla, ja ekstrudaattinauhat eivät liity yhteen ennen kuin polyatsetidiiniesipolymeerin kuivuminen on suoritettu.

Keksinnön mukaisen menetelmän edullisissa suoritusmuodoissa, partikkelin muotoinen, immobilisoitu entsyymi kuivataan alle noin 25 % paino/paino vesipitoisuuteen. Yli noin 25 % lopullisella vesipitoisuudella, tuotteen mikrobinen stabilisuus on epätyydyttävä. Lisäksi, kuten aikaisemmin on osoitettu, kun vesipitoisuus on yli noin 25 %, polyatsetidiiniesipolymeerin ristiinsitoutumista ei kenties tapahdu, tai se ei ole täydellistä, partikkeleilla saattaa olla taipumusta liittyä yhteen varastoinnin aikana. Kuivaaminen noin alle 15 % vesipitoisuuteen saattaa aiheuttaa entsyymiaktiivisuuden menetystä.

Kuten on jo osoitettu, tämän keksinnön käyttö kohdistuu tapauksiin, joissa halutaan muuttaa soluun sidottuja entsyymejä partikkelimuotoiseksi solumassaksi. Käytettäessä tätä keksintöä, edellä kuvatuilla parametreillä on riittävä vaihtelevuus tekemään keksinnön käyttö sopivaksi minkä tahansa mikro-orga-nismilähteen soluun sidotulle entsyymille. Esimerkiksi glu-koosi-isomeraasia, hyvin tunnettua soluun sidottua entsyymiä, voidaan tuottaa viljelemällä Bacillus coagulansia 10 83973 tai viljelemällä glukoosi-isomeraasia tuottavaa kantaa, joka kuuluu Streptomyces-sukuun, esim. Streptomyces murinus-ryh-män kantaa. Soluun sidottu entsyymi Bacillus coagulansista voidaan immobilisoida helposti antamalla reagoida glutaralde-hydin kanssa (katso edellä mainittua US-patenttia 3 980 521). Kuitenkin Streptomyces-suvun kannoilla, mukaan lukien Streptomyces murinus-ryhmä, tuotetuille soluun sidotuille entsyymeille on tunnusomaista puutteellinen ristisidontakyky glutar-aldehydin kanssa tyydyttävän partikkelimuotoisen solumassaan immobilisoidun entsyymin tuottamiseksi. Kuitenkin, käyttämällä tätä keksintöä voidaan jompikumpi näistä soluun sidotuista entsyymeistä immobilisoida partikkelimuotoiseksi solu-massaksi. Tästä seuraa tietenkin, että tämän keksinnön käyttö on erityisen sopivaa Streptomyces murinus-entsyymille. Glu-koosi-isomeraasi on kaupallisesti tärkeä entsyymi, mikä tarkoittaa, että Streptomyces murinuksen glukoosi-isomeraasin immobilisointi on yksi tämän keksinnön edullisista ilmenemismuodoista.

Alempana on esitetty esimerkkejä tämän keksinnön yleisestä käyttökelpoisuudesta erilaisella, kaupallisesti tärkeällä soluun sidotulla entsyymillä, se on E. colista johdetulla tryptofanisyntetaasilla. Tämän entsyymin valmistus on myös tämän keksinnön käytön haluttu ilmenemismuoto. Yksikään aikaisemman tekniikan immobilisointimenetelmistä, joita on tutkittu, ei ole·johtanut;immobilisoidun tryptofanisyntetaasin tuotannossa tyydyttävään fysikaaliseen lujuuteen. On todettu, että trypto-fanisyntetaasi tarvitsee kasvutekijän. Sellainen on olemassa sytoplasmassa. Koska solun rikkoutuminen voisi aiheuttaa kasvutekijän häviötä, käytetään tryptofanisyntetaasin tapauksessa kokonaisten solujen immobilisointia.

Tätä keksintöä käyttämällä valmistetut entsyymihelmet, erityisesti keksinnön etusijalle asetettujen menetelmien mukaan, osoittivat erinomaisia fysikaalisia ominaisuuksia. Niiden aiheuttama painehäviö täytekerroksessa läpivirtaavalle liuokselle oli vain 50 % vastaavasta, aikaisemman työn tuotteen 11 83973 aiheuttamasta. (Tässä koetutkimuksessa vertaileva, aikaisempi tutkimustuote oli glutaraldehydillä ristisidottu Bacillus coagulansin glukoosi-isomeraasi, joka oli valmistettu US-patentin 3 980 521 mukaan, tuote, joka on yleisesti kaupallisessa käytössä). Lisäksi todettiin suurta fysikaalista lujuutta ja kestävyyttä kulumista vastaan.

Jotta tämän keksinnön käyttöä ymmärrettäisiin paremmin, esitetään seuraavat yksityiskohtaiset esimerkit.

Esimerkki 1

Glukoosi-isomeraasia sisältäviä Streptomyces murinus-soluja, DSM 3252, viljeltiin tavallisessa ravintoliuoksessa, joka sisälsi glukoosia, kompleksisen typpilähteen, kivennäisaineita ja hivenaineita.

Kun pH oli säädetty alueelle 7,0-7,5, solut otettiin talteen fermenttoriliuoksesta sentrifugoimalla, ja homogenisoitiin 0,5 % paino/tilavuus MgSO^, 7Η2<0 lisäyksen jälkeen Manton-Goulin'in homogenisaattorilla. Homogenisoitunutta solulie-tettä pidettiin -18°C:ssa ja sulatettiin välittömästi ennen käyttöä immobilisointikokeessa.

300 g homogenisoitunutta solulietettä, jonka kuiva-aineen määrä oli 6,7 %, laimennettiin 750 ml:aan 1,5 % MgSO^, 7Η^Ο, ja pH säädettiin arvoon 7,5. 30 g Corcat p-18 polyeteeni-imiini-saostusainetta (Cordova Chem. Co.) lisättiin, tämän jälkeen 9,24 g 50 %:sta glutaraldehydiä lisättiin; pH pidettiin alueella 7,4-7,6 yhden tunnin ajan. Höytäleet otettiin talteen suodattamalla.

Suodinkakku, joka sisälsi noin 15,8 % DM:tä, jaettiin kahteen yhtä suureen osaan kuiva-ainepitoisuuden mukaan. Nämä kaksi osaa sekoitettiin, toinen 0 % ja toinen 15 % paino/paino (kuiva-aineesta laskettuna) Polycup 1884 polyatsetidiini-esipolymeeriliuokseen, pH 7,5 (Hercules, Inc., Delaware) laskettiin suodinkakun kuiva-aineelle. Molemmat osat suulake- 12 83973 puristettiin 0,8 mm:n suuttimien läpi. Suulakepuristetun aineen annettiin kuivua huoneen lämpötilassa 83-85 % kuiva-ainepitoisuuteen. 300-700 ^u jae saatiin seulafraktioinnilla.

Kahdessa immobilisoidussa entsyymivalmisteessa saatu glu-koosi-isomeraasin aktiivisuus (mitattu NOVO:n Document 2 F 850399 mukaan) oli suunnilleen sama. Painehäviö (g/cm ) mitattiin NOVO:n mukaan, AF 166 on annettu seuraavassa taulukossa 1.

Taulukko 1

Painehäviö polyatsetidiinipitoisuuden suhteen, laskettuna kuiva-aineena suodinkakun kuiva-aineelle.

% polyatsetidiini 0 15 painehäviö (25 h/50 h) 14/17 6/7

Esimerkki 2

Tryptofanisyntetaasia tuottavaa E. coli-kantaa, ATCC 15491, kasvatettiin agar-vinopinnalla 37°C:ssa ja sieltä siirros-tettiin esikasvatukseen ravistelupulloissa 37°C:ssa. Esi-kasvatus ympättiin kasvualustalle, joka oli valmistettu seuraavasti. Kasvualustan koostumus oli: (NH4)2S04 8 g/1 ΚΗ?Ρ04 1,6 g/1

Na2HP04, 2H20 5,6 g/1

Trinatriumsitraatti, 2H20 0,5 g/1

NaCl 3 g/1

MgS04, 7H20 0,5 g/1

CaCl2, 2H20 0,2 g/1

FeCl32H20 90 mg/1

ZnS04, 7H20 20 mg/1

MgS04, 4H20 24 mg/1

MnS04, 4H20 22 mg/1

CuS04, 5H20 4 mg/1 13 83973 ΚΙ 4 mg/1

NaMo04, 2H20 4 mg/1 H3B03, 6H20 1,2 mg/1

CoCl2, 6H20 6 mg/1

NiCl2, 6H20 6 mg/1 * Biotiini 4 yug/l * Kalsiumpantotenaatti 800 yug/l * Foolihappo 4 yug/1 * Inositoli 4000 yUg/1 * Niasiini 800 yug/1 * p-aminobentsoehappo 400 yug 1 * Pyridoksiini HC1 800 yUg/1 * Riboflaviini 400 yUg/1 * Tiamiini HCl 800 yUg/1

Kasvuliuos steriloitiin 121°C:ssa 25 minuutin ajan lukuunottamatta vitamiineja (*), jotka lisättiin steriilisuoda-tettuina jäähdytyksen jälkeen yhdessä dekstroosin (10 g/1) ja indolin 48 %:ssa etanolissa (125 mg/1) kanssa. Submerssi-fermentaatiota pidettiin aseptisissa olosuhteissa 37°C:ssa 1 tilavuus/tilavuus/minuutti ilmastuksella, 500 rpm:n sekoituksella, ja pH säädettiin happo/emäs-lisäyksellä pH-arvoon 7,0 40 tunniksi. 24 tunnin kuluttua siirrostamisesta lisättiin edelleen dekstroosia (40 g/1) ja indolia 48 %:ssa etanolissa (875 mg/1). 40 tunnin kuluttua solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja ne käytettiin välittömästi immobilisointi-kokeisiin, jotka on kuvattu esimerkissä 3, alempana.

Esimerkki 3 60 g märkiä soluja, jotka otettiin talteen esimerkissä 2 kuvatulla tavalla, ja joiden kuiva-ainepitoisuus oli 17 % paino/ paino, suspendoitiin uudelleen 1200 ml:aan 0,2 M EDTA (säädetty pH-arvoon 7,5), ja pidettiin 30 minuuttia huoneenlämmössä ja sitten sentrifugoitiin. Pesukäsittely vesipitoisella EDTA:11a toistettiin kerran.

14 83973 Märät solut sekoitettiin 300 ml:n 85 mM KI^PO^, pH 7,5, 8.4 g:n polystyreeniä (Kodakilta, 200-400 mesh, ristisidottu 2 % paino/paino divinyylibentsoehapon kanssa) , 96 mg:n pyrid-oksaalifosfaattia ja 9,6 g:n 12,5 paino/tilavuus glutaralde-hydiliuosta. Irainobilisoinnin aikana pH pidettiin pH-arvossa 7.5 lisäämällä emästä. Sitten lisättiin 60 g Corcat P-150 polyeteeni-imiiniliuosta, (Gordova Chemical Company of Michigan) , jonka pH oli säädetty 10 N NaOH:lla arvoon 7,5, jonka jälkeen lisättiin sama määrä glutaraldehydiliuosta kuin ennenkin. Laimennus suoritettiin 900 ml :11a 50 mM KH2PO4, pH 7,5, yhden tunnin jälkeen ensimmäisestä glutaraldehydilisäyksestä. Flokkulointi suoritettiin lisäämällä 250 ml og 1 0/00 paino/ tilavuus Superfloc A 130-yhdistettä American Cyanamidilta. Osittaisesti ristisidotut ja flokkuloidut solut otettiin talteen suodattamalla.

Suodinkakku, joka sisälsi noin 19 % paino/paino kuiva-ainetta, jaettiin kahteen yhtä suureen osaan. Yksi osa sekoitettiin ® 7,2 g Polycup 172 (Hercules Inc., Delaware) kanssa, pH 7,5, joka vastaa 16,5 % paino/paino kuivaa polyatsetidiiniesipoly-meerin suhteessa sentrifugoinnilla fermentoinnista saatujen märkien solujen kuiva-aineeseen.

Molemmat osat suulakepuristettiin 0,8 mm:n suulakkeiden läpi. Suulakepuristetun materiaalin (molemmat osat) annettiin kuivua huoneenlämpötilassa 90 % paino/paino kuiva-ainepitoisuuteen. 300-700 yU jae saatiin seulafraktioinnilla.

Kahdella immobilisoidulla entsyymituotteella saatu trypto-fanisyntetaasin aktiivisuus oli suunnilleen sama. NOVO:n AF 166 menetelmän mukaan mitatut painehäviöt olivat 14 (25 h)/15 (59 h) polyatsetidiinituotteelle ja 23 (25 h)/24 (50 h) tuotteelle, jossa ei ollut polyatsetidiiniä.

li

Claims (7)

15 83973

1. Menetelmä entsymaattisesti aktiivisten mikro-organis-misolujen ja soluainesten vesipitoisen dispersion immobi-lisoimiseksi sekoittamalla tällainen dispersio vesipitoisen polyatsetidiiniesipolymeerin kanssa, joka sitten kovetetaan, tunnettu siitä, että entsymaattisesti aktiivisen mikro-organismin solulietettä käsitellään glutaraldehydillä, jota on 5-40 % solulietteen kuiva-aineesta, jolloin tapahtuu osittaista ristisidontaa, minkä jälkeen vettä poistetaan osittaisesti ristisidotusta solulietteestä vesipitoisuuteen, joka on alueella 70-90 % paino/paino, tuottaen täten tai-kinamainen soluliete; taikinamainen solumassa sekoitetaan vesipitoisen polyatsetidiiniesipolymeerin kanssa, jota on 5-30 % solulietteen kuiva-aineesta, minkä jälkeen edellä mainittu seos kuivataan, jolloin saadaan partikkelimuotoi-nen immobilisoitu entsyymituote.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että helmiseoksen vesipitoisuutta lasketaan alle noin 25 % painostaan kovetuksen aikana.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattisesti aktiiviset mikro-organismisolut sisältävät soluja glukoosi-isomeraasia tuottavasta Strepto-myces murinus -ryhmän kannasta.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattisesti aktiiviset mikro-organismisolut sisältävät soluja tryptofaanisyntetaasia tuottavasta mikro-organismikannasta.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ovat peräisin E. coli -kannasta.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että osittaisesti ristisidotusta solumassasta poistetaan vettä vesipitoisuuteen 80-85 % paino/paino. ie 83973

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glutaraldehydi muodostaa 10-20 % solulietteen kuiva-aineesta.